本發(fā)明涉及植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域,特別涉及一種利用花生子葉為受體,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花生轉(zhuǎn)基因的方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù):
利用在大量的轉(zhuǎn)基因群體進(jìn)行優(yōu)良株系的選育對利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行作物遺傳改良最為直接有效。大規(guī)模的轉(zhuǎn)基因群體是進(jìn)行商業(yè)化轉(zhuǎn)基因育種的保障之一。因此、快速簡便的轉(zhuǎn)化方法是作物轉(zhuǎn)基因育種過程中重要的一環(huán)。
花生(Arachis hypogaea L.)是一種重要的油料兼食作物,也是我國主要的油料經(jīng)濟作物,也是重要蛋白質(zhì)來源?;ㄉ霓D(zhuǎn)基因育種相對滯后,主要是在遺傳轉(zhuǎn)化上相對比較困難。近年來通過研究者的不斷努力,花生的轉(zhuǎn)基因技術(shù)有了一定的進(jìn)展,初步建立農(nóng)桿菌和基因槍介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法。雖然也獲得了一些轉(zhuǎn)基因植株,但是都沒有后續(xù)的報道,而且這些方法大多依賴于組織培養(yǎng),轉(zhuǎn)化的效率也不高,操作步驟又相對復(fù)雜,很難適應(yīng)大規(guī)?;ㄉD(zhuǎn)基因育種的開展。特別是隨著花生基因組的完成,大量功能基因的驗證需要更為簡單有效的轉(zhuǎn)基因技術(shù)和方法??焖伲啽愕霓D(zhuǎn)基因方法也能開展大規(guī)模的轉(zhuǎn)基因育種和商業(yè)化應(yīng)用。在研究中發(fā)現(xiàn),花生種皮在種子萌發(fā)中有一定的抑制作用,同時也容易導(dǎo)致培養(yǎng)基的褐化,在利用種子進(jìn)行轉(zhuǎn)化的時候都需要去掉種皮。但花生種皮和子葉的結(jié)合非常牢固,不容易分離開,導(dǎo)致工作量非常大,效率低下,是限制種子作為受體的主要因素之一。目前也有非組織培養(yǎng)的方法成功。在“在以花生半片成熟種子為受體的非組織培養(yǎng)基因轉(zhuǎn)化方法”(201110074925.7)中同樣也需要人工去除種皮,同時也需要單獨分離子葉,工作效率十分低下,嚴(yán)重限制大量制作轉(zhuǎn)基因受體,從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率不高。排除受體制作的限制,大量獲得受體進(jìn)行花生的遺傳轉(zhuǎn)化,特別是適合農(nóng)桿菌介導(dǎo)的侵染的材料有利于提高轉(zhuǎn)基因的效率。建立高效的轉(zhuǎn)基因方法也能開展大規(guī)模的轉(zhuǎn)基因育種也有利于轉(zhuǎn)基因花生的培育和商業(yè)化應(yīng)用。
技術(shù)實現(xiàn)要素:
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足,本發(fā)明的目的在于提供一種利用花生子葉快速獲得轉(zhuǎn)基因花生的方法,該轉(zhuǎn)基因方法取材容易、操作簡單、節(jié)約時間和成本,且轉(zhuǎn)化效率高,適用于大規(guī)模轉(zhuǎn)基因花生的研制。
本發(fā)明的另一目的在于提供該轉(zhuǎn)基因方法在制備轉(zhuǎn)基因花生中的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的采用以下技術(shù)方案實現(xiàn):
利用花生子葉快速獲得轉(zhuǎn)基因花生的方法,包括以下步驟:
1)取處于對數(shù)生長期的含有外源基因的農(nóng)桿菌,重懸于第一培養(yǎng)基中,得到轉(zhuǎn)化菌液;
2)取成熟的花生種子,萌發(fā)0-5天,然后將子葉縱切為兩半,再切掉胚軸頂端的胚芽,得到轉(zhuǎn)化受體;
3)將所述轉(zhuǎn)化受體浸泡在轉(zhuǎn)化菌液中,侵染20-50分鐘,接著取出轉(zhuǎn)化受體,吸干表面的液體,再置于吸水紙上,于22±2℃暗培養(yǎng)3-4天;培養(yǎng)過程中,向吸水紙上噴施液體營養(yǎng)液,使得吸水紙保持濕潤;所述液體營養(yǎng)液為含有1-10mg/L 6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)的MS培養(yǎng)基;
4)將經(jīng)步驟3)處理的轉(zhuǎn)化受體沖洗干凈,利用第二培養(yǎng)基進(jìn)行選擇培養(yǎng),得到花生幼苗;所述第二培養(yǎng)基為含有1-10mg/L的6-芐氨基腺嘌呤和0.2-0.4vol.%的抗性篩選物質(zhì)的MS培養(yǎng)基;所述抗性篩選物質(zhì)用于篩選含外源基因的花生;
5)將所述花生幼苗繼續(xù)培養(yǎng)至得到花生植株,對花生植株進(jìn)行鑒定,即可確定轉(zhuǎn)基因植株。
優(yōu)選的,在步驟1)中,所述的外源基因為雙丙酰磷抗性基因(Bar),所述抗性篩選物質(zhì)為草胺膦。
優(yōu)選的,在步驟1)中,采用YEP液體培養(yǎng)基,于28℃下將含有外源基因的農(nóng)桿菌培養(yǎng)至OD600為0.5-0.8,即得所述處于對數(shù)生長期的含有外源基因的農(nóng)桿菌。
優(yōu)選的,在步驟1)中,所述第一培養(yǎng)基為含100-200μM的乙酰丁香酮(AS)的MS培養(yǎng)基。
優(yōu)選的,在步驟1)中,將含有外源基因的農(nóng)桿菌接種于含抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中,28℃搖床過夜,再按體積百分比1%的接種量轉(zhuǎn)接入50-800mL含抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)2-4小時至OD600為0.6,收集菌體;然后用50-800mL含100-200μM的乙酰丁香酮的MS培養(yǎng)基重新懸浮沉淀,將菌液轉(zhuǎn)入50-800mL含100-200μM的乙酰丁香酮的MS培養(yǎng)基中,于28℃搖床上培養(yǎng)至OD600到0.6,即得轉(zhuǎn)化菌液。
優(yōu)選的,在步驟2)中,所述成熟的花生種子為剛好萌發(fā)、子葉分離的花生種子。
優(yōu)選的,在步驟3)中,將所述轉(zhuǎn)化受體浸泡在轉(zhuǎn)化菌液中,使得轉(zhuǎn)化菌液剛好浸沒轉(zhuǎn)化受體。
優(yōu)選的,在步驟3)中,所述侵染的時間為30-50min。
優(yōu)選的,在步驟5)中,花生幼苗在培養(yǎng)成花生植株的過程中,進(jìn)行了煉苗、移栽及除草劑篩選的處理。
本發(fā)明還公開了上述利用花生子葉快速獲得轉(zhuǎn)基因花生的方法在制備轉(zhuǎn)基因花生中的應(yīng)用。
相比現(xiàn)有技術(shù),本發(fā)明的有益效果在于:
1.本發(fā)明采用花生子葉作為材料,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)將外源基因?qū)牖ㄉ?xì)胞,直接通過細(xì)胞途徑再生出轉(zhuǎn)基因植株,整個過程只需要3個月,大大縮短了轉(zhuǎn)基因花生研制周期。同時,轉(zhuǎn)化所用的受體材料也容易得到,不需要對種皮進(jìn)行剝離等特別處理,也不需要對種子嚴(yán)格進(jìn)行子葉的分離,特別適合大規(guī)模的花生轉(zhuǎn)基因批量生產(chǎn)。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于植物轉(zhuǎn)基因研究,有著成本低廉,效率高的特點。以抗草丁膦的Bar為目的基因?qū)ㄉ尤~進(jìn)行轉(zhuǎn)化,獲得了含有Bar的抗除草劑轉(zhuǎn)基因花生,證實了該方法的可行性。
2.與目前常用的轉(zhuǎn)基因方法相比較,本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因方法不受材料限制,節(jié)約時間,不需要進(jìn)行組織培養(yǎng),不需要無菌操作等苛刻的試驗條件,也避免了花生再生體系建立的困難。本方法以子葉為外源基因受體,通過細(xì)胞途徑獲得轉(zhuǎn)基因植株,和以愈傷組織等其它受體的轉(zhuǎn)基因方法相比,取材容易,也大大縮短了得到轉(zhuǎn)基因花生植株的時間,更適合大規(guī)模的轉(zhuǎn)基因花生研制。同時,方法培養(yǎng)時間短,避免了長期組織培養(yǎng)過程中,外源激素導(dǎo)致變異的影響。本方法采用花生子葉直接做為轉(zhuǎn)基因受體,為獲得轉(zhuǎn)基因花生提供新方法。
3.本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因方法,轉(zhuǎn)化效率高,得到的嵌合體少;而且具有可拓展性,可以適用于大規(guī)模轉(zhuǎn)基因花生的研制,大大減少工作量,降低研究費用。
附圖說明
圖1為實施例1中獲得的轉(zhuǎn)基因花生PCR檢測電泳結(jié)果;
圖2為實施例2中獲得的轉(zhuǎn)基因花生PCR檢測電泳結(jié)果;
圖3為實施例3中獲得的轉(zhuǎn)基因花生PCR檢測電泳結(jié)果;
圖4為實施例4中獲得的轉(zhuǎn)基因花生PCR檢測電泳結(jié)果。
具體實施方式
下面,結(jié)合附圖以及具體實施方式,對本發(fā)明做進(jìn)一步描述:
以下實施例中,LBA4404感受態(tài)細(xì)胞購買于寶生物工程(大連)有限公司,Bar基因來源于商業(yè)載體pCAMBIA3301。
實施例1
利用花生子葉快速獲得轉(zhuǎn)基因花生的方法,包括以下步驟:
①制備含有Bar基因的農(nóng)桿菌LBA4404:將Pcambia3301質(zhì)粒按照《分子克隆》的方法,導(dǎo)入到LBA4404細(xì)胞中。
②農(nóng)桿菌的培養(yǎng):挑取含有Bar基因的農(nóng)桿菌LBA4404單菌落,接種于5ml含有50mg/L的利福平的YEB液體培養(yǎng)基中,28℃搖床過夜,接著將0.5ml菌液接種于50mL含有50mg/L的利福平的YEB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600為0.5左右。將菌液于4℃、5000rpm離心5min,收集菌體。然后用5mL含100μM AS的MS培養(yǎng)基重新懸浮沉淀,再將菌液轉(zhuǎn)入50mL的含100μM AS的MS培養(yǎng)基中,27℃搖床上培養(yǎng)至OD600為0.5,得到農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化菌液。
③轉(zhuǎn)化受體的制備:取成熟的花生種子(航花2號廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所選育),萌發(fā)5天后,用手術(shù)刀片將子葉縱切為兩半,再切掉胚軸頂端的胚芽,得到轉(zhuǎn)化受體。
④農(nóng)桿菌侵染:
A、將步驟③制備的轉(zhuǎn)化受體浸入步驟②制備的MS農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化菌液(含100μM AS)中,30min后將轉(zhuǎn)化受體取出,中間輕緩晃動數(shù)次。
B、接著將轉(zhuǎn)化受體表面的液體吸干,再將其置于含有濕潤吸水紙上,于22±2℃暗培養(yǎng)3天,培養(yǎng)過程中噴施含7mg/L 6-BA的MS培養(yǎng)基,以保持吸水紙的濕潤。
⑤抗除草劑轉(zhuǎn)基因花生的再生與移栽:
A、選擇培養(yǎng):用自來水將經(jīng)步驟④處理的轉(zhuǎn)化受體沖洗干凈,裝入尼龍網(wǎng),或者紗布包裹,或者繼續(xù)放在濕潤的吸水紙上進(jìn)行選擇培養(yǎng),得到花生幼苗。培養(yǎng)過程中所噴施的培養(yǎng)液為:含2mg/L 6-BA和0.2vol.%草胺膦的MS培養(yǎng)基。
B、待苗高為2-3cm時,對其進(jìn)行煉苗、移栽,得到轉(zhuǎn)基因花生植株。
⑥抗除草劑轉(zhuǎn)基因花生檢測:
A、取種植在育苗盤中轉(zhuǎn)基因花生植株葉片,采用微量法提取總DNA(王繼華,李余良,胡建廣等,一種轉(zhuǎn)基因花生基因組DNA的快速提取方法,甘蔗糖業(yè),2007,(6):6-7)進(jìn)行PCR擴增。
B、PCR擴增引物是依據(jù)質(zhì)粒表達(dá)載體中Bar序列設(shè)計。上游序列:5'-ACCATCGTCAACCACTACAT-3',下游序列:5'-AGTCCAGCTGCCAGAAACCC-3'。PCR反應(yīng)體系:模板DNA 50-100ng,10×Buffer 1.5μL,10mmol/L dNTP 0.35μL,10mmol/L ZG3 0.35μL,10mmol/L ZG4 0.35μL,25mmol/L MgCl2 1.0μL,Taq酶(5U/μL)0.2μL,補ddH2O至15μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3min;95℃30sec,60℃40sec,72℃40sec,35個循環(huán);72℃延伸10min,4℃保存。
C、對得到的DNA序列進(jìn)行質(zhì)量體積比1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,所得結(jié)果如圖1所示。
從圖1中可以看出,本實施例花生植株的PCR檢測到了目的基因條帶,說明該花生植株為抗除草劑轉(zhuǎn)基因花生植株。
實施例2
利用花生子葉快速獲得轉(zhuǎn)基因花生的方法,包括以下步驟:
①制備含有Bar基因的農(nóng)桿菌LBA4404:將Pcambia3301質(zhì)粒按照《分子克隆》的方法,導(dǎo)入到LBA4404細(xì)胞中。
②農(nóng)桿菌的培養(yǎng):挑取含有Bar基因的農(nóng)桿菌LBA4404單菌落,接種于5ml含有50mg/L利福平的YEB液體培養(yǎng)基中,28℃搖床過夜,接著將0.5ml菌液接種于50mL含有50mg/L利福平的YEB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600為0.5左右。將菌液于4℃、5000rpm離心5min,收集菌體。然后用5mL含100μM AS的MS培養(yǎng)基重新懸浮沉淀,再將菌液轉(zhuǎn)入50mL的含100μM AS的MS培養(yǎng)基中,27℃搖床上培養(yǎng)至OD600為0.5,得到農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化菌液。
③轉(zhuǎn)化受體的制備:取成熟的花生種子(粵油7號,廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所選育),萌發(fā)5天后,用手術(shù)刀片將子葉縱切為兩半,再切掉胚軸頂端的胚芽,得到轉(zhuǎn)化受體。
④農(nóng)桿菌侵染:
A、將步驟③制備的轉(zhuǎn)化受體浸入步驟②制備的MS農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化菌液(含100μM AS)中,30min后將轉(zhuǎn)化受體取出,中間輕緩晃動數(shù)次。
B、接著將轉(zhuǎn)化受體表面的液體吸干,再將其置于含有濕潤吸水紙上,于22±2℃暗培養(yǎng)3天,培養(yǎng)過程中噴施含2mg/L 6-BA的MS培養(yǎng)基的液體營養(yǎng)液,以保持吸水紙的濕潤。
⑤抗除草劑轉(zhuǎn)基因花生的再生與移栽:
A、選擇培養(yǎng):用自來水將經(jīng)步驟④處理的轉(zhuǎn)化受體沖洗干凈,裝入尼龍網(wǎng),或者紗布包裹,或者繼續(xù)放在濕潤的吸水紙上進(jìn)行選擇培養(yǎng),得到花生幼苗。培養(yǎng)過程中所噴施的培養(yǎng)液為:含2mg/L 6-BA和0.2%vol.草胺膦的MS培養(yǎng)基。
B、待苗高為2-3cm時,對其進(jìn)行煉苗、移栽,得到轉(zhuǎn)基因花生植株。
⑥抗除草劑轉(zhuǎn)基因花生檢測:
A、取種植在育苗盤中轉(zhuǎn)基因花生植株葉片,采用微量法提取總DNA(王繼華,李余良,胡建廣等,一種轉(zhuǎn)基因花生基因組DNA的快速提取方法,甘蔗糖業(yè),2007,(6):6-7)進(jìn)行PCR擴增。
B、PCR擴增引物是依據(jù)質(zhì)粒表達(dá)載體中Bar序列設(shè)計。上游序列:5'-ACCATCGTCAACCACTACAT-3',下游序列:5'-AGTCCAGCTGCCAGAAACCC-3'。PCR反應(yīng)體系:模板DNA 50-100ng,10×Buffer 1.5μL,10mmol/L dNTP 0.35μL,10mmol/L ZG3 0.35μL,10mmol/L ZG4 0.35μL,25mmol/L MgCl2 1.0μL,Taq酶(5U/μL)0.2μL,補ddH2O至15μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3min;95℃30sec,60℃40sec,72℃40sec,35個循環(huán);72℃延伸10min,4℃保存。
C、對得到的DNA序列進(jìn)行質(zhì)量體積比1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,所得結(jié)果如圖2所示。
從圖2中可以看出,本實施例的花生植株的PCR檢測到了目的基因條帶,說明該花生植株為抗除草劑轉(zhuǎn)基因花生植株。
實施例3
利用花生子葉快速獲得轉(zhuǎn)基因花生的方法,包括以下步驟:
①制備含有Bar基因的農(nóng)桿菌LBA4404:將Pcambia3301質(zhì)粒按照《分子克隆》的方法,導(dǎo)入到LBA4404細(xì)胞中。
②農(nóng)桿菌的培養(yǎng):挑取含有Bar基因的農(nóng)桿菌LBA4404單菌落,接種于5ml含有50mg/L利福平的YEB液體培養(yǎng)基中,28℃搖床過夜,接著將0.5ml菌液接種于50mL含有50mg/L利福平的YEB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600為0.5左右。將菌液于4℃、5000rpm離心5min,收集菌體。然后用5mL含100μM AS的MS培養(yǎng)基重新懸浮沉淀,再將菌液轉(zhuǎn)入50mL的含100μM AS的MS培養(yǎng)基中,27℃搖床上培養(yǎng)至OD600為0.5,得到農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化菌液。
③轉(zhuǎn)化受體的制備:取成熟的花生種子(粵油7號,廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所選育),用自來水浸泡30分鐘后,用手術(shù)刀片將子葉縱切為兩半,再切掉胚軸頂端的胚芽,得到轉(zhuǎn)化受體。
④農(nóng)桿菌侵染:
A、將步驟③制備的轉(zhuǎn)化受體浸入步驟②制備的MS農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化菌液(含100μM AS)中,20min后將轉(zhuǎn)化受體取出,中間輕緩晃動數(shù)次。
B、接著將轉(zhuǎn)化受體表面的液體吸干,再將其置于含有濕潤吸水紙上,于22±2℃暗培養(yǎng)4天,培養(yǎng)過程中噴施含5mg/L 6-BA的MS培養(yǎng)基,以保持吸水紙的濕潤。
⑤抗除草劑轉(zhuǎn)基因花生的再生與移栽:
A、選擇培養(yǎng):用自來水將經(jīng)步驟④處理的轉(zhuǎn)化受體沖洗干凈,裝入尼龍網(wǎng),或者紗布包裹,或者繼續(xù)放在濕潤的吸水紙上進(jìn)行選擇培養(yǎng),得到花生幼苗。培養(yǎng)過程中所噴施的培養(yǎng)液為:含2mg/L 6-BA和0.2%vol.草胺膦的MS培養(yǎng)基。
B、待苗高為2-3cm時,對植株進(jìn)行煉苗、移栽,得到轉(zhuǎn)基因花生植株。
⑥抗除草劑轉(zhuǎn)基因花生檢測:
A、取種植在育苗盤中轉(zhuǎn)基因花生植株葉片,采用微量法提取總DNA(王繼華,李余良,胡建廣等,一種轉(zhuǎn)基因花生基因組DNA的快速提取方法,甘蔗糖業(yè),2007,(6):6-7)進(jìn)行PCR擴增。
B、PCR擴增引物是依據(jù)質(zhì)粒表達(dá)載體中Bar序列設(shè)計。上游序列:5'-ACCATCGTCAACCACTACAT-3',下游序列:5'-AGTCCAGCTGCCAGAAACCC-3'。PCR反應(yīng)體系:模板DNA 50-100ng,10×Buffer 1.5μL,10mmol/L dNTP 0.35μL,10mmol/L ZG3 0.35μL,10mmol/L ZG4 0.35μL,25mmol/L MgCl2 1.0μL,Taq酶(5U/μL)0.2μL,補ddH2O至15μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3min;95℃30sec,60℃40sec,72℃40sec,35個循環(huán);72℃延伸10min,4℃保存。
C、對得到的DNA序列進(jìn)行質(zhì)量體積比1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,所得結(jié)果如圖3所示。
從圖3中可以看出,本實施例花生植株的PCR檢測到了目的基因條帶,說明該花生植株為抗除草劑轉(zhuǎn)基因花生植株。
實施例4
利用花生子葉快速獲得轉(zhuǎn)基因花生的方法,包括以下步驟:
①制備含有Bar基因的農(nóng)桿菌LBA4404:將Pcambia3301質(zhì)粒按照《分子克隆》的方法,導(dǎo)入到LBA4404細(xì)胞中。
②農(nóng)桿菌的培養(yǎng):挑取含有Bar基因的農(nóng)桿菌LBA4404單菌落,接種于5ml含有50mg/L利福平的YEB液體培養(yǎng)基中,28℃搖床過夜,接著將0.5ml菌液接種于50mL含有50mg/L利福平的YEB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600為0.5左右。將菌液于4℃、5000rpm離心5min,收集菌體。然后用5mL含100μM AS的MS培養(yǎng)基重新懸浮沉淀,再將菌液轉(zhuǎn)入50mL的含100μM AS的MS培養(yǎng)基中,27℃搖床上培養(yǎng)至OD600為0.5,得到農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化菌液。
③轉(zhuǎn)化受體的制備:取成熟的花生種子(航花2號廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所選育),萌發(fā)1天后,用手術(shù)刀片將子葉縱切為兩半,再切掉胚軸頂端的胚芽,得到轉(zhuǎn)化受體。
④農(nóng)桿菌侵染:
A、將步驟③制備的轉(zhuǎn)化受體浸入步驟②制備的MS農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化菌液(含100μM AS)中,50min后將轉(zhuǎn)化受體取出,中間輕緩晃動數(shù)次。
B、接著將轉(zhuǎn)化受體表面的液體吸干,再將其置于含有濕潤吸水紙上,于22±2℃暗培養(yǎng)4天,培養(yǎng)過程中噴施含2mg/L 6-BA的MS培養(yǎng)基,以保持吸水紙的濕潤。
⑤抗除草劑轉(zhuǎn)基因花生的再生與移栽:
A、選擇培養(yǎng):用自來水將經(jīng)步驟④處理的轉(zhuǎn)化受體沖洗干凈,裝入尼龍網(wǎng),或者紗布包裹,或者繼續(xù)放在濕潤的吸水紙上進(jìn)行選擇培養(yǎng),得到花生幼苗。培養(yǎng)過程中所噴施的培養(yǎng)液為:含3mg/L 6-BA和0.2%vol.草胺膦的MS培養(yǎng)基。
B、待苗高為2-3cm時,對植株進(jìn)行煉苗、移栽,得到轉(zhuǎn)基因花生植株。
⑥抗除草劑轉(zhuǎn)基因花生檢測:
A、取種植在育苗盤中轉(zhuǎn)基因花生植株葉片,采用微量法提取總DNA(王繼華,李余良,胡建廣等,一種轉(zhuǎn)基因花生基因組DNA的快速提取方法,甘蔗糖業(yè),2007,(6):6-7)進(jìn)行PCR擴增。
B、PCR擴增引物是依據(jù)質(zhì)粒表達(dá)載體中Bar序列設(shè)計。上游序列:5'-ACCATCGTCAACCACTACAT-3',下游序列:5'-AGTCCAGCTGCCAGAAACCC-3'。PCR反應(yīng)體系:模板DNA 50-100ng,10×Buffer 1.5μL,10mmol/L dNTP 0.35μL,10mmol/L ZG3 0.35μL,10mmol/L ZG4 0.35μL,25mmol/L MgCl2 1.0μL,Taq酶(5U/μL)0.2μL,補ddH2O至15μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3min;95℃30sec,60℃40sec,72℃40sec,35個循環(huán);72℃延伸10min,4℃保存。
C、對得到的DNA序列進(jìn)行質(zhì)量體積比1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,所得結(jié)果如圖4所示。
從圖4中可以看出,本實施例花生植株的PCR檢測到了目的基因條帶,說明該花生植株為抗除草劑轉(zhuǎn)基因花生植株。
圖1-圖4的結(jié)果表明,采用本發(fā)明的方法,可快速獲得大量的轉(zhuǎn)基因花生,說明該轉(zhuǎn)基因方法切實可行,為批量獲得轉(zhuǎn)基因花生提供了新思路。
對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說,可根據(jù)以上描述的技術(shù)方案以及構(gòu)思,做出其它各種相應(yīng)的改變以及形變,而所有的這些改變以及形變都應(yīng)該屬于本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍之內(nèi)。