本發(fā)明屬于植物基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種小麥整株TRV載體介導(dǎo)病毒誘導(dǎo)基因沉默方法。背景介紹植物突變體很難獲得，有些基因的突變對(duì)植物可能是致死的，基因沉默相對(duì)容易獲得，病毒誘導(dǎo)的基因沉默(Virus-inducedgenesilencing,VIGS)是一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默技術(shù)，作為一種有效的反向遺傳學(xué)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于植物基因工程的研究中，其作用原理是植物在抵御病毒侵染時(shí)會(huì)啟動(dòng)RNA沉默(RNAsilencing)機(jī)制。植物體內(nèi)的Dicer-likeprotein4可以識(shí)別病毒復(fù)制過(guò)程中產(chǎn)生dsRNA，并將其切割成21-24nt的siRNAs(smallinterferingRNAs)，siRNAs中的一條鏈與Agronatue(AGO)等蛋白結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNAinducedsilencingcomplex，RISC)，并特異的與同源的靶標(biāo)mRNA結(jié)合最終導(dǎo)致靶標(biāo)mRNA的降解，這一過(guò)程即病毒誘導(dǎo)的基因沉默。同樣的，如果將寄主植物基因的片段克隆島病毒VIGS載體中，當(dāng)寄主植物通過(guò)RNA沉默引起防御反應(yīng)時(shí)，相應(yīng)的寄主基因也會(huì)被沉默。一系列改造過(guò)的RNA或DNA病毒載體被用于VIGS(BeckerandLange,2010)。煙草脆裂病毒(Tobaccorattlevirus，TRV)是一類應(yīng)用比較廣泛而且效率和持久性較好的病毒載體，能夠介導(dǎo)基因沉默同時(shí)不會(huì)帶來(lái)病毒誘導(dǎo)的癥狀。改造后的病毒能夠促進(jìn)非病毒序列的插入以及對(duì)植物的后續(xù)感染，也可以鑒定宿主植物生長(zhǎng)點(diǎn)的基因，因此TRV在植物基因功能鑒定中具有廣泛的應(yīng)用。小麥?zhǔn)俏覈?guó)重要的糧食作物，小麥基因組測(cè)序的初步完成為小麥功能基因組學(xué)的研究提供了重要的參考(Brenchleyetal.,2012,Jiaetal.,2013,Lingetal.,2013)。但是小麥?zhǔn)橇扼w作物，多拷貝基因普遍存在；小麥基因組復(fù)雜，突變體不易獲得；小麥遺傳轉(zhuǎn)化困難，受基因型限制等特點(diǎn)對(duì)小麥基因功能的研究帶來(lái)了諸多不便。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種快速方便的小麥整株TRV載體介導(dǎo)病毒誘導(dǎo)基因沉默方法及應(yīng)用，能夠快速高效的在整個(gè)小麥植株中沉默目的基因。一種小麥整株TRV載體介導(dǎo)病毒誘導(dǎo)基因沉默方法，具體步驟如下：步驟(1)：取小麥種子50粒，用有效氯為1％次氯酸鈉消毒液進(jìn)行種子消毒，將消毒過(guò)的小麥種子放在墊有濕潤(rùn)無(wú)菌濾紙片的培養(yǎng)皿內(nèi)，并透氣性密封，置于室溫下黑暗處萌發(fā)30h后獲得無(wú)菌小麥芽，備用；步驟(2)：用基因工程的方法將擴(kuò)增后的番茄八氫番茄紅素脫氫酶(下稱：番茄PDS)基因片段連接到TRV病毒誘導(dǎo)基因沉默載體pTRV2中，得到pTRV-SlPDS；具體步驟如下：cDNA合成：按TaKaRa提取試劑盒操作說(shuō)明提取番茄葉片的總RNA，以1μg的總RNA做模板，按照TaKaRacDNA合成試劑盒操作說(shuō)明合成cDNA的第一鏈，然后稀釋10倍備用；PDS基因擴(kuò)增：設(shè)計(jì)引物，上游引物5’-CGGGGTACCGGCACTCAACTTTATAAACC-3’和下游引物5’-CGGGGATCCTTCAGTTTTCTGTCAAACC-3’，PCR產(chǎn)物為409-bp番茄PDS基因片段；以番茄的cDNA第一鏈為模板、用KAPAHiFiPCRKits，50μL體系進(jìn)行擴(kuò)增；擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性3min；30個(gè)循環(huán)的98℃變性20s，60℃退火20s，72℃延伸30s；72℃后延伸5min，4℃保存；PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)為單一條帶，純化后備用；pTRV-SlPDS基因沉默載體的構(gòu)建：純化后的PCR基因片段，經(jīng)KpnI-BamHI雙酶切后，與經(jīng)KpnI-BamHI雙酶切的pTRV2質(zhì)粒用T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有50mg/LKan抗生素的LB平板培養(yǎng)基，37℃倒置過(guò)夜培養(yǎng)，長(zhǎng)出單克隆，挑取單克隆至含有50mg/LKan抗生素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃，250轉(zhuǎn)每分鐘震蕩培養(yǎng)12小時(shí)，提取質(zhì)粒，驗(yàn)證正確后備用；步驟(3)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化及培養(yǎng)：3.1)將pTRV-SlPDS、pTRV2以及pTRV1質(zhì)粒分別用液氮凍融法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)菌液PCR鑒定正確后，得到分別含有質(zhì)粒pTRV1、pTRV2和pTRV-SlPDS的農(nóng)桿菌GV3101陽(yáng)性菌株，記為TRV1、TRV2和TRV-SlPDS，保菌備用；3.2)將含有TRV1、TRV2、TRV-SlPDS質(zhì)粒的農(nóng)桿菌GV3101菌液，在含有抗生素的LB平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)長(zhǎng)出單克??；3.3)分別挑取3.2)中的單克隆放于含有抗生素的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，以實(shí)現(xiàn)單克隆的增殖；3.4)將3.3)得到的TRV1與TRV2單克隆培養(yǎng)液以1：1混合，TRV1與TRV-SlPDS單克隆培養(yǎng)液以1:1混合，分別按1:100轉(zhuǎn)接到相同的LB培養(yǎng)基上，在三角瓶中繼續(xù)培養(yǎng)到菌液的O.D.600＝0.04-1.5，并調(diào)整兩個(gè)三角瓶中的菌液的O.D.600值相同；步驟(4)配制轉(zhuǎn)化菌液：向步驟(3)所得的菌液中加入乙酰丁香酮(AS)終濃度為19.62mg·L-1、半胱氨酸(Cys)終濃度為400mg·L-1和吐溫20(Tween20)終濃度為5ml·L-1，均勻混合得到含TRV1與TRV2的轉(zhuǎn)化菌液和含TRV1與TRV-SlPDS的轉(zhuǎn)化菌液，放置于超凈工作臺(tái)中備用；步驟(5)小麥芽侵染：將等量的處理過(guò)的小麥芽分別放入帶橡膠塞的10ml玻璃瓶中，記為玻璃瓶1和2，玻璃瓶1中加入5ml含TRV1與TRV2的轉(zhuǎn)化菌液，玻璃瓶2中加入5ml含TRV1與TRV-SlPDS的轉(zhuǎn)化菌液，使種子完全浸泡在轉(zhuǎn)化菌液中；用20ml注射器對(duì)玻璃瓶抽真空，每次保持15s，操作1～2次；最后，分別將玻璃瓶1、玻璃瓶2中的小麥種子和轉(zhuǎn)化菌液倒入步驟(4)相應(yīng)的剩余轉(zhuǎn)化菌液中，在28℃、200轉(zhuǎn)每分鐘下過(guò)夜培養(yǎng)0-25h；培養(yǎng)結(jié)束，超凈臺(tái)用無(wú)菌水清洗干凈，將經(jīng)TRV1與TRV2轉(zhuǎn)化菌液侵染過(guò)的小麥芽和經(jīng)TRV1與TRV-SlPDS轉(zhuǎn)化菌液侵染過(guò)的小麥芽清洗干凈，分別轉(zhuǎn)接到相同的固體MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件為：19-22℃，光照強(qiáng)度為150μmol·m-2·s-1，光周期為16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗，相對(duì)濕度為55％，培養(yǎng)兩天，移栽至土壤中繼續(xù)生長(zhǎng)，兩周后觀察表型，提取RNA鑒定。進(jìn)一步，步驟(2)中，番茄PDS經(jīng)PCR擴(kuò)增后所得的番茄PDS基因片段與小麥PDS基因TaPDS的相似度為76.53％。進(jìn)一步，步驟(3)中，所述的液氮凍融法具體方法為：取農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，冰上融化，加入200納克待轉(zhuǎn)質(zhì)粒，冰浴30分鐘，液氮速凍2分鐘，37℃水浴鍋水浴2分鐘，冰浴2分鐘，加入到800微升無(wú)抗LB液體培養(yǎng)基，28℃180轉(zhuǎn)每分鐘震蕩培養(yǎng)3小時(shí)，涂布于含有50mg/LKna和50mg/LRif抗生素的固體LB培養(yǎng)基上，28℃倒置避光培養(yǎng)3天長(zhǎng)出單克??；挑取單克隆于含有50mg/LKan和50mg/LRif抗生素的液體LB培養(yǎng)基中，28℃200轉(zhuǎn)每分鐘震蕩培養(yǎng)24小時(shí)，經(jīng)菌液PCR鑒定正確后，得到含有質(zhì)粒pTRV1、pTRV2和pTRV-SlPDS農(nóng)桿菌GV3101陽(yáng)性菌株。進(jìn)一步，步驟(3)中，100ml三角瓶中培養(yǎng)的菌液的OD600＝0.3。進(jìn)一步，步驟(5)中，帶橡膠塞的10ml玻璃瓶中，同時(shí)加入轉(zhuǎn)化菌液5ml，使種子完全浸泡在轉(zhuǎn)化菌液中；用20ml注射器抽真空，每次保持15s，操作2次。進(jìn)一步，步驟(5)中，所述的分別將玻璃瓶1、玻璃瓶2中的小麥芽和轉(zhuǎn)化菌液倒入步驟(4)相應(yīng)的剩余轉(zhuǎn)化菌液中，在28℃、200轉(zhuǎn)每分鐘下過(guò)夜培養(yǎng)15h。本發(fā)明還公開(kāi)了一種小麥整株TRV載體介導(dǎo)病毒誘導(dǎo)基因沉默方法在研究同時(shí)沉默小麥MLO同源基因中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明具有如下主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)：(1)本發(fā)明針對(duì)小麥研究現(xiàn)存的問(wèn)題，發(fā)明一種基于TRV的VIGS新技術(shù)，能夠快速高效的在整個(gè)小麥植株中沉默目的基因，對(duì)于多拷貝基因的同時(shí)沉默更為有效。八氫番茄紅素脫氫酶(phytoenedesaturase，PDS)沉默后植株會(huì)有光漂白現(xiàn)象(Liuetal.,2002a,Dinesh-Kumaretal.,2003)，本發(fā)明利用番茄PDS基因來(lái)沉默小麥PDS基因，能夠快速高效的實(shí)現(xiàn)小麥PDS基因沉默，葉片呈現(xiàn)出光漂白現(xiàn)象。本發(fā)明方法簡(jiǎn)便、快捷、高效、低成本、不需要基因轉(zhuǎn)化，且本發(fā)明為全株沉默，效率高，方便研究目的基因在各個(gè)組織中功能。(2)這種基于TRV的VIGS法實(shí)現(xiàn)小麥基因沉默的方法也可用于研究其他小麥的基因功能。小麥MLO是一個(gè)負(fù)調(diào)小麥對(duì)白粉菌抗性的基因，小麥基因組有三個(gè)拷貝分別位于A、B、D基因組上，將三個(gè)拷貝同時(shí)突變會(huì)使小麥對(duì)白粉病感病變?yōu)榭共?，本發(fā)明同時(shí)對(duì)MLO的三個(gè)拷貝進(jìn)行沉默，并檢測(cè)對(duì)多拷貝基因同時(shí)沉默的效果，結(jié)果表明，本發(fā)明的方法方便快捷、基因沉默效果一目了然。附圖說(shuō)明圖1小麥PDS基因TaPDS和番茄PDS基因SlPDS片段相似度比對(duì)結(jié)果；圖2TRV介導(dǎo)的番茄PDS基因沉默的小麥培養(yǎng)16天的表型；圖3半定量檢測(cè)沉默小麥植株中PDS基因表達(dá)水平；圖4不同參數(shù)下TRV誘導(dǎo)玉米基因沉默效果；圖5TaMLO-A1,TaMLO-B1和TaMLO-D1三個(gè)基因片段序列相似度比對(duì)結(jié)果；圖6同時(shí)沉默小麥MLO的三個(gè)拷貝后的小麥表型與未沉默的小麥的表型對(duì)比圖。具體實(shí)施方式下面通過(guò)實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，其目的在于更好理解本
發(fā)明內(nèi)容而非限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)試驗(yàn)條件，若Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，或按照制造廠商說(shuō)明書建議的條件。實(shí)施例實(shí)施例1沉默小麥PDS基因一種小麥整株TRV載體介導(dǎo)病毒誘導(dǎo)基因沉默方法：原料來(lái)源：小麥品種為小堰22；(試驗(yàn)采用萌發(fā)的小麥種子的培養(yǎng)條件為：19-21℃，光照強(qiáng)度為150μmol·m-2·s-1，光周期為16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗，相對(duì)濕度為55％，培養(yǎng)至芽長(zhǎng)3mm。)；所用載體：VIGS實(shí)驗(yàn)所用沉默載體為煙草脆裂病毒(TRV)的RNA1和RNA2cDNA的雙元表達(dá)載體，分別為TRV1和TRV2，由劍橋大學(xué)DavidBaulcombe教授和清華大學(xué)劉玉樂(lè)教授饋贈(zèng)。pTRV1載體包括編碼RNA依賴的RNA聚合酶、運(yùn)動(dòng)蛋白和16kD蛋白的基因，是VIGS體系的輔助病毒載體。pTRV2載體包括衣殼蛋白(Cp)基因、多克隆位點(diǎn)(MCS)等，用于目的基因的構(gòu)建。具體步驟如下：步驟(1)：取小麥種子50粒(用發(fā)芽的小麥種子，后續(xù)小麥PDS基因的沉默效率最好，詳見(jiàn)圖4a)，用有效氯為1％次氯酸鈉消毒液進(jìn)行種子消毒，備用；步驟(2)：用基因工程的方法將擴(kuò)增后的番茄八氫番茄紅素脫氫酶(下稱：番茄PDS)基因片段連接到TRV病毒誘導(dǎo)基因沉默載體pTRV2中，得到pTRV-SlPDS；具體步驟如下：cDNA合成：按TaKaRa提取試劑盒操作說(shuō)明提取番茄的總RNA，以1μg的總RNA做模板，按照TaKaRacDNA合成試劑盒操作說(shuō)明合成cDNA的第一鏈，然后稀釋10倍備用；PDS基因擴(kuò)增：設(shè)計(jì)引物，上游引物5’-CGGGGTACCGGCACTCAACTTTATAAACC-3’和下游引物5’-CGGGGATCCTTCAGTTTTCTGTCAAACC-3’，PCR產(chǎn)物為409-bp。以番茄的cDNA第一鏈為模板、用KAPAHiFiPCRKits，50μL體系進(jìn)行擴(kuò)增；擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性3min；30個(gè)循環(huán)的98℃變性20s，60℃退火20s，72℃延伸30s；72℃后延伸5min，4℃保存；PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)為單一條帶，純化后備用；番茄PDS經(jīng)PCR擴(kuò)增后所得的番茄PDS基因片段與小麥PDS基因TaPDS的相似度為76.53％，詳見(jiàn)圖1；pTRV-SlPDS基因沉默載體的構(gòu)建：純化后的PCR基因片段，經(jīng)KpnI-BamHI雙酶切后，與經(jīng)KpnI-BamHI雙酶切的pTRV2質(zhì)粒用T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有50mg/LKan抗生素的LB平板培養(yǎng)基，37℃倒置過(guò)夜培養(yǎng)，長(zhǎng)出單克隆，挑取單克隆至含有50mg/LKan抗生素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃，250轉(zhuǎn)每分鐘震蕩培養(yǎng)12小時(shí)，提取質(zhì)粒，驗(yàn)證正確后備用；步驟(3)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化及培養(yǎng)：將驗(yàn)證正確的pTRV-SlPDS、pTRV2(空載，起對(duì)照作用)以及pTRV1質(zhì)粒分別用液氮凍融法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞中，所述的液氮凍融法具體方法為：取農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，冰上融化，加入200納克待轉(zhuǎn)質(zhì)粒，冰浴30分鐘，液氮速凍2分鐘，37℃水浴鍋水浴2分鐘，冰浴2分鐘，加入到800微升無(wú)抗LB液體培養(yǎng)基，28℃180轉(zhuǎn)每分鐘震蕩培養(yǎng)3小時(shí)，涂布于含有50mg/LKna和50mg/LRif抗生素的固體LB培養(yǎng)基上，28℃倒置避光培養(yǎng)3天長(zhǎng)出單克??；挑取單克隆于含有50mg/LKan和50mg/LRif抗生素的液體LB培養(yǎng)基中，28℃200轉(zhuǎn)每分鐘震蕩培養(yǎng)24小時(shí)，經(jīng)菌液PCR鑒定正確后，得到含有質(zhì)粒pTRV1、pTRV2和pTRV-SlPDS農(nóng)桿菌GV3101陽(yáng)性菌株，記為TRV1、TRV2和TRV-SlPDS，保菌備用；將含有TRV1、TRV2、TRV-SlPDS質(zhì)粒的農(nóng)桿菌GV3101菌液，分別在含有相應(yīng)抗生素的LB平板培養(yǎng)基上劃線，28℃倒置避光培養(yǎng)3天長(zhǎng)出單克?。惶羧慰寺》庞?ml含有相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，用50ml離心管在28℃、200轉(zhuǎn)每分鐘條件下，震蕩培養(yǎng)24小時(shí)；將TRV1與TRV2以1：1混合(空載，起對(duì)照作用)，TRV1與TRV-SlPDS以1:1混合，分別按1:100轉(zhuǎn)接到20ml相同的LB培養(yǎng)基中，在100ml三角瓶中繼續(xù)培養(yǎng)到菌液的OD600＝0.04-1.5(OD600最優(yōu)值是0.3，參見(jiàn)圖4d)，并調(diào)整兩個(gè)三角瓶中的菌液的OD600值相同；步驟(4)配制轉(zhuǎn)化菌液：向步驟(3)所得的菌液中加入乙酰丁香酮(AS)終濃度為19.62mg·L-1、半胱氨酸(Cys)終濃度為400mg·L-1和吐溫20(Tween20)終濃度為5ml·L-1，(采用乙酰丁香酮、半胱氨酸和吐溫20的混合液培養(yǎng)效果最佳，圖4表示不同參數(shù)下，TRV誘導(dǎo)小麥基因沉默效果，圖4b表示：不同組分侵染液對(duì)基因沉默效率的影響，結(jié)果顯示：采用乙酰丁香酮、半胱氨酸和吐溫20的混合液培養(yǎng)效果最佳，混合液中，乙酰丁香酮，終濃度為19.62mg·L-1；半胱氨酸，終濃度為400mg·L-1；吐溫20，終濃度為5ml·L-1)，均勻混合得到含TRV1與TRV2的轉(zhuǎn)化菌液和含TRV1與TRV-SlPDS的轉(zhuǎn)化菌液，放置于超凈工作臺(tái)中備用；步驟(5)小麥種子侵染：將等量的處理過(guò)的小麥種子分別放入帶橡膠塞的10ml玻璃瓶中，記為玻璃瓶1和2，玻璃瓶1中加入5ml含TRV1與TRV2的轉(zhuǎn)化菌液(起對(duì)照作用)，玻璃瓶2中加入5ml含TRV1與TRV-SlPDS的轉(zhuǎn)化菌液，使種子完全浸泡在轉(zhuǎn)化菌液中；用20ml注射器對(duì)玻璃瓶抽真空，每次保持15秒，操作1～2次(利用注射器抽真空能非常有效的輔助侵染，真空處理每次15s，兩次即總時(shí)間30秒沉默效率最高(參見(jiàn)圖4C))；最后，分別將玻璃瓶1、玻璃瓶2中的小麥種子和轉(zhuǎn)化菌液倒入步驟(4)相應(yīng)的剩余轉(zhuǎn)化菌液中，在28℃、200轉(zhuǎn)每分鐘下過(guò)夜培養(yǎng)0-25小時(shí)(侵染效果最好的是和農(nóng)桿菌共培養(yǎng)15h，參見(jiàn)圖4e)；培養(yǎng)結(jié)束，超凈臺(tái)用無(wú)菌水清洗干凈，將經(jīng)TRV1與TRV2轉(zhuǎn)化菌液侵染過(guò)的小麥和經(jīng)TRV1與TRV-SlPDS轉(zhuǎn)化菌液侵染過(guò)的小麥清洗干凈，分別轉(zhuǎn)接到相同的固體MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件為：19-22℃，光照強(qiáng)度為150μmol·m-2·s-1，光周期為16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗，相對(duì)濕度為55％，培養(yǎng)兩天，移栽至土壤中繼續(xù)生長(zhǎng)，兩周后觀察表型，提取RNA，進(jìn)一步鑒定。結(jié)果分析：1.對(duì)經(jīng)TRV1與TRV21：1混合侵染過(guò)的小麥種子(起對(duì)照作用)和經(jīng)TRV1與TRV-SlPDS1：1混合侵染過(guò)的小麥種子清洗干凈，分別轉(zhuǎn)接到相同的固體MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件為：19-22℃，光照強(qiáng)度為150μmol·m-2·s-1，光周期為16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗，相對(duì)濕度為55％，培養(yǎng)至長(zhǎng)出葉片，移栽至土壤中繼續(xù)生長(zhǎng)兩周后觀察表型，結(jié)果如圖2所示(A、本實(shí)驗(yàn)使用的萌發(fā)的小麥種子；B、真空輔助攜帶病毒質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染小麥種子；C-E、對(duì)照處理小麥種子萌發(fā)16天后的表型(經(jīng)TRV1與TRV21：1混合侵染過(guò)的小麥種子)；F-H、經(jīng)含有PDS基因片段TRV載體(TRV1,TRV-SlPDS)的農(nóng)桿菌侵染后的小麥種子萌發(fā)兩周后的表型；I、本實(shí)驗(yàn)使用的小麥種子；J-L、經(jīng)含有PDS基因片段TRV載體(TRV1,TRV-SlPDS)的農(nóng)桿菌侵染后的小麥種子萌發(fā)20天后的表型。標(biāo)尺A圖和I圖為6.25mm，B圖為14.41mm，D、G和L圖為4.96mm，E、H和K圖為3.94mm，C、F和J圖為1.49cm)，如圖中所示，經(jīng)TRV1與TRV21：1混合侵染過(guò)的小麥種子，萌發(fā)16天后長(zhǎng)勢(shì)良好，葉子呈綠色或黃綠色，表示控制其葉綠素合成的基因未沉默；經(jīng)TRV1與TRV-SlPDS1：1混合侵染過(guò)的小麥種子，萌發(fā)兩周后，葉子呈白色，產(chǎn)生光漂白現(xiàn)象，表示控制其葉綠素合成的PDS基因沉默；由此可知，小麥種子經(jīng)TRV載體介導(dǎo)番茄PDS病毒基因侵染后，控制其葉綠素合成的PDS基因沉默。2.按照TaKaRa提取試劑盒提取經(jīng)TRV1與TRV21：1混合侵染過(guò)的小麥萌發(fā)兩周后的植株和經(jīng)TRV1與TRV-SlPDS1：1混合侵染過(guò)的小麥萌發(fā)兩周的植株的總RNA。以1μg提的總RNA做模板，按照cDNA合成試劑盒(TaKaRa)操作說(shuō)明合成第一鏈cDNA，然后稀釋10倍備用。采用半定量RT-PCR方法檢測(cè)沉默植株中PDS基因轉(zhuǎn)錄本的沉默效果。小麥Actin基因(GenBank登錄號(hào)AB181991.1或者KC775780.1)為內(nèi)參基因，半定量RT-PCR檢測(cè)小麥PDS基因(登錄號(hào)FJ517553.1)的表達(dá)水平，引物序列(TaActin：5’-GATACACGCTTCCTCATGCTATCC-3’和5’-AGAGCCACCGATCCAGACACTG-3’TaPDS:5’-TATTTGAGTCCCATCAGTAA-3’和5’-ACAGCCGTTTTGATTTCC-3’)。PCR所用試劑為Taq酶預(yù)混液(2×TaqPCRStarMixwithLoadingDye，購(gòu)于北京康潤(rùn)科技有限公司)，20μl體系，按照說(shuō)明書配制，PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3min；28-36個(gè)循環(huán)的95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s；72℃延伸5min，4℃保存，陽(yáng)性克隆菌液提質(zhì)粒備用；為了避免PCR產(chǎn)物量到達(dá)平臺(tái)期對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，按照上述條件進(jìn)行28、30、32、34和36個(gè)不同循環(huán)數(shù)的擴(kuò)增，采用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果如圖3所示：與內(nèi)參基因相比較，經(jīng)TRV1與TRV-SlPDS1：1混合侵染過(guò)的小麥萌發(fā)兩周的植株的根部和莖部，小麥PDS基因的表達(dá)量顯著降低。不同條件對(duì)TRV誘導(dǎo)小麥基因沉默效率影響，如圖4所示：A表示：侵染小麥種子和萌發(fā)的小麥種子對(duì)沉默效率的影響，侵染萌發(fā)的小麥種子沉默效率顯著高于直接侵染小麥種子；B表示：侵染液不同組分對(duì)基因沉默效率的影響，所用幾種組分均為必需組分；C表示：真空處理時(shí)間對(duì)基因沉默效率的影響，30s達(dá)到最高沉默效率；D表示：侵染所用農(nóng)桿菌O.D600.值對(duì)基因沉默效率的影響，O.D.600＝0.3時(shí)效果最好；E表示：和農(nóng)桿菌共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)基因沉默效率的影響，共培養(yǎng)15h最佳。結(jié)果表明：受體為萌發(fā)的小麥種子，用含有組分2所有試劑配制的侵染液，在農(nóng)桿菌O.D.600＝0.3時(shí)，抽真空侵染30s，侵染后共培養(yǎng)15h得到的沉默效率最高。實(shí)施例2同時(shí)沉默小麥MLO-A1，MLO-B1和MLO-D1MLO是小麥對(duì)白粉病抗性的負(fù)調(diào)基因，小麥MLO-A1，MLO-B1和MLO-D1分別位于小麥的A、B和D基因組上，序列高度相似，功能冗余，沉默或敲出任何一個(gè)或兩個(gè)基因均不能顯著影響小麥對(duì)白粉病的抗病性，只有同時(shí)沉默MLO-A1，MLO-B1和MLO-D1才能顯著增強(qiáng)小麥對(duì)白粉病的抗病性。本實(shí)施例利用小麥整株TRV載體介導(dǎo)病毒誘導(dǎo)基因沉默方法，同時(shí)沉默小麥MLO-A1，MLO-B1和MLO-D1，并通過(guò)觀察小麥抗病表型來(lái)證實(shí)MLO同源基因MLO-A1，MLO-B1和MLO-D1被同時(shí)沉默。植物和白粉菌材料：沉默MLO的植物材料同實(shí)施例1。利用本發(fā)明所述的利用小麥整株TRV載體介導(dǎo)病毒誘導(dǎo)基因沉默的方法，沉默小麥MLO基因的具體做法是：步驟(1)：小麥白粉菌小種E18(Blumeriagraminisf.sp.Tritici，BgtisolateE18)生長(zhǎng)在小麥品種京411上，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，19-21℃，光照強(qiáng)度為150μmol·m-2·s-1，光周期為16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗，相對(duì)濕度70％，每周轉(zhuǎn)接一次到新的小麥的幼苗上。步驟(2)TRV-MLO重組載體的構(gòu)建、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化及培養(yǎng)和配制轉(zhuǎn)化菌液：以轉(zhuǎn)接有白粉菌的小麥cDNA為模板擴(kuò)增小麥基因組MLO-B1CDS序列210-668bp的459bp片段(引物序列5’-CCGGAATTCCATCTCGCTGCTGCTCGCCG-3’和5’-CGCGGATCCGTGAGGTAGTCCACCTTGGT-3’)，這段序列在三個(gè)MLO之間高度保守，MLO序列參考(WangY,ChengX,ShanQ,ZhangY,LiuJ,GaoC,QiuJL(2014)Simultaneouseditingofthreehomoeoallelesinhexaploidbreadwheatconfersheritableresistancetopowderymildew.NatBiotechnol32:947-51)，這段序列三個(gè)基因的相似度超過(guò)98％(參見(jiàn)圖5)。PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRI-BamHI雙酶切后構(gòu)建到TRV2載體中，驗(yàn)證正確后用液氮凍融法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞中，記為TRV-MLO(該過(guò)程采用的擴(kuò)增、構(gòu)建重組載體、液氮凍融法以及對(duì)照組試驗(yàn)的設(shè)計(jì)和實(shí)施例1相同)。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化及培養(yǎng)和配制轉(zhuǎn)化菌液，采用的方法同實(shí)施例1，此處不再詳述。步驟(3)小麥白粉菌侵染實(shí)驗(yàn)該實(shí)驗(yàn)共設(shè)計(jì)三組：第一組：(WT)對(duì)未侵染小麥接種白粉菌BgtE18處理；第二組：(TRV)用TRV1-TRV2(空載)轉(zhuǎn)化菌液侵染小麥接種白粉菌BgtE18；第三組：(TRV-MLO)用TRV-MLO轉(zhuǎn)化菌液侵染小麥接種白粉菌BgtE18。取沉默MLO和對(duì)照的小麥植株葉片，平鋪到1％Agar(含有85μmol苯并咪唑)平板上，放置4h以上，低密度接種生長(zhǎng)一周的小麥白粉菌。接種后放置于白粉菌培養(yǎng)箱中3天后進(jìn)行微觀表型分析，接菌后培養(yǎng)7天進(jìn)行宏觀表型觀察。步驟如下：固定：取接菌的小麥葉片放置于固定液(乙醇：醋酸的體積比為1:1)中室溫浸泡24h；脫色，取出固定后的葉片，清水沖洗，放入脫色液(乳酸：甘油：水的體積比為1:1:1)中，室溫脫色48h；染色，取出脫色后的葉片，清水沖洗，用0.6％(w/v)考馬斯亮藍(lán)R250染色5-10s，立即用清水沖洗；顯微鏡觀察，葉片放于載玻片上加一滴50％甘油蓋上蓋玻片，光學(xué)顯微鏡觀察白粉菌菌絲和孢子的發(fā)育情況；結(jié)果如圖6A所示。接種60小時(shí)后小麥白粉菌BgtE18植株上白粉菌孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)顯微觀察，可以看出沉默MLO的葉片和對(duì)照組相比，白粉菌孢子萌發(fā)正常，但是不能正常侵染；(形成菌絲的孢子占總萌發(fā)孢子的比例作為衡量植物抗病的一個(gè)指標(biāo)，數(shù)值越低植株越抗病結(jié)果表明沉默MLO的小麥葉片白粉菌生長(zhǎng)顯著受到抑制而抗病性增強(qiáng))。接菌后培養(yǎng)7天進(jìn)行菌落指數(shù)統(tǒng)計(jì)：結(jié)果如圖6B所示：接種白粉菌BgtE18小麥分別進(jìn)行WT、TRV、TRV-MLO處理后，對(duì)小麥葉片的微菌落指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，每種處理至少統(tǒng)計(jì)2,000個(gè)萌發(fā)的孢子，得出形成菌落的孢子占總萌發(fā)孢子的百分比，四次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果間**P<0.01(t-test)；顯示：沉默MLO的葉片上白粉菌生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制。接菌后培養(yǎng)7天進(jìn)行宏觀表型觀察，結(jié)果如圖6C所示，沉默MLO的葉片和對(duì)照組相比，沉默MLO的植株菌的生長(zhǎng)顯著受到抑制，白粉菌孢子不能形成菌落，未經(jīng)病毒侵染和空載體(TRV)侵染的植株白粉菌生長(zhǎng)正常，可見(jiàn)白色菌落(圖6C)。結(jié)果表明MLO的MLO-A，MLO-B和MLO-D被同時(shí)沉默。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3