本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的耐鹽椒樣薄荷莖段轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。

背景技術(shù)：

椒樣薄荷(Mentha piperita L.)是唇形科薄荷屬多年生草本植物，別名歐洲薄荷、胡椒薄荷、黑薄荷，系水薄荷(Mentha aquatica)和綠薄荷(Mentha spicata)雜交而成的六倍體不育系，至今已有250年。原產(chǎn)于歐洲，我國(guó)20世紀(jì)開(kāi)始引進(jìn)，目前在新疆和陜西有小規(guī)模種植。椒樣薄荷作為廣泛種植的精油作物之一，薄荷精油為其最主要產(chǎn)品，主要含薄荷酮、薄荷醇、乙酸薄荷酯等118種成分，香氣純正，清爽宜人，廣泛用于日用化妝品、醫(yī)藥和食品行業(yè)。

山東省應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室篩選出1種可在黃河三角洲地區(qū)大規(guī)模推廣種植耐鹽椒樣薄荷，并經(jīng)過(guò)品種審定命名為“科院1號(hào)”。該耐鹽椒樣薄荷能夠耐受0.8％NaCl脅迫，并具有很好的脫鹽效果。

農(nóng)桿菌(Agrobacterium)是一類生活在植物根的表面，依靠根組織滲透出來(lái)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)生存的，普遍存在于土壤中的革蘭氏陰性細(xì)菌。農(nóng)桿菌具有天然感染植物細(xì)胞的能力，可以誘發(fā)植物冠癭瘤。農(nóng)桿菌中存在一種巨大質(zhì)粒，稱為T(mén)i質(zhì)粒。Ti質(zhì)?？梢宰鳛橥庠椿虻妮d體，介導(dǎo)外源基因的轉(zhuǎn)化。目前農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化已經(jīng)廣泛應(yīng)用于雙子葉植物和單子葉植物中，應(yīng)用的農(nóng)桿菌主要為根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌兩種。

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的方法主要有整體植株接種共感染法和葉盤(pán)轉(zhuǎn)化法。葉盤(pán)轉(zhuǎn)化法是由Horsch等發(fā)展起來(lái)的一種轉(zhuǎn)化方法，其操作方法是首先用打孔器從消毒葉片上取得葉圓片，亦稱之葉盤(pán)。后來(lái)這一共培養(yǎng)系統(tǒng)被廣泛用于愈傷組織、細(xì)胞、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞、莖切段、子葉切片、下胚軸切段等離體材料的轉(zhuǎn)化。目前，椒樣薄荷的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化多采用的是葉盤(pán)法，外植體主要為葉片。本研究室對(duì)獲得的耐鹽椒樣薄荷的體外再生體系進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，以葉片作為外植體建立再生體系比較困難，葉片容易褐化且分化效率較低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明就是針對(duì)上述存在的缺陷而提供農(nóng)桿菌介導(dǎo)的耐鹽椒樣薄荷莖段轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，具體為種使用耐鹽椒樣薄荷含芽莖段為外植體的外源基因轉(zhuǎn)化方法。相較于葉片含有腋芽的莖段分化和獲得再生植株都較容易，可以用來(lái)作為農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的外植體。

本發(fā)明的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的耐鹽椒樣薄荷莖段轉(zhuǎn)化系統(tǒng)技術(shù)方案為，步驟包括：

(1)耐鹽椒樣薄荷莖段預(yù)培養(yǎng)；

(2)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的外源基因轉(zhuǎn)化；

(3)共培養(yǎng)；

(4)叢生芽再生與抗生素篩選；

(5)生根誘導(dǎo)和陽(yáng)性植株檢測(cè)。

步驟(1)所用耐鹽椒樣薄荷莖段為含腋芽莖段，并用無(wú)菌刀片在腋芽處輕輕劃幾刀，使其具有損傷易于轉(zhuǎn)化和叢生芽分化，然后將莖段放入預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基中黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)3天。

預(yù)培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為：MS+3.0mg/L 6-BA(6-芐氨基腺嘌呤)+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH5.8。

步驟(2)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的外源基因轉(zhuǎn)化的方法是：將預(yù)培養(yǎng)的耐鹽椒樣薄荷莖段置于用轉(zhuǎn)化液重懸的農(nóng)桿菌菌液中，菌液調(diào)整OD₆₀₀為0.6-0.8，抽真空10-15min，然后黑暗條件下30℃，200r/min震蕩培養(yǎng)30min。

所述轉(zhuǎn)化液為：0.2MS+0.5g/L MES(2-(N-嗎啡啉)乙磺酸)+30mg/L AS(乙酰丁香酮)+1％葡萄糖+2％蔗糖，pH 5.4。

步驟(3)的方法為：抽真空轉(zhuǎn)化的耐鹽椒樣薄荷莖段置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，25±3℃暗培養(yǎng)3-4d。

共培養(yǎng)培養(yǎng)基為：MS+30mg/L AS(乙酰丁香酮)+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH 5.8。

步驟(4)叢生芽再生與抗生素篩選的方法為：共培養(yǎng)的耐鹽椒樣薄荷莖段用無(wú)菌水清洗后，轉(zhuǎn)至添加頭孢和篩選標(biāo)記抗生素的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)叢生芽再生。

叢生芽再生和篩選和培養(yǎng)基為：MS+3mg/L 6-BA(6-芐氨基腺嘌呤)+0.2mg/L NAA(萘乙酸)+200mg/L頭孢+抗生素+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH 5.8。

步驟(5)所述生根誘導(dǎo)和陽(yáng)性植株檢測(cè)中，生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：1/2MS+0.2mg/L NAA(萘乙酸)+10g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH 5.8，陽(yáng)性植株檢測(cè)為利用基因組DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)。

具體方法為：

(1)椒樣薄荷莖段預(yù)培養(yǎng)：利用“科院1號(hào)”耐鹽椒樣薄荷無(wú)菌苗，剪取長(zhǎng)度大約為1-2cm的莖段，且保證每個(gè)莖段含腋芽，用無(wú)菌刀片在腋芽處輕輕劃幾下，然后將莖段放入預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基中黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)3天。預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基為：MS+3.0mg/L 6-BA(6-芐氨基腺嘌呤)+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，PH5.8。

(2)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的外源基因轉(zhuǎn)化：將-80℃保存的含有植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌按1:100接種到含有50mg/L利福平的10ml YEP液體培養(yǎng)基中，30℃，200r/min過(guò)夜震蕩培養(yǎng)，將活化的菌液再按照1:50接種到含有50mg/L利福平的50ml YEP液體培養(yǎng)基中，30℃，200r/min震蕩培養(yǎng)16-18h。將活化的菌液置于滅菌的50mL離心管中，5000rpm，離心5min，收集菌體，用轉(zhuǎn)化液重懸菌體，5000rpm離心5min，洗滌菌體，然后再次用轉(zhuǎn)化液重懸菌體，調(diào)整OD600為0.6-0.8,加30mg/L AS(乙酰丁香酮)，備用。將預(yù)培養(yǎng)3天的耐鹽椒樣薄荷莖段置于重懸好的農(nóng)桿菌菌液中，抽真空10-15min，然后黑暗條件下30℃，200r/min震蕩培養(yǎng)30min。其中轉(zhuǎn)化液為：0.2MS+0.5g/L MES(2-(N-嗎啡啉)乙磺酸)+1％葡萄糖+2％蔗糖，PH 5.4。

(3)共培養(yǎng)：將耐鹽椒樣薄荷莖段從農(nóng)桿菌菌液中取出，用無(wú)菌的濾紙吸去表面殘留的菌液，置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，25±3℃暗培養(yǎng)3-4d。共培養(yǎng)培養(yǎng)基為：MS+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，PH 5.8，使用前加入AS(乙酰丁香酮)至30mg/L。

(4)叢生芽再生與抗生素篩選：共培養(yǎng)完的耐鹽椒樣薄荷莖段用添加100mg/mL頭孢的無(wú)菌水清洗3-4次，用無(wú)菌濾紙吸干多余水，轉(zhuǎn)至叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，25±3℃，16h光照/8h黑暗條件下誘導(dǎo)叢生芽再生。叢生芽再生培養(yǎng)基上添加載體所帶抗性篩選標(biāo)記的抗生素，同時(shí)篩選出陽(yáng)性叢生芽。叢生芽再生培養(yǎng)基：MS+3mg/L 6-BA(6-芐氨基腺嘌呤)+0.2mg/L NAA(萘乙酸)+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，PH 5.8，使用前添加200mg/L頭孢和一定濃度的篩選抗生素。

(5)生根誘導(dǎo)和陽(yáng)性植株檢測(cè)：抗生素篩選獲得的陽(yáng)性叢生芽生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，產(chǎn)生陽(yáng)性植株。從陽(yáng)性植株上剪取2-3片葉片，用CTAB法提取耐鹽椒樣薄荷基因組DNA。利用基因組DNA 進(jìn)行PCR驗(yàn)證植株陽(yáng)性。生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：1/2MS+0.2mg/L NAA(萘乙酸)+10g/L蔗糖+7g/L瓊脂，PH 5.8。

本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明是一種可以運(yùn)用于椒樣薄荷基因轉(zhuǎn)化的體系，相較于葉片含有腋芽的莖段分化和獲得再生植株都較容易，可以用來(lái)作為農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的外植體。適用于多種植物表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化，容易獲得再生植株。

附圖說(shuō)明

圖1所示為實(shí)施例1中植物表達(dá)載體pCAMBIA1304，啟動(dòng)子為CaMV 35S，含有報(bào)告基因mgfp5和gusA，和篩選標(biāo)記潮霉素抗性基因(HYG)；

圖2所示為實(shí)施例1基因組PCR檢測(cè)利用轉(zhuǎn)化液1轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)pCAMBIA1304載體的耐鹽椒樣薄荷再生植株的陽(yáng)性；M：Marker，+為陽(yáng)性對(duì)照pCAMBIA1304載體質(zhì)粒，-為未轉(zhuǎn)化的耐鹽椒樣薄荷作為陰性對(duì)照；

圖3所示為實(shí)施例1基因組PCR檢測(cè)利用轉(zhuǎn)化液2轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)pCAMBIA1304載體的耐鹽椒樣薄荷再生植株的陽(yáng)性；M：Marker，+為陽(yáng)性對(duì)照pCAMBIA1304載體質(zhì)粒，-為未轉(zhuǎn)化的耐鹽椒樣薄荷作為陰性對(duì)照；

圖4所示為實(shí)施例1轉(zhuǎn)pCAMBIA1304載體的耐鹽椒樣薄荷陽(yáng)性植株，GUS染色檢測(cè)；

圖5所示為實(shí)施例2植物表達(dá)載體pB2GW7，啟動(dòng)子為CaMV35S，篩選標(biāo)記基因?yàn)锽ar；

圖6所示為實(shí)施例2基因組PCR檢測(cè)利用轉(zhuǎn)化液1轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)pB2GW7載體的耐鹽椒樣薄荷再生植株的陽(yáng)性；M：Marker，+為陽(yáng)性對(duì)照pB2GW7載體質(zhì)粒，-為未轉(zhuǎn)化的耐鹽椒樣薄荷作為陰性對(duì)照；

圖7所示為實(shí)施例2基因組PCR檢測(cè)利用轉(zhuǎn)化液2轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)pB2GW7載體的耐鹽椒樣薄荷再生植株的陽(yáng)性；M：Marker，+為陽(yáng)性對(duì)照pB2GW7載體質(zhì)粒，-為未轉(zhuǎn)化的耐鹽椒樣薄荷作為陰性對(duì)照。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

以耐鹽椒樣薄荷“科院1號(hào)”莖段為外植體，利用轉(zhuǎn)化含有pCAMBIA1304載體(圖1)的農(nóng)桿菌GV3101進(jìn)行轉(zhuǎn)化，陽(yáng)性植株利用基因組PCR進(jìn)行檢測(cè)，并進(jìn)行GUS染色驗(yàn)證。

(1)椒樣薄荷莖段預(yù)培養(yǎng)

利用實(shí)驗(yàn)室已有的耐鹽椒樣薄荷無(wú)菌苗，去掉莖部葉片，用無(wú)菌剪刀剪成長(zhǎng)度大約為1-2cm的含腋芽的莖段，用無(wú)菌刀片在腋芽處輕輕劃幾刀，暴露損傷部位，然后將莖段放入預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基中，用鋁箔紙包裹平皿，25±3℃黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)3天。預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基為：MS+3.0mg/L 6-BA(6-芐氨基腺嘌呤)+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，PH5.8。

(2)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的外源基因轉(zhuǎn)化

將-80℃保存的含有植物表達(dá)載體pCAMBIA1304的農(nóng)桿菌GV3101按1:100接種到含有50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的10ml YEP液體培養(yǎng)基中，30℃，200r/min過(guò)夜震蕩培養(yǎng)，將活化的菌液再按照1:50接種到含有50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的50ml YEP液體培養(yǎng)基中，30℃，200r/min震蕩培養(yǎng)16-18h。將活化的菌液置于滅菌的50mL離心管中，5000rpm，離心5min，收集菌體，用轉(zhuǎn)化液重懸菌體，5000rpm離心5min，洗滌菌體，然后再次用轉(zhuǎn)化液重懸菌體，調(diào)整OD600為0.6-0.8,加入30mg/L AS(乙酰丁香酮),備用。轉(zhuǎn)化液選用兩種分別為：轉(zhuǎn)化液1：0.1MS+0.5g/L MES(2-(N- 嗎啡啉)乙磺酸)+1％葡萄糖+2％蔗糖，PH 5.4；轉(zhuǎn)化液2：0.2MS+0.5g/L MES(2-(N-嗎啡啉)乙磺酸)+1％葡萄糖+2％蔗糖，PH 5.4，從中選擇最合適的配方。

將預(yù)培養(yǎng)3天的耐鹽椒樣薄荷莖段置于重懸的農(nóng)桿菌菌液中，抽真空10-15min，然后黑暗條件下30℃，200r/min震蕩培養(yǎng)30min。

(3)共培養(yǎng)

將抽真空轉(zhuǎn)化的耐鹽椒樣薄荷莖段從農(nóng)桿菌菌液中取出，用無(wú)菌濾紙吸去表面殘留的菌液，置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，25±3℃暗培養(yǎng)3-4d。共培養(yǎng)培養(yǎng)基為：MS+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，PH 5.8，使用前加入AS(乙酰丁香酮)至30mg/L。

(4)叢生芽再生與抗生素篩選

共培養(yǎng)完的耐鹽椒樣薄荷莖段用添加100mg/mL頭孢的無(wú)菌水清洗3-4次，用無(wú)菌濾紙吸干多余水，轉(zhuǎn)至添加200mg/L頭孢和50mg/L潮霉素的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，25±3℃，16h光照/8h黑暗條件下誘導(dǎo)叢生芽再生。叢生芽再生培養(yǎng)基：MS+3mg/L 6-BA(6-芐氨基腺嘌呤)+0.2mg/L NAA(萘乙酸)+200mg/L頭孢+50mg/L潮霉素+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，PH 5.8。

(5)生根誘導(dǎo)和陽(yáng)性植株檢測(cè)

抗生素篩選獲得的陽(yáng)性叢生芽在生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，產(chǎn)生陽(yáng)性植株。生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：1/2MS+0.2mg/L NAA(萘乙酸)+10g/L蔗糖+7g/L瓊脂，PH 5.8。

植株生長(zhǎng)至7-8個(gè)葉時(shí)，從植株上剪取2-3片葉片，用CTAB法提取耐鹽椒樣薄荷基因組DNA。CTAB法提取基因組DNA方法為：

①耐鹽椒樣薄荷葉片用液氮研磨后，將粉末放入1.5mL離心管中，加入600μL預(yù)熱(65℃)的1×CTAB提取液，混勻后，65℃水浴1-1.5h，期間不時(shí)上下顛倒混勻。

②冷卻至室溫后，向離心管中加入等體積的酚：氯仿：異戊醇(體積比為25:24:1)，混勻后，12000rpm離心15min。

③轉(zhuǎn)移上清液至新的1.5mL離心管中，在加入等體積的氯仿：異戊醇(體積比為24：1)，混勻后，12000rpm離心15min。

④上清液轉(zhuǎn)至新的離心管，加入等體積的預(yù)冷的異丙醇，混勻后，-20℃條件靜置2h，12000rpm離心10min，棄上清液。

⑤用70％乙醇清洗沉淀3次，6000rpm，離心5min，然后倒掉乙醇，空離心1min。吸去試管底部殘余乙醇，室溫晾干。

⑥按1:1000將RNase A(100mg/mL)加入ddH2O中，用50-100μL溶解基因組DNA，備用。

利用基因組DNA為模板，35S引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證植株陽(yáng)性。所用引物序列為：

35SF TGTAGAGAGAGACTGGTGATTTCAG

35SR TATTGGCTAGAGCAGCTTGCCA

PCR反應(yīng)體系為：

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?/p>

94℃5min；94℃30sec，55℃30sec，72℃2min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物用1％的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)(圖2，圖3)。

結(jié)果顯示：用兩種轉(zhuǎn)化液分別轉(zhuǎn)化150個(gè)莖段，用轉(zhuǎn)化液1轉(zhuǎn)化的莖段分化叢生芽數(shù)為198，用抗生素篩選獲得植株數(shù)目為16，利用基因組PCR檢測(cè)陽(yáng)性植株為7株，轉(zhuǎn)化率為3.54％；用轉(zhuǎn)化液2轉(zhuǎn)化的莖段分化從發(fā)芽數(shù)目為236，用抗生素篩選獲得植株24株，PCR檢測(cè)陽(yáng)性植株為16株，轉(zhuǎn)化率為6.78％。用轉(zhuǎn)化液2的轉(zhuǎn)化率明顯高于轉(zhuǎn)化液1。如表1所示：

表1

篩選的陽(yáng)性植株進(jìn)行GUS染色驗(yàn)證，GUS染色方法為：

(1)取材，固定：剪取轉(zhuǎn)基因耐鹽椒樣薄荷植株的莖段，加-20℃保存的90％丙酮，沒(méi)過(guò)材料即可，冰上放置20min。

(2)漂洗：用漂洗液(0.1M磷酸鈉緩沖液，2.5mM K3Fe(CN)6，2.5mM K4Fe(CN)6)漂洗三次。

(3)染色：加入X-Gluc染色液(100mg X-Gluc用9.58mLDMSO溶解，溶解液200μL加入5mL漂洗液即為染色液)，抽真空5min，37℃染色2h以上。

GUS染色結(jié)果顯示，PCR檢測(cè)獲得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株能夠進(jìn)行GUS染色(圖4)，確定含植物表達(dá)載體pCAMBIA1304的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化耐鹽椒樣薄荷莖段成功。并且合適的轉(zhuǎn)化液為轉(zhuǎn)化液2：轉(zhuǎn)化液2：0.2MS+0.5g/L MES(2-(N-嗎啡啉)乙磺酸)+1％葡萄糖+2％蔗糖，PH 5.4。

實(shí)施例2

以耐鹽椒樣薄荷“科院1號(hào)”莖段為外植體，利用轉(zhuǎn)化含有pB2GW7載體(圖5)的農(nóng)桿菌GV3101進(jìn)行轉(zhuǎn)化，陽(yáng)性植株利用基因組PCR進(jìn)行檢測(cè)。

(1)椒樣薄荷莖段預(yù)培養(yǎng)

利用實(shí)驗(yàn)室已有的耐鹽椒樣薄荷無(wú)菌苗，去掉莖部葉片，用無(wú)菌剪刀剪成長(zhǎng)度大約為1-2cm的含腋芽的莖段，用無(wú)菌刀片在腋芽處輕輕劃幾刀，暴露損傷部位，然后將莖段放入預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基中，25±3℃黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)3天。預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基為：MS+3.0mg/L 6-BA(6-芐氨基腺嘌呤)+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，PH5.8。

(2)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的外源基因轉(zhuǎn)化

將-80℃保存的含有植物過(guò)表達(dá)載體pB2GW7的農(nóng)桿菌GV3101按1:100接種到含有50mg/L利福平和100mg/L壯觀霉素的10ml YEP液體培養(yǎng)基中，30℃，200r/min過(guò)夜震蕩培養(yǎng)，將活化的菌液再按照1:50接種到含有50mg/L利福平和100mg/L壯觀霉素的50ml YEP液體培養(yǎng)基中，30℃，200r/min震蕩培養(yǎng)16-18h。將活化的菌液置于滅菌的50mL離心管中，5000rpm，離心5min，收集菌體，用轉(zhuǎn)化液重懸菌體，5000rpm離心5min，洗滌菌體，然后再次用轉(zhuǎn)化液重懸菌體，調(diào)整OD600為0.6-0.8,加入30mg/L AS(乙酰丁香酮),備用。轉(zhuǎn)化液選用兩種分別為：轉(zhuǎn)化液1：0.1MS+0.5g/L MES(2-(N-嗎啡啉)乙磺酸)+1％葡萄糖+2％蔗糖，PH 5.4；轉(zhuǎn)化液2：0.2MS+0.5g/L MES(2-(N-嗎啡啉)乙磺酸)+1％葡萄糖+2％蔗糖，PH 5.4，從中選擇最合適的配方。

將預(yù)培養(yǎng)3天的耐鹽椒樣薄荷莖段置于重懸的農(nóng)桿菌菌液中，抽真空10-15min，然后黑暗條件下30℃，200r/min震蕩培養(yǎng)30min。

(3)共培養(yǎng)

將抽真空轉(zhuǎn)化的耐鹽椒樣薄荷莖段從農(nóng)桿菌菌液中取出，用無(wú)菌濾紙吸去表面殘留的菌液，置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，25±3℃暗培養(yǎng)3-4d。共培養(yǎng)培養(yǎng)基為：MS+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，PH 5.8，使用前加入AS(乙酰丁香酮)至30mg/L。

(4)叢生芽再生與抗生素篩選

共培養(yǎng)完的耐鹽椒樣薄荷莖段用添加100mg/mL頭孢的無(wú)菌水清洗3-4次，用無(wú)菌濾紙吸干多余水，轉(zhuǎn)至添加200mg/L頭孢和0.125‰的Bar的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，25±3℃，16h光照/8h黑暗條件下誘導(dǎo)叢生芽再生。叢生芽再生培養(yǎng)基：MS+3mg/L 6-BA(6-芐氨基腺嘌呤)+0.2mg/L NAA(萘乙酸)+200mg/L頭孢+0.125‰的Bar+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂，PH 5.8。

(5)生根誘導(dǎo)和陽(yáng)性植株檢測(cè)

抗生素篩選獲得的陽(yáng)性叢生芽在生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，產(chǎn)生陽(yáng)性植株。生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：1/2MS+0.2mg/L NAA(萘乙酸)+10g/L蔗糖+7g/L瓊脂，PH 5.8。

植株生長(zhǎng)至7-8個(gè)葉時(shí)，從植株上剪取2-3片葉片，用CTAB法提取耐鹽椒樣薄荷基因組DNA。CTAB法提取基因組DNA方法為：

①耐鹽椒樣薄荷葉片用液氮研磨后，將粉末放入1.5mL離心管中，加入600μL預(yù)熱(65℃)的1×CTAB提取液，混勻后，65℃水浴1-1.5h，期間不時(shí)上下顛倒混勻。

②冷卻至室溫后，向離心管中加入等體積的酚：氯仿：異戊醇(體積比為25:24:1)，混勻后，12000rpm離心15min。

③轉(zhuǎn)移上清液至新的1.5mL離心管中，在加入等體積的氯仿：異戊醇(體積比為24：1)，混勻后，12000rpm離心15min。

④上清液轉(zhuǎn)至新的離心管，加入等體積的預(yù)冷的異丙醇，混勻后，-20℃條件靜置2h，12000rpm離心10min，棄上清液。

⑤用70％乙醇清洗沉淀3次，6000rpm，離心5min，然后倒掉乙醇，空離心1min。吸去試管底部殘余乙醇，室溫晾干。

⑥按1:1000將RNase A(100mg/mL)加入ddH2O中，用50-100μL溶解基因組DNA，備用。

利用基因組DNA為模板，35S引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證植株陽(yáng)性。所用引物序列為：

35SF TGTAGAGAGAGACTGGTGATTTCAG

35SR TATTGGCTAGAGCAGCTTGCCA

PCR反應(yīng)體系為：

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?/p>

94℃5min；94℃30sec，55℃30sec，72℃2min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物用1％的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)(圖6，圖7)。

結(jié)果顯示：用轉(zhuǎn)化液1轉(zhuǎn)化的莖段數(shù)為68，分化叢生芽數(shù)為98，用抗生素篩選獲得植株數(shù)目為8，利用基因組PCR檢測(cè)陽(yáng)性植株為5 株，轉(zhuǎn)化率為5.10％；用轉(zhuǎn)化液2轉(zhuǎn)化的莖段數(shù)為50，分化從發(fā)芽數(shù)目為86，用抗生素篩選獲得植株12株，PCR檢測(cè)陽(yáng)性植株為7株，轉(zhuǎn)化率為8.14％。用轉(zhuǎn)化液2的轉(zhuǎn)化率明顯高于轉(zhuǎn)化液1。如表2所示：

表2