本發(fā)明屬于分子生物學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種高效介導(dǎo)T1R3基因過表達(dá)慢病毒載體和慢病毒及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
：味覺功能學(xué)研究表明，甜味主要由味覺細(xì)胞的G蛋白偶聯(lián)受體(Gproteincoupledreceptors，GPCRs)家族所介導(dǎo)，即味覺受體第1家族(tastereceptorfamily1members，T1Rs)。其中T1R2和T1R3是甜味受體，它們以T1R2+T1R3異二聚體的形式發(fā)揮作用，共同對(duì)甜味進(jìn)行識(shí)別。甜味受體在結(jié)合配體后，下游G蛋白被激活，其α亞基與β、γ亞基分離，T1R3亞基進(jìn)入胞漿進(jìn)而激活下游效應(yīng)器，最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高。因此，通過構(gòu)建共表達(dá)T1R2、T1R3和Gα基因的細(xì)胞系，可用鈣流檢測(cè)方法對(duì)甜味物質(zhì)進(jìn)行識(shí)別。構(gòu)建共表達(dá)T1R2、T1R3和Gα基因的細(xì)胞系，需要使用到帶有T1R3基因的過表達(dá)載體?，F(xiàn)有的方法采用的是將整合有T1R3基因的質(zhì)粒載體通過脂質(zhì)體對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，但是脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染質(zhì)粒載體的轉(zhuǎn)染效率較低，要構(gòu)建能穩(wěn)定共表達(dá)T1R2、T1R3和Gα三種基因的細(xì)胞系成功率也較低。因此，如何提高T1R3基因過表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染效率是目前亟需解決的問題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種T1R3基因過表達(dá)慢病毒載體、慢病毒、宿主細(xì)胞及其構(gòu)建方法。該方法所構(gòu)建的慢病毒載體，轉(zhuǎn)染效率高，并能將T1R3基因整合到宿主細(xì)胞的基因組中，因此能特異、持續(xù)、高效地促進(jìn)T1R3基因在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：一種高效介導(dǎo)T1R3基因過表達(dá)慢病毒載體，以pCDH-CMV-EF1-PURO慢病毒表達(dá)載體為基礎(chǔ)進(jìn)行構(gòu)建，并整合有T1R3基因，得到T1R3基因過表達(dá)慢病毒載體pCDH-CMV-EF1-PURO-T1R3。本發(fā)明還提供上述pCDH-CMV-EF1-PURO-T1R3慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟：步驟(1)，人工合成T1R3基因；步驟(2)，以下列PCR擴(kuò)增引物進(jìn)行T1R3基因的PCR擴(kuò)增：所述的PCR擴(kuò)增引物為：T1R3-F：agattctagagctagcaccaccatggatgctgggccctgctg；T1R3-R：agatccttgcggccgctcactcatgtttcccctg；步驟(3)，用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI分別對(duì)T1R3基因的PCR產(chǎn)物和慢病毒表達(dá)載體pCDH-CMV-EF1-PURO進(jìn)行雙酶切；步驟(4)，用T4DNA連接酶將酶切的得到的線性化的T1R3基因和酶切慢病毒表達(dá)載體得到的產(chǎn)物進(jìn)行連接，將得到的連接液轉(zhuǎn)化EcoliXL1-BLUEMRF’感受態(tài)細(xì)胞，并進(jìn)行PCR鑒定，對(duì)PCR鑒定陽(yáng)性的克隆進(jìn)行測(cè)序和比對(duì)，比對(duì)正確的克隆即為構(gòu)建成功的T1R3基因過表達(dá)慢病毒載體pCDH-CMV-EF1-PURO-T1R3；其中，步驟(4)PCR鑒定采用的PCR擴(kuò)增引物與步驟(2)所采用的PCR擴(kuò)增引物相同。步驟(4)測(cè)序所用引物為：CMV-F：cgcaaatgggcggtaggcgtg；EF13：ccaacttctcggggactgtg；T1R3seq1：accttcccctccttcttc；T1R3seq2：ctctgtctacgcagctgtg。本發(fā)明另外提供一種T1R3慢病毒的構(gòu)建方法，采用上述T1R3基因過表達(dá)慢病毒載體，方法是：使用慢病毒包裝質(zhì)粒pLP/VSVG、pLP1和pLP2對(duì)T1R3基因過表達(dá)慢病毒載體pCDH-CMV-EF1-PURO-T1R3進(jìn)行包裝，通過轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，得到T1R3基因過表達(dá)慢病毒。本發(fā)明還要求保護(hù)上述T1R3慢病毒的構(gòu)建方法構(gòu)建得到的T1R3慢病毒。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其有益效果為：本發(fā)明所構(gòu)建的T1R3基因過表達(dá)慢病毒載體對(duì)宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率高達(dá)80％～90％，比起現(xiàn)有的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染效率提高了1倍以上。此外由于慢病毒能將T1R3基因整合到宿主細(xì)胞的基因組中，因此使用該方法能特異、持續(xù)、高效地促進(jìn)基因T1R3在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)。過表達(dá)T1R3基因的細(xì)胞可用于構(gòu)建共表達(dá)T1R2、T1R3和Gα基因的細(xì)胞系，可用鈣流檢測(cè)方法對(duì)甜味物質(zhì)進(jìn)行識(shí)別。附圖說明圖1是pCDH-CMV-EF1-PURO慢病毒表達(dá)載體圖譜；圖2是pLP/VSVG慢病毒包裝質(zhì)粒圖譜；圖3是pLP1慢病毒包裝質(zhì)粒圖譜；圖4是pLP2慢病毒包裝質(zhì)粒圖譜。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過購(gòu)買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。主要實(shí)驗(yàn)試劑及廠家：1)限制性內(nèi)切酶(Thermoscientific)2)DNA連接酶(Thermoscientific)3)DNA回收試劑盒(美基生物)4)PrimeSTARMaxPremix(2X)(Takara)5)T4DNA連接酶(ThermoScientific)6)EcoliXL1-BLUEMRF’感受態(tài)細(xì)胞(Stratagene)7)FItran：慢病毒包裝專用轉(zhuǎn)染試劑(輝駿生物)8)DMEM完全培養(yǎng)基(含10％FBS、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素)(Gibco)9)TrizolReagent(Ambion)10)BestarTMqPCRRTKit(德國(guó)DBI)11)SybrGreenqPCRmastermix(德國(guó)DBI)pCDH-CMV-EF1-PURO，以及慢病毒包裝質(zhì)粒pLP/VSVG、pLP1和pLP2均可商購(gòu)于廣州輝駿生物科技有限公司。實(shí)施例1：T1R3基因過表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建。1、人工合成T1R3基因，其DNA序列如SEQIDNO.1所示。2、使用PrimeSTAR高保真酶，以人工合成的T1R3基因?yàn)槟０?，通過如表1所示引物進(jìn)行的PCR擴(kuò)增：表1引物名稱引物序列(5’-3’)SEQIDNO.T1R3-Fagattctagagctagcaccaccatggatgctgggccctgctg2T1R3-Ragatccttgcggccgctcactcatgtttcccctg3PCR反應(yīng)體系與條件如表2：表2試劑體積模板1μL上游引物(10μM)1μL下游引物(10μM)1μLPrimeSTARMax(2x)10μLddH2O7μL總體積20μLPCR程序如表3：表33、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小是否與預(yù)期一致，切割在瓊脂糖凝膠電泳膠中的目的片段條帶，用DNA回收試劑盒回收純化；4、用EcoRI和BamHI限制性內(nèi)切酶分別對(duì)T1R3基因的PCR產(chǎn)物和慢病毒載體pCDH-CMV-EF1-PURO進(jìn)行雙酶切(于37℃酶切3h)，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如表4：表45、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切效果，切割在瓊脂糖凝膠電泳膠中的T1R3基因片段條帶和線性化的慢病毒載體，用膠回收試劑盒回收DNA；6、用T4DNA連接酶于16℃水浴下，將兩種酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，過夜。反應(yīng)如表5：表5試劑體積10XT4DNA連接酶buffer2μLT4DNA連接酶(400U/μL)1μLT1R3基因片段10μL線性化的慢病毒載體4μLddH2O3μL總體積20μL7、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞：從-80℃冰箱取出1管100μLEcoliXL1-BLUEMRF’感受態(tài)細(xì)胞，放冰上解凍(解凍至無冰狀態(tài))后，取10μL上述步驟6中的連接產(chǎn)物加到感受態(tài)細(xì)胞中混勻，靜置30min，42℃水浴熱激1min，冰上靜置2min。加LB液體培養(yǎng)基500μL，37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)。3000rpm離心5min，留100μl左右上清液混勻細(xì)菌后涂到LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。8、挑取數(shù)個(gè)菌落，做菌落PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)化子，反應(yīng)體系和條件見步驟2；9、將菌落PCR鑒定得到的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序引物如表6：表6實(shí)施例2：T1R3慢病毒包裝1、給匯合度達(dá)80％以上的HEK293細(xì)胞換上無抗生素培養(yǎng)基DMEM+10％(v/v)FBS，37℃、5％(v/v)CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2個(gè)小時(shí)。2、將包裝質(zhì)粒混合物(pLP/VSVG+pLP1+pLP2，各3μg)和4μgT1R3基因過表達(dá)慢病毒載體在400μL0.9％(w/v)生理鹽水中混合，并加入50μL轉(zhuǎn)染試劑Fitran，室溫靜置孵化20min后緩慢均勻滴入步驟1的含有HEK293細(xì)胞的培養(yǎng)皿中，適當(dāng)搖勻；此時(shí)記為轉(zhuǎn)染開始時(shí)間。3、轉(zhuǎn)染4-6h后準(zhǔn)備換液，倒掉舊的培養(yǎng)基后，吸取適量PBS輕輕漂洗細(xì)胞1-2次，換上含有2％(v/v)FBS的DMEM培養(yǎng)基。4、轉(zhuǎn)染后72小時(shí)收集上清，將收集到的上清于3000rpm4℃離心10min，取上清用0.45um微孔濾器過濾。5、將濾液于40mL超速離心管中，4℃，25000r/min離心20min，棄上清液。6、而后以500ul冰PBS重旋病毒沉淀于4℃溶解過夜，得到慢病毒液，即T1R3慢病毒。實(shí)施例3：細(xì)胞轉(zhuǎn)染1、在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)HEK293細(xì)胞，待細(xì)胞完全貼壁匯合度為40％-50％后，即可進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染前，每孔細(xì)胞換成500μL新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基，并且每孔加入1μL的聚凝胺(polybrene)，放置于培養(yǎng)箱孵育1h。2、在上述6孔細(xì)胞培養(yǎng)板的2個(gè)孔中，分別加入5μL實(shí)施例2得到的T1R3慢病毒液，其中一孔細(xì)胞加10μL的空載慢病毒液(空載慢病毒液與T1R3慢病毒液的唯一區(qū)別是不含有T1R3基因，其余制備方法都相同)，另一孔做空白細(xì)胞對(duì)照，充分的搖勻后放入37℃、5％(v/v)CO2、95％相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3、轉(zhuǎn)染6小時(shí)后，吸走孔內(nèi)的培養(yǎng)基，并用PBS洗兩次；換成新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基，放入37℃、5％(v/v)CO2、95％相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4、待細(xì)胞生長(zhǎng)至80％融合度時(shí)，加入3μL的嘌呤霉素Puromycin(2mg/mL)進(jìn)行藥篩(Puromycin的終濃度為3ug/ml)；5、第二天觀察到細(xì)胞多數(shù)漂浮，去除前一天藥篩的漂浮細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁加入3μL的Puromycin(2mg/mL)維持；6、加藥后細(xì)胞多漂浮，每天更換完全培養(yǎng)基和3μL的Puromycin(2mg/mL)直至空白細(xì)胞HEK293全部凋亡后，給純化后的HEK293-T1R3換上新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；7、篩選得到純化的HEK293-T1R3細(xì)胞更換上新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)進(jìn)行傳代擴(kuò)大培養(yǎng)，每次更換細(xì)胞培養(yǎng)基均需要加入原藥物濃的一半來維持細(xì)胞生長(zhǎng)，即Puromycin的終濃度為1.5ug/ml。實(shí)施例4：使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行T1R3基因的表達(dá)檢測(cè)。1、HEK293-T1R3細(xì)胞總RNA提取：1)將10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中匯合度達(dá)80％的實(shí)施例3得到的HEK293-T1R3細(xì)胞用預(yù)冷PBS緩沖液洗2遍，加1mlTrizol裂解液重懸。2)接著加入0.2ml三氯甲烷，劇烈搖動(dòng)10s，室溫放置3分鐘。3)4℃，12000rpm離心20min。4)將上清水相轉(zhuǎn)移至另一新的無RNA酶離心管中，并加入等體積的異丙醇，混勻，-80℃放置1h。5)4℃，12000rpm離心10min，去上清。6)加入1ml體積濃度為75％乙醇洗滌沉淀。7)4℃，5000rpm離心3min，去上清，室溫晾干。8)加入40μLRNase-free水溶解RNA。2、去基因組DNA和cDNA的合成將RNA加入到gDNA吸附柱，室溫10,000g離心1min，收集濾液即為去除基因組DNA的RNA。把RNA在65℃條件下熱變性5分鐘后，立即置于冰上冷卻。使用BestarTMqPCRRTKit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到cDNA，反應(yīng)體系如表7：表7反應(yīng)條件：37℃,15min98℃,5min4℃,保持反應(yīng)結(jié)束后，-20℃保存。3、cDNA的實(shí)時(shí)熒光定量PCR將T1R3基因和內(nèi)參基因18SrRNA的cDNA樣本分別取樣在熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。PCR反應(yīng)體系為20μL，反應(yīng)體系如表8：表8熒光定量PCR使用的引物如表9：表9反應(yīng)條件為：循環(huán)結(jié)束后從60℃升高到98℃獲取熔解曲線。本發(fā)明所構(gòu)建的T1R3基因過表達(dá)慢病毒載體對(duì)宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率高達(dá)80％～90％。實(shí)驗(yàn)以18SrRNA為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法進(jìn)行分析，經(jīng)所構(gòu)建的pCDH-CMV-EF1-PURO-T1R3慢病毒載體轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中T1R3基因的相對(duì)表達(dá)量是未轉(zhuǎn)入T1R3基因的HEK293細(xì)胞的5396倍。以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。序列表SEQIDNO.1SEQIDNO.2agattctagagctagcaccaccatggatgctgggccctgctg42SEQIDNO.3agatccttgcggccgctcactcatgtttcccctg34SEQIDNO.4cgcaaatgggcggtaggcgtg21SEQIDNO.5ccaacttctcggggactgtg20SEQIDNO.6accttcccctccttcttc18SEQIDNO.7ctctgtctacgcagctgtg19SEQIDNO.8cctggataccgcagctagga20SEQIDNO.9gcggcgcaatacgaatgcccc21SEQIDNO.10caaaacccagacgacatcgc20SEQIDNO.11ctgtcccgatggtgaacgaa20當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3