本發(fā)明是在由國立衛(wèi)生研究院(NationalInstitutesofHealth)資助的HL-077439、HL-111665、HL-093039、DK-099653和U01-HL-100401下由政府支持完成的。政府對本發(fā)明享有一定的權(quán)利。優(yōu)先權(quán)請求本公開內(nèi)容要求2014年8月11日提交的美國臨時申請序列號62/035,584的優(yōu)先權(quán)的權(quán)益，其全部內(nèi)容通過引用并入本文。背景1.
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開內(nèi)容涉及分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和遺傳學(xué)的領(lǐng)域。更具體地，本公開內(nèi)容涉及使用基因組編輯來治療迪謝納肌營養(yǎng)不良(Duchennemusculardystrophy，DMD)。2.相關(guān)技術(shù)迪謝納肌營養(yǎng)不良(DMD)由X染色體上肌養(yǎng)蛋白(dystrophin)基因的突變引起并且在3,500個男孩中約有1個受到影響。肌養(yǎng)蛋白是肌肉細(xì)胞膜完整性所必需的大的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)蛋白。沒有它，則肌肉退化，從而導(dǎo)致無力和肌病(Fairclough等，2013)。DMD患者的死亡通常發(fā)生在25歲以前，通常死于呼吸并發(fā)癥和心肌病。因此，DMD的治療需要持續(xù)地挽救骨骼肌、呼吸肌和心肌的結(jié)構(gòu)以及功能。盡管近三十年前就發(fā)現(xiàn)了DMD的遺傳原因(Worton等，1988)，并且已經(jīng)開發(fā)了幾種基于基因和基于細(xì)胞的療法以向患病肌肉組織遞送功能性Dmd等位基因或肌養(yǎng)蛋白樣蛋白，但是已遇到了許多治療挑戰(zhàn)，并且不存在治愈的治療(VanDeutekom和VanOmmen，2003)?；贗I型CRISPR(成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列，ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeat)/Cas(CPISPR相關(guān)，CRISPRAssociated)系統(tǒng)之RNA引導(dǎo)的核酸酶介導(dǎo)的基因組編輯提供了改變基因組的新方法(Jinek等，2012；Cong等，2013和Mali等，2013a)。簡言之，Cas9(一種由單引導(dǎo)RNA(sgRNA)引導(dǎo)的核酸酶)與毗鄰前間區(qū)序列鄰近基序(protospacerad.iacentmotif，PAM)的靶向基因組基因座結(jié)合并產(chǎn)生雙鏈斷裂(double-strandbreak，DSB)。然后通過導(dǎo)致插入/缺失(插失，indel)突變的非同源末端連接(non-homologousend-joining，NHEJ)或通過需要外源模板并且可在靶基因座處產(chǎn)生精確修飾的同源定向修復(fù)(homology-directedrepair，HDR)來修復(fù)DSB(Mali等，2013b)。與向患者細(xì)胞添加功能性或部分功能性的基因拷貝但保留原始的功能障礙的基因拷貝之其他基因治療方法不同，該系統(tǒng)可以消除所述缺陷。在組織培養(yǎng)細(xì)胞(Schwank等，2013)和罕見疾病的嚙齒類動物模型(Yin等，2014)中已經(jīng)證明了使用工程化核酸酶的遺傳校正(Urnov等，2005；Ousterout等，2013；Osborn等，2013；Wu等，2013和Schwank等，2013)，但在相對常見和目前不可治愈的疾病(例如DMD)的模型中尚未證明。技術(shù)實現(xiàn)要素：因此，根據(jù)本公開內(nèi)容，提供了校正對象中肌養(yǎng)蛋白基因缺陷的方法，其包括使所述對象中的細(xì)胞與Cas9和DMD引導(dǎo)RNA接觸。所述細(xì)胞可以是肌肉細(xì)胞、衛(wèi)星細(xì)胞或iPSC/iCM?？赏ㄟ^編碼Cas9和/或DMD引導(dǎo)RNA的一種或更多種表達(dá)載體(例如病毒載體如腺相關(guān)病毒載體)或非病毒載體的表達(dá)來向所述細(xì)胞提供Cas9和/或DMD引導(dǎo)RNA?？梢砸月阗|(zhì)粒DNA或化學(xué)修飾的mRNA向所述細(xì)胞提供Cas9。所述方法還可包括使所述細(xì)胞與單鏈DMD寡核苷酸接觸以實現(xiàn)同源定向修復(fù)。所述方法還可包括基于參考Duchenne突變數(shù)據(jù)庫(例如DuchenneSkipper數(shù)據(jù)庫)設(shè)計肌養(yǎng)蛋白基因靶標(biāo)?？梢栽谝环N或更多種納米顆粒中向所述細(xì)胞提供Cas9、DMD引導(dǎo)RNA和/或單鏈DMD寡核苷酸、或編碼它們的表達(dá)載體。Cas9、DMD引導(dǎo)RNA和/或單鏈DMD寡核苷酸可以被直接遞送至肌肉組織，例如脛骨前肌、四頭肌、比目魚肌、膈或心臟。Cas9、DMD引導(dǎo)RNA和/或單鏈DMD寡核苷酸可以被全身遞送。所述校正可以是突變外顯子或多于一個外顯子的永久跳讀(skipping)。所述對象可表現(xiàn)出正常的肌養(yǎng)蛋白陽性肌纖維和/或包含中央核(centralizednuclei)的鑲嵌的(mosaic)肌養(yǎng)蛋白陽性肌纖維。與接觸前的血清CK水平相比，所述對象可表現(xiàn)出降低的血清CK水平。與接觸前的血清CK水平相比，經(jīng)治療的對象可表現(xiàn)出改善的握力。構(gòu)想本文所述的任何方法或組合物可相對于本文所述的任何其他方法或組合物實施。根據(jù)以下詳細(xì)描述，本公開內(nèi)容的其他目的、特征和優(yōu)點將變得明顯。然而，應(yīng)理解，盡管表明了本公開內(nèi)容的一些具體實施方案，但是詳細(xì)描述和具體實施例僅以舉例說明的方式給出，因為根據(jù)該詳細(xì)描述，在本公開內(nèi)容的精神和范圍內(nèi)的多種變化和修改對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的。附圖說明以下附圖構(gòu)成本說明書的一部分并且包括在內(nèi)以進(jìn)一步證明本公開內(nèi)容的某些方面。通過參考這些附圖中的一個或更多個結(jié)合詳細(xì)描述可以更好地理解本公開內(nèi)容。圖1A-E.mdx小鼠中CRISPR/Cas9介導(dǎo)的Dmd校正。(圖1A)小鼠Dmd的靶向外顯子的示意圖和來自野生型小鼠(上)和mdx小鼠(下)的序列。具有mdx點突變(C到T)的提前終止密碼子加下劃線。(圖1B)mdx等位基因(上)和PAM的20-ntsgRNA靶序列的示意圖。箭頭表示Cas9切割位點。將包含位于靶位點每側(cè)側(cè)翼的90bp同源序列的ssODN用作HDR模板。ssODN并入四個沉默突變(灰色)并添加TseI限制酶位點(加下劃線)以用于基因分型和HDR介導(dǎo)的基因編輯的定量(圖4B)。(圖1C)通過HDR或NHEJ進(jìn)行基因校正的示意圖。相應(yīng)的DNA和蛋白質(zhì)序列示于圖5A中。(圖1D)通過種系基因治療在mdx小鼠中進(jìn)行基因校正的策略。(圖1E)具有2至100％校正的Dmd基因鑲嵌現(xiàn)象的mdx-C小鼠的基因分型結(jié)果。在2％瓊脂糖凝膠上的未消化PCR產(chǎn)物(上圖)、TseI消化(中間圖)和T7E1消化(下圖)。中間圖中的上面的箭頭標(biāo)記了指示由TseI消化產(chǎn)生的HDR介導(dǎo)的校正的DNA條帶。下面的箭頭標(biāo)記了未校正的mdx等位基因的DNA條帶。DNA條帶的相對強(qiáng)度(由下面的和上面的箭頭所指示的)反映了基因組DNA中HDR的百分比。HDR的百分比位于中間圖下方。通過ImageJ(NIH)定量條帶強(qiáng)度。下圖中的下面的箭頭和上面的箭頭表示未切割的條帶和經(jīng)T7E1切割的條帶。M表示大小標(biāo)記物泳道。bp表示標(biāo)記物條帶的堿基對長度。圖2.來自野生型、mdx和mdx-C小鼠的肌肉的組織學(xué)分析。來自7-9周齡野生型、mdx和mdx-C小鼠(HDR-17％、HDR-41％或NHEJ-83％)的肌肉的免疫染色和組織學(xué)分析。野生型小鼠中的肌養(yǎng)蛋白免疫熒光存在于所有肌肉中，包括四頭肌、比目魚肌、膈和心臟，而在mdx小鼠中則不存在，骨骼肌中的單回復(fù)體纖維(singlerevertantfiber)除外。來自HDR-17％小鼠的骨骼肌具有在肌養(yǎng)蛋白陰性纖維簇附近的肌養(yǎng)蛋白陽性纖維簇的獨特模式，而HDR-41％或NHEJ-83％mdx-C骨骼肌僅由肌養(yǎng)蛋白陽性肌纖維構(gòu)成。白色箭頭表示肌養(yǎng)蛋白陽性纖維的相鄰簇。比例尺，100微米。圖3A-C.來自mdx-C小鼠的衛(wèi)星細(xì)胞的分析和通過CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組校正用于挽救肌營養(yǎng)不良的模型。(圖3A)將mdx-C腓腸肌的冷凍切片裝在聚乙烯膜框架載玻片上并對衛(wèi)星細(xì)胞的標(biāo)志物Pax-7進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。激光解剖(laserdissection)前(左)和激光解剖后(右)肌肉的截面示出衛(wèi)星細(xì)胞的精確分離(在圓中)。比例尺，25微米。(圖3B)從mdx-C小鼠的衛(wèi)星細(xì)胞分離的基因組DNA產(chǎn)生對應(yīng)于Dmd外顯子23的PCR產(chǎn)物。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序且其示出CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯在體內(nèi)校正了一組衛(wèi)星細(xì)胞。第四個箭頭(1-r)表示通過HDR介導(dǎo)的經(jīng)校正的等位基因。其他箭頭表示沉默突變位點。在DNA序列下方示出了相應(yīng)的氨基酸殘基。灰色框表示校正的位點。(圖3C)通過CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組校正挽救肌營養(yǎng)不良的模型。mdx-C小鼠中存在三種類型的肌纖維：1)正常的肌養(yǎng)蛋白陽性肌纖維(灰色膜)和源自校正的祖細(xì)胞的衛(wèi)星細(xì)胞(灰色核)；2)營養(yǎng)不良的肌養(yǎng)蛋白陰性肌纖維(淺灰色膜)和源自mdx祖細(xì)胞的衛(wèi)星細(xì)胞(淺灰色核)；3)通過融合經(jīng)校正的祖細(xì)胞與mdx祖細(xì)胞或通過融合經(jīng)校正的衛(wèi)星細(xì)胞與預(yù)先存在的營養(yǎng)不良纖維產(chǎn)生的具有中央核(灰色和淺灰色核)的鑲嵌肌養(yǎng)蛋白陽性肌纖維。mdx-C小鼠中三種類型肌纖維的免疫染色示于圖11C中。圖4A-E.野生型小鼠中HDR和NHEJ介導(dǎo)的Dmd的基因編輯。(圖4A)Dmd和PAM(灰色)的20-ntsgRNA靶序列的示意圖。箭頭指示Cas9切割位點。(圖4B)基于PCR的基因分型的策略。將包含位于靶位點每側(cè)側(cè)翼之90bp同源序列的ssODN用作HDR模板。ssODN并入了四個沉默突變(灰色)，其消除了通過sgRNA/Cas9復(fù)合體的再切割并添加TseI限制酶位點(加下劃線的)以用于基因分型和HDR介導(dǎo)的基因編輯的定量。黑色箭頭指示對應(yīng)于Dmd基因編輯位點的PCR引物的位置。用TseI消化PCR產(chǎn)物(729bp)顯示出現(xiàn)HDR(437bp)。(圖4C)(上圖)用表S1中列出的引物使用從一窩的17只小鼠幼崽(表S2)尾組織活檢物分離的DNA進(jìn)行基于PCR的基因分型。(中間圖)將PCR產(chǎn)物用TseI切割以進(jìn)行限制性片段長度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)分析從而篩選HDR。(下圖)使用對由CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯產(chǎn)生的異源雙鏈體DNA具有特異性的T7內(nèi)切核酸酶I(T7E1)來篩選突變。將DNA產(chǎn)物上樣到2％瓊脂糖凝膠上。箭頭指示TseI或T7E1的切割條帶。M表示大小標(biāo)記物泳道?！癰p”表示標(biāo)記物條帶的堿基對長度。(圖4D)示出了HDR的小鼠#07(上圖)(來自圖4C)和示出了NHEJ介導(dǎo)的Dmd基因的編輯的小鼠#14(下圖)(來自圖4C)的PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果。箭頭指示通過HDR引入的點突變的位置。箭頭指向靶向位點附近色譜圖上的混合測序峰，表示雜合NHEJ介導(dǎo)的基因編輯。(圖4E)來自將Cas9、sgRNA和ssODN顯微注射到B6C3F1小鼠合子中的四個F0小鼠(來自圖4C的#07、#13、#14和#15)之Dmd等位基因的序列。將來自每只小鼠的基因組尾部DNA的PCR產(chǎn)物亞克隆到pCRII-TOPO載體中，挑取單個克隆并測序。用灰色字母表示點突變和沉默突變。小寫字母是箭頭指示的位置處的插入序列。缺失的序列由黑色破折號代替。每個基因組DNA克隆的基因型列于序列旁邊，框內(nèi)插入或缺失被稱為IF-Ins和IF-Del。插入的核苷酸數(shù)目用(+)表示，缺失用(-)表示。具有相同序列的克隆的數(shù)目(No.)由(×)表示。圖5A-C.在mdx小鼠中的HDR和NHEJ介導(dǎo)的基因校正。(圖5A)舉例說明通過HDR或NHEJ之CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因校正的示意圖。相應(yīng)的氨基酸殘基示于DNA序列下方。(圖5B)WT、mdx和經(jīng)校正的mdx-C小鼠的直接測序結(jié)果。一個箭頭表示W(wǎng)T等位基因(上)。一個箭頭表示mdx等位基因(中間)。第四個箭頭(1-r)表示通過HDR介導(dǎo)的經(jīng)校正的等位基因。其他箭頭表示沉默突變位點(下)。相應(yīng)的氨基酸殘基示于DNA序列下方?；疑虮硎窘?jīng)校正的位點。(圖5C)將Cas9、sgRNA和ssODN顯微注射到mdx小鼠(C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J)合子中的F0mdx-C小鼠(圖1E)中存在的Dmd等位基因的序列。將來自每只小鼠的基因組尾部DNA的PCR產(chǎn)物亞克隆到pCRII-TOPO載體中，挑取單個克隆并測序。mdx點突變(C到T)和沉默突變用灰色字母表示。具有相同序列的克隆的數(shù)目(No.)由(×)表示。以每個mdx-C小鼠HDR或NHEJ序列與mdx序列的比觀察到的變異性(variability)反映了鑲嵌現(xiàn)象的程度。圖6A-C。靶位點(Dmd)和32個理論脫靶位點的深度測序分析。(圖6A)來自四組小鼠(mdx、mdx+Cas9、WT和WT+Cas9)的DNA的深度測序在靶位點(Dmd)處之HDR(條的下部)和NHEJ(條的上部)介導(dǎo)的基因校正的頻率。(圖6B)來自四組小鼠的DNA的深度測序結(jié)果在全基因組“前十個”理論脫靶位點(OT-01至OT-10)(表S3)處之NHEJ介導(dǎo)的插失的頻率(圖例的上到下就是從左到右)。(圖6C)來自四組小鼠的DNA的深度測序在外顯子內(nèi)二十二個理論脫靶位點處(OTE-01至OTE-22)(表S3)之NHEJ介導(dǎo)的插失的頻率(圖例的從上到下就是從左到右)。圖7A-B.來自野生型、mdx和mdx-C小鼠的肌肉的組織學(xué)和Western印跡分析。(圖7A)來自7-9周齡野生型、mdx和mdx-C小鼠(HDR-17％、HDR-41％和NHEJ-83％校正的等位基因，如圖2所示)的肌肉的蘇木精和伊紅(H&E)以及免疫染色。免疫熒光檢測肌養(yǎng)蛋白。通過碘化丙啶(紅色)標(biāo)記核。比例尺，100微米。(圖7B)來自野生型、mdx和部分校正(HDR-17％)和完全校正(HDR-41％)的mdx-C小鼠的心臟和骨骼肌(四頭肌)樣品的Western印跡分析。紅色箭頭(＞250kD)表示肌養(yǎng)蛋白的免疫反應(yīng)性條帶。較小條帶(＜250kD)(在mdx樣品中也不存在)可能代表全長肌養(yǎng)蛋白蛋白質(zhì)、天然變體或蛋白質(zhì)合成中間體的蛋白水解分解。在來自野生型和mdx-C小鼠的樣品中觀察到相同的條帶模式。GAPDH是上樣對照。通過2％麗春紅(PonceauRed)對PVDF膜的總蛋白進(jìn)行染色。M表示大小標(biāo)記物泳道。kD表示標(biāo)記條帶的蛋白質(zhì)長度。圖8A-B.示出了通過CRISPR/Cas9介導(dǎo)的Dmd等位基因的基因組編輯減少纖維化和壞死之肌肉的組織學(xué)。來自(圖8A)7-9周齡野生型、mdx、HDR-17％和HDR-41％和(圖8B)3周齡野生型、mdx、HDR-40％-3wk的全部比目魚肌、腓腸肌、脛骨前肌、指總伸肌、四頭肌和膈之蘇木精和伊紅(H&E)染色的橫向冷凍切片。比例尺，125微米。圖9A-D.來自野生型、mdx和校正的mdx-C小鼠的肌肉的RFLP分析和肌纖維測量。(圖9A)進(jìn)行RFLP分析以對從野生型、mdx、HDR-17％和HDR-41％小鼠的尾、比目魚肌(Sol)、膈(Dia)以及心臟(Hrt)分離的基因組DNA的鑲嵌現(xiàn)象程度進(jìn)行定量。使用引物(Dmd729F和Dmd729R)(上圖)以基因組DNA進(jìn)行PCR，并用TseI(下圖)進(jìn)行消化。將DNA產(chǎn)物上樣到2％瓊脂糖凝膠上。下方的箭頭標(biāo)記由TseI消化產(chǎn)生的DNA條帶，表明HDR介導(dǎo)的校正。上方的箭頭標(biāo)記未校正的mdx等位基因的DNA條帶。M表示大小標(biāo)記物泳道。bp表示標(biāo)記物條帶的堿基對長度。(圖9B)四頭肌、比目魚肌、膈和心臟中肌養(yǎng)蛋白陽性細(xì)胞的定量。對于WT，n＝6；對于mdx，n＝3。誤差條示出基于來自多個肌肉切片的數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)差(圖例的從上到下就是從左到右)。(圖9C)來自野生型小鼠比目魚肌的肌纖維截面積分布的測量示出均勻尺寸的纖維，其中90％的纖維為700至1499μm2。相比之下，來自mdx小鼠的肌纖維在尺寸上不均勻，為300至1899μm2。來自HDR-41％肌肉的肌纖維的尺寸分布與野生型小鼠的尺寸分布極其相似。對于WT，n＝6；對于mdx，n＝3。誤差條示出基于來自多個肌肉切片的數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)差(圖例的從上到下是從左到右)。(圖9D)具有中央核的比目魚肌肌纖維的分布。來自HDR-17％的肌肉的再生肌纖維的百分比為700至1099μm2，其高于來自mdx肌肉的纖維的百分比(圖例的從上到下是從左到右)。圖10A-B.在CRISPR/Cas9介導(dǎo)的Dmd等位基因的基因組編輯后，骨骼肌而非心臟的逐步恢復(fù)。來自3周齡和9周齡野生型、mdx和mdx-C小鼠(3周齡是HDR-40％-3wk；9周齡是HDR-41％)的(圖10A)比目魚肌或(圖10B)心臟的蘇木精和伊紅(H&E)以及肌養(yǎng)蛋白免疫染色。免疫熒光檢測肌養(yǎng)蛋白。通過碘化丙啶(紅色)標(biāo)記核。方框區(qū)域的放大圖示出了3周齡(HDR-40％-3wk)和9周齡(HDR-41％)肌肉。在3周齡時，許多(但不是全部)的肌纖維表達(dá)顯示部分恢復(fù)的肌養(yǎng)蛋白。白色星星表示肌養(yǎng)蛋白陰性肌纖維。到9周齡時，校正的肌肉中所有肌纖維都示出肌養(yǎng)蛋白表達(dá)。盡管在mdx-C小鼠的心臟中肌養(yǎng)蛋白的表達(dá)已經(jīng)恢復(fù)，但是從3周齡到9周齡沒有觀察到隨著年齡的逐步改善。比例尺，100微米。圖11A-C.mdx-C小鼠中衛(wèi)星細(xì)胞和三種類型肌纖維的分析。(圖11A)來自對衛(wèi)星細(xì)胞特異性標(biāo)志物Pax7(左)和核(中間，碘化丙啶)免疫染色的mdx-C小鼠的腓腸肌的截面。合并的圖像(右)示出了位于肌肉纖維邊緣的“黃色”衛(wèi)星細(xì)胞，并將其與“紅色”肌纖維核區(qū)分開。白色箭頭指示Pax-7陽性衛(wèi)星細(xì)胞。比例尺，40微米。(圖11B)在2％瓊脂糖凝膠上分析對應(yīng)于來自野生型、mdx-C和mdx小鼠的激光解剖衛(wèi)星細(xì)胞之Dmd基因外顯子23的232bpPCR產(chǎn)物。M表示大小標(biāo)記物泳道。bp表示標(biāo)記物條帶的堿基對長度。(圖11C)用抗-肌養(yǎng)蛋白和碘化丙啶對mdx-C比目魚肌的免疫染色，突出顯示了部分校正的mdx肌肉中的三種類型肌纖維：1)源自CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組校正的肌肉祖細(xì)胞之正常的肌養(yǎng)蛋白陽性肌纖維；2)源自mdx突變祖細(xì)胞的營養(yǎng)不良的肌養(yǎng)蛋白陰性肌纖維；3)由校正的衛(wèi)星細(xì)胞與預(yù)先存在的營養(yǎng)不良肌肉融合形成的具有中央核的鑲嵌的肌養(yǎng)蛋白陽性肌纖維。圖12.外顯子跳讀的策略。示出了肌養(yǎng)蛋白的結(jié)構(gòu)域和外顯子的結(jié)構(gòu)。內(nèi)含子-外顯子連接的形狀表明在剪接后保持開放閱讀框的互補(bǔ)性。圖13.兩種類型的Myo編輯介導(dǎo)的外顯子跳讀。示出了通過NHEJ繞過外顯子23的策略。圖14.在mdx小鼠種系中Myo編輯介導(dǎo)的外顯子跳讀的策略。(圖14A)通過黑色和藍(lán)色箭頭指示引導(dǎo)RNA靶向外顯子23的5’和3，。(圖14B)將Cas9mRNA和引導(dǎo)RNA共注射到mdx卵子中。(圖14C)在瓊脂糖凝膠上分析來自幼崽的對應(yīng)于Dmd外顯子23的PCR產(chǎn)物。上方的條帶表示全長PCR產(chǎn)物，下方的條帶表示具有～200bp缺失的PCR產(chǎn)物(外顯子23)。9個幼崽中有7個跳讀外顯子23。M表示大小標(biāo)記物泳道。泳道2-5和9以及泳道6和7分別表示具有大插失突變和小插失突變的陽性mdx幼崽。圖15.在Myo編輯后跳讀外顯子23。用指定的引物組(F和R)對來自mdx和編輯的mdx小鼠的RNA進(jìn)行RT-PCR。外顯子23剪接位點的破壞允許從外顯子22至24(下方的帶)進(jìn)行剪接并恢復(fù)肌養(yǎng)蛋白開放閱讀框。圖16.通過跳讀外顯子23在mdx小鼠中挽救肌養(yǎng)蛋白表達(dá)。示出了來自mdx小鼠和在NHEJ介導(dǎo)的外顯子23的跳讀后mdx小鼠的肌肉的肌養(yǎng)蛋白染色(綠色)。通過跳讀外顯子23完全恢復(fù)了肌養(yǎng)蛋白的表達(dá)。圖17A-C.通過AAV介導(dǎo)的Myo編輯在mdx小鼠中體內(nèi)挽救肌營養(yǎng)不良的示意圖。(圖17A)通過上方的箭頭指示引導(dǎo)RNA靶向外顯子23的5’和3’。(圖17B)來自AAV病毒載體的Cas9、引導(dǎo)RNA和GFP表達(dá)的策略。(圖17C)不同模式的AAV9遞送的示意圖：腹膜內(nèi)注射(IP)、肌內(nèi)注射(IM)、眶后注射(RO)和心內(nèi)注射(IC)。黑色箭頭表示注射后組織收集的時間點。圖18A-B.通過直接肌內(nèi)注射(IM-AAV)或心內(nèi)注射(IC-AAV)用AAV9-Cas9遞送通過Myo編輯在mdx小鼠中挽救肌養(yǎng)蛋白表達(dá)。(圖18A)在AAV9-Cas9+AAV9-gsRNA-GFP的IM-AAV后3周(在出生后第10天的IM-AAV；P10)示出了來自mdx小鼠脛骨前肌連續(xù)切片的天然綠色熒光蛋白(GFP)和肌養(yǎng)蛋白免疫染色。在IM-AAV后3周(n＝3，肌養(yǎng)蛋白陽性肌纖維為總肌纖維的函數(shù))，在經(jīng)處理的mdx小鼠脛骨前肌中估計有7.7％±3.1％的肌纖維的轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率或挽救。(圖18B)來自mdx小鼠心臟連續(xù)切片的天然GFP和肌養(yǎng)蛋白免疫染色示出了在IC-AAV后4周(28天齡的IC-AAV)之心肌細(xì)胞挽救的證據(jù)。虛線指示注射針道，框指示更高放大倍數(shù)的區(qū)域，星號表示連續(xù)切片肌纖維排列。圖19.用IM-AAV通過Myo編輯在mdx小鼠中逐步挽救肌養(yǎng)蛋白表達(dá)。對于野生型小鼠(WT)、mdx小鼠和IM-AAV處理的mdx小鼠，在注射后3周和6周示出脛骨前肌的肌養(yǎng)蛋白免疫染色。到IM-AAV(n＝3)后六周，估計肌纖維的轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率(挽救)提高至25.5％±2.9％。比例尺，40微米。圖20.通過眶后注射(RO-AAV)用AAV9-Cas9全身遞送通過Myo編輯在mdx小鼠中逐步挽救肌養(yǎng)蛋白表達(dá)。對于野生型小鼠(WT)、mdx小鼠和RO-AAV處理的mdx小鼠，在注射后4和8周(RO-AAV在P10)示出了脛骨前肌和心臟的肌養(yǎng)蛋白免疫染色。在RO-AAV后4周，估計處理的mdx小鼠脛骨前肌中肌纖維的轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率(挽救)為1.9％±0.51％，而在處理的mdx小鼠心臟中心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率(挽救)為1.3％±0.05％。到RO-AAV后8周，估計脛骨前肌中肌纖維的挽救提高至6.1±3.2％，而心肌細(xì)胞挽救高達(dá)8.7％(5.0％±2.1％)(所有組中n＝3)。用白色星號突出顯示了未經(jīng)編輯的mdx對照小鼠脛骨前肌的肌纖維壞死，其顯示細(xì)胞質(zhì)填充自體熒光。箭頭指示在RO-AAV后4周經(jīng)處理的mddx小鼠心臟中的肌養(yǎng)蛋白陽性心肌細(xì)胞。比例尺，40微米。圖21.通過腹膜內(nèi)注射(IP-AAV)用AAV9-Cas9全身遞送通過Myo-編輯來挽救mdx小鼠中的肌養(yǎng)蛋白表達(dá)。在注射后4周(IP-AAV在P1)對于野生型小鼠(WT)、mdx小鼠和IP-AAV處理的mdx小鼠，示出了脛骨前肌和心臟的肌養(yǎng)蛋白免疫染色。在IP-AAV后28天時，在處理的mdx小鼠脛骨前肌(n＝1)中估計肌纖維的轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率(挽救)為3.0％，而在經(jīng)處理的mdx小鼠心臟(n＝1)中心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率(挽救)為2.4％。星號和箭頭分別表示在IP-AAV處理的mdx小鼠中的肌養(yǎng)蛋白陽性肌纖維和心肌細(xì)胞。比例尺，40微米。圖22.一組sgRNA靶向DMD中的熱點突變區(qū)。箭頭指示靶位點。圖23A-B.在人細(xì)胞中Myo編輯靶向外顯子51剪接受體位點。(圖23A)使用引導(dǎo)RNA文庫，選擇靶向外顯子51的5’的3個引導(dǎo)RNA。(圖23B)通過T7E1測定證明Myo編輯效率。引導(dǎo)RNA#3(紅色)在293T細(xì)胞中顯示高活性，而引導(dǎo)RNA#1和2沒有可檢測的活性。在正常人iPSC中觀察到引導(dǎo)RNA#3的相同結(jié)果。圖24A-B.從正常、DMD(RikenHPS0164)和經(jīng)編輯的iPSC分化的心肌細(xì)胞的RT-PCR。(圖24A)DMD患者中的缺失(外顯子48-50)在外顯子51中產(chǎn)生移碼突變。(圖24B)來自心肌細(xì)胞的RNA的RT-PCR，其中外顯子51剪接受體序列被用指定的引物組(F和R)進(jìn)行的Myo編輯破壞。DMD-iPSC中外顯子51剪接受體的破壞使得從外顯子47至52進(jìn)行剪接以及恢復(fù)肌養(yǎng)蛋白開放閱讀框(最低條帶)。圖25.DMDiPSC衍生的心肌細(xì)胞中通過CRISPR/Cas9Myo編輯成功地挽救肌養(yǎng)蛋白表達(dá)。肌養(yǎng)蛋白表達(dá)的免疫細(xì)胞化學(xué)(綠色染色)示出DMDiPSC(RikenHPS0164)衍生的心肌細(xì)胞通常缺乏肌養(yǎng)蛋白，而DMDiPSC心肌細(xì)胞中成功的Myo編輯具有肌養(yǎng)蛋白表達(dá)。免疫熒光(紅色)檢測心臟標(biāo)志物肌鈣蛋白-I。通過Hoechst染料(藍(lán)色)標(biāo)記核。圖26.DMD-iPSC中Myo編輯的示意圖。圖27.患者DC0160的假外顯子(pseudoexon)47A的Myo編輯策略。DMD外顯子表示為灰色框。帶終止碼的假外顯子由終止符號標(biāo)記。黑框表示Myo編輯介導(dǎo)的插失?；疑け硎菊５募○B(yǎng)蛋白陽性心肌細(xì)胞。圖28.患者DC0160的假外顯子47A的引導(dǎo)RNA序列。DMD外顯子表示為黑框，假外顯子表示為淺灰框(47A)。灰色框表示插失。圖29.從正常、DMD和經(jīng)編輯的iPSC分化的人心肌細(xì)胞的RT-PCR。圖30.通過DMD(DC0160)-iPSC衍生的人心肌細(xì)胞的Myo編輯來挽救肌養(yǎng)蛋白表達(dá)。肌養(yǎng)蛋白表達(dá)的免疫細(xì)胞化學(xué)示出了缺乏肌養(yǎng)蛋白表達(dá)的DMDiPSC(DC0160)心肌細(xì)胞。在成功的Myo編輯后，經(jīng)編輯的DMDiPSC心肌細(xì)胞表達(dá)肌養(yǎng)蛋白。免疫熒光檢測心臟標(biāo)志物肌鈣蛋白-I。通過Hoechst染料標(biāo)記核。具體實施方式像許多其他遺傳起源的疾病一樣，迪謝納肌營養(yǎng)不良存在具有挑戰(zhàn)性的治療情景。最近，“基因編輯”的發(fā)展已提高了校正細(xì)胞中遺傳效應(yīng)的能力。以下公開內(nèi)容描述了使用導(dǎo)致插入/缺失(插失)突變的非同源末端連接(NHEJ)或通過在靶基因座產(chǎn)生精確修飾的同源定向修復(fù)(HDR)，CRIPSR/Cas9系統(tǒng)編輯在肌養(yǎng)蛋白基因中攜帶缺陷的細(xì)胞的基因組的用途。以下詳細(xì)闡述本公開內(nèi)容的這些和另一些方面。I.迪謝納肌營養(yǎng)不良A.背景迪謝納肌營養(yǎng)不良(DMD)是肌肉營養(yǎng)不良的隱性X-連鎖形式，在3,500個男孩中約1個受到影響，其導(dǎo)致肌肉變性和過早死亡。該病癥由位于人X染色體上編碼蛋白質(zhì)肌養(yǎng)蛋白的基因肌養(yǎng)蛋白中的突變引起。肌養(yǎng)蛋白是肌肉組織內(nèi)的重要組分，為細(xì)胞膜的肌營養(yǎng)不良聚糖復(fù)合體(dystroglycancomplex，DGC)提供結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。雖然兩性均可攜帶突變，但是女性很少受到骨骼肌形式的疾病的影響。B.癥狀癥狀通常出現(xiàn)在2歲至3歲的男孩中，并且在嬰兒早期可見。即使癥狀直到嬰兒早期仍不出現(xiàn)，實驗室測試也可鑒定出生時攜帶活躍突變的兒童。首先觀察到與肌肉重量損失相關(guān)的腿和骨盆的進(jìn)行性近端肌無力。最終這種無力蔓延到手臂、頸部和其他區(qū)域。早期征兆可包括假性肥大(腓腸肌和三角肌的增大)、低耐力以及無輔助下站立的困難或無法上樓梯。隨著病癥發(fā)展，肌肉組織經(jīng)歷萎縮，并最終被脂肪和纖維化組織(纖維化)替代。到10歲時，可能需要支具來幫助行走，但是大多數(shù)患者到12歲時仍然依賴輪椅。隨后的癥狀可能包括導(dǎo)致骨骼畸形(包括脊柱彎曲)的異常骨發(fā)育。由于肌肉的逐步惡化，發(fā)生運動的喪失，最終導(dǎo)致癱瘓。智力障礙可能存在也可能不存在，但是如果存在，不會隨著兒童年齡而逐步惡化。患有DMD的男性的平均壽命期望約為25歲。迪謝納肌營養(yǎng)不良(一種進(jìn)行性神經(jīng)肌肉疾病)的主要癥狀是與肌肉萎縮相關(guān)的肌無力，其中首先受影響的是隨意肌，特別是臀部、骨盆區(qū)域、大腿、肩膀和小腿的那些。隨后在手臂、頸部和其他區(qū)域也發(fā)生肌無力。腓腸經(jīng)常增大。癥狀通常在6歲以前出現(xiàn)，并且可能出現(xiàn)在嬰兒早期。另一些身體癥狀有：·不便的行走、踏步或跑步方式-(患者傾向于靠其前趾行走，原因是腓腸肌張力增加。而且，腳趾行走是對膝伸肌無力的一種補(bǔ)償性適應(yīng))。·頻繁跌倒·疲勞·運動技能(跑步、跳躍、跳高)困難·腰椎脊柱前凸過度(lumbarhyperlordosis)，可能導(dǎo)致髖-屈肌縮短。這對整體姿勢以及步行、踏步或跑步的方式有影響?！じ旌湍N旁腱(hamstring)的肌肉攣縮損害功能，原因是肌纖維縮短和結(jié)締組織中的纖維化·進(jìn)行性行走困難·肌纖維畸形·舌和腓腸肌的假性肥大(增大)。肌肉組織最終被脂肪和結(jié)締組織替代，因此稱為假性肥大。·神經(jīng)行為障礙(例如，ADHD)、學(xué)習(xí)障礙(誦讀困難)和特定認(rèn)知技能(特別是短期言語記憶)的非進(jìn)行性虛弱的較高風(fēng)險，這被認(rèn)為是大腦缺乏肌養(yǎng)蛋白或肌養(yǎng)蛋白功能障礙的結(jié)果?！ぷ罱K喪失行走能力(通常到12歲時)·骨骼畸形(包括某些情況下的脊柱側(cè)凸)·由躺臥或坐姿站起來困難通常在臨床上可從患者邁出他的第一步的那一刻起就可以觀察到該病癥，并且行走的能力通常在男孩9至12歲之間完全喪失。大多數(shù)受DMD影響的男性到21歲時基本上“從頸部以下癱瘓”。肌肉萎縮始于腿和骨盆，然后發(fā)展到肩膀和頸部的肌肉，隨后喪失手臂肌肉和呼吸肌。腓腸肌增大(假性肥大)相當(dāng)明顯。心肌病特別是(擴(kuò)張型心肌病)是常見的，但是充血性心力衰竭或心律失常(不規(guī)則心跳)的發(fā)生只是偶爾的。陽性高爾斯征(Gowers’sign)反映下肢肌肉更嚴(yán)重的損傷。兒童用上肢幫助自己站起來：首先靠他的胳膊和膝蓋立起來，然后用手沿著他的腿“走”以直立。受影響的兒童通常比同齡兒童更容易疲倦并且總體力量更小。血流中的肌酸激酶(CPK-MM)水平極高。肌電圖(EMG)示出無力是由肌肉組織的破壞而不是由神經(jīng)的損傷引起的。遺傳測試可以揭示Xp21基因中的遺傳錯誤。肌肉組織活檢(免疫組織化學(xué)或免疫印跡)或遺傳測試(血液測試)證實缺乏肌養(yǎng)蛋白，雖然遺傳測試的改進(jìn)通常使得這不必要。·心肌異常(心肌病)·充血性心力衰竭或不規(guī)則的心律(心律失常)·胸部和背部的畸形(脊柱側(cè)凸)·腓腸、臀部和肩膀的肌肉增大(約4或5歲)。這些肌肉最終被脂肪和結(jié)締組織替代(假性肥大)?！ぜ∪庵亓繐p失(萎縮)·腳跟、腿部肌肉攣縮·肌肉畸形·呼吸系統(tǒng)病癥，包括肺炎和吞咽食物或流體進(jìn)入肺中(在疾病的晚期)C.原因迪謝納肌營養(yǎng)不良(DMD)由位于X染色體短臂上的基因座Xp21處的肌養(yǎng)蛋白基因突變引起。肌養(yǎng)蛋白負(fù)責(zé)通過含有許多亞基的蛋白質(zhì)復(fù)合體連接每個肌纖維的細(xì)胞骨架與下面的基底膜(胞外基質(zhì))。肌養(yǎng)蛋白的缺乏允許過量的鈣穿透肌膜(細(xì)胞膜)。鈣和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的改變導(dǎo)致水進(jìn)入線粒體中，然后破裂。在骨骼肌營養(yǎng)不良中，線粒體功能障礙引起應(yīng)激誘導(dǎo)的胞質(zhì)鈣信號的放大和應(yīng)激誘導(dǎo)的活性氧類(ROS)產(chǎn)生的放大。在涉及幾種途徑并且尚未清楚理解的復(fù)雜級聯(lián)過程中，細(xì)胞內(nèi)增加的氧化應(yīng)激損害肌膜，并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。肌纖維經(jīng)歷壞死并最終被脂肪和結(jié)締組織替代。DMD以X連鎖隱性模式遺傳。女性通常是疾病的攜帶者，而男性將受到影響。通常，女性攜帶者不知道她們攜帶突變，直到她們生了一個受影響的兒子。攜帶者母親的兒子有50％的機(jī)會從他的母親遺傳有缺陷的基因。攜帶者母親的女兒有50％的機(jī)會成為攜帶者，而有50％的機(jī)會具有兩個正常的基因拷貝。在所有情況下，一個未受影響的父親將一個正常的Y傳給他的兒子或?qū)⒄５腦傳給他的女兒。X連鎖隱性病癥(例如DMD)的女性攜帶者可以根據(jù)其X失活的模式顯示癥狀。迪謝納肌營養(yǎng)不良在3,500名男性嬰兒中發(fā)生率為1。肌養(yǎng)蛋白基因內(nèi)的突變可以遺傳或者在種系傳遞過程中自發(fā)發(fā)生。D.診斷建議有該病家族史的人進(jìn)行遺傳咨詢。迪謝納肌營養(yǎng)不良可通過在懷孕期間進(jìn)行的遺傳研究以約95％的準(zhǔn)確度檢測。DNA測試。肌養(yǎng)蛋白基因的肌肉特異性同工型由79個外顯子構(gòu)成，DNA測試和分析通常可鑒定外顯子突變的特定類型或受影響的外顯子。在大多數(shù)情況下DNA測試證實了診斷。肌肉組織活檢。如果DNA測試未能發(fā)現(xiàn)突變，可以進(jìn)行肌肉組織活檢測試。提取小份肌肉組織樣品(通常用手術(shù)刀而不是針)，并且使用顯示肌養(yǎng)蛋白存在的染料。完全缺失該蛋白質(zhì)表明患有該病癥。在過去幾年中，已經(jīng)開發(fā)了檢測更多的導(dǎo)致該病癥之許多突變的DNA測試，并且不需要頻繁地進(jìn)行肌肉組織活檢以確認(rèn)迪謝納肌營養(yǎng)不良的存在。產(chǎn)前測試。DMD由X連鎖隱性基因攜帶。男性只有一個X染色體，所以一個拷貝的突變基因?qū)?dǎo)致DMD。父親不能將X連鎖的性狀傳遞給他們的兒子，所以突變由母親傳遞。如果母親是攜帶者，因此她的兩個X染色體之一具有DMD突變，那么女孩有50％的機(jī)會遺傳該突變作為她的兩個X染色體之一，并且成為攜帶者。男孩有50％的機(jī)會遺傳該突變作為他的一個X染色體，因此患有DMD。產(chǎn)前測試可以判斷他們未出生的孩子是否有最常見的突變。有許多突變導(dǎo)致DMD，一些還沒有被鑒定出來，所以遺傳測試只有當(dāng)患有DMD的家庭成員具有已經(jīng)被鑒定的突變時才起作用。在侵入性測試(invasivetesting)之前，重要的是確定的胎兒性別；盡管男性有時受這種X連鎖疾病的影響，但女性DMD極為罕見。這可通過在16周時的超聲掃描或最近通過胎兒游離DNA測試來實現(xiàn)。絨毛膜采樣(chorionvillussampling，CVS)可在11至14周進(jìn)行，并具有1％的流產(chǎn)風(fēng)險。羊膜腔穿刺術(shù)可在15周后進(jìn)行，并具有0.5％的流產(chǎn)風(fēng)險。胎兒血液采樣可在約18周進(jìn)行。在不清楚的基因測試結(jié)果的情況下，另一個選擇是胎兒肌肉組織活檢。E.治療目前對于DMD沒有治愈方法，并且管理機(jī)構(gòu)已經(jīng)認(rèn)識到存在持續(xù)的醫(yī)療需求。對于某些突變使用外顯子跳讀治療的1-2a期試驗已經(jīng)阻止其下降并且在步行方面產(chǎn)生小的臨床改善。治療通常旨在控制癥狀的發(fā)作以最大限度地提高生活質(zhì)量，并且包括以下：·皮質(zhì)類固醇(例如潑尼松龍和地夫可特)提高了能量和力量，并推遲某些癥狀的嚴(yán)重程度。·隨機(jī)對照試驗(randomisedcontroltrial)已示出β-2-激動劑提高肌肉力量，但不改變疾病進(jìn)展。大多數(shù)RCT對β2激動劑的隨訪時間僅約12個月，因此在超過該時間范圍外不能外推結(jié)果?！す膭钶p度、不刺激的身體活動例如游泳。不活動(例如臥床休息)可使肌肉疾病惡化?！の锢碇委熡兄诰S持肌肉力量、靈活性和功能?！こC形器具(例如支具和輪椅)可改善移動性和自我護(hù)理能力。在睡眠期間將腳踝保持在適當(dāng)位置的合身可移動的腿部支具可推遲攣縮的發(fā)生?！るS著疾病的進(jìn)展，適當(dāng)?shù)暮粑С质侵匾?。DMD的綜合性多學(xué)科護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)/指南已經(jīng)由疾病控制和預(yù)防中心(theCentersforDiseaseControlandPrevention，CDC)制定，并于2010年在“TheLancetNeurology”中以兩部分出版。要下載PDF格式的這兩篇文章，請到TREAT-NMD網(wǎng)站。1.物理治療物理治療師關(guān)注使患者能夠達(dá)到其最大身體潛能。他們的目的是：·通過制定適當(dāng)?shù)纳煺购湾憻捰媱?，使攣縮和畸形的發(fā)展最小化·通過推薦支具和耐用的醫(yī)療設(shè)備，期望并最小化物理性質(zhì)的其他繼發(fā)性并發(fā)癥·監(jiān)測呼吸功能并對輔助呼吸訓(xùn)練的技術(shù)和清除分泌物的方法提供建議2.呼吸輔助現(xiàn)代的“體積通氣機(jī)/呼吸器(volumeventilator/respirator)”每次呼吸向人遞送可調(diào)節(jié)體積(量)的空氣，其對于治療患有肌營養(yǎng)不良相關(guān)呼吸問題的人是有價值的。通氣機(jī)可能需要通過其直接遞送空氣的侵入性氣管內(nèi)管或氣管插管，但是對于一些人來說，通過面罩或口罩(mouthpiece)的非侵入性遞送就足夠了。在后一種方式中，有時使用氣道正壓力機(jī)(Positiveairwaypressuremachine)，特別是雙水平的壓力機(jī)。呼吸設(shè)備可容易地安裝在具有外部電池的電動輪椅底部或背部上的通氣機(jī)托盤上以便攜帶。通氣機(jī)治療可以從當(dāng)呼吸肌開始衰竭的青少年中后期開始。如果肺活量降至低于正常值的40％，則可在睡眠時間(即人最可能在低通氣(“通氣不足”)的時候)期間使用體積通氣機(jī)/呼吸器。在睡眠期間的通氣不足是由睡眠障礙的詳盡病史以及血氧定量(oximetry)研究和毛細(xì)血管血氣決定的(參見肺功能測試)。咳嗽輔助裝置可通過用正氣壓的肺過度充氣，然后用負(fù)壓使粘液上升來幫助處理肺中的過多粘液。如果肺活量繼續(xù)下降到少于正常值的30％，白天還可能需要體積通氣機(jī)/呼吸器以獲得更多幫助。人們將根據(jù)需要在白天逐漸增加使用通氣機(jī)/呼吸器的時間量。F.預(yù)后迪謝納肌營養(yǎng)不良是一種進(jìn)行性疾病，其最終影響所有的隨意肌并涉及后期的心肌和呼吸肌。目前估計壽命期望為25歲左右，但這隨患者而異。最近在醫(yī)學(xué)上的進(jìn)展正在延長那些受折磨的人的生命。MuscularDystrophyCampaign是關(guān)注所有肌肉疾病的領(lǐng)先的英國慈善機(jī)構(gòu)，其指出“隨著高標(biāo)準(zhǔn)的醫(yī)療護(hù)理，迪謝納肌營養(yǎng)不良的年輕人通常在他們30多歲仍生活得很好。在極少數(shù)情況下，如果需要，使用在輪椅和床上適當(dāng)?shù)亩ㄎ?、通氣機(jī)支持(通過氣管切開術(shù)或口罩)、呼吸道清除和心臟藥物，已看到患有DMD的人能夠生存到四十多歲或五十多歲出頭。對于晚年護(hù)理所需支持的早期計劃已經(jīng)表明患有DMD的人壽命更長了。奇怪的是，在迪謝納肌營養(yǎng)不良的mdx小鼠模型中，肌養(yǎng)蛋白的缺乏與提高的鈣水平和骨骼肌肌壞死相關(guān)。喉內(nèi)肌(intrinsiclaryngealmuscle，ILM)受到保護(hù)，不會發(fā)生肌壞死。ILM具有鈣調(diào)節(jié)系統(tǒng)譜，表明與外肌(outhermuscle)相比，處理鈣變化的能力更好，并且這可為其獨特的病理生理學(xué)性質(zhì)提供機(jī)理性啟示。ILM可促進(jìn)開發(fā)用于在多種臨床情景下預(yù)防和治療肌肉萎縮的新策略。II.CRISPR/CAS系統(tǒng)A.CRISPR/CASCRISPR(成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列)是包含堿基序列的短重復(fù)的DNA基因座。每個重復(fù)之后是來自先前暴露于病毒的“間隔區(qū)DNA”的短區(qū)段。在約40％測序的真細(xì)菌基因組和90％測序的古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)CRISPR。CRISPR通常與編碼與CRISPR相關(guān)的蛋白質(zhì)的cas基因相關(guān)。CRISPR/Cas系統(tǒng)是原核免疫系統(tǒng)，其賦予對外來遺傳元件(例如質(zhì)粒和噬菌體)的抗性并提供獲得性免疫的形式。CRISPR間隔區(qū)識別并沉默真核生物體中的這些外源遺傳元件例如RNAi。1987年首次描述了細(xì)菌大腸桿菌(Escherichiacoli)的重復(fù)序列。在2000年，在另外的細(xì)菌和古細(xì)菌中鑒定出類似的成簇重復(fù)序列，并稱為短規(guī)律間隔重復(fù)序列(ShortRegularlySpacedRepeats，SRSR)。SRSR在2002年被重命名為CRISPR。發(fā)現(xiàn)其中一些編碼推定的核酸酶或解旋酶蛋白的一組基因(cas或CRISPR相關(guān)基因)與CRISPR重復(fù)序列相關(guān)。在2005年，三個獨立的研究人員表明，CRISPR間隔區(qū)示出與幾個噬菌體DNA和染色體外DNA(例如質(zhì)粒)的同源性。這表明CRISPR/cas系統(tǒng)可在細(xì)菌的適應(yīng)性免疫中起作用。Koonin和同事提出，間隔區(qū)充當(dāng)RNA分子的模板，類似于使用稱為RNA干擾的系統(tǒng)的真核細(xì)胞。2007年，Barrangou，Horvath(Danisco的食品工業(yè)科學(xué)家)和另一些人表明，他們可以用間隔區(qū)DNA改變嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)對噬菌體攻擊的抗性。Doudna和Charpentier獨立地探索CRISPR相關(guān)蛋白以了解細(xì)菌如何在其免疫防御中部署間隔區(qū)。他們共同研究了一種更簡單的CRISPR系統(tǒng)，其依賴于一種稱為Cas9的蛋白質(zhì)。他們發(fā)現(xiàn)細(xì)菌通過將間隔區(qū)和回文DNA轉(zhuǎn)錄為長RNA分子而對入侵噬菌體作出應(yīng)答，然后細(xì)胞使用tracrRNA和Cas9將長RNA分子切割成稱作crRNA的片段。在2012年首次表明CRISPR在人細(xì)胞培養(yǎng)物中用作基因組工程/編輯工具。它已經(jīng)被用于多種生物體，包括面包酵母(S.cerevisiae)、斑馬魚、線蟲(C.elegans)、植物、小鼠和幾種其他生物體。此外，CRISPR已被修飾從而制備使科學(xué)家們能夠靶向和激活或沉默特定基因的可編程轉(zhuǎn)錄因子?，F(xiàn)在可得到數(shù)以萬計的引導(dǎo)RNA的文庫。2014年3月展示了CRISPR可以逆轉(zhuǎn)活體動物中疾病癥狀的第一個證據(jù)，當(dāng)時MIT研究人員治愈了罕見肝臟疾病的小鼠。自2012年以來，CRISPR/Cas系統(tǒng)已被用于基因編輯(沉默、增強(qiáng)或改變特定基因)，其甚至在真核生物像小鼠和靈長類動物中起作用。通過插入含有cas基因和特異性設(shè)計的CRISPR的質(zhì)粒，可以在任何期望的位置切割生物體的基因組。CRISPR重復(fù)序列的大小為24至48個堿基對。它們通常顯示一些二重對稱，這意味著形成二級結(jié)構(gòu)例如發(fā)夾，但不是真正的回文結(jié)構(gòu)。重復(fù)序列被相似長度的間隔區(qū)分開。一些CRISPR間隔區(qū)序列與來自質(zhì)粒和噬菌體的序列完全匹配，盡管一些間隔區(qū)與原核生物的基因組匹配(自靶向間隔區(qū))。響應(yīng)于噬菌體感染，可以迅速添加新的間隔區(qū)。CRISPR相關(guān)(cas)基因通常與CRISPR重復(fù)-間隔區(qū)陣列相關(guān)。截至2013年，已描述了超過四十個不同的Cas蛋白家族。在這些蛋白家族中，Cas1似乎在不同的CRISPR/Cas系統(tǒng)中是普遍存在的。cas基因和重復(fù)序列結(jié)構(gòu)的特定組合已用于限定8種CRISPR亞型(Ecoli、Ypest、Nmeni、Dvulg、Tneap、Hmari、Apern和Mtube)，其中一些與編碼重復(fù)序列相關(guān)神秘蛋白(repeat-associatedmysteriousprotein，RAMP)的另外的基因模塊相關(guān)。在單個基因組中可存在多于一種CRISPR亞型。CRISPR/Cas亞型的不規(guī)律分布表明該系統(tǒng)在微生物進(jìn)化過程中經(jīng)歷水平基因轉(zhuǎn)移。外源DNA似乎由Cas基因編碼的蛋白質(zhì)加工成小元件(長度為～30個堿基對)，然后以某種方式將其插入靠近前導(dǎo)序列的CRISPR基因座中。來自CRISPR基因座的RNA組成型表達(dá)，并且被Cas蛋白加工成由具有側(cè)翼重復(fù)序列的單獨外源衍生序列元件構(gòu)成的小RNA。RNA引導(dǎo)其他Cas蛋白在RNA或DNA水平上沉默外源遺傳元件。證據(jù)表明CRISPR亞型之間的功能多樣性。Cse(Cas亞型Ecoli)蛋白(在大腸桿菌(E.coli)中稱為CasA-E)形成功能復(fù)合體Cascade，其將CRISPRRNA轉(zhuǎn)錄本加工成Cascade保留的間隔區(qū)-重復(fù)序列單元。在另一些原核生物中，Cas6加工CRISPR轉(zhuǎn)錄本。有趣的是，大腸桿菌中基于CRISPR的噬菌體滅活需要Cascade和Cas3，但不需要Cas1和Cas2。在激烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)和另一些原核生物中發(fā)現(xiàn)的Cmr(CasRAMP模塊)蛋白與小的CRISPRRNA形成功能性復(fù)合體，其識別和切割互補(bǔ)靶RNA。RNA引導(dǎo)的CRISPR酶被分類為V型限制酶。還參見美國專利公開2014/0068797，其通過引用整體并入。B.Cas9Cas9是核酸酶(一種專用于切割DNA的酶)，具有兩個活性切割位點，雙螺旋的每條鏈各一個。該團(tuán)隊證明他們可使一個或這兩個位點失效，同時保留Cas9之歸巢定位其靶DNA的能力。Jinek等(2012)將tracrRNA和間隔區(qū)RNA合并成“單引導(dǎo)RNA”分子，其與Cas9混合，可找到并切割正確的DNA靶標(biāo)。Jinek等(2012)提出這樣的合成引導(dǎo)RNA可能能夠用于基因編輯。Cas9蛋白在致病和共生細(xì)菌中高度富集。CRISPR/Cas介導(dǎo)的基因調(diào)節(jié)可以有助于內(nèi)源細(xì)菌基因的調(diào)節(jié)，特別是在與真核宿主的細(xì)菌相互作用期間。例如，新兇手弗朗西斯氏菌(Francisellanovicida)的Cas蛋白Cas9使用獨特的小的CRISPR/Cas相關(guān)RNA(scaRNA)來抑制編碼細(xì)菌脂蛋白的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄本，所述細(xì)菌脂蛋白對于新兇手弗朗西斯氏菌(F.novicida)抑制宿主應(yīng)答和促進(jìn)毒力是至關(guān)重要的。Wang等示出Cas9mRNA和sgRNA共注射到種系(合子)產(chǎn)生的具有突變的小鼠中。也構(gòu)想了Cas9DNA序列的遞送。C.gRNA作為RNA引導(dǎo)的蛋白，Cas9需要短RNA以指導(dǎo)DNA靶標(biāo)的識別(Mali等，2013a)。雖然Cas9優(yōu)先地探詢含有PAM序列NGG的DNA序列，但其可在沒有前間區(qū)靶標(biāo)的情況下在此結(jié)合。然而，Cas9-gRNA復(fù)合體需要與gRNA緊密匹配以產(chǎn)生雙鏈斷裂(Cho等，2013；Hsu等，2013)。細(xì)菌中的CRISPR序列在多個RNA中表達(dá)，然后經(jīng)加工以產(chǎn)生RNA的引導(dǎo)鏈(Bikard等，2013)。因為真核系統(tǒng)缺乏處理CRISPRRNA所需的一些蛋白質(zhì)，所以創(chuàng)建合成構(gòu)建體gRNA以將用于Cas9靶向的RNA必需片段并入用RNA聚合酶III型啟動子U6表達(dá)的單個RNA中(Mali等，2013a，b)。合成的gRNA的最小長度稍微超過100bp，并且包含靶向就在PAM序列NGG之前的20個前間區(qū)核苷酸的部分；gRNA不含有PAM序列。III.核酸遞送如上所述，在某些實施方案中，表達(dá)盒用于表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子產(chǎn)物，以用于隨后純化和遞送至細(xì)胞/對象，或直接用于基于遺傳的遞送方法。表達(dá)需要在載體中提供適當(dāng)?shù)男盘?，并且包括多種來自病毒和哺乳動物來源二者之驅(qū)動目的基因在細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)控元件(例如增強(qiáng)子/啟動子)。還定義了設(shè)計用于優(yōu)化宿主細(xì)胞中信使RNA穩(wěn)定性和可翻譯性的元件。還提供了使用多種顯性藥物選擇標(biāo)志物以建立表達(dá)產(chǎn)物的永久穩(wěn)定細(xì)胞克隆的條件，以及將藥物選擇標(biāo)志物的表達(dá)與多肽的表達(dá)聯(lián)系起來的元件。A.調(diào)控元件在整個本申請中，術(shù)語“表達(dá)盒”意在包括含有編碼基因產(chǎn)物的核酸的任何類型遺傳構(gòu)建體，其中部分或全部核酸編碼序列能夠被轉(zhuǎn)錄和翻譯，即，在啟動子的控制下?！皢幼印笔侵赣善鹗蓟虻奶禺愋赞D(zhuǎn)錄所需的細(xì)胞的合成機(jī)器或引入的合成機(jī)器識別的DNA序列。短語“在轉(zhuǎn)錄控制下”意指啟動子相對于核酸處于正確的位置和方向中以控制RNA聚合酶起始和基因的表達(dá)?！氨磉_(dá)載體”意在包括包含在遺傳構(gòu)建體中能夠復(fù)制的表達(dá)盒，并因此包括一個或更多個復(fù)制起點、轉(zhuǎn)錄終止信號、poly-A區(qū)、可選擇標(biāo)志物和多用途克隆位點。術(shù)語啟動子在本文中用于指在RNA聚合酶II的起始位點周圍簇集的一組轉(zhuǎn)錄控制模塊。關(guān)于如何組織啟動子的大多數(shù)想法來自幾種病毒啟動子的分析，包括HSV胸苷激酶(tk)和SV40早期轉(zhuǎn)錄單位的那些。通過更新的工作加強(qiáng)的這些研究已經(jīng)示出啟動子由離散的功能模塊構(gòu)成，各自由約7-20bp的DNA組成，并含有一個或更多個轉(zhuǎn)錄激活蛋白或抑制蛋白的識別位點。每個啟動子中至少一個模塊用于定位RNA合成的起始位點。其最著名的實例是TATA盒，但是在缺少TATA盒的一些啟動子(例如哺乳動物末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶基因的啟動子和SV40晚期基因的啟動子)中，覆蓋起始位點的離散元件本身有助于確定起始位置。另外的啟動子元件調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始的頻率。通常，這些位于起始位點上游30-110bp的區(qū)域中，但是最近已經(jīng)示出許多啟動子在起始位點下游也包含功能元件。啟動子元件之間的間隔通常是柔性的，以使得當(dāng)元件相對于彼此倒置或移動時保持啟動子功能。在tk啟動子中，啟動子元件之間的間隔在活性開始下降之前可以增加至相距50bp。根據(jù)啟動子，似乎單個元件可以協(xié)同地或獨立地起作用以激活轉(zhuǎn)錄。在某些實施方案中，病毒促進(jìn)例如人巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus，CMV)立即早期基因啟動子、SV40早期啟動子、勞斯肉瘤病毒長末端重復(fù)序列、大鼠胰島素啟動子且甘油醛-3-磷酸脫氫酶可用于獲得目的編碼序列的高水平表達(dá)。還考慮使用本領(lǐng)域公知的另一些病毒或哺乳動物細(xì)胞或細(xì)菌噬菌體啟動子來實現(xiàn)目的編碼序列的表達(dá)，只要表達(dá)水平對于給定目的足夠即可。通過使用具有公知性質(zhì)的啟動子，可以優(yōu)化轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化后目的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平和模式。此外，選擇響應(yīng)于特定生理信號而被調(diào)節(jié)的啟動子可允許基因產(chǎn)物的誘導(dǎo)型表達(dá)。增強(qiáng)子是增加來自位于相同DNA分子上的遠(yuǎn)端位置之啟動子的轉(zhuǎn)錄的遺傳元件。增強(qiáng)子的組織很像啟動子。也就是說，它們由許多單個元件構(gòu)成，其各自結(jié)合一個或更多個轉(zhuǎn)錄蛋白。增強(qiáng)子和啟動子之間的基本區(qū)別是可操作性。增強(qiáng)子區(qū)域作為整體必須能夠在一定距離處刺激轉(zhuǎn)錄；對于啟動子區(qū)或其組成元件不需要這樣。另一方面，啟動子必須具有在特定位點和特定方向上指導(dǎo)RNA合成起始的一種或更多種元件，而增強(qiáng)子缺乏這些特異性。啟動子和增強(qiáng)子通常是重疊和連續(xù)的，通?？雌饋砭哂蟹浅Ｏ嗨频哪K化組織。下面是可與表達(dá)構(gòu)建體中編碼目的基因的核酸組合使用的啟動子/增強(qiáng)子和誘導(dǎo)型啟動子/增強(qiáng)子的列表。另外，任何啟動子/增強(qiáng)子組合(根據(jù)真核啟動子數(shù)據(jù)庫EPDB)也可用于驅(qū)動基因的表達(dá)。如果提供合適的細(xì)菌聚合酶作為遞送復(fù)合體的一部分或作為另外的遺傳表達(dá)構(gòu)建體，則真核細(xì)胞可以支持來自某些細(xì)菌啟動子的細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄。特別感興趣的是肌肉特異性啟動子。這些啟動子包括肌球蛋白輕鏈-2啟動子(Franz等，1994；Kelly等，1995)、α-肌動蛋白啟動子(Moss等，1996)、肌鈣蛋白1啟動子(Bhavsar等，1996)；Na+/Ca2+交換體啟動子(Barnes等，1997)、肌養(yǎng)蛋白啟動子(Kimura等，1997)、α7整聯(lián)蛋白啟動子(Ziober和Kramer，1996)、腦利尿鈉肽啟動子(LaPointe等，1996)和αB-晶體蛋白/小熱休克蛋白啟動子(Gopal-Srivastava，1995)、α-肌球蛋白重鏈啟動子(Yamauchi-Takihara等，1989)和ANF啟動子(LaPointe等，1988)。當(dāng)使用cDNA插入片段時，通常希望包括聚腺苷酸化信號以實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄本的適當(dāng)聚腺苷酸化。認(rèn)為聚腺苷酸化信號的性質(zhì)對于本發(fā)明的成功實施并不是至關(guān)重要的，并且可采用任何這樣的序列，例如人生長激素和SV40聚腺苷酸化信號。還構(gòu)想作為表達(dá)盒元件的是終止子。這些元件可用于增強(qiáng)信息水平和最小化從盒到其他序列的讀取。B.2A肽發(fā)明人利用來自昆蟲病毒明脈扁刺蛾β四體病毒(Thoseaasigna)(TaV2A肽)的2A樣自切割結(jié)構(gòu)域(Chang等，2009)。已經(jīng)示出這些2A樣結(jié)構(gòu)域在整個真核生物中起作用，并導(dǎo)致在2A樣肽結(jié)構(gòu)域內(nèi)共翻譯地發(fā)生氨基酸切割。因此，包含TaV2A肽使得能夠從單個mRNA轉(zhuǎn)錄本表達(dá)多種蛋白質(zhì)。重要的是，當(dāng)在真核系統(tǒng)中測試時，TaV的結(jié)構(gòu)域示出大于99％的切割活性(Donnelly等，2001)。C.表達(dá)載體的遞送存在許多將表達(dá)載體引入細(xì)胞中的方式。在本發(fā)明的某些實施方案中，表達(dá)構(gòu)建體包含衍生自病毒基因組的病毒或工程構(gòu)建體。某些病毒通過受體介導(dǎo)的胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞，整合到宿主細(xì)胞基因組中并穩(wěn)定和有效地表達(dá)病毒基因的能力使得其成為將外源基因轉(zhuǎn)移到哺乳動物細(xì)胞中的有吸引力的候選物(Ridgeway，1988；Nicolas和Rubenstein，1988；Baichwal和Sugden，1986；Temin，1986)。用作基因載體的第一種病毒是DNA病毒，包括乳多空病毒(猿病毒40、牛乳頭瘤病毒和多瘤病毒)(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986)以及腺病毒(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986)。這些對外來DNA序列具有相對低的容納力，并且具有受限的宿主譜。此外，它們在允許細(xì)胞中的致癌潛力和細(xì)胞病變效應(yīng)引起了安全性問題。它們只能容納達(dá)8kB的外來遺傳物質(zhì)，但可容易地引入多種細(xì)胞系和實驗動物中(Nicolas和Rubenstein，1988；Temin，1986)。用于體內(nèi)遞送的一種優(yōu)選方法涉及使用腺病毒表達(dá)載體?！跋俨《颈磉_(dá)載體”意在包括含有足以(a)支持構(gòu)建體包裝和(b)表達(dá)其中已克隆的反義多核苷酸的腺病毒序列的那些構(gòu)建體。在本發(fā)明上下文中，表達(dá)不需要合成基因產(chǎn)物。表達(dá)載體包括基因工程形式的腺病毒。對腺病毒(36kB的線性雙鏈DNA病毒)的遺傳組織的了解允許用達(dá)7kB的外來序列取代大片段腺病毒DNA(Grunhaus和Horwitz，1992)。與逆轉(zhuǎn)錄病毒相反，宿主細(xì)胞的腺病毒感染不導(dǎo)致染色體整合，原因是腺病毒DNA可以以附加體方式復(fù)制而沒有潛在的遺傳毒性。此外，腺病毒在結(jié)構(gòu)上是穩(wěn)定的，并且在大量擴(kuò)增后沒有檢測到基因組重排。腺病毒可感染幾乎所有上皮細(xì)胞，而不論其細(xì)胞周期階段如何。迄今為止，腺病毒感染似乎僅與輕度疾病(例如人的急性呼吸道疾病)相關(guān)。腺病毒特別適合用作基因轉(zhuǎn)移載體，原因是其具有中等大小的基因組、易于操作、高效價、寬靶細(xì)胞范圍和高感染性。病毒基因組的兩端均含有100-200個堿基對的反向重復(fù)(ITR)，其是病毒DNA復(fù)制和包裝所必需的順式元件。基因組的早期(E)和晚期(L)區(qū)域包含不同的轉(zhuǎn)錄單位，其被病毒DNA復(fù)制的起始分開。E1區(qū)(E1A和E1B)編碼負(fù)責(zé)調(diào)控病毒基因組和少數(shù)細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)。E2區(qū)(E2A和E2B)的表達(dá)導(dǎo)致用于病毒DNA復(fù)制的蛋白質(zhì)的合成。這些蛋白質(zhì)參與DNA復(fù)制、晚期基因表達(dá)和宿主細(xì)胞關(guān)閉(Renan，1990)。晚期基因的產(chǎn)物(包括大多數(shù)病毒衣殼蛋白)僅在由主要晚期啟動子(majorlatepromoter，MLP)產(chǎn)生的單一初級轉(zhuǎn)錄本的顯著加工后表達(dá)。在感染的晚期期間MLP(位于16.8m.u.)特別有效，并且從該啟動子產(chǎn)生的所有mRNA具有5’-三聯(lián)前導(dǎo)(TPL)序列，使其成為用于翻譯的優(yōu)選mRNA。在一個系統(tǒng)中，重組腺病毒由穿梭載體和原病毒載體之間的同源重組產(chǎn)生。由于兩種原病毒載體之間可能的重組，因此可以從該過程產(chǎn)生野生型腺病毒。因此，從單個噬斑(plaque)分離單個病毒克隆并檢查其基因組結(jié)構(gòu)是至關(guān)重要的。產(chǎn)生和擴(kuò)增復(fù)制缺陷型的現(xiàn)有腺病毒載體取決于獨特輔助細(xì)胞系，稱為293，其通過Ad5DNA片段從人胚腎細(xì)胞轉(zhuǎn)化并組成型表達(dá)E1蛋白質(zhì)(Graham等，1977)。由于E3區(qū)是腺病毒基因組所必需的(Jones和Shenk，1978)，因此現(xiàn)有腺病毒載體在293細(xì)胞的幫助下在E1、D3或這兩個區(qū)域中攜帶外來DNA(Graham和Prevec，1991)。在自然界中，腺病毒可以包裝大約105％的野生型基因組(Ghosh-Choudhury等，1987)，提供額外約2kbDNA的容量。加上在E1和E3區(qū)域中可替代的約5.5kb的DNA，現(xiàn)有腺病毒載體的最大容量為7.5kb或載體總長度的約15％。載體骨架中保留超過80％的腺病毒病毒基因組并且是載體攜帶的細(xì)胞毒性的來源。此外，E1缺失的病毒的復(fù)制缺陷是不完全的。輔助細(xì)胞系可衍生自人細(xì)胞，例如人胚胎腎細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、造血細(xì)胞或者其他人胚胎間充質(zhì)或上皮細(xì)胞?；蛘撸o助細(xì)胞可衍生自允許人腺病毒的其他哺乳動物物種的細(xì)胞。這樣的細(xì)胞包括例如Vero細(xì)胞或其他猴胚胎間充質(zhì)或上皮細(xì)胞。如上所述，優(yōu)選的輔助細(xì)胞系是293。Racher等(1995)公開了用于培養(yǎng)293細(xì)胞和繁殖腺病毒的改進(jìn)方法。在一種方式中，通過將單獨細(xì)胞接種到含有100-200ml培養(yǎng)基的1升硅化旋轉(zhuǎn)瓶(Techne，Cambridge，UK)中來培養(yǎng)天然細(xì)胞聚集體。在以40rpm攪拌后，用臺盼藍(lán)估計細(xì)胞生存力。在另一種方式中，如下使用Fibra-Cel微載體(BibbySterlin，Stone，UK)(5g/l)。將懸浮在5ml培養(yǎng)基中的細(xì)胞接種物添加到250ml錐形瓶中的載體(50ml)并靜置1至4小時，偶爾進(jìn)行攪拌。然后用50ml新鮮培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基并開始搖動。對于病毒產(chǎn)生，允許細(xì)胞生長至約80％匯合，此后更換培養(yǎng)基(至最終體積的25％)，并添加0.05MOI的腺病毒。將培養(yǎng)物靜置過夜，然后將體積增加至100％，并再開始搖動72小時。除了要求腺病毒載體是復(fù)制缺陷型或至少條件性缺陷之外，不認(rèn)為腺病毒載體的性質(zhì)對成功實施本發(fā)明至關(guān)重要。腺病毒可以是已知的42種不同血清型或A-F亞組中的任一種。優(yōu)選亞組C的5型腺病毒作為起始材料以獲得用于本發(fā)明的條件復(fù)制缺陷型腺病毒載體。這是因為5型腺病毒是已知其大量生物化學(xué)和遺傳信息的人腺病毒，并且歷史上已經(jīng)將其用于大多數(shù)采用腺病毒作為載體的構(gòu)建。如上所述，根據(jù)本發(fā)明的典型載體是復(fù)制缺陷型的，并且不具有腺病毒E1區(qū)。因此，最方便的是在E1編碼序列已被去除的位置處引入編碼目的基因的多核苷酸。然而，構(gòu)建體在腺病毒序列內(nèi)的插入位置對于本發(fā)明不是關(guān)鍵的。如Karlsson等(1986)所述，編碼目的基因的多核苷酸也可插入E3替代載體中來代替缺失的E3區(qū)，或者其中插入輔助細(xì)胞系或輔助病毒補(bǔ)充E4缺陷的E4區(qū)。腺病毒易于生長和操作并在體外和體內(nèi)展示廣泛的宿主范圍。這組病毒可以以高效價獲得，例如，每毫升109-1012噬斑形成單位，并且它們是高度感染性的。腺病毒的生命周期不需要整合到宿主細(xì)胞基因組中。由腺病毒載體遞送的外來基因是附加體，因此對宿主細(xì)胞的遺傳毒性低。在用野生型腺病毒疫苗接種的研究中未報道有副作用(Couch等，1963；Top等，1971)，證明了它們作為體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移載體的安全性和治療潛力。腺病毒載體已經(jīng)用于真核基因表達(dá)(Levrero等，1991；Gomez-Foix等，1992)和疫苗開發(fā)(Grunhaus和Horwitz，1992；Graham和Prevec，1991)。動物研究表明，重組腺病毒可用于基因治療(Stratford-Perricaudet和Perricaudet，1991；Stratford-Perricaudet等，1990；Rich等，1993)。將重組腺病毒施用于不同組織的研究包括氣管滴注(Rosenfeld等，1991；Rosenfeld等，1992)、肌肉注射(Ragot等，1993)、外周靜脈內(nèi)注射(Herz和Gerard，1993)以及腦內(nèi)立體定向(stereotactic)接種(LeGalLaSalle等，1993)。逆轉(zhuǎn)錄病毒是一組單鏈RNA病毒，其特征在于通過逆轉(zhuǎn)錄過程將其RNA轉(zhuǎn)化為感染細(xì)胞中雙鏈DNA的能力(Coffin，1990)。然后所得DNA穩(wěn)定整合到細(xì)胞染色體中作為前病毒并指導(dǎo)病毒蛋白的合成。整合導(dǎo)致在接受細(xì)胞及其后代中保留病毒基因序列。逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組含有分別編碼衣殼蛋白、聚合酶和包膜組分的三個基因gag、pol和env。在gag基因上游發(fā)現(xiàn)的序列含有用于將基因組包裝到病毒體中的信號。病毒基因組的5’和3’端有兩個長末端重復(fù)(longterminalrepeat，LTR)序列。這些含有強(qiáng)啟動子和增強(qiáng)子序列，并且也是整合到宿主細(xì)胞基因組中所必需的(Coffin，1990)。為了構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，將編碼目的基因的核酸插入病毒基因組某些病毒序列位置處以產(chǎn)生復(fù)制缺陷型病毒。為了產(chǎn)生病毒體，構(gòu)建了含有g(shù)ag、pol和env基因但無LTR的包裝細(xì)胞系和包裝組分(Mann等，1983)。當(dāng)將含有cDNA的重組質(zhì)粒與逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR和包裝序列一起引入(例如通過磷酸鈣沉淀)該細(xì)胞系中時，包裝序列使重組質(zhì)粒的RNA轉(zhuǎn)錄本包裝成病毒顆粒，然后其分泌到培養(yǎng)基中(Nicolas和Rubenstein，1988；Temin，1986；Mann等，1983)。然后收集含有重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的培養(yǎng)基，任選地濃縮，并用于基因轉(zhuǎn)移。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能夠感染多種細(xì)胞類型。然而，整合和穩(wěn)定表達(dá)需要宿主細(xì)胞分裂(Paskind等，1975)?；谀孓D(zhuǎn)錄病毒的化學(xué)修飾，通過將乳糖殘基化學(xué)添加至病毒包膜，最近開發(fā)了設(shè)計為使逆轉(zhuǎn)錄病毒載體特異性靶向的新方法。這種修飾可使得通過唾液酸糖蛋白受體特異性感染肝細(xì)胞。設(shè)計了重組逆轉(zhuǎn)錄病毒靶向的另一種方法，其中使用針對逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白和針對特定細(xì)胞受體的生物素化抗體。該抗體用鏈霉親和素通過生物素組分偶聯(lián)(Roux等，1989)。使用針對主要組織相容性復(fù)合體I類和II類抗原的抗體，他們證明在體外用同向性病毒感染帶有那些表面抗原的多種人細(xì)胞(Roux等，1989)。在本發(fā)明的所有方面中使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體存在某些限制。例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體通常整合到細(xì)胞基因組中的隨機(jī)位點中。這可通過中斷宿主基因或通過插入可以干擾側(cè)翼基因功能的病毒調(diào)節(jié)序列而導(dǎo)致插入誘變(Varmus等，1981)。使用缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的另一個問題是在包裝細(xì)胞中潛在出現(xiàn)有復(fù)制能力的野生型病毒。這可能由其中來自重組病毒的完整序列插入整合在宿主細(xì)胞基因組中的gag、poi、env序列的上游的重組事件引起。然而，現(xiàn)在已有的新的包裝細(xì)胞系可大大降低重組的可能性(Markowitz等，1988；Hersdorffer等，1990)。另一些病毒載體可用作本發(fā)明中的表達(dá)構(gòu)建體?？刹捎醚苌砸韵虏《镜妮d體：例如痘苗病毒(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1988)、腺相關(guān)病毒(AAV)(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Hermonat和Muzycska，1984)和皰疹病毒。它們?yōu)槎喾N哺乳動物細(xì)胞提供了數(shù)個有吸引力的特征(Friedmann，1989；Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1988；Horwich等，1990)。為了實現(xiàn)有義或反義基因構(gòu)建體的表達(dá)，必須將表達(dá)構(gòu)建體遞送到細(xì)胞中。這種遞送可以在體外實現(xiàn)，如在用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的實驗室過程中，或者在體內(nèi)或離體實現(xiàn)，如在某些疾病狀態(tài)的治療中。一種遞送機(jī)制是通過病毒感染，其中表達(dá)構(gòu)建體被包封在感染性病毒顆粒中。本發(fā)明也構(gòu)想了用于將表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞中的數(shù)種非病毒方法。這些包括磷酸鈣沉淀(Graham和VanDerEb，1973；Chen和Okayama，1987；Rippe等，1990)、DEAE-葡聚糖(Gopal，1985)、電穿孔(Tur-Kaspa等，1986；Potter等，1984)、直接顯微注射(Harland和Weintraub，1985)、負(fù)載DNA的脂質(zhì)體(Nicolau和Sene，1982；Fraley等，1979)和lipofectamine-DNA復(fù)合體、細(xì)胞超聲(Fechheimer等，1987)、使用高速微粒的基因轟擊(Yang等，1990)和受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Wu和Wu，1987；Wu和Wu，1988)。這些技術(shù)中的一些可以成功地適于體內(nèi)或離體使用。一旦表達(dá)構(gòu)建體已被遞送到細(xì)胞中，編碼目的基因的核酸可以在不同位點定位和表達(dá)。在某些實施方案中，編碼基因的核酸可以穩(wěn)定整合到細(xì)胞的基因組中。這種整合可以通過同源重組(基因置換)處于同源的位置和方向，或者其可整合到隨機(jī)的非特異性位置中(基因增強(qiáng))。在另一些實施方案中，核酸可以作為單獨的DNA的附加體區(qū)段穩(wěn)定地保持在細(xì)胞中。這樣的核酸區(qū)段或“附加體”編碼這樣的序列，所述序列足以允許獨立于宿主細(xì)胞周期或與宿主細(xì)胞周期同步地維持和復(fù)制。如何將表達(dá)構(gòu)建體遞送至細(xì)胞以及在細(xì)胞中核酸保留在何處取決于所使用的表達(dá)構(gòu)建體的類型。在本發(fā)明的另一個實施方案中，表達(dá)構(gòu)建體可以簡單地由裸重組DNA或質(zhì)粒組成。構(gòu)建體的轉(zhuǎn)移可以通過上述的物理或化學(xué)滲透細(xì)胞膜的任何方法進(jìn)行。這尤其適用于體外轉(zhuǎn)移，但也可以應(yīng)用于體內(nèi)使用。Dubensky等(1984)成功地將磷酸鈣沉淀形式的多瘤病毒DNA注射到成年和新生小鼠的肝和脾中，證明活性病毒復(fù)制和急性感染。Benvenisty和Neshif(1986)也證明直接腹膜內(nèi)注射磷酸鈣沉淀的質(zhì)粒導(dǎo)致轉(zhuǎn)染的基因表達(dá)?？梢栽O(shè)想，編碼目的基因的DNA也可以以類似的方式在體內(nèi)轉(zhuǎn)移并表達(dá)基因產(chǎn)物。在用于將裸DNA表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中之本發(fā)明的另一個實施方案中，可以涉及粒子轟擊。這種方法取決于將DNA包被的微粒加速到高速以使其穿刺細(xì)胞膜并進(jìn)入細(xì)胞而不殺傷細(xì)胞的能力(Klein等，1987)。已經(jīng)開發(fā)了用于加速小顆粒的幾種裝置。一種這樣的裝置依賴于高電壓放電以產(chǎn)生電流，其進(jìn)而提供動力(Yang等，1990)。所用的微粒由生物惰性物質(zhì)(例如鎢或金珠)組成。選擇的器官(包括大鼠和小鼠的肝、皮膚和肌肉組織)在體內(nèi)被轟擊(Yang等，1990；Zelenin等，1991)。這可能需要組織或細(xì)胞的手術(shù)暴露以消除槍和靶器官之間的任何中間組織，即離體處理。同樣，編碼特定基因的DNA可以通過該方法遞送，并且仍通過本發(fā)明并入。在本發(fā)明的另一個實施方案中，表達(dá)構(gòu)建體可以包載在脂質(zhì)體中。脂質(zhì)體是以磷脂雙層膜和內(nèi)部水性介質(zhì)為特征的囊狀結(jié)構(gòu)。多層脂質(zhì)體具有通過水性介質(zhì)分離的多個脂質(zhì)層。當(dāng)磷脂懸浮在過量的水溶液中時，它們自發(fā)形成。脂質(zhì)組分在形成閉合結(jié)構(gòu)之前經(jīng)歷自身重排，并且在脂質(zhì)雙層之間包載水和溶解的溶質(zhì)(Ghosh和Bachhawat，1991)。還構(gòu)想了lipofectamine-DNA復(fù)合體。脂質(zhì)體介導(dǎo)的體外核酸遞送和外來DNA的表達(dá)已經(jīng)非常成功。Wong等(1980)證明在培養(yǎng)的雞胚、HeLa和肝瘤細(xì)胞中脂質(zhì)體介導(dǎo)的遞送和外來DNA的表達(dá)的可行性。Nicolau等(1987)在靜脈內(nèi)注射后在大鼠中實現(xiàn)了成功的脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。稱為Lipofectamine2000fM的試劑被廣泛使用并可商購。在本發(fā)明的某些實施方案中，脂質(zhì)體可以與血凝病毒(hemagglutinatingvirus，HVJ)復(fù)合。這已經(jīng)示出促進(jìn)與細(xì)胞膜的融合和促進(jìn)脂質(zhì)體包封的DNA的細(xì)胞進(jìn)入(Kaneda等，1989)。在另一些實施方案中，脂質(zhì)體可以與核的非組蛋白染色體蛋白(HMG-1)復(fù)合或聯(lián)合使用(Kato等，1991)。在另一些實施方案中，脂質(zhì)體可以與HVJ和HMG-1二者復(fù)合或聯(lián)合使用。由于這種表達(dá)構(gòu)建體已經(jīng)成功地用于體外和體內(nèi)核酸的轉(zhuǎn)移和表達(dá)，因此它們適用于本發(fā)明。當(dāng)在DNA構(gòu)建體中使用細(xì)菌啟動子時，也期望在脂質(zhì)體內(nèi)包括合適的細(xì)菌聚合酶。可用于將編碼特定基因的核酸遞送到細(xì)胞中的另一些表達(dá)構(gòu)建體是受體介導(dǎo)的遞送載體。這些載體利用在幾乎所有真核細(xì)胞中通過受體介導(dǎo)的胞吞作用選擇性攝取大分子。由于多種受體的細(xì)胞類型特異性分布，因此遞送可以是高度特異性的(Wu和Wu，1993)。受體介導(dǎo)的基因靶向載體通常由兩種組分組成：細(xì)胞受體特異性配體和DNA結(jié)合劑。幾種配體已經(jīng)用于受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。最廣泛表征的配體是無唾液酸血清類粘蛋白(asialoorosomucoid，ASOR)(Wu和Wu，1987)和轉(zhuǎn)鐵蛋白(Wagner等，1990)。與ASOR識別相同的受體的合成擬糖蛋白已經(jīng)用作基因遞送載體(Ferkol等，1993；Perales等，1994)，而表皮生長因子(EGF)也已經(jīng)用于遞送基因至鱗狀癌細(xì)胞(Myers，EP0273085)。IV.藥物組合物和遞送方法當(dāng)構(gòu)想臨床應(yīng)用時，藥物組合物將以適于預(yù)期應(yīng)用的形式制備。通常，這將需要制備基本上不含熱原以及可能對人或動物有害的其他雜質(zhì)的組合物。通常期望使用合適的鹽和緩沖液以使藥物、蛋白質(zhì)或遞送載體穩(wěn)定并允許被靶細(xì)胞攝取。本發(fā)明的水性組合物包含溶解或分散在可藥用載體或水性介質(zhì)中的有效量的藥物、載體或蛋白質(zhì)。短語“可藥用的或藥理學(xué)上可接受的”是指當(dāng)向動物或人施用時不產(chǎn)生不利的、變應(yīng)性的或其他不良反應(yīng)的分子實體和組合物。如本文所用，“可藥用的載體”包括用于配制藥物(例如適合向人施用的藥物)的可接受的溶劑、緩沖液、溶液、分散介質(zhì)、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。這種介質(zhì)和試劑用于藥物活性物質(zhì)的用途是本領(lǐng)域公知的。除非任何常規(guī)介質(zhì)或試劑與本發(fā)明的活性成分不相容，否則構(gòu)想其在治療組合物中的用途。補(bǔ)充的活性成分也可并入組合物中，只要它們不使組合物的載體或細(xì)胞失活。本發(fā)明的活性組合物可包括經(jīng)典的藥物制劑。根據(jù)本發(fā)明的這些組合物的施用可通過任何常見途徑，只要靶組織可通過該途徑獲得所述組合物即可，但通常包括全身施用。這包括經(jīng)口、經(jīng)鼻或口含(buccal)?；蛘撸┯每梢酝ㄟ^皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)注射，或通過直接注射到肌肉組織中進(jìn)行。如上所述，這樣的組合物通常作為可藥用組合物施用?；钚曰衔镆部山?jīng)腸胃外或腹膜內(nèi)施用。例如，作為游離堿或藥理學(xué)上可接受的鹽的活性化合物的溶液可在水中與表面活性劑(例如羥丙基纖維素)適當(dāng)?shù)鼗旌隙苽洹７稚Ⅲw也可以在甘油、液體聚乙二醇、及其混合物中以及在油中制備。在普通的儲存和使用條件下，這些制備物通常含有防腐劑以防止微生物的生長?？蛇m于注射使用的藥物形式包括例如無菌水溶液或分散體和用于臨時制備無菌可注射溶液或分散體的無菌粉末。通常，這些制備物是無菌的和流動的，達(dá)到容易注射的程度。制備物在制造和儲存條件下應(yīng)當(dāng)是穩(wěn)定的，并且應(yīng)當(dāng)防止微生物(例如細(xì)菌和真菌)的污染作用。合適的溶劑或分散介質(zhì)可含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)、其合適的混合物，和植物油?？赏ㄟ^例如使用包衣(例如卵磷脂)，通過在分散體的情況下維持所需的粒徑并通過使用表面活性劑來保持適當(dāng)?shù)牧鲃有?。微生物作用的預(yù)防可通過多種抗菌抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等來實現(xiàn)。在許多情況下，優(yōu)選包括等滲劑，例如糖或氯化鈉?？勺⑸浣M合物的延長吸收可通過在組合物中使用延遲吸收的試劑(例如單硬脂酸鋁和明膠)來實現(xiàn)?？赏ㄟ^將適量的活性化合物以及所期望的任何其他成分(例如如上所列的)一起并入溶劑中，隨后過濾滅菌來制備無菌可注射溶液。通常，通過將多種滅菌的活性成分并入含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)和所需的其他成分(例如，如上面列舉的)的無菌載體中制備分散體。在用于制備無菌注射溶液的無菌粉末的情況下，優(yōu)選的制備方法包括真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，其產(chǎn)生來自其之前無菌過濾溶液的活性成分的粉末以及任何另外的所需成分。本發(fā)明的組合物通常可配制成中性或鹽形式。可藥用鹽包括例如衍生自無機(jī)酸(例如，鹽酸或磷酸)，或衍生自有機(jī)酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)的酸加成鹽(與蛋白質(zhì)的游離氨基形成)。與蛋白質(zhì)的游離羧基形成的鹽也可衍生自無機(jī)堿(例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵)或衍生自有機(jī)堿(例如異丙胺、三甲胺、組氨酸、普魯卡因等)。在配制時，優(yōu)選以與劑量制劑相容的方式和以治療有效的量施用溶液。制劑可易于以多種劑型施用，例如可注射溶液、藥物釋放膠囊等。對于水溶液中的腸胃外施用，例如，溶液通常進(jìn)行適當(dāng)?shù)鼐彌_，并且首先例如用足夠的鹽水或葡萄糖使液體稀釋劑等滲。這樣的水溶液可用于例如靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下和腹膜內(nèi)施用。優(yōu)選地，特別是根據(jù)本公開內(nèi)容，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的無菌水性介質(zhì)。例如，單劑量可溶解在1ml的等滲NaCl溶液中，并且添加至1000ml的皮下輸液液體(hypodermoclysisfluid)或在所推薦的輸注部位注射(參見例如“Remington’sPharmaceuticalSciences”第15版，第1035-1038頁和第1570-1580頁)。根據(jù)被治療的對象的病癥，劑量將必然發(fā)生一些變化。在任何情況下，負(fù)責(zé)施用的人將確定個體對象的適當(dāng)劑量。此外，對于人施用，制備物應(yīng)滿足FDA生物制品標(biāo)準(zhǔn)辦公室(FDAOfficeofBiologicsstandards)要求的無菌性、熱原性、整體安全性和純度標(biāo)準(zhǔn)。V.實施例包括以下實施例以證明本公開內(nèi)容的一些優(yōu)選實施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，以下實施例中公開的技術(shù)代表由本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的用于實施本公開內(nèi)容的運行良好的技術(shù)，因此被認(rèn)為是實施本發(fā)明的一些優(yōu)選方式。然而，根據(jù)本公開內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，在不脫離本公開內(nèi)容的精神和范圍的情況下，可以在所公開的具體實施方案中進(jìn)行許多改變，并且仍然獲得相同或相似的結(jié)果。實施例1-材料和方法質(zhì)粒。含有人密碼子優(yōu)化的Cas9基因的hCas9質(zhì)粒(Addgene質(zhì)粒41815)和含有sgRNA骨架的gRNA克隆載體質(zhì)粒(Addgene質(zhì)粒41824)均購自Addgene。根據(jù)ChurchLabCRISPR質(zhì)粒說明(萬維網(wǎng)網(wǎng)址addgene.org/crispr/church/)進(jìn)行sgRNA的克隆。Cas9mRNA和sgRNA的體外轉(zhuǎn)錄。通過PCR將T3啟動子序列添加到hCas9編碼區(qū)。根據(jù)制造商的說明書，將T3-hCas9PCR產(chǎn)物凝膠純化并亞克隆到pCRII-TOPO載體(Invitrogen)中。線性化的T3-hCas9質(zhì)粒用作用于使用mMESSAGEmMACHINET3轉(zhuǎn)錄試劑盒(LifeTechnologies)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄的模板。通過PCR將T7啟動子序列添加到sgRNA模板。使用凝膠純化的PCR產(chǎn)物作為使用MEGAshortscriptT7試劑盒(LifeTechnologies)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄的模板。通過MEGAclear試劑盒(LifeTechnologies)純化hCas9RNA和sgRNA，并用無核酸酶的水(Ambion)洗脫。通過NanoDrop儀器(ThermoScientific)測量RNA的濃度。單鏈寡脫氧核苷酸(ssODN)。使用ssODN作為HDR模板并且以UltramerDNA寡核苷酸購自IntegratedDNATechnologies。將ssODN與Cas9mRNA和sgRNA直接混合而不進(jìn)行純化。ssODN的序列列于表S1中。通過單細(xì)胞胚胎注射之CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯。所有動物程序都得到德克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心(University0fTexasSouthwesternMedicalCenter)的實驗動物照管及使用委員會(InstitutionalAnimalCareandUseCommittee)批準(zhǔn)。B6C3F1(C57BL/6NCr雌性XC3H/HeNMTV雄性)、C57BL/6NCr和C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J是用作卵母細(xì)胞供體的三個小鼠品系。將超數(shù)排卵(Superovulate)的雌性B6C3F1小鼠(6周齡)與B6C3F1配種飼養(yǎng)的雄性交配。將超數(shù)排卵的雌性C57BL/6NCr雌性(12-18克)與C57BL/6NCr雄性交配，并將超數(shù)排卵的雌性純合子C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J(12-18克)與半合子C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J配種飼養(yǎng)的雄性交配。收獲合子并在37℃下在M16培養(yǎng)基(用于卵子培養(yǎng)的Brinster培養(yǎng)基，其中有100U/ml青霉素和50mg/ml鏈霉素)中保持1小時。將合子轉(zhuǎn)移到M2培養(yǎng)基(M16培養(yǎng)基和20mMHEPES)并注射hCas9mRNA、sgRNA和ssODN。將Cas9/sgRNA僅注射到原核(稱為Nuc)或原核和細(xì)胞質(zhì)(稱為Nuc+Cyt)中。通過Nuc或Nuc+Cyt將不同劑量的Cas9mRNA、sgRNA和ssODN注射入合子(如表S2中詳述)。將注射的合子在37℃下在M16培養(yǎng)基中培養(yǎng)1小時，然后轉(zhuǎn)移到假孕ICR雌性小鼠的輸卵管中。基因組DNA的分離。將尾組織活檢物添加到100μl的25mMNaOH/0.2mMEDTA溶液，并在95℃下放置15分鐘，然后冷卻至室溫。在添加100μl的40mMTris-HCl(pH5.5)后，將試管在15,000×g下離心5分鐘。將DNA樣品保存在4℃下數(shù)周或在-20℃下長期儲存。根據(jù)制造商的說明書，使用TRIzol(LifeTechnologies)從肌肉中分離基因組DNA。通過PCR擴(kuò)增靶基因組區(qū)。PCR測定含有2μl的GoTaq(Promega)、20μl的5XGreenGoTaq反應(yīng)緩沖液、8μl的25mMMgCl2、2μl的10μM引物(DMD729F和DMD729R)(表S1)、2μl的10mMdNTP、4μl的基因組DNA以及ddH2O至100μl。PCR條件為：94℃2分鐘；32X(94℃15秒，59℃30秒，72℃1分鐘)；72℃7分鐘；然后是4℃。通過2％瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，并使用QIAquickPCR純化試劑盒(Qiagen)從凝膠中純化以用于直接測序。根據(jù)制造商的說明書，將這些PCR產(chǎn)物亞克隆到pCRII-TOPO載體(Invitrogen)中。挑取個體克隆并對DNA進(jìn)行測序。PCR產(chǎn)物的RFLP分析。將由20μl的基因組PCR產(chǎn)物、3μl的10XNEB緩沖液CS和1μl的TseI(NewEnglandBioLabs)組成的消化反應(yīng)物在65℃下孵育1小時，并通過2％瓊脂糖凝膠電泳分析。來自野生型DNA的消化PCR產(chǎn)物為581bp，而來自F0小鼠的HDR介導(dǎo)的基因組編輯DNA示出約437bp的額外產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物的T7E1分析。通過使用以下條件使25μl的基因組PCR樣品變性/復(fù)性來獲得錯配的雙鏈體DNA：95℃10分鐘，95℃至85℃(-2.0℃/秒)，85℃1分鐘，85℃至75℃(-0.3℃/秒)，75℃1分鐘，75℃至65℃(-0.3℃/秒)，65℃1分鐘，65℃至55℃(-0.3℃/秒)，55℃1分鐘，55℃至45℃(-0.3℃/秒)，45℃1分鐘，45℃至35℃(-0.3℃/秒)，35℃1分鐘，35℃至25℃(-0.3℃/秒)，25℃1分鐘，保持在4℃。在變性/復(fù)性后，向樣品添加以下物質(zhì)：3μl的10XNEB緩沖液2、0.3μl的T7E1(NewEnglandBioLabs)和ddH2O至30μl。將消化反應(yīng)物在37℃下孵育1小時。通過2％瓊脂糖凝膠電泳分析未消化的PCR樣品和T7E1消化的PCR產(chǎn)物。未消化的PCR產(chǎn)物是729bp，而來自具有錯配DNA的F0小鼠的基因組DNA示出在約440bp和290bp處的兩個額外的消化產(chǎn)物。握力測試。通過由德克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心(UTSouthwesternMedicalCenter)的Neuro-ModelsCoreFacility進(jìn)行的握力行為工作來評估肌肉力量。將小鼠從籠中取出，稱重并從尾部提起，從而使前肢抓住與握力強(qiáng)度計(ColumbusInstruments)連接的拉桿組件。沿著遠(yuǎn)離傳感器的直線拉小鼠，直到握力下降，并記錄以克計的力的峰值量。重復(fù)5次。血清肌酸激酶(CK)測量。從頜下靜脈收集血液，通過VITROS化學(xué)產(chǎn)品CK載玻片測量血清CK水平以使用VITROS250化學(xué)系統(tǒng)定量測量CK活性。肌肉的組織學(xué)分析。分別解剖來自野生型、mdx和校正的mdx-C小鼠的骨骼肌，并在黃蓍膠粉末(Sigma-Aldrich)與組織冷凍培養(yǎng)基(TissueFreezingMedium，TFM)(TriangleBioscience)的1∶2體積混合物中冷凍包埋(cryoembed)。心臟在TFM中冷凍包埋。將所有包埋物在異戊烷熱提取劑中快速冷凍過度冷卻至-155℃。在切片前將所得團(tuán)塊(block)在-80℃下儲存過夜。在LeicaCM3050低溫恒溫器上制備骨骼肌的八微米橫切片和心臟的前切片(frontalsection)，并在染色同一天前風(fēng)干。根據(jù)已建立的染色方案進(jìn)行H&E染色，并且使用MANDYS8單克隆抗血清(Sigma-Aldrich)進(jìn)行肌養(yǎng)蛋白免疫組織化學(xué)，其中對制造商的說明進(jìn)行了修改。簡言之，將恒冷切片解凍并在1％triton/磷酸鹽緩沖鹽水，pH7.4(PBS)中再水化/脫脂。在脫脂后，洗滌切片除去Triton，用小鼠IgG封閉試劑(M.O.M.試劑盒，VectorLaboratories)孵育、洗滌并用MOM蛋白濃縮物/PBS和在MOM蛋白濃縮物/PBS中1∶1800稀釋的MANDYS8依次平衡。在4℃下孵育一抗過夜后，洗滌切片，與MOM生物素化的抗小鼠IgG一起孵育、洗滌并通過孵育Vector熒光素-抗生物素蛋白DCS完成檢測。在用Vectashield覆片之前，用碘化丙啶(MolecularProbes)對核進(jìn)行復(fù)染色。成像和分析。用配有落射熒光照明(epifluiorescenceillumination)、CRI色輪和ZeissAxiocam單色CCD照相機(jī)的ZeissAxioplan2iE直立照相顯微鏡觀察試樣。使用OpenLab4.0采集和控制軟件(Perkin-Elmer)捕獲4x、10x和20x物鏡放大視野，并進(jìn)一步用于應(yīng)用指示的偽彩色和合并圖像疊加。將圖像用AdobePhotoshopCS2調(diào)整峰值水平并保存用于圖像分析。使用ImageJ1.47來應(yīng)用立體形態(tài)測量隨機(jī)化網(wǎng)格疊加并使用軟件的計數(shù)函數(shù)對每個肌肉組的約500個聚集肌纖維(來自最少三個間隔切片)的肌養(yǎng)蛋白陽性和陰性免疫染色進(jìn)行標(biāo)記和評分。還用ImageJ1.47分析每種基因型的比目魚肌H&E染色切片的尺寸和特征。簡言之，對115+個立體隨機(jī)化的肌纖維的肌膜邊界進(jìn)行手動勾畫，計算其截面積，并記錄中央核表型。Western印跡分析。解剖肌肉并在液氮中快速冷凍。按照(Nicholson等，1989和Kodippili等，2014)所述(進(jìn)行了修改)來進(jìn)行蛋白質(zhì)提取和Western印跡分析。將樣品用勻化器(POLYTRONSystemPT1200E)在含有10％SDS、62.5mMTris、1mMEDTA和蛋白酶抑制劑(Roche)的400μL樣品緩沖液中勻化2X20秒。使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒(Pierce)測量蛋白質(zhì)濃度。將每個肌肉樣品的50微克蛋白質(zhì)上樣到梯度SDS-PAGE(Bio-Rad)上。將凝膠在100V下運行2.5小時。將分離的蛋白質(zhì)在冷藏室(4℃)中在35V下轉(zhuǎn)移到PVDF膜過夜。使用2％麗春紅對PVDF膜的總蛋白進(jìn)行染色，然后在25℃下在溫和搖動下用5％w/v脫脂奶粉、1XTBS、0.1％Tween-20(TBST)封閉1小時。將封閉的膜與小鼠抗肌養(yǎng)蛋白單克隆抗體(MANDYS8，Sigma-Aldrich，在5％奶/TBST中1∶1000稀釋)在4℃下孵育過夜，然后在TBST中洗滌。然后將印跡與辣根過氧化物酶綴合的山羊抗小鼠IgG二抗(Bio-Rad，1∶10,000稀釋)在25℃下孵育1小時。用TBST洗滌后，將印跡暴露于WesternBlottingLuminol試劑(SantaCruzBiotech)1分鐘以檢測信號。通過抗GAPDH抗體(Millipore，1∶10,000稀釋)監(jiān)測蛋白質(zhì)上樣。脫靶位點的深度測序。使用表S1中列出的針對(A)mdx(B)mdx+Cas9(C)WT和(D)WT+Cas9的引物通過PCR擴(kuò)增脫靶基因座。PCR產(chǎn)物通過MinElutePCR純化試劑盒(QIAGEN)純化，調(diào)節(jié)至相同濃度(10ng/μL)，并且對于每組合并等體積(5μL)。根據(jù)制造商的說明書(KAPALibraryPreparationKitswithstandardPCRlibraryamplificationmodule，KapaBiosystems)進(jìn)行文庫制備。在來自Illumina的Hiseq2500上進(jìn)行測序并使用RapidMode150PE化學(xué)運行。使用BWA(bio-bwa.sourceforge.net/)對測序讀數(shù)制圖。保留了制圖質(zhì)量大于30的讀數(shù)以用于變體發(fā)現(xiàn)。所有區(qū)域和所有樣品的平均讀數(shù)深度為2570倍。使用SAMtools(samtools.sourceforge.net/)和自定義腳本對這些變體命名。在每個區(qū)域中，在以Cas9潛在切割位點為中心的50-bp窗口中對3個堿基對或更長的插入和缺失進(jìn)行計數(shù)。衛(wèi)星細(xì)胞的激光顯微解剖。來自腓腸肌冷凍包埋物的冷凍切片被裝在聚乙烯膜框架載玻片(LeicaMicrosystemsPET-Foil11505151)上進(jìn)行同日設(shè)置(same-dayset-up)的Pax-7免疫組織化學(xué)。按照(Murphy等2011)所述(進(jìn)行了修改)使用單克隆Pax-7抗體(DevelopmentalStudiesHybridomaBank)對PET箔膜框架載玻片進(jìn)行抗原修復(fù)(Gjerdrum等，2001)。簡言之，將腓腸肌冷凍切片風(fēng)干，用4％的多聚甲醛固定、Triton-X100脫脂并在抗原修復(fù)緩沖液(檸檬酸鈉緩沖液pH6.0)中在65℃下孵育20小時。在抗原修復(fù)后，用0.6％的過氧化氫淬滅切片，除去內(nèi)源性過氧化物酶，并與小鼠IgG封閉試劑(M.O.M試劑盒，VectorLaboratories)一起孵育，用PBS洗滌，與MOM蛋白濃縮物/PBS一起孵育，然后與Pax-7抗體(2μg/ml)在MOM蛋白濃縮物/PBS中在4℃下過夜孵育。用PBS洗滌切片并與MOM生物素化的抗小鼠IgG、鏈霉親和素-過氧化物酶(VectorLaboratories)孵育，并用二氨基聯(lián)苯胺發(fā)色團(tuán)(DAB，Dako)顯色。用無核酸酶的Mayer蘇木精對核進(jìn)行復(fù)染。使用LeicaAS-LMD顯微鑒定Pax-7陽性衛(wèi)星細(xì)胞，并通過激光顯微解剖在63x物鏡放大下分離。對于每種基因型，分離60至70個Pax-7陽性衛(wèi)星細(xì)胞，并合并到10μl的捕獲緩沖液中(DirectPCRLysisReagent，ViagenBiotechInc.)并儲存在-20℃。如上所述，使用引物DMD232_f和DMD232_r(表S1)通過PCR擴(kuò)增靶基因組區(qū)。實施例2-結(jié)果本研究的目的是通過體內(nèi)CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯來校正mdx小鼠Dmd基因中的遺傳缺陷。mdx小鼠(C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J)在Dmd基因的外顯子23中含有無義突變(14，15)(圖1A)。本發(fā)明人將Cas9、sgRNA和HDR模板注射到小鼠合子中以校正種系中的致病基因突變(16，17)，這種策略具有校正身體所有細(xì)胞(包括肌源性祖細(xì)胞)中突變的潛力。還評估了基于CRISPR/Cas9的基因治療的安全性和效力。最初，本發(fā)明人測試了在野生型小鼠(C57BL6/C3H和C57BL/6)中CRISPR/Cas9介導(dǎo)的Dmd基因編輯的可行性并優(yōu)化了條件。本發(fā)明人設(shè)計了靶向Dmd外顯子23的sgRNA(圖4A)和作為用于HDR介導(dǎo)的基因修復(fù)之模板的單鏈寡脫氧核苷酸(ssODN)(圖4B和表S1)。將野生型合子與Cas9mRNA、sgRNA-DMD和ssODN共注射，然后植入假孕雌性小鼠中。對來自后代小鼠的對應(yīng)于Dmd外顯子23的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物進(jìn)行測序(圖4C-E)。CRISPR/Cas9介導(dǎo)的Dmd基因編輯的效率在表S2中示出。本發(fā)明人接下來將優(yōu)化的CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯方法應(yīng)用于mdx小鼠(圖1B)。CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯系統(tǒng)將在胚胎發(fā)育期間通過HDR或NHEJ校正mdx小鼠中的點突變(圖1C-D和圖5A)。通過RFLP分析和錯配特異性T7內(nèi)切核酸酶I(T7E1)測定(圖1E，表S2)來鑒定“校正的”mdx后代(稱為mdx-C)。本發(fā)明人分析了總共11只不同的mdx-C小鼠。對來自用HDR介導(dǎo)的基因校正的七只mdx-C小鼠(稱為mdx-C1至C7)和含有NHEJ介導(dǎo)的終止密碼子之框內(nèi)缺失的四只mdx-C小鼠(稱為mdx-N1至N4)的Dmd外顯子23的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。測序結(jié)果揭示，CRISPR/Cas9介導(dǎo)的種系編輯產(chǎn)生表現(xiàn)出Dmd基因2％至100％校正的遺傳性鑲嵌mdx-C小鼠(圖1E和圖5B-C)。如果在合子階段后發(fā)生CRISPR/Cas9介導(dǎo)的修復(fù)，則發(fā)生大范圍的鑲嵌現(xiàn)象，從而導(dǎo)致一組胚胎細(xì)胞中的基因組編輯(Yen等，2014)。所有小鼠后代發(fā)育成成體，沒有腫瘤生長的跡象或其他異常表型。本發(fā)明人測試了四個不同的小鼠組之CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯的可能的脫靶效應(yīng)：(a)未處理的mdx小鼠(稱為mdx)，(b)CRISPR/Cas9編輯的mdx小鼠(稱為mdx+Cas9)，(c)未處理的野生型對照小鼠(C57BL6/C3H)(稱為WT)和(d)CRISPR/Cas9編輯的野生型小鼠(稱為WT+Cas9)(圖6A)。通過CRISPR設(shè)計工具(crispr.mit，edu/)預(yù)測小鼠基因組中靶位點(Dmd外顯子23)的序列和總共32個潛在脫靶(OT)位點，并列于表S3中。稱為OT-01至OT-10的32個位點中的10個代表全基因組的十大命中(top-tenhits)。稱為OTE-01至OTE-22的32個位點中的22個位于外顯子內(nèi)。對應(yīng)于Dmd外顯子23的PCR產(chǎn)物的深度測序揭示了在B組和D組中高比率的HDR和NHEJ介導(dǎo)的遺傳修飾，但在對照組A和C中則沒有(圖6A和表S4)。在不同組之間的32個潛在脫靶區(qū)域中的插失突變的頻率沒有差異(圖6B-C，表S5)。這些結(jié)果也與最近的全基因組研究一致，表明通過Cas9的DNA切割不是混雜的(Wu等，2014；Kuscu等，2014；Duan等，2014)。因此，脫靶效應(yīng)在體內(nèi)比以前在體外可能是較小的問題(Pattanayak等，2013和Fu等，2013)。為了分析CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯對肌營養(yǎng)不良的發(fā)生的影響，本發(fā)明人對在7-9周齡時具有不同百分比的Dmd基因校正的來自野生型小鼠、mdx小鼠和三個選擇的mdx-C小鼠的四種不同肌肉類型(四頭肌、比目魚肌(后肢肌肉)、膈(呼吸肌)和心肌)進(jìn)行了組織學(xué)分析。mdx肌肉顯示肌營養(yǎng)不良的組織病理學(xué)標(biāo)志，包括纖維直徑、中央核、變性纖維、壞死纖維和礦化纖維以及間質(zhì)纖維化的變化(圖2、圖7A和8A)。免疫組織化學(xué)示出在mdx小鼠的骨骼肌或心臟中沒有肌養(yǎng)蛋白表達(dá)，而野生型小鼠在纖維和心臟的肌膜下區(qū)域中示出肌養(yǎng)蛋白表達(dá)(圖2)。盡管mdx小鼠攜帶Dmd基因的終止突變，但本發(fā)明人觀察到0.2-0.6％的回復(fù)纖維(revertantfiber)，與以前的報道(24)一致。通過HDR校正的具有41％mdx等位基因的mdx-C小鼠(稱為HDR-41％)或通過框內(nèi)NHEJ的具有83％校正的mdx-C小鼠(稱為NHEJ-83％)示出完全缺乏營養(yǎng)不良肌肉表型和在所有肌纖維的肌膜下區(qū)域中恢復(fù)肌養(yǎng)蛋白表達(dá)(圖2)。引人注目的是，僅17％的突變Dmd等位基因的校正(稱為HDR-17％)就足以使大多數(shù)肌纖維中的肌養(yǎng)蛋白表達(dá)與野生型小鼠的強(qiáng)度水平相當(dāng)，并且與mdx肌肉相比，肌肉展示較少的肌營養(yǎng)不良的組織病理學(xué)標(biāo)志(圖7A)。與僅17％的基因校正相關(guān)的顯著更高百分比(47-60％)的肌養(yǎng)蛋白陽性纖維(圖9A-B)表明校正的骨骼肌細(xì)胞的選擇性優(yōu)勢。Western印跡分析示出在mdx-C小鼠的骨骼肌(四頭肌)和心臟中恢復(fù)的肌養(yǎng)蛋白達(dá)到與肌養(yǎng)蛋白陽性纖維的百分比一致的水平(圖7B和圖9B)。為了比較隨著時間的挽救效率，本發(fā)明人選擇具有約40％挽救的可比鑲嵌現(xiàn)象的mdx-C小鼠。如圖10A所示，具有約40％HDR-介導(dǎo)的基因校正的3周mdx-C小鼠(稱為HDR-40％-3wks)在大多數(shù)肌養(yǎng)蛋白陽性纖維中示出偶爾的肌養(yǎng)蛋白陰性肌纖維。相反，在9周齡時在具有可比基因校正的小鼠中未觀察到肌養(yǎng)蛋白陰性纖維，表明在骨骼肌中隨年齡的進(jìn)行性挽救。在具有可比鑲嵌現(xiàn)象的mdx-C小鼠中，本發(fā)明人沒有觀察到3至9周齡之間心臟中肌養(yǎng)蛋白表達(dá)的顯著差異(圖10B)，表明年齡依賴性改善可能限于骨骼肌。骨骼肌中肌養(yǎng)蛋白表達(dá)的廣泛和進(jìn)行性挽救可能反映肌纖維的多核結(jié)構(gòu)，以使得具有經(jīng)校正的Dmd基因的一組核可補(bǔ)償具有Dmd突變的核。校正的衛(wèi)星細(xì)胞(骨骼肌的干細(xì)胞群)與營養(yǎng)不良纖維的融合也可能進(jìn)行性促進(jìn)營養(yǎng)不良肌肉的再生(Yin等，2013)。為了研究這種可能性，本發(fā)明人通過用Pax-7(一種用于衛(wèi)星細(xì)胞的特異性標(biāo)志物)進(jìn)行免疫染色，鑒定了mdx-C小鼠的肌肉切片中的衛(wèi)星細(xì)胞(圖11A)。本發(fā)明人使用激光顯微解剖來解剖Pax-7陽性衛(wèi)星細(xì)胞和分離的基因組DNA以用于PCR分析(圖3A和圖11B)。來自這些分離的衛(wèi)星細(xì)胞之對應(yīng)于Dmd外顯子23的PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果示出經(jīng)校正的Dmd基因(圖3B)。這些結(jié)果表明，CRISPR/Cas9基因組編輯校正衛(wèi)星細(xì)胞中的突變，從而使得這些肌肉干細(xì)胞挽救營養(yǎng)不良肌肉(圖3C和圖11C)。在野生型、mdx和mdx-C小鼠中測量了血清肌酸激酶(CK)，其是一種反映肌肉滲漏(muscleleakage)的肌營養(yǎng)不良的診斷標(biāo)志物。與組織學(xué)結(jié)果一致，與mdx小鼠相比，mdx-C小鼠的血清CK水平顯著降低，并且與基因組校正的百分比成反比(表1)。還對野生型、mdx和mdx-C小鼠進(jìn)行握力測試以測量肌肉性能，并且與mdx小鼠相比，mdx-C小鼠示出增強(qiáng)的肌肉性能(表1)。通過CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯(Myo編輯)的永久外顯子跳讀。對出生后組織中基因組編輯的挑戰(zhàn)是在有絲分裂后的細(xì)胞(例如肌纖維和心肌細(xì)胞)中不發(fā)生HDR。然而，NHEJ確實發(fā)生并且可用于破壞突變而不需要誘變的精確性。外顯子跳讀是一種其中基因的部分被“跳讀”的策略，從而使得產(chǎn)生部分功能性肌養(yǎng)蛋白(Aartsma-Rus，2012)。然而，傳統(tǒng)的反義寡核苷酸(AON)介導(dǎo)的瞬時外顯子跳讀具有寡核苷酸組織攝取的效率低、寡核苷酸終身遞送的需求和不完全外顯子跳讀的問題。為了克服這種挑戰(zhàn)，本發(fā)明人使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)破壞DMD突變之前的外顯子剪接位點或者刪除突變體或框外外顯子，從而使得周圍外顯子之間剪接以重建缺少突變的框內(nèi)肌養(yǎng)蛋白。通過永久校正引起DMD的遺傳損傷，基因組編輯僅需要將編輯組分一次遞送至心臟或骨骼肌。此外，肌肉功能隨時間的逐步改善使得在基因組編輯后長時間中發(fā)生肌肉功能的持續(xù)恢復(fù)。肌養(yǎng)蛋白的示意圖如圖12所示。這種3685個氨基酸的大蛋白含有數(shù)個表征充分的結(jié)構(gòu)域，包括在N-末端的肌動蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域、具有一系列血影蛋白樣重復(fù)和肌動蛋白結(jié)合重復(fù)的中心桿結(jié)構(gòu)域以及在C末端介導(dǎo)與肌養(yǎng)蛋白聚糖、小肌營養(yǎng)蛋白(dystrobrevin)和互養(yǎng)蛋白(syntrophin)結(jié)合的富含WW和半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域。重要的是，蛋白質(zhì)的許多區(qū)域?qū)_(dá)到外顯子跳讀策略的治療效力的功能是不必要的。因此，肌養(yǎng)蛋白的C-末端對于以下功能是必需的：恢復(fù)C-末端的外顯子跳讀策略可將DMD轉(zhuǎn)化為貝克肌營養(yǎng)不良(BeckerMuscularDystrophy，BMD)(一種不引起過早死亡或嚴(yán)重移動性喪失的相對溫和形式的疾病)，從而使得功能顯著改善?？紤]到在人中已經(jīng)鑒定出數(shù)千個單獨的DMD突變，一個明顯的問題是如何通過CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯容易地校正這樣大量的突變。為了克服該挑戰(zhàn)，本發(fā)明人提出使用CRISPR/Cas9破壞DMD突變前的剪接受體/供體位點或缺失突變外顯子，從而使得周圍外顯子之間剪接以重建缺乏突變的框內(nèi)肌養(yǎng)蛋白。該方法的示意圖在圖13中示出，其中NHEJ可產(chǎn)生內(nèi)部基因組缺失以校正開放閱讀框或可破壞剪接受體位點。該實施例示出了如何可以應(yīng)用該方法來繞過造成mdx小鼠營養(yǎng)不良表型的外顯子23突變，但是原則上可應(yīng)用于基因內(nèi)的多種類型的突變。據(jù)估計，多達(dá)80％的DMD患者可能潛在受益于外顯子跳讀策略以部分恢復(fù)肌養(yǎng)蛋白表達(dá)。在mdx小鼠種系上CRISPR/Cas9介導(dǎo)的永久Dmd外顯子跳讀。為了開始測試mdx小鼠中外顯子23突變的Myo編輯，本發(fā)明人首先產(chǎn)生了靶向外顯子23的5’端和3’端的sgRNA(sgRNA-L和R)的庫(圖14A)。NHEJ介導(dǎo)的插失可廢除保守的RNA剪接位點或缺失外顯子23。將這些引導(dǎo)RNA克隆到質(zhì)粒spCas9-2A-GFP(Addgene#48138)中。最初，本發(fā)明人評估了小鼠10T1/2細(xì)胞中引導(dǎo)RNA的效率。通過如前所述的T7E1測定檢測Myo編輯效率。外顯子23的sgRNA-R3靶標(biāo)3’端示出高活性。然后，在沒有HDR模板的情況下，他們將Cas9和引導(dǎo)RNAmdx以及R3共注射到mdx合子中(圖14B)。引人注目的是，9個后代小鼠中的7個在3’供體位點含有插失或缺失整個外顯子23(圖14C)。在以前的工作中，僅有～8％的mdx幼崽含有HDR介導(dǎo)的校正。使用新方法將效率顯著提高十倍。對來自外顯子23的靶位點的PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆和測序。結(jié)果表明，Myo編輯可有效地產(chǎn)生NHEJ介導(dǎo)的插失突變從而挽救肌養(yǎng)蛋白基因的開放閱讀框。一組NHEJ基因編輯的mdx小鼠具有廢除外顯子23中剪接位點的遺傳缺失。本發(fā)明人通過使用外顯子22和24中的引物對產(chǎn)生的RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序來分析這些小鼠可能的外顯子跳讀。測序結(jié)果示出外顯子22直接剪接至外顯子24，不包括外顯子23(圖15)。跳讀外顯子23的結(jié)果維持肌養(yǎng)蛋白的開放閱讀框并恢復(fù)蛋白質(zhì)表達(dá)(圖16)。外顯子23“跳讀(skipper)”小鼠(也稱為mdx-AE23小鼠)的RT-PCR產(chǎn)物的測序證實了對應(yīng)于缺乏外顯子23序列和肌養(yǎng)蛋白71個氨基酸的框內(nèi)缺失的213個核苷酸缺失。這些研究結(jié)果建立了使用NHEJ介導(dǎo)的基因組編輯以繞過Dmd基因中的許多不同突變之計劃的研究的重要概念證據(jù)。通過AAV介導(dǎo)的Myo編輯在小鼠中體內(nèi)挽救肌營養(yǎng)不良。AAV是用于安全遞送Cas9蛋白和引導(dǎo)RNA以對人骨骼肌和心臟進(jìn)行精確Myo編輯的最有前景和合適的載體之一。重要的是要強(qiáng)調(diào)這樣的問題：通過AAV遞送CRISPR/Cas9精確Myo編輯療法與優(yōu)化病毒遞送和基因組工程過程二者的效率緊密相關(guān)。本發(fā)明人集中于開發(fā)用于將CRISPR/Cas9基因組編輯機(jī)器體內(nèi)遞送至肌肉細(xì)胞的最高效價的AAV9制備物。這是一個有大量國際研究的領(lǐng)域(Senis等，2014；Schmidt&Grimm，2015)。本發(fā)明人使用經(jīng)驗證的引導(dǎo)RNA-mdx/R3來產(chǎn)生AAV9-引導(dǎo)RNA(圖17A)。他們獲得了獨特的AAV9CRISPR/Cas9載體(微小CMV-Cas9-短PolyA質(zhì)粒)(圖17B)。這種病毒構(gòu)建體使用盡可能最短的“微小”-CMV啟動子/增強(qiáng)子序列來驅(qū)動Cas9蛋白的表達(dá)。本發(fā)明人在mdx小鼠模型中體內(nèi)評估了這些重組病毒。他們系統(tǒng)地測試AAV9遞送的不同模式以及表達(dá)時間的變化以確定實現(xiàn)最大Dmd編輯的最佳方法。他們在不同年齡施用四種類型的注射途徑：(i)在P1時腹膜內(nèi)(IP)，(ii)在P10時肌內(nèi)(IM)，(iii)在P14時框后(RO)以及(iv)在P28時心內(nèi)(IC)。在圖17C中示出的時間點收獲心臟和骨骼肌。在概念驗證實驗中，本發(fā)明人通過P10小鼠的IM注射或P28的IC注射來注射重組AAV。在注射后3周，通過免疫染色分析肌肉組織的肌養(yǎng)蛋白表達(dá)，如圖18A所示。天然綠色熒光蛋白(GFP)指示在肌纖維中AAV介導(dǎo)的基因表達(dá)。經(jīng)注射小鼠的骨骼肌具有鄰近肌養(yǎng)蛋白陰性纖維簇的肌養(yǎng)蛋白陽性纖維簇的獨特模式。在IM-AAV后3周，在經(jīng)處理的mdx小鼠的脛骨前肌中估計肌纖維的轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率或挽救為7.7％±3.1％。(圖18B)來自mdx小鼠心臟的連續(xù)切片的天然GFP和肌養(yǎng)蛋白免疫染色示出在心肌細(xì)胞中的肌養(yǎng)蛋白表達(dá)(在IC-AAV后4周)。在IM-AAV后6周，估計肌纖維的轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率(挽救)提高到25.5％±2.9％(圖19)。在IM-AAV后3周至6周，觀察到隨著年齡的逐步改善，這與來自種系編輯的結(jié)果一致(圖10A)。在注射后4周和8周，通過免疫組織化學(xué)檢查在P14時通過眶后注射注射有重組AAV(RO-AAV)的小鼠的肌肉組織(圖20)。將肌養(yǎng)蛋白陽性纖維或肌細(xì)胞的百分比計算為總估計纖維的函數(shù)。在mdx小鼠中RO注射后4周，1.9％±0.51％的肌纖維是肌養(yǎng)蛋白陽性，而1.3％±0.05％的心肌細(xì)胞是肌養(yǎng)蛋白陽性。在RO-AAV后4周至8周觀察到隨著年齡的逐步改善。到RO-AAV后8周時，估計脛骨前肌中肌纖維的挽救提高至6.1±3.2％，而心肌細(xì)胞挽救提高至5.0％±2.1％。在P1mdx幼崽進(jìn)行IP注射后4周，通過免疫組織化學(xué)檢查骨骼肌和心臟(圖21)。在經(jīng)處理的mdx小鼠中，估計在脛骨前肌中的肌纖維的轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率(挽救)為3.0％，而心肌細(xì)胞中為2.4％。本發(fā)明人期望隨著時間逐步進(jìn)行更高百分比的肌肉校正。事實上，在本發(fā)明人先前的種系研究中，體內(nèi)編輯隨著時間逐步改善(Long等，2014)。已報道在心臟中肌養(yǎng)蛋白甚至低水平的表達(dá)(4-15％)可部分改善mdx小鼠的心肌病(vanPutten等，2014)。在以20×物鏡放大率掃描的脛骨前肌和心臟的全標(biāo)本逐層切片(wholestep-section)的重復(fù)片上進(jìn)行肌養(yǎng)蛋白陽性和總肌纖維和心肌細(xì)胞的形態(tài)測量分析。使用NikonImagingSolutionElementsv4.20.00軟件的注釋和測量功能(NIS/AM)以大小為7889×7570像素至27518×18466像素解析掃描的圖像。分別對肌養(yǎng)蛋白陽性肌纖維和心肌細(xì)胞的數(shù)目進(jìn)行計數(shù)并使用NIS/AM記錄，同時從由8個20×物鏡圖像的平均值得到的每個視野的細(xì)胞計數(shù)來估計總肌纖維和心肌細(xì)胞的數(shù)目，并外推至整個掃描截面區(qū)域。結(jié)果表明AAV介導(dǎo)的Myo編輯可以有效地在體內(nèi)挽救mdx小鼠中肌養(yǎng)蛋白的閱讀框。不同的AAV遞送方法對組織具有不同的影響。在注射的骨骼肌(TA)中IM具有最高的挽救百分比肌纖維，而RO在心臟中示出最佳性能。通過Myo編輯挽救DMD心肌細(xì)胞功能。長期目標(biāo)是使Myo編輯適用于出生后心臟和骨骼肌細(xì)胞并利用該方法來校正人中的DMD突變。本發(fā)明人現(xiàn)在通過改造DMD患者來源的iPSC的基因組中突變外顯子的跳讀，將小鼠的Myo編輯擴(kuò)展到人DMD患者的細(xì)胞?；颊咧械腄MD突變簇集在基因的特定區(qū)域(“熱點”突變)(圖22)。他們已經(jīng)使用sgRNA庫來靶向最高的12個熱點突變外顯子，優(yōu)化了“熱點”DMD突變的Myo編輯，這可能適用于80％的DMD患者。他們選擇三到六個PAM序列以靶向每個外顯子的5’或3’端(表2)。Myo編輯介導(dǎo)的插失廢除了保守的RNA剪接受體/供體位點并挽救框外的外顯子?；谝阎腄MD突變，本發(fā)明人正建立用于選擇Myo編輯的最佳靶標(biāo)DMD序列的在線資源(DuchenneSkipperDatabase)，其將挽救大多數(shù)DMD患者中的肌養(yǎng)蛋白功能。例如，本發(fā)明人設(shè)計了靶向外顯子51的5’的三個引導(dǎo)RNA(圖23A)。將這些引導(dǎo)RNA克隆到質(zhì)粒spCas9-2A-GFP(Addgene#48138)中。最初，本發(fā)明人通過轉(zhuǎn)染和核轉(zhuǎn)染來評估人293T細(xì)胞和正常人iPSC中引導(dǎo)RNA的效率。通過GFP報道子分選經(jīng)轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞和核轉(zhuǎn)染的iPSC。按照以上所述通過T7E1測定來檢測Myo編輯效率(圖23B)。在GFP+分選的293T細(xì)胞中，引導(dǎo)RNA#3示出高活性，而引導(dǎo)RNA#1和2沒有可檢測的活性。結(jié)果突顯了靶序列優(yōu)化的重要性。然后，本發(fā)明人在人iPSC中應(yīng)用引導(dǎo)RNA#3并觀察到相同的結(jié)果。將來自外顯子51的靶位點的PCR產(chǎn)物克隆并測序。結(jié)果示出Myo編輯可以有效地廢除剪接受體位點(Aag)或產(chǎn)生插失以挽救閱讀框。接著，本發(fā)明人對來自具有缺失(外顯子48-50)的DMD患者的iPSC系(也稱為RikenHPS0164)進(jìn)行Myo編輯，這產(chǎn)生如圖24A中可見的移碼突變。原則上，外顯子51中剪接受體的破壞允許外顯子47至外顯子52的剪接，從而重構(gòu)開放閱讀框。本發(fā)明人使用引導(dǎo)RNA(外顯子51-sgRNA#3)(圖23B)成功地破壞了來自該患者iPSC中外顯子51中的剪接受體，通過NHEJ突變恢復(fù)了開放閱讀框(圖24B)。利用Myo編輯的DMD-iPSC庫，本發(fā)明人使用標(biāo)準(zhǔn)化條件將其分化成心肌細(xì)胞(iCM)，并且在一組這些細(xì)胞中通過免疫細(xì)胞化學(xué)證實肌養(yǎng)蛋白表達(dá)的挽救(圖25)。為了進(jìn)一步擴(kuò)展Myo編輯概念，UTSW處的Myo編輯核心產(chǎn)生另外的DMDiPSC細(xì)胞系，其用于測試永久外顯子跳讀策略(圖26)。本發(fā)明人由患者的血液樣品而不是皮膚細(xì)胞制備DMD-iPSC，因為血液細(xì)胞更易獲得，對患者的風(fēng)險最小。將從全血獲得的PBMC(外周血單核細(xì)胞)進(jìn)行培養(yǎng)，然后使用表達(dá)重編程因子的重組仙臺病毒載體(Cytotune2.0，LifeTechnologies)將其重編程為iPSC。通過免疫細(xì)胞化學(xué)、支原體測試和畸胎瘤形成來驗證iPSC集落。22歲的男性患者在內(nèi)含子47中具有自發(fā)突變(c.6913-4037T＞G)，其產(chǎn)生新的RNA剪接受體位點(YnNYAG)，并產(chǎn)生外顯子47A的假外顯子(圖27)。該假外顯子編碼提前終止信號。本發(fā)明人設(shè)計了精確靶向突變位點的兩個引導(dǎo)RNA(圖28)。Myo編輯可廢除新的剪接受體位點并且永久地跳讀假外顯子。值得指出的是，引導(dǎo)RNA#2將僅靶向突變等位基因，因為野生型DMD不含有PAM序列(AGG)，這對于具有突變和野生型等位基因二者的女性DMD攜帶者中潛在的Myo編輯是重要的。此外，Myo編輯介導(dǎo)的插失突變在內(nèi)含子區(qū)域的中間，其不會影響所編碼的肌養(yǎng)蛋白的正常功能。理論上，通過跳讀假基因，所得的肌養(yǎng)蛋白基因可產(chǎn)生全長mRNA和肌養(yǎng)蛋白。按照所述將特異性引導(dǎo)RNA克隆并核轉(zhuǎn)染到iPSC中。本發(fā)明人通過RT-PCR在這些DMD-iCM中測試了外顯子跳讀的效力(圖29)。通過免疫細(xì)胞化學(xué)測定衍生自校正的iPSC之肌肉細(xì)胞的肌養(yǎng)蛋白表達(dá)，其在myo編輯的DMD心肌細(xì)胞中示出肌養(yǎng)蛋白表達(dá)(圖30)?？傊?，精確的Myo編輯使我們不僅靶向DMD“熱點”(例如，RikenHPS0164DMD-iPSC)，而且容易地校正任何其他罕見突變(例如DC0160DMD)。Myo編輯代表永久地消除DMD的遺傳原因的新的和強(qiáng)大的方法?？紤]到在有絲分裂后成體組織中的持久和進(jìn)行性治療響應(yīng)的可能性，本發(fā)明人認(rèn)為這是應(yīng)用Myo編輯來永久性校正與DMD相關(guān)的肌肉異常的適宜時機(jī)。實施例3-討論這些結(jié)果示出CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯能夠校正引起肌肉營養(yǎng)不良(DMD)的原發(fā)性遺傳病變，并防止mdx小鼠中該疾病的特征性特點的發(fā)展。由于種系中基因組編輯產(chǎn)生具有寬范圍鑲嵌現(xiàn)象(2至100％)的遺傳校正的動物，因此本發(fā)明人能夠?qū)⒒蚪M校正百分比與正常肌肉結(jié)構(gòu)和功能的挽救程度進(jìn)行比較。本發(fā)明人觀察到，在體內(nèi)僅一組校正細(xì)胞就足以完成表型挽救。如圖3C所示意，部分校正的mdx小鼠的組織學(xué)分析揭示了三種類型的肌纖維：1)正常肌養(yǎng)蛋白陽性肌纖維；2)營養(yǎng)不良的肌養(yǎng)蛋白陰性肌纖維；和3)指示肌肉再生的含有中央核的鑲嵌肌養(yǎng)蛋白陽性肌纖維。本發(fā)明人提出，后一類型的肌纖維來源于將校正的衛(wèi)星細(xì)胞募集到損傷的肌纖維中，從而形成具有中央核的鑲嵌肌纖維。培養(yǎng)物中這些細(xì)胞的增殖潛能和再生能力的喪失已經(jīng)阻礙了將衛(wèi)星細(xì)胞作為細(xì)胞來源離體擴(kuò)增以用于體內(nèi)植入的努力(Montarras等，2005)。因此，通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)在體內(nèi)直接編輯衛(wèi)星細(xì)胞代表了促進(jìn)DMD中肌肉修復(fù)之潛在的有前景的替代方法。如果可以克服某些技術(shù)挑戰(zhàn)，則原則上可設(shè)想在出生后細(xì)胞中在體內(nèi)進(jìn)行基因組編輯。例如，需要能夠在體內(nèi)將CRISPR/Cas9系統(tǒng)的組分引導(dǎo)至營養(yǎng)不良肌肉或衛(wèi)星細(xì)胞的合適的體細(xì)胞遞送系統(tǒng)。在這方面，已證明非病原性腺相關(guān)病毒(AAV)遞送系統(tǒng)是安全和有效的，并已在用于基因治療的臨床試驗中得到發(fā)展(Nathwani等，2011和Peng等，2005)。此外，已經(jīng)示出AAV9血清型在DMD患者的骨骼肌、心臟和腦、受影響的主要組織中提供穩(wěn)健的表達(dá)。也可考慮另一些非病毒基因遞送方法，包括注射裸質(zhì)粒DNA(Peng等，2005)、化學(xué)修飾的mRNA(Kormann等，2011和L.Zangi等，2013)以及含有核酸的納米顆粒(Harris等，2010)。關(guān)于CRISPR/Cas9系統(tǒng)臨床應(yīng)用的可行性的另一個挑戰(zhàn)是嚙齒類動物與人之間身體尺寸的增加，需要大規(guī)模擴(kuò)大。CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)入臨床使用的發(fā)展還需要在出生后體細(xì)胞組織中更有效的基因組編輯。盡管CRISPR/Cas9可在體細(xì)胞中有效產(chǎn)生NHEJ介導(dǎo)的插失突變，但是HDR介導(dǎo)的校正在有絲分裂后的細(xì)胞(例如肌纖維和心肌細(xì)胞)中相對無效，原因是這些細(xì)胞缺乏同源重組所必需的蛋白質(zhì)(Hsu等，2014)。HDR途徑的組分與CRISPR/Cas9系統(tǒng)的共表達(dá)可增強(qiáng)HDR介導(dǎo)的基因修復(fù)。最后，CRISPR/Cas9系統(tǒng)的安全性問題，特別是長期使用時，需要在大型動物疾病模型的臨床前研究中進(jìn)行評估。盡管有上面列出的挑戰(zhàn)，但是隨著基因遞送系統(tǒng)的快速技術(shù)進(jìn)步和CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)的改進(jìn)(Hsu等，2014)，本發(fā)明人描述的方法在可預(yù)見的未來最終可以為DMD和另一些人遺傳疾病提供治療益處?？傊疚牡姆椒ㄊ褂肅RISPR/Cas9系統(tǒng)來缺失含有肌養(yǎng)蛋白基因突變的外顯子上游的外顯子剪接受體。該方法在基因組上僅產(chǎn)生微小的改變(幾個核苷酸)，這將避免破壞內(nèi)含子中的其他功能元件(增強(qiáng)子、可變啟動子和微RNA等)。這種基因校正機(jī)制不同于其他人報道的機(jī)制。主要剪接體剪接在5’剪接位點含有GU以及在3’剪接位點含有AG的內(nèi)含子。由單鏈引導(dǎo)RNA(sgRNA)引導(dǎo)的Cas9與毗鄰前間區(qū)序列鄰近基序(PAM)的靶向基因組基因座結(jié)合并產(chǎn)生雙鏈斷裂(DSB)。經(jīng)典Cas9(來自釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes))的PAM序列是NAG或NGG，這意味著原則上其可以靶向具有突變的任何外顯子并通過外顯子跳讀來挽救基因表達(dá)。另外，本文的方法是通過使用AAV9(和其他遞送方法)遞送CRISPR/Cas9系統(tǒng)來指導(dǎo)體內(nèi)衛(wèi)星細(xì)胞或肌纖維的基因組編輯。迄今為止尚未報道人中的直接的基因組編輯。這種直接的方法代表一種促進(jìn)DMD肌肉修復(fù)的潛在有前景的替代方法。表1.野生型、mdx和mdx-C小鼠的血清肌酸激酶(CK)水平和前肢握力表2.DMD基因12個外顯子的引導(dǎo)RNA的序列注：粗體表示用于Myo編輯的最佳引導(dǎo)表S1.寡核苷酸和引物序列表S2.通過細(xì)胞質(zhì)和原核注射之CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯的效率表S3.小鼠基因組中靶位點(Dmd外顯子23)和32個潛在脫靶(OT)位點的序列表S4.來自Dmd靶位點的PCR產(chǎn)物的深度測序結(jié)果表S5.來自32個潛在脫靶區(qū)的PCR產(chǎn)物的深度測序結(jié)果＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊根據(jù)本公開內(nèi)容，可以制備和實施本文公開和要求保護(hù)的所有組合物和/或方法而無需過度實驗。雖然已經(jīng)根據(jù)一些優(yōu)選實施方案描述了本公開內(nèi)容的組合物和方法，但是對于本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是，在不脫離本公開內(nèi)容的概念、精神和范圍的情況下可以對本文描述的組合物和/或方法以及方法的步驟或步驟順序進(jìn)行變化。更具體地，明顯的是，化學(xué)和生理學(xué)二者相關(guān)的某些試劑可代替本文所述的試劑，同時將獲得相同或相似的結(jié)果。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是所有這些類似的替代和修改均被認(rèn)為在由所附權(quán)利要求限定的本公開內(nèi)容的精神、范圍和概念內(nèi)。VI.參考文獻(xiàn)以下參考文獻(xiàn)，在其對本文所闡述的內(nèi)容提供補(bǔ)充性的示例性方法或其他細(xì)節(jié)的程度上，通過引用明確并入本文。Aartsma-Rus，MethodsMolBiol867：97-116，2012.Angeletal.，Mol.Cell.Biol.，7：2256，1987a.Angeletal.，Cell，49：729，1987b.BaichwalandSugdsn，In：GeneTransfer，Kucherlapati(Ed)，NY，PlenumPress，117-148，1986.Banerjietal.，Cell，27(2Pt1)：299-308，1981.Banerjietal.，Cell，33(3)：729-740，1983.Barnesetal.，J.Biol.Chem.，272(17)：11510-7，1997.BenvenistyandNeshif，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：9551-9555，1986.Berkhoutetal.，Cell，59：273-282，1989.Bhavsaretal.，Genomics，35(1)：11-23，1996.Bikardetal.，NucleicAcidsRes.41(15)：7429-7437，2013.Blanaretal.，EMBOJ.，8：1139，1989.BodineandLey，EMBOJ.，6：2997，1987.Boshartetal.，Cell，41：521，1985.Boszeetal.，EMBOJ.，5(7)：1615-1623，1986.Braddocketal.，Cell，58：269，1989.BullaandSiddiqui，J.Virol.，62：1437，1986.CampbellandVillarreal，Mol.Cell.Biol.，8：1993，1988.CampereandTilghman，GenesandDev.，3：537，1989.Campoetal.，Nature，303：77，1983.CelanderandHaseltine，J.Virology，61：269，1987.Celanderetal.，J.Virology，62：1314，1988.Chandleretal.，Cell，33：489，1983.Changetal.，Mol.Cell.Biol.，9：2153，1989.Changetal.，StemCells.，27：1042-1049，2009.Chatterjeeetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：9114，1989.ChenandOkayama，Mol.CellBiol.，7：2745-2752，1987.Choetal.，Nat.Biotechnol.31(3)：230-232，2013.Choietal.，Cell，53：519，1988.Coffin，In：Virology，F(xiàn)ieldsetal.(Eds.)，RavenPress，NY，1437-1500，1990.Cohenetal.，J.Cell.Physiol.，5：75，1987.Congetal.，Science339，819-823，2013.Congetal.，Sciencexpress，2013.Costaetal.，Mol.Cell.Biol.，8：81，1988.Couchetal.，Am.Rev.Resp.Dis.，88：394-403，1963.Couparetal.，Gene，68：1-10，1988.Cripeetal.，EMBOJ.，6：3745，1987.CulottaandHamer，Mol.Cell.Biol.，9：1376，1989.Dandoloetal.，J.Virology，47：55-64，1983.DeVilliersetal.，Nature，312(5991)：242-246，1984.Deansetal.，Cell.，130：363-372，2007.Deschampsetal.，Science，230：1174-1177，1985.Donnellyetal.，J.Gen.Virol.82，1027-1041，2001.Duanetal.，CellRes，publishedonline(10.1038/cr.2014.87)，2014.Dubenskyetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：7529-7533，1984.Edbrookeetal.，Mol.Cell.Biol.，9：1908，1989.Edlundetal.，Science，230：912-916，1985.EP0273085Faircloughetal.，NatRevGenet14，373-378，2013.Fechheimeretal.，ProcNatl.Acad.Sci.USA，84：8463-8467，1987.FengandHolland，Nature，334：6178，1988.Ferkoletal.，F(xiàn)ASEBJ.，7：1081-1091，1993.FirakandSubramanian，Mol.Cell.Biol.，6：3667，1986.FoeckingandHofstetter，Gene，45(1)：101-105，1986.Fraleyetal.，ProcNatl.Acad.Sci.USA，76：3348-3352，1979Franzetal.，Cardoscience，5(4)：235-43，1994.Friedmann，Science，244：1275-1281，1989.Fuetal.，NatBiotechnol31，822-826，2013.Fuetal.，Nat.Biotechnol.，2013.Fujitaetal.，Cell，49：357，1987.GhoshandBachhawat，In：LiverDiseases，TargetedDiagnosisandTherapyUsingSpecificReceptorsandLigands，Wuetal.(Eds.)，MarcelDekker，NY，87-104，1991.Ghosh-Choudhuryetal.，EMBOJ.，6：1733-1739，1987.Gibsonetal.，Naturemethods.6：343-345，2009.Gillesetal.，Cell，33：717，1983.Gjerdrumetal.，JMolDiagn3，105-110，2001.Glossetal.，EMBOJ.，6：3735，1987.Godboutetal.，Mol.Cell.Biol.，8：1169，1988.Gomez-Foixetal.，J.Biol.Chem.，267：25129-25134，1992.GoodbournandManiatis，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：1447，1988.Goodbournetal.，Cell，45：601，1986.Gopal，Mol.CellBiol.，5：1188-1190，1985.Gopal-Srivastavaetal.，J.Mol.Cell.Biol.，15(12)：7081-90，1995.GrahamandPrevec，In：MethodsinMolecularBiology：GeneTransferandExpressionProtocol，Murray(Ed.)，HumanaPress，Clifton，NJ，7：109-128，1991.GrahamandvanderEb，Virology，52：456-467，1973.Grahametal.，J.Gen.Virol.，36：59-72，1977.Greeneetal.，ImmunologyToday，10：272，1989GrosschedlandBaltimore，Cell，41：885，1985.GrunhausandHorwitz，SeminarinVirology，3：237-252，1992.HarlandandWeintraub，J.CellBiol.，101：1094-1099，1985.Harrisetal.，Biomaterials31，998-1006，2010.HaslingerandKarin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：8572，1985.HauberandCullen，J.Virology，62：673，1988.Henetal.，Nature，321：249，1986.Henseletal.，LymphokineRes.，8：347，1989.HermonatandMuzycska，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA，81：6466-6470，1984.HerrandClarke，Cell，45：461，1986.Hersdorfferetal.，DNACellBiol.，9：713-723，1990.HerzandGerard，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA90：2812-2816，1993.Hirochikaetal.，J.Virol.，61：2599，1987.Holbrooketal.，Virology，157：211，1987.HorlickandBenfield，Mol.Cell.Biol.，9：2396，1989.Horwichetal.，J.Virol.，64：642-650，1990.Hsuetal.，Cell157，1262-1278，2014.Hsuetal.，Nat.Biotechnol.，2013.Hsuetal.，NatlBiotechnol.31：827-832，2013Huangetal.，Cell，27：245，1981.Hugetal.，Mol.Cell.Biol.，8：3065，1988.Hwangetal.，Mol.Cell.Biol.，10：585，1990.Imagawaetal.，Cell，51：251，1987.ImbraandKarin，Nature，323：555，1986.Imleretal.，Mol.Cell.Biol.，7：2558，1987.ImperialeandNevins，Mol.Cell.Biol.，4：875，1984.Jakobovitsetal.，Mol.Cell.Biol.，8：2555，1988.JameelandSiddiqui，Mol.Cell.Biol.，6：710，1986.Jaynesetal.，Mol.Cell.Biol.，8：62，1988.Jineketal.，Science337，816-821，2012.Johnsonetal.，Mol.Cell.Biol.，9：3393，1989.JonesandShenk，Cell，13：181-188，1978.KadeschandBerg，Mol.Cell.Biol.，6：2593，1986.Kanedaetal.，Science，243：375-378，1989.Karinetal.，Mol.Cell.Biol.，7：606，1987.Karlssonetal.，EMBOJ.，5：2377-2385，1986.Katinkaetal.，Cell，20：393，1980.Karoetal.，JBiolChem.，266(6)：3361-3364，1991.Kawamotoetal.，Mol.Cell.Biol.，8：267，1988.Kellyetal.，J.CellBiol.，129(2)：383-96，1995.Kiledjianetal.，Mol.Cell.Biol.，8：145，1988.Kimuraetal.，Dev.GrowthDiffer.，39(3)：257-65，1997.Klamutetal.，Mol.Cell.Biol.，10：193，1990.Kleinetal.，Nature，327：70-73，1987.Kochetal.，Mol.Cell.Biol.，9：303，1989.Kodippilietal.，PLosOne9，e88280，2014.Kormannetal.，NatBiotechnol29，154-157，2011.KrieglerandBotchan，In：EukaryoticViralVectors，Gluzman(Ed.)，ColdSpringHarbor：ColdSpringHarborLaboratory，NY，1982.KrieglerandBotchan，Mol.Cell.Biol.，3：325，1983.Kriegleretal.，Cell，38：483，1984.Kriegleretal.，Cell，53：45，1988.Kuhletal.，Cell，50：1057，1987.Kunzetal.，Nucl.AcidsRes.，17：1121，1989.Kuscuetal.，NatBiotechnol32，677-683，2014.L.Zangietal.，NatBiotechnol31，898-907，2013.LaPointeetal.，Hypertension，27(3)：715-22，1996LaPointeetal.，J.Biol.Chem.，263(19)：9075-8，1988.Larsenetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，83：8283，1986.Laspiaetal.，Cell，59：283，1989.Latimeretal.，Mol.Cell.Biol.，10：760，1990.LeGalLaSalleetal.，Science，259：988-990，1993.Leeetal.，Nature，294：228，1981.Levinsonetal.，Nature，295：79，1982.Levreroetal.，Gene，101：195-202，1991.Lietal.，J.Biol.Chem.，273：34970-34975，1998.Linetal.，Mol.Cell.Biol.，10：850，1990.Longetal.，Science345：1184-1188，2014.Luriaetal.，EMBOJ.，6：3307，1987.LuskyandBotchan，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：3609，1986.Luskyetal.，Mol.Cell.Biol.，3：1108，1983.MajorsandVarmus，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：5866，1983.Malietal.，Science339，823-826，2013a.Malietal.，NatMethods10，957-963，2013b.Malietal.，Nat.Biotechnol.31：833-838，2013b.Mannetal.，Cell，33：153-159，1983.Markowitzetal.，J.Virol.，62：1120-1124，1988.McNealletal.，Gene，76：81，1989.Miksiceketal.，Cell，46：203，1986.Montarrasetal.，Science309，2064-2067，2005.MordacqandLinzer，GenesandDev.，3：760，1989.Moreauetal.，Nucl.AcidsRes.，9：6047，1981.Mossetal.，J.Gen.Physiol.，108(6)：473-84，1996.Muesingetal.，Cell，48：691，1987.Murphyetal.，Development138，3625-3637，2011.Nathwanietal.，MolTher19，876-885，2011.Nicholsonetal.，JNeuroSci94，1250136，1989.NicolasandRubinstein，In：Vectors：Asurveyofmolecularcloningvectorsandtheiruses，RodriguezandDenhardt(Eds.)，Stoneham：Butterworth，494-513，1988.NicolauandSene，Biochim.Biophys.Acta，721：185-190，1982.Nicolauetal.，MethodsEnzymol.，149：157-176，1987.Ondeketal.，EMBOJ.，6：1017，1987.Ornitzetal.，Mol.Cell.Biol.，7：3466，1987.Osbometal.，MolTher21，1151-1159，2013.Ousteroutetal.，MolTher21，1718-1726，2013.Palmiteretal.，Cell，29：701，1982.Palmiteretal.，Nature，300：611，1982.Paskindetal.，Virology，67：242-248，1975.Pattanayaketal.，NatBiotechnol31，839-843，2013.Pechetal.，Mol.Cell.Biol.，9：396，1989.Pengetal.，BiochemBiophysResCommun338，1490-1498，2005.Peralesetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91(9)：4086-4090，1994.Perez-StableandConstantini，Mol.Cell.Biol.，10：1116，1990.PicardandSchaffner，Nature，307：83，1984.Pigozzoetal.，PLoSOne8，e72147，2013.Pinkertetal.，GenesandDev.，1：268，1987.Pontaetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：1020，1985.Portonetal.，Mol.Cell.Biol.，10：1076，1990.Potteretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：7161-7165，1984.QueenandBaltimore，Cell，35：741，1983.Quinnetal.，Mol.Cell.Biol.，9：4713，1989.Racheretal.，Biotech.Techniques，9：169-174，1995.Ragotetal.，Nature，361：647-650，1993.Redondoetal.，Science，247：1225，1990.ReismanandRotter，Mol.Cell.Biol.，9：3571，1989.Renan，Radiother.Oncol.，19：197-218，1990.ResendezJr.etal.，Mol.Cell.Biol.，8：4579，1988.Richetal.，Hum.GeneTher.，4：461-476，1993.Ridgeway，In：Vectors：Asurveyofmolecularcloningvectorsandtheiruses，Stoneham：Butterworth，467-492，1988.Ripeetal.，Mol.Cell.Biol.，9：2224，1989.Rippeetal.，Mol.CellBiol.，10：689-695，1990.Rittlingetal.，Nuc.AcidsRes.，17：1619，1989.Rosenetal.，Cell，41：813，1988.Rosenfeldetal.，Cell，68：143-155，1992.Rosenfeldetal.，Science，252：431-434，1991.Rouxetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：9079-9083，1989.Sageetal.，Cell.Div.，5：17-1028-5-17，2010.Sakaietal.，GenesandDev.，2：1144，1988.Satakeetal.，J.Virology，62：970，1988.Schaffneretal.，J.Mol.Biol.，201：81，1988.Schmidt&Grimm，BiotechnologyJournal10：258-272，2015.Schwanketal.，CellStemCell13，653-658，2013.Searleetal.，Mol.Cell.Biol.，5：1480，1985.Senisetal.，BiotechnologyJournal9：1402-1412，2014.SharpandMarciniak，Cell，59：229，1989.ShaulandBen-Levy，EMBOJ.，6：1913，1987.Shermanetal.，Mol.Cell.Biol.，9：50，1989.SleighandLockett，J.EMBO，4：3831，1985.Spalholzetal.，Cell，42：183，1985.SpandauandLee，J.Virology，62：427，1988.SpandidosandWilkie，EMBOJ.，2：1193，1983.StephensandHentschel，Biochem.J.，248：1，1987.Sternbergetal.，Nature，2014.Stratford-PerricaudetandPerricaudet，In：HumanGeneTransfer，Cohen-HaguenauerandBoiron(Eds.)，JohnLibbeyEurotext，F(xiàn)rance，51-61，1991.Stratford-Perricaudetetal.，Hum.Gene.Ther.，1：241-256，1990.Stuartetal.，Nature，317：828，1985.SullivanandPeterlin，Mol.Cell.Biol.，7：3315，1987.SwartzendruberandLehman，J.Cell.Physiology，85：179，1975.Takebeetal.，Mol.Cell.Biol.，8：466，1988.Tavernieretal.，Nature，301：634，1983.TaylorandKingston，Mol.Cell.Biol.，10：165，1990a.TaylorandKingston，Mol.Cell.Biol.，10：176，1990b.Tayloretal.，J.Biol.Chem.，264：15160，1989.Temin，In：GeneTransfer，Kucherlapati(Ed.)，NY，PlenumPress，149-188，1986.Thiesenetal.，J.Virology，62：614，1988.Topetal.，J.Infect.Dis.，124：155-160，1971.Troncheetal.，Mol.Biol.Med.，7：173，1990.TrudelandConstantini，GenesandDev.6：954，1987.Tur-Kaspaetal.，Mol.CellBiol.，6：716-718，1986.Tyndelletal.，Nuc.Acids.Res.，9：6231，1981.Urnovetal.，Nature435，646-651，2005.VanDeutekomandVanOmmen，NatRevGenet4，774-783，2003.vanPuttenetal.，JMolCellCardiol69：17-23，2014.VanniceandLevinson，J.Virology，62：1305，1988.Varmusetal.，Cell，25：23-36，1981.Vasseuretal.，ProcNatl.Acad.Sci.U.S.A.，77：1068，1980.Wagneretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87(9)：3410-3414，1990.WangandCalame，Cell，47：241，1986.Wangetal.，Cell，153：910-910，2013.Weberetal.，Cell，36：983，1984.Weinbergeretal.Mol.Cell.Biol.，8：988，1984.WinotoandBaltimore，Cell，59：649，1989.Wongetal.，Gene，10：87-94，1980.Wortonetal.，AnnuRevGenet22。601-629。1988.WuandWu，Adv.DrugDeliveryRev.，12：159-167，1993.WuandWu，Biochemistry，27：887-892，1988.WuandWu，J.Biol.Chem.，262：4429-4432，1987.Wuetal.，CellStemCell13，659-662，2013.Wuetal.，NatBiotechnol32，670-676，2014.Yamauchi-Takiharaetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86(10)：3504-3508，1989.Yangetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：9568-9572，1990.Yenetal.，DevBiol，publishedonline(10.1016/j.ydbio.2014.06.017)，2014.Yinetal.，NatBiotechnol32，551-553，2014.Yinetal.，PhysiolRev93，23-67，2013.Yutzeyetal.Mol.Cell.Biol.，9：1397，1989.Zeleninetal.，F(xiàn)EBSLett.，280：94-96，1991.ZioberandKramer，J.Bio.Chem.，271(37)：22915-22922，1996.序列表<110>THEBOARDOFREGENTSOFTHEUNIVERSITYOFTEXASSYSTEM<120>通過CRISPR/CAS9介導(dǎo)的基因編輯預(yù)防肌營養(yǎng)不良<130>UTFD.P2838WO<140>未知<141>2015-08-11<150>US62/035,584<151>2014-08-11<160>182<170>PatentInversion3.5<210>1<211>21<212>DNA<213>小鼠（Musmusculus）<400>1ttgaaagagcaacaaaatggc21<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸<400>2ttgaaagagcaataaaatggc21<210>3<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸<400>3agttctttgaaagagcaataaaatggcttc30<210>4<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸<400>4agttctttaaaggagcagcagaatggcttc30<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸<400>5ttaaaggagcagcagaatggc21<210>6<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸<400>6agttctttgaaagagcaacaaaatggcttcaac33<210>7<211>33<212>DNA<213>小鼠<400>7gttgaagccattttgttgctctttcaaagaact33<210>8<211>30<212>RNA<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸<400>8ucuuugaaagagcaacaaaaguuuuauuuu30<210>9<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸<400>9agttctttaaaggagcagcagaatggcttcaac33<210>10<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸<220><221>misc_feature<222>(16)..(16)<223>n是a、c、g或t<220><221>misc_feature<222>(19)..(23)<223>n是a、c、g或t<220><221>misc_feature<222>(25)..(33)<223>n是a、c、g或t<400>10agttctttgaaagagnaannnnntnnnnnnnnn33<210>11<211>78<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸<400>11agttctttgaaagagcaacttctatttaattttgaggctctgcaaagttctttaaaggag60aagcagaatggcttcaac78<210>12<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸<400>12agttctttgaaagagaaaatggcttcaac29<210>13<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸<400>13agttctttgaaagagaaatggcttcaac28<210>14<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸<400>14agttctttgaaagagcaacccaaaatggcttcaac35<210>15<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸<400>15agttctttgaaagagcaaaatggcttcaac30<210>16<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸<400>16agttctttgaaagagcaacgaaatggcttcaac33<210>17<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸<400>17agttctttgaaagagcaacaaaacggcttcaac33<210>18<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸<400>18agttctttgaaagagcaataaaatggcttcaac33<210>19<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸<400>19SerSerLeuLysGluGln15<210>20<211>11<212>PRT<213>小鼠<400>20SerSerLeuLysGluGlnGlnAsnGlyPheAsn1510<210>21<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸<400>21SerSerLeuLysGluGlnAsnGlyPheAsn1510<210>22<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸<400>22agttctttg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