本發(fā)明涉及新型治療方法。更具體地，在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及治療或預(yù)防呼吸道感染、特別是患有潛在呼吸病癥諸如慢性阻塞性肺病(COPD)的患者中的呼吸道感染的方法。本發(fā)明還涉及治療或預(yù)防COPD或COPD惡化的方法。本發(fā)明具體描述了刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4信號(hào)傳導(dǎo)在此類方法中的作用以及刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4作為治療和篩選靶標(biāo)的用途。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于此類治療方法中的藥物組合物，其包含刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4信號(hào)傳導(dǎo)的抑制劑。在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明涉及篩選可用于所述治療方法中的刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4信號(hào)傳導(dǎo)的抑制劑的方法。發(fā)明背景刻缺蛋白信號(hào)傳導(dǎo)(圖1)是最初在黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)中發(fā)現(xiàn)的進(jìn)化保守途徑，并且已經(jīng)顯示影響許多不同生物體中的細(xì)胞命運(yùn)決定。在哺乳動(dòng)物中，存在4種刻缺蛋白受體(刻缺蛋白1-4)，其可以結(jié)合Jagged(Jagged1和2)和Delta樣配體(DLL13和4)家族的配體?？倘钡鞍资荏w是I型跨膜蛋白，并且在配體接合后，蛋白水解切割事件釋放刻缺蛋白的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(NICD)，然后其移位至細(xì)胞核，在細(xì)胞核中，其結(jié)合螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子CSL/RBP-J。在NICD不存在的情況下，CSL/RBP-J形成阻遏物復(fù)合物，因此抑制轉(zhuǎn)錄，而與NICD相互作用后，共阻遏物被置換并且共激活物被募集，導(dǎo)致靶基因的轉(zhuǎn)錄激活。如上所述，靶向刻缺蛋白受體的蛋白水解切割事件對(duì)于成功的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是絕對(duì)關(guān)鍵的。這些由蛋白酶的ADAM家族和多蛋白γ-分泌酶復(fù)合物介導(dǎo)。γ-分泌酶復(fù)合物活性的抑制已經(jīng)用于治療性阻斷刻缺蛋白信號(hào)傳導(dǎo)，并且用作研究該途徑的生物學(xué)功能的工具。病毒和細(xì)菌性呼吸道感染是COPD惡化的主要觸發(fā)因素，所述COPD惡化是與氣道中的過(guò)度粘液產(chǎn)生和嗜中性粒細(xì)胞炎癥相關(guān)的癥狀的急性惡化。氣道上皮通過(guò)提供粘液纖毛自動(dòng)梯(mucociliaryescalator)以驅(qū)逐病原體而在針對(duì)呼吸道病原體的先天防御中起著關(guān)鍵作用，并且經(jīng)由炎癥介質(zhì)的表達(dá)來(lái)協(xié)調(diào)免疫應(yīng)答。在COPD中，已顯示這兩種上皮細(xì)胞功能是功能障礙的?？倘钡鞍仔盘?hào)傳導(dǎo)已通過(guò)在生理?xiàng)l件下促進(jìn)基底細(xì)胞朝向產(chǎn)生粘液的杯狀細(xì)胞譜系的分化而牽涉于在大氣道上皮細(xì)胞中的細(xì)胞命運(yùn)決定(GusehJS等人,Development,May2009;RockJR等人,CellStemCells,May2011)。目前沒(méi)有有效的治療可用于同時(shí)治療COPD惡化中的嗜中性粒細(xì)胞炎癥和過(guò)度粘液產(chǎn)生。CXCR2抑制劑可以有效地減少嗜中性粒細(xì)胞炎癥而對(duì)粘膜纖毛反應(yīng)沒(méi)有任何影響，而粘液溶解劑通常不是非常有效的并且對(duì)炎癥沒(méi)有任何影響。此外，這些治療不會(huì)對(duì)上皮的恢復(fù)具有任何長(zhǎng)期影響。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4信號(hào)傳導(dǎo)的抑制，例如在病毒性呼吸道感染誘導(dǎo)的COPD惡化期間，可以導(dǎo)致嗜中性粒細(xì)胞炎癥和粘液產(chǎn)生的同時(shí)減少，同時(shí)保持基本免疫應(yīng)答完整。據(jù)信這可以緩解病理，恢復(fù)粘膜纖毛自動(dòng)梯和肺的體內(nèi)平衡，因此降低繼發(fā)性細(xì)菌感染的風(fēng)險(xiǎn)。發(fā)明概述因此，在一個(gè)方面，提供了治療或預(yù)防呼吸道感染的方法，其包括抑制哺乳動(dòng)物中的刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4信號(hào)傳導(dǎo)。在另一個(gè)方面，提供了治療或預(yù)防COPD的方法，其包括抑制哺乳動(dòng)物中的刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4信號(hào)傳導(dǎo)。在另一個(gè)方面，提供了治療或預(yù)防COPD惡化的方法，其包括抑制哺乳動(dòng)物中的刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4信號(hào)傳導(dǎo)。在另一個(gè)方面，提供了用于治療或預(yù)防呼吸道感染、COPD或COPD惡化的藥物組合物，其包含刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4信號(hào)傳導(dǎo)的抑制劑，連同至少一種藥物載體、稀釋劑或賦形劑。在一個(gè)進(jìn)一步方面，提供了篩選用于治療或預(yù)防呼吸道感染、COPD或COPD惡化的刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4信號(hào)傳導(dǎo)的抑制劑的方法，其包括確定試劑是否抑制刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4途徑的步驟。附圖說(shuō)明圖1刻缺蛋白信號(hào)傳導(dǎo)途徑。圖2獲得自偶爾和頻繁惡化的前吸煙者(ex-smoker)COPD患者的支氣管刷的基因表達(dá)分析。與偶爾惡化的COPD患者相比，刻缺蛋白3以及刻缺蛋白靶基因在頻繁惡化的COPD患者中升高。圖3通過(guò)用HRV16感染72小時(shí)并用γ-分泌酶抑制劑化合物A處理的COPD支氣管上皮細(xì)胞的微陣列的全基因組轉(zhuǎn)錄分析。刻缺蛋白信號(hào)傳導(dǎo)的抑制恢復(fù)纖毛相關(guān)基因并抑制HRV16感染后杯狀細(xì)胞相關(guān)基因的上調(diào)。有趣的是，干擾素反應(yīng)未改變。(A)說(shuō)明基于治療最佳分辨上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄特征的兩種組分的主要組分分析(PCA)。(B)說(shuō)明COPD供體中的上皮細(xì)胞反應(yīng)的量級(jí)的維恩圖。數(shù)字表示由每種處理調(diào)節(jié)的探針的數(shù)量。(C)說(shuō)明來(lái)自用單獨(dú)或與化合物A組合的HRV16感染的COPD的支氣管上皮細(xì)胞(BEC)中的平均基因表達(dá)的熱圖。圖4用HRV16感染并用化合物A或刻缺蛋白豁免γ-分泌酶調(diào)節(jié)劑(Notch-sparingγ-secretasemodulator)處理72小時(shí)的COPDBEC中的基因表達(dá)的分析?？倘钡鞍谆砻猞?分泌酶調(diào)節(jié)劑對(duì)HRV16感染的細(xì)胞中的刻缺蛋白靶基因或粘膜纖毛端點(diǎn)的表達(dá)沒(méi)有影響。(A)說(shuō)明通過(guò)實(shí)時(shí)PCR的COPDBEC的ALI培養(yǎng)物中的刻缺蛋白靶基因的基因表達(dá)的條形圖。(B)說(shuō)明通過(guò)實(shí)時(shí)PCR的COPDBEC的ALI培養(yǎng)物中的纖毛和杯狀細(xì)胞相關(guān)基因的基因表達(dá)的條形圖。圖注表示以nM計(jì)的濃度。圖5用HRV16感染并用化合物A處理72小時(shí)的COPDBEC的粘膜纖毛反應(yīng)?？倘钡鞍仔盘?hào)傳導(dǎo)的抑制抑制了HRV16感染的細(xì)胞中的粘液產(chǎn)生。(A)說(shuō)明通過(guò)實(shí)時(shí)PCR的COPDBEC的ALI培養(yǎng)物中的杯狀細(xì)胞特異性基因的基因表達(dá)的條形圖。(B)說(shuō)明粘液表達(dá)的用AB/PAS染色的COPDBEC的橫切片。圖6單獨(dú)或與化合物A組合的HRV16感染72小時(shí)的COPDBEC的粘膜纖毛反應(yīng)。HRV16感染后，刻缺蛋白信號(hào)傳導(dǎo)的抑制恢復(fù)了纖毛化。(A)說(shuō)明通過(guò)實(shí)時(shí)PCR的COPDBEC的ALI培養(yǎng)物中的纖毛細(xì)胞特異性基因的基因表達(dá)的條形圖。(B)說(shuō)明在單獨(dú)或與化合物A組合的HRV16感染的ALI培養(yǎng)的COPDBEC中β-微管蛋白IV表達(dá)的免疫熒光染色的代表性顯微照片。圖7在具有或不具有化合物A治療的HRV16感染后24小時(shí)COPDBEC中通過(guò)實(shí)時(shí)PCR的免疫介質(zhì)的基因表達(dá)分析?？倘钡鞍仔盘?hào)傳導(dǎo)的抑制導(dǎo)致編碼嗜中性粒細(xì)胞趨化因子的基因的轉(zhuǎn)錄抑制，而T細(xì)胞相關(guān)趨化因子的基因表達(dá)受影響較小。(A)與嗜中性粒細(xì)胞炎癥相關(guān)的趨化因子的基因表達(dá)。(B)與T-細(xì)胞募集相關(guān)的趨化因子的基因表達(dá)。圖8用單獨(dú)或與化合物A組合的HRV16感染后72小時(shí)，ALI培養(yǎng)的COPDBEC的上清液中免疫介質(zhì)的蛋白分泌的定量?？倘钡鞍仔盘?hào)傳導(dǎo)的抑制導(dǎo)致嗜中性粒細(xì)胞趨化因子的分泌減少，而T-細(xì)胞相關(guān)趨化因子的分泌受影響較小。(A)與嗜中性粒細(xì)胞炎癥相關(guān)的趨化因子的蛋白濃度。(B)與T-細(xì)胞募集相關(guān)的趨化因子的蛋白濃度。圖9與未處理的感染樣品相比，響應(yīng)于用化合物A處理的上清液，嗜中性粒細(xì)胞趨化性降低。T-細(xì)胞趨化性不變。響應(yīng)于單獨(dú)或與化合物A組合的HRV16感染后72小時(shí)，從ALI培養(yǎng)的COPDBEC收集的上清液的健康嗜中性粒細(xì)胞(A)和T細(xì)胞(B)趨化性的分析。圖10在HRV1B接種和用γ-分泌酶抑制劑化合物B處理后，雌性Balb/c小鼠的肺中的炎癥和粘液基因表達(dá)的分析。在感染后8小時(shí)，γ-分泌酶處理的動(dòng)物的肺中嗜中性粒細(xì)胞和粘蛋白基因表達(dá)的募集減少。(A)嗜中性粒細(xì)胞在感染后8小時(shí)流入肺(BAL)。(B)在感染后8小時(shí)Muc5ac的基因表達(dá)。圖11在穩(wěn)定狀態(tài)下具有和不具有GSI處理的COPDBEC上的CD66a/c/e(CEACAM1/5/6)的細(xì)胞表面表達(dá)。說(shuō)明在用GSI處理48小時(shí)的細(xì)胞上減少的CD66a/c/e表達(dá)的代表性柱狀圖。圖12通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)的ALI培養(yǎng)的COPDBEC上的刻缺蛋白受體的表達(dá)。說(shuō)明在穩(wěn)定狀態(tài)下的COPDBEC上的刻缺蛋白3的細(xì)胞表面表達(dá)與刻缺蛋白4的較低水平的代表性柱狀圖。刻缺蛋白1和2不表達(dá)。圖13通過(guò)免疫組織化學(xué)的COPD肺中的刻缺蛋白受體的表達(dá)。(A)說(shuō)明在穩(wěn)定狀態(tài)下的COPD肺中的刻缺蛋白3的表達(dá)與刻缺蛋白4的較低水平的代表性顯微照片?？倘钡鞍?不表達(dá)。(B)在肺中發(fā)現(xiàn)的不同細(xì)胞群體中的受體表達(dá)的定量。發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4信號(hào)傳導(dǎo)的抑制可以導(dǎo)致嗜中性粒細(xì)胞炎癥和粘液產(chǎn)生的同時(shí)減少。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防嗜中性粒細(xì)胞炎癥和粘液產(chǎn)生的方法，其包括抑制哺乳動(dòng)物中的刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4信號(hào)傳導(dǎo)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防嗜中性粒細(xì)胞炎癥的方法，其包括抑制哺乳動(dòng)物中的刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4信號(hào)傳導(dǎo)。在一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防粘液產(chǎn)生的方法，其包括抑制哺乳動(dòng)物中的刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4信號(hào)傳導(dǎo)。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防呼吸道感染的方法，其包括抑制哺乳動(dòng)物中的刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4信號(hào)傳導(dǎo)?？梢灾委熁蝾A(yù)防的呼吸道感染包括病毒感染、細(xì)菌感染和/或其他病原體的感染。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述呼吸道感染是病毒感染。病毒感染包括，例如，流感、鼻病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、人副流感病毒(HPIV)、腺病毒和/或冠狀病毒的感染。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述呼吸道感染是細(xì)菌感染。細(xì)菌感染包括例如肺炎鏈球菌(S.Pneumoniae)、流感嗜血桿菌(H.Influenzae)和/或卡他莫拉氏菌(M.Catarrhalis)的感染。所述細(xì)菌感染可以繼發(fā)于病毒感染。在一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方案中，所述呼吸道感染是另一種病原體的感染，例如，曲霉病和/或利什曼病。本發(fā)明還提供了治療或預(yù)防呼吸道感染的方法，其包括抑制具有潛在呼吸病癥的哺乳動(dòng)物中的刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4信號(hào)傳導(dǎo)。潛在呼吸病癥可以是，例如，COPD、哮喘、囊性纖維化、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)和/或特發(fā)性肺纖維化(IPF)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述潛在病癥是COPD。在一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方案中，所述潛在病癥是哮喘。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防呼吸道感染的方法，其包括抑制患有COPD的哺乳動(dòng)物中的刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4信號(hào)傳導(dǎo)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防呼吸道感染的方法，其包括抑制患有COPD的人中的刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4信號(hào)傳導(dǎo)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防病毒性呼吸道感染的方法，其包括抑制患有COPD的人中的刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4信號(hào)傳導(dǎo)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防細(xì)菌性呼吸道感染的方法，其包括抑制患有COPD的人中的刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4信號(hào)傳導(dǎo)。在一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防繼發(fā)性細(xì)菌性呼吸道感染的方法，其包括抑制患有COPD的人中的刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4信號(hào)傳導(dǎo)。鑒于刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4信號(hào)傳導(dǎo)在嗜中性粒細(xì)胞炎癥和粘液產(chǎn)生中的作用，除了在治療或預(yù)防患有COPD的患者中的呼吸道感染中使用刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑外，據(jù)信此類抑制劑可用于治療或預(yù)防潛在COPD。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防COPD的方法，其包括抑制哺乳動(dòng)物中的刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4信號(hào)傳導(dǎo)。盡管COPD惡化通常由呼吸道感染觸發(fā)，但顯著比例的惡化也可以由例如空氣污染物、患者自身的嗜中性粒細(xì)胞或無(wú)法鑒定的原因觸發(fā)。據(jù)信刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑可用于治療或預(yù)防COPD惡化，而無(wú)論原因。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防COPD惡化的方法，其包括抑制哺乳動(dòng)物中的刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4信號(hào)傳導(dǎo)。某些COPD患者由于其對(duì)惡化的易感性增加而被稱為“頻繁惡化者”。此類患者通常受困于肺功能的加速減退、生活質(zhì)量較差和住院和死亡的風(fēng)險(xiǎn)較高。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防呼吸道感染的方法，其包括抑制作為頻繁惡化者的COPD患者中的刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4信號(hào)傳導(dǎo)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療COPD的方法，其包括抑制作為頻繁惡化者的COPD患者中的刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4信號(hào)傳導(dǎo)。在一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防COPD惡化的方法，其包括抑制作為頻繁惡化者的COPD患者中的刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4信號(hào)傳導(dǎo)?？倘钡鞍?和/或刻缺蛋白4信號(hào)傳導(dǎo)可以被任何合適的抑制劑抑制。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“抑制劑”可以是能夠抑制刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4信號(hào)傳導(dǎo)的任何試劑，即中斷受體：配體相互作用或刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4受體下游的任何其它信號(hào)傳導(dǎo)事件的任何化合物或治療。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抑制劑是γ-分泌酶抑制劑。所述抑制劑可以具有不同的性質(zhì)和來(lái)源，包括天然來(lái)源(例如植物、動(dòng)物、真核、細(xì)菌、病毒來(lái)源)或是合成的(例如有機(jī)、無(wú)機(jī)、合成或半合成分子)。例如，所述抑制劑可以是核酸、肽、多肽、蛋白或化學(xué)化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抑制劑可以是能夠抑制刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4的表達(dá)的反義核酸。所述反義核酸可以包含刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4受體的序列或與之互補(bǔ)的序列的全部或部分。所述反義序列可以是DNA、RNA(例如siRNA)、核酶等。其可以是單鏈或雙鏈的。其也可以是由反義基因編碼的RNA。當(dāng)使用包含所考慮的基因或信使RNA的部分序列的反義核酸時(shí)，優(yōu)選使用包含來(lái)自所述序列的至少10個(gè)、更優(yōu)選至少15個(gè)連續(xù)堿基的部分，以確保特異性雜交。在反義寡核苷酸的情況下，其通常包含少于100個(gè)堿基，例如大約10至50個(gè)堿基。該寡核苷酸可以被修飾以改善其穩(wěn)定性、其核酸酶抗性、其細(xì)胞穿透性等。反義分子的序列與靶基因或信使RNA的序列之間的完全互補(bǔ)是不需要的，但通常是優(yōu)選的。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，抑制劑化合物可以是多肽。其可以是例如包含刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4受體的區(qū)域且能夠拮抗其活性的肽。肽有利地包含所考慮的刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4受體的一級(jí)序列的5至50個(gè)連續(xù)氨基酸，通常7至40個(gè)連續(xù)氨基酸。所述多肽還可以是針對(duì)刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4受體的抗體。術(shù)語(yǔ)“抗體”，如本文所用，是指具有免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域的分子(例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE)，且包括單克隆、重組、多克隆、嵌合、人、人源化、多特異性抗體(包括雙特異性抗體)和異源綴合物抗體；單一可變結(jié)構(gòu)域(例如，VH、VHH、VL、結(jié)構(gòu)域(dAbTM))、抗原結(jié)合抗體片段、Fab、F(ab')2、Fv、二硫化物連接的Fv、單鏈Fv、二硫化物-連接的scFv、雙抗體、TANDABSTM等，以及任何前述的修飾版本(對(duì)于替代“抗體”形式的概述，參見(jiàn)Holliger和Hudson,NatureBiotechnology,2005,Vol23,No.9,1126-1136)。替代抗體形式包括其中一個(gè)或多個(gè)CDR可排列在合適的非免疫球蛋白支架或骨架上的替代支架，諸如親合體(affibody)、SpA支架、LDL受體A類結(jié)構(gòu)域、avimer(參見(jiàn)，例如美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2005/0053973、2005/0089932、2005/0164301)或EGF結(jié)構(gòu)域。另外的抗體包括mAbdAbs、dAbTM綴合物和dAbTM融合體。術(shù)語(yǔ)“結(jié)構(gòu)域”是指保留其三級(jí)結(jié)構(gòu)的折疊的蛋白結(jié)構(gòu)，其獨(dú)立于蛋白的其余部分。通常，結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)蛋白的離散的功能特性，并且在許多情況下，在不喪失該蛋白其他部分和/或該結(jié)構(gòu)域的功能的情況下，可添加、去除或轉(zhuǎn)移至其他蛋白。術(shù)語(yǔ)“單一可變結(jié)構(gòu)域”是指包含抗體可變結(jié)構(gòu)域的特征性的序列的折疊的多肽結(jié)構(gòu)域。因此其包括完整的抗體可變結(jié)構(gòu)域諸如VH、VHH和VL和修飾的抗體可變結(jié)構(gòu)域，例如其中一個(gè)或多個(gè)環(huán)被非抗體可變結(jié)構(gòu)域特征性的序列所替代的抗體可變結(jié)構(gòu)域，或已截短或包含N-或C-端延長(zhǎng)的抗體可變結(jié)構(gòu)域，以及保留至少全長(zhǎng)結(jié)構(gòu)域的結(jié)合活性和特異性的可變結(jié)構(gòu)域片段。單一可變結(jié)構(gòu)域能夠與抗原或表位結(jié)合，而獨(dú)立于不同可變區(qū)或結(jié)構(gòu)域?！敖Y(jié)構(gòu)域抗體”或“dAbTM”可被視為與“單一可變結(jié)構(gòu)域”相同。單一可變結(jié)構(gòu)域可為人單一可變結(jié)構(gòu)域，但也包括來(lái)自其他物種的單一可變結(jié)構(gòu)域，諸如嚙齒類(例如，如公開(kāi)于WO00/29004)、鉸口鯊(nurseshark)和駱駝科VHHdAbsTM。駱駝科VHH為免疫球蛋白單一可變結(jié)構(gòu)域，其衍生自物種，包括駱駝、美洲駝、羊駝、單峰駱駝和駱馬，其產(chǎn)生天然無(wú)輕鏈的重鏈抗體。此類VHH結(jié)構(gòu)域可根據(jù)本領(lǐng)域中可得的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)人源化，且此類結(jié)構(gòu)域被視為“單一可變結(jié)構(gòu)域”。如本文所用，VH包括駱駝科VHH結(jié)構(gòu)域。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“mAbdAb”是指與另外結(jié)合結(jié)構(gòu)域、特別是單一可變結(jié)構(gòu)域諸如結(jié)構(gòu)域抗體連接的單克隆抗體。mAbdAb具有至少兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，其中至少一個(gè)來(lái)自結(jié)構(gòu)域抗體，并且至少一個(gè)來(lái)自配對(duì)的VH/VL結(jié)構(gòu)域。mAbdAb描述于WO2009/068649中?！癲AbTM綴合物”是指包含dAb的組合物，其中藥物借助共價(jià)或非共價(jià)鍵與所述dAb化學(xué)綴合。優(yōu)選地，dAb和藥物共價(jià)鍵合。此共價(jià)鍵可通過(guò)肽鍵或其他方式諸如經(jīng)由修飾的側(cè)鏈。非共價(jià)鍵合可以是直接的(例如靜電相互作用、疏水性相互作用)或間接的(例如通過(guò)互補(bǔ)結(jié)合伴侶(例如生物素和抗生物素蛋白)的非共價(jià)結(jié)合，其中一個(gè)伴侶與藥物共價(jià)鍵合，而互補(bǔ)的結(jié)合伴侶與dAbTM共價(jià)鍵合)。當(dāng)采用互補(bǔ)的結(jié)合伴侶時(shí)，結(jié)合伴侶之一可直接或通過(guò)合適的接頭部分與藥物共價(jià)鍵合，而互補(bǔ)的結(jié)合伴侶可直接或經(jīng)由合適的接頭部分與dAbTM共價(jià)鍵合。如本文所用，“dAbTM融合體”是指包含dAbTM和多肽藥物(其可為dAbTM或mAb)的融合蛋白。dAbTM和多肽藥物作為單一連續(xù)多肽鏈的離散部分(部分)存在。此類抗體、片段或衍生物可以通過(guò)常規(guī)技術(shù)產(chǎn)生，所述技術(shù)包括免疫動(dòng)物和回收血清(多克隆)或脾細(xì)胞(以通過(guò)與適當(dāng)?shù)募?xì)胞系融合來(lái)產(chǎn)生雜交瘤)。在現(xiàn)有技術(shù)中描述了用于在各種物種中產(chǎn)生多克隆抗體的方法。通常，將抗原與佐劑(例如弗氏佐劑)組合并施用于動(dòng)物，通常通過(guò)皮下注射?？梢赃M(jìn)行重復(fù)注射。收集血液樣品并分離免疫球蛋白或血清。用于產(chǎn)生單克隆抗體的常規(guī)方法包括用抗原免疫動(dòng)物，隨后回收脾細(xì)胞，然后將其與永生化細(xì)胞諸如骨髓瘤細(xì)胞融合。所得雜交瘤產(chǎn)生單克隆抗體，并且可以通過(guò)有限稀釋來(lái)選擇以分離單個(gè)克隆。Fab或F(ab')2片段可以通過(guò)根據(jù)常規(guī)技術(shù)的蛋白酶消化來(lái)產(chǎn)生。抑制刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4的抗體是本領(lǐng)域已知的。根據(jù)進(jìn)一步實(shí)施方案，所述抑制劑可以是能夠調(diào)節(jié)刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4受體的表達(dá)或活性的天然或合成來(lái)源的化學(xué)化合物，特別是有機(jī)或無(wú)機(jī)分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述化學(xué)化合物是γ-分泌酶抑制劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述化學(xué)化合物是(S)-2-[2-(3,5-二氟苯基)-乙酰氨基]-N-((S)-1-甲基-2-氧代-5-苯基-2,3-二氫-1H-苯并[e][1,4]二氮雜?-3-基)-丙酰胺。在一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方案中，所述化學(xué)化合物是N2-?[(2S)?-?2-?(3,5-二氟苯基)-2-羥基乙?；鵠?-?N1-?[(7S)?-?5-?甲基-6-氧代-6,7-二氫-?5H-二苯并[b,d]?氮雜?-7-基]-L-丙氨酰胺。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，刻缺蛋白3信號(hào)傳導(dǎo)被抑制。在另一個(gè)實(shí)施方案中，刻缺蛋白4信號(hào)傳導(dǎo)被抑制。在一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方案中，刻缺蛋白3和刻缺蛋白4信號(hào)傳導(dǎo)被抑制。根據(jù)本發(fā)明，通常將刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4信號(hào)傳導(dǎo)的抑制劑以治療有效量施用于受試者。如本文所用，“有效量”是指例如研究人員或臨床醫(yī)生正在尋求的將引發(fā)組織、系統(tǒng)、動(dòng)物或人的生物或醫(yī)學(xué)反應(yīng)的藥物或藥劑的量。此外，術(shù)語(yǔ)“治療有效量”意指任何這樣的量，與沒(méi)有接受此類量的相應(yīng)受試者相比，導(dǎo)致疾病、病癥或副作用的改善的治療、愈合或減輕，或者疾病或病癥的進(jìn)展速率的降低。該術(shù)語(yǔ)在其范圍內(nèi)還包括有效增強(qiáng)正常生理功能的量。如本文所用，關(guān)于病癥的“治療(treating)”或“治療(treatment)”意指：(1)減輕或預(yù)防病癥或病癥的一種或多種生物學(xué)表現(xiàn)，(2)干預(yù)(a)導(dǎo)致或引起病癥的生物學(xué)級(jí)聯(lián)中的一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)，或(b)病癥的一種或多種生物學(xué)表現(xiàn)，(3)緩解與病癥相關(guān)的一種或多種癥狀或影響，或(4)減緩病癥或病癥的一種或多種生物學(xué)表現(xiàn)的進(jìn)程。如本文所用，關(guān)于病癥的“預(yù)防(preventing)”或“預(yù)防(prevention)”意指預(yù)防性施用藥物，以顯著減少病癥或其生物學(xué)表現(xiàn)的可能性或嚴(yán)重程度，或延遲此類病癥或其生物學(xué)表現(xiàn)的發(fā)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及病癥的治療。在一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及病癥的預(yù)防。盡管可能為了用于療法中，抑制劑可以作為粗化學(xué)品施用，但將活性成分作為藥物組合物呈現(xiàn)是可能的。因此，在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于治療或預(yù)防呼吸道感染、COPD或COPD惡化的藥物組合物，其包含刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4信號(hào)傳導(dǎo)的抑制劑，連同至少一種藥物載體、稀釋劑或賦形劑。載體、稀釋劑或賦形劑必須在與組合物的其他成分相容且對(duì)其接受者無(wú)害的意義上是可接受的。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，還提供制備藥物組合物的方法，所述藥物組合物包括抑制劑或其藥學(xué)上可接受的鹽與至少一種藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。藥物組合物可用于治療或預(yù)防本文所述的病況中的任一種。藥物組合物可以每單位劑量含有預(yù)定量的活性成分的單位劑型呈現(xiàn)。優(yōu)選的單位劑型組合物為含有日劑量或亞劑量或其適當(dāng)部分的活性成分的那些。因此，此類單位劑量可一天施用一次或超過(guò)一次。此類藥物組合物可以通過(guò)藥學(xué)領(lǐng)域中眾所周知的任何方法來(lái)制備。藥物組合物可適用于通過(guò)任何適當(dāng)途徑施用，例如通過(guò)經(jīng)口(包括經(jīng)頰或舌下)、直腸、吸入、鼻內(nèi)、局部(包括經(jīng)頰、舌下或經(jīng)皮)、陰道或腸胃外(包括皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮內(nèi))途徑。此類組合物可通過(guò)藥劑學(xué)領(lǐng)域中已知的任何方法(例如通過(guò)將活性成分與載體或賦形劑結(jié)合)來(lái)制備。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物通過(guò)吸入途徑來(lái)施用。適用于經(jīng)口施用的藥物組合物可作為離散單位呈現(xiàn)，所述離散單位諸如膠囊或片劑；散劑或顆粒；水性或非水性液體中的溶液或懸浮液；可食用泡沫或抽打泡沫(whips)；或水包油型液體乳液或油包水型液體乳液。例如，對(duì)于片劑或膠囊形式的經(jīng)口施用，可將活性藥物組分與經(jīng)口無(wú)毒的藥學(xué)上可接受的惰性載體(諸如乙醇、甘油、水等)組合。散劑通過(guò)將化合物減小至合適微細(xì)尺寸和與類似制備的藥物載體(諸如可食用碳水化合物，如例如，淀粉或甘露醇)混合來(lái)制備。也可存在調(diào)味劑、防腐劑、分散劑和著色劑。通過(guò)制備如上所述的粉末混合物且填充形成的明膠鞘來(lái)制造膠囊?？稍谔畛洳僮髦皩⒅鲃┖蜐?rùn)滑劑諸如膠態(tài)二氧化硅、滑石、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣或固態(tài)聚乙二醇添加至粉末混合物。也可添加崩解劑或增溶劑諸如瓊脂-瓊脂(agar-agar)、碳酸鈣或碳酸鈉以改進(jìn)當(dāng)攝入膠囊時(shí)藥物的可用性。此外，當(dāng)期望或需要時(shí)，也可將合適的粘合劑、助流劑、潤(rùn)滑劑、甜味劑、調(diào)味劑、崩解劑和著色劑并入混合物中。合適的粘合劑包括淀粉、明膠、天然糖(諸如葡萄糖或β-乳糖)、玉米甜味劑、天然和合成膠(諸如阿拉伯樹(shù)膠、黃蓍膠或海藻酸鈉)、羧甲基纖維素、聚乙二醇、蠟等。用于這些劑型中的潤(rùn)滑劑包括油酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯甲酸鈉、乙酸鈉、氯化鈉等。崩解劑包括但不限于淀粉、甲基纖維素、瓊脂(agar)、膨潤(rùn)土、黃原膠等。例如，通過(guò)制備粉末混合物、粒化或壓錠、添加潤(rùn)滑劑和崩解劑和壓成片劑來(lái)配制片劑。通過(guò)將適當(dāng)粉碎的化合物與如上所述的稀釋劑或基質(zhì)混合且任選地與粘合劑(諸如羧甲基纖維素、海藻酸鹽、明膠或聚乙烯吡咯烷酮)、溶液阻滯劑(諸如石蠟)、再吸收加速劑(諸如季鹽)和/或吸收劑(諸如膨潤(rùn)土、高嶺土或磷酸二鈣)混合來(lái)制備粉末混合物?？赏ㄟ^(guò)用粘合劑(諸如糖漿、淀粉糊、阿拉伯樹(shù)膠粘液或纖維素或聚合材料的溶液)潤(rùn)濕且迫使其穿過(guò)篩網(wǎng)來(lái)?；勰┗旌衔?。作為?；奶娲桨?，可使粉末混合物穿過(guò)壓片機(jī)且結(jié)果為碎裂成顆粒的不完全成形的干壓物(slugs)?？赏ㄟ^(guò)添加硬脂酸、硬脂酸鹽、滑石或礦物油的方式潤(rùn)滑所述顆粒以防止粘附于片劑成形模具。然后將潤(rùn)滑的混合物壓縮成片劑。也可將本發(fā)明的化合物與自由流動(dòng)的惰性載體合并并在不經(jīng)歷粒化或壓錠步驟的情況下直接壓縮成片劑。可提供透明或不透明保護(hù)包衣，其由蟲(chóng)膠的密封包衣、糖或聚合材料的包衣和蠟的拋光包衣組成?？蓪⑷玖咸砑又吝@些包衣以區(qū)分不同單位劑量?？梢詫⒔?jīng)口流體諸如溶液、糖漿劑和酏劑制成單位劑型，使得給定量含有預(yù)定量的化合物。糖漿劑可通過(guò)將化合物溶解于合適調(diào)味的水溶液中來(lái)制備，而酏劑通過(guò)使用無(wú)毒含醇媒介物來(lái)制備。懸浮液可通過(guò)將化合物分散于無(wú)毒媒介物中來(lái)配制。也可添加增溶劑和乳化劑(諸如乙氧基化異硬脂醇和聚氧乙烯山梨糖醇醚)、防腐劑、調(diào)味添加劑(諸如胡椒薄荷油或天然甜味劑或糖精或其他人工甜味劑)等。適當(dāng)時(shí)，用于經(jīng)口施用的劑量單位組合物可被微囊化。也可制備組合物以例如通過(guò)將微粒材料包衣或包埋于聚合物、蠟等中來(lái)延長(zhǎng)或維持釋放。也可以脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)的形式(諸如小單層囊泡、大單層囊泡和多層囊泡)施用本發(fā)明的化合物。脂質(zhì)體可由多種磷脂，諸如膽固醇、硬脂胺或磷脂酰膽堿形成。適用于經(jīng)皮施用的藥物組合物可以作為離散貼劑呈現(xiàn)，所述離散貼劑意欲與接受者的表皮保持長(zhǎng)時(shí)間段的緊密接觸。適用于局部施用的藥物組合物可配制為軟膏、乳膏、懸浮液、洗劑、散劑、溶液、糊劑、凝膠、噴霧劑、氣溶膠或油劑。適用于在口中局部施用的藥物組合物包括錠劑、糖果錠劑和漱口劑。用于經(jīng)鼻或吸入施用的劑型可便利地配制為氣溶膠、溶液、懸浮滴劑、凝膠或干燥粉末。對(duì)于適合和/或適用于吸入施用的組合物，優(yōu)選的是，試劑呈粒徑減小的形式，且更優(yōu)選地，尺寸減小的形式通過(guò)微粉化獲得或可獲得。尺寸減小(例如，微粉化)的化合物或鹽或溶劑化物的優(yōu)選粒徑通過(guò)約0.5至約10微米的D50值定義(例如，如使用激光衍射所測(cè)量)。適用于通過(guò)吸入施用的組合物包括顆粒粉劑或霧劑。其中載體是液體的用于作為鼻噴霧劑或滴劑施用的合適的組合物包括活性成分的水性或油溶液/懸浮液，其可以借助各種類型的計(jì)量劑量加壓氣溶膠、噴霧器或吹入器來(lái)生成。例如用于吸入施用的氣溶膠制劑可包含于藥學(xué)上可接受的水性或非水性溶劑中的試劑的溶液或微細(xì)懸浮液。氣溶膠制劑可以單劑量或多劑量的量在密封容器中以無(wú)菌形式呈現(xiàn)，其可采用藥筒或再填充物的形式用于與霧化裝置或吸入器一起使用。或者，密封的容器可以是整體分配裝置，諸如意欲一旦容器的內(nèi)容物已耗盡就丟棄的單劑量經(jīng)鼻吸入器或裝有計(jì)量閥的氣溶膠分配器(計(jì)量吸入器)。當(dāng)劑型包含氣溶膠分配器時(shí)，其優(yōu)選含有壓力下的合適推進(jìn)劑，諸如壓縮空氣、二氧化碳或有機(jī)推進(jìn)劑(諸如氫氟烴(HFC))。合適HFC推進(jìn)劑包括1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷和1,1,1,2-四氟乙烷。氣溶膠劑型也可采取泵-霧化器的形式。加壓氣溶膠可含有活性化合物的溶液或懸浮液。這可能需要并入額外賦形劑(例如共溶劑和/或表面活性劑)以改善懸浮液制劑的分散特征和均勻性。溶液制劑也可能需要添加共溶劑諸如乙醇。也可以引入其他賦形劑修飾劑以改善，例如，制劑的穩(wěn)定性和/或味道和/或細(xì)粒質(zhì)量特征(量和/或概況)。對(duì)于適合和/或適用于吸入施用的藥物組合物，藥物組合物可以是干燥粉末可吸入組合物。此類組合物可包含粉末基質(zhì)，諸如乳糖、葡萄糖、海藻糖、甘露醇或淀粉；試劑(優(yōu)選呈粒徑減小的形式，例如呈微粉化形式)；和任選性能改性劑，諸如L-亮氨酸或另一氨基酸、纖維二糖八乙酸酯和/或硬脂酸的金屬鹽，諸如硬脂酸鎂或硬脂酸鈣。優(yōu)選布置氣溶膠制劑，使得氣霧劑的每個(gè)計(jì)量劑量或“一次噴霧(puff)”含有特定量的本發(fā)明的化合物。施用可以是每天一次或每天數(shù)次，例如2、3、4或8次，每次給予例如1、2或3個(gè)劑量。通過(guò)吸入器或吹入器中的膠囊和藥筒遞送的總每日劑量和計(jì)量劑量通常是具有氣溶膠制劑的那些的兩倍。適用于腸胃外施用的藥物組合物包括可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使組合物與預(yù)期接受者的血液等滲的溶質(zhì)的水性和非水性無(wú)菌注射溶液；和可包括懸浮劑和增稠劑的水性和非水性無(wú)菌懸浮液。組合物可存在于單位劑量或多劑量容器(例如密封安瓿和小瓶)中，且可儲(chǔ)存于冷凍干燥(凍干)條件下，僅需要在臨使用之前添加無(wú)菌液體載體，例如注射用水。可從無(wú)菌散劑、顆粒和片劑制備即用型注射溶液和懸浮液。應(yīng)當(dāng)理解，除了上述具體提及的成分之外，所述組合物可以包括考慮所討論的制劑類型的本領(lǐng)域中常規(guī)的其他試劑，例如適合于經(jīng)口施用的那些可以包括調(diào)味劑。可以向有需要的哺乳動(dòng)物施用反義或RNA干擾分子。或者，可以施用包含其的構(gòu)建體。此類分子和構(gòu)建體可以用于干擾目標(biāo)蛋白、例如刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4的表達(dá)，并且因此改變基因表達(dá)。通常，遞送是通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法。反義或RNA干擾分子可以在體外遞送至細(xì)胞，或在體內(nèi)，例如遞送至哺乳動(dòng)物的腫瘤。可以非限制性使用遞送節(jié)點(diǎn)，包括：靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、手術(shù)期間的局部遞送、內(nèi)窺鏡、皮下和經(jīng)口?？梢葬槍?duì)任何具體應(yīng)用所需的性質(zhì)選擇載體。載體可以是病毒或質(zhì)粒。腺病毒載體在這方面是有用的。組織特異性、細(xì)胞類型特異性或其他可調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子可用于控制抑制性多核苷酸分子的轉(zhuǎn)錄。也可以使用非病毒載體諸如脂質(zhì)體或納米球。試劑的治療有效量將取決于多種因素，包括例如受試者的年齡和體重、需要治療的精確病況和其嚴(yán)重程度、制劑性質(zhì)和施用途徑，并將最終由主治醫(yī)師或獸醫(yī)決定。具體而言，待治療的受試者是哺乳動(dòng)物，特別是人。所述抑制劑可以以每日劑量施用。該量可以每天單劑量或更通常以每天多次(諸如兩次、三次、四次、五次或六次)的亞劑量給予，使得總?cè)談┝渴窍嗤摹Ｋ鲆种苿┛梢詥为?dú)使用或與其他治療劑組合使用。根據(jù)本發(fā)明使用的抑制劑可以與一種或多種其他治療劑組合使用或包括一種或多種其他治療劑，并且可以通過(guò)任何方便的途徑在單獨(dú)或組合的藥物組合物中依次或同時(shí)施用。根據(jù)本發(fā)明使用的抑制劑和藥物組合物可以與一種或多種其他治療劑組合使用，或包括一種或多種其他治療劑，所述其他治療劑例如選自抗炎劑諸如皮質(zhì)類固醇、NSAID、PI3Kd抑制劑、PDE4抑制劑或非類固醇GR激動(dòng)劑；支氣管擴(kuò)張劑諸如抗膽堿能藥或β2-腎上腺素受體激動(dòng)劑；抗毒蕈堿；抗感染劑諸如抗生素或抗病毒劑；或抗組胺藥。在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供了篩選用于治療或預(yù)防呼吸道感染、COPD或COPD惡化的刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4信號(hào)傳導(dǎo)的抑制劑的方法，其包括確定試劑是否抑制刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4途徑的步驟。本發(fā)明首次提出，刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4信號(hào)傳導(dǎo)是用于治療或預(yù)防呼吸道感染、COPD或COPD惡化的潛在治療靶標(biāo)。因此，本發(fā)明提供了用于基于其抑制刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4信號(hào)傳導(dǎo)的能力來(lái)鑒定、驗(yàn)證、選擇和優(yōu)化活性劑的新靶標(biāo)。因此，本發(fā)明涉及鑒定、篩選、表征或定義用于治療或預(yù)防呼吸道感染、COPD或COPD惡化的能夠抑制刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4信號(hào)傳導(dǎo)的試劑的方法。所述方法可用于篩選例如大量用于呼吸道感染、COPD或COPD惡化中的臨床應(yīng)用的候選化合物?？梢栽诨诩?xì)胞的系統(tǒng)、動(dòng)物系統(tǒng)中或通過(guò)無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)定(篩選方法)。此類技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見(jiàn)的，并且可以基于相互作用的量度(例如結(jié)合、置換或競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定)或活性、轉(zhuǎn)錄等的功能的量度。因此，例如，本發(fā)明提供了測(cè)試試劑抑制刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4信號(hào)傳導(dǎo)的能力的方法。本文提供了用于將刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4信號(hào)傳導(dǎo)的抑制劑鑒定為潛在地用于治療或預(yù)防呼吸道感染、COPD或COPD惡化的篩選方法。一種方法涉及篩選刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4信號(hào)傳導(dǎo)的抑制劑，其包括以下步驟：使可通過(guò)乙酰化修飾的肽與刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4受體或其片段在測(cè)試物質(zhì)存在和不存在的情況下接觸，和將測(cè)試物質(zhì)鑒定為刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4活性的抑制劑。用于篩選作為刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4的抑制劑的測(cè)試劑(或物質(zhì))可以來(lái)自本領(lǐng)域已知的任何來(lái)源。它們可以是天然產(chǎn)物，純化的或混合物，合成化合物，化合物文庫(kù)的成員等。測(cè)試物質(zhì)可以選自先前已經(jīng)鑒定為具有生物或藥物活性的那些，或選自沒(méi)有鑒定為具有生物或藥物活性的那些。在一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方案中，篩選缺刻蛋白3和/或缺刻蛋白4受體的抑制劑的方法包括結(jié)合測(cè)定。因此，可以在競(jìng)爭(zhēng)或直接結(jié)合測(cè)定中鑒定抑制刻缺蛋白3和/或刻缺蛋白4受體與其底物結(jié)合的化合物。直接和競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定形式兩者都與免疫測(cè)定和受體結(jié)合測(cè)定中使用的形式相似，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員通常已知的。描述以下實(shí)施例以說(shuō)明本發(fā)明中描述的方法的有效性且進(jìn)一步例舉上述一般方法的特定應(yīng)用。因此，以下實(shí)施例部分決不意圖限制本文所考慮的本發(fā)明的范圍。實(shí)施例材料和方法細(xì)胞和組織制備來(lái)自慢性阻塞性肺病(COPD)供體的氣-液界面(ALI)培養(yǎng)的人支氣管上皮細(xì)胞(BEC)或者是完全分化地購(gòu)買的(EpithelixSarl，目錄號(hào)EP10MD)，或者使用Pneumocult方法(StemCellTechnologies，目錄號(hào)05001)以24孔格式內(nèi)部培養(yǎng)。用于內(nèi)部ALI培養(yǎng)的原代細(xì)胞獲得自EpithelixSarl，目錄號(hào)EP18AB。通過(guò)在曼徹斯特大學(xué)實(shí)驗(yàn)藥物單位進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)性支氣管鏡檢查從頻繁(一年超過(guò)2次)或偶爾(一年0次)惡化的COPD患者獲得支氣管刷。將支氣管刷儲(chǔ)存在TRIZOl?試劑(LifeTechnologies，目錄號(hào)15596-026)中，用于下游轉(zhuǎn)錄分析。對(duì)于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，以總共50μl中的1x108噬斑形成單位(PFU)的人鼻病毒血清型1b(HRV1b)病毒鼻內(nèi)感染8周齡的雌性BALB/c小鼠，并且用0.5mg/kg的濃度的γ-分泌酶抑制劑化合物BN2-?[(2S)?-?2-?(3,5-二氟苯基)-2-羥基乙?；鵠?-?N1-?[(7S)?-?5-?甲基-6-氧代-6,7-二氫-?5H-二苯并[b,d]?氮雜?-7-基]-L-丙氨酰胺處理或不處理。為了評(píng)價(jià)肺的炎癥，收集支氣管-肺泡灌洗液(BALF)，并在Sysmex細(xì)胞分析系統(tǒng)(MiltonKeynes,UK)上分析細(xì)胞浸潤(rùn)物。隨后，將全肺置于1mlTRIZOL?試劑中用于下游基因表達(dá)分析。ALI培養(yǎng)的COPDBEC的鼻病毒感染在感染前，將ALI細(xì)胞在溫?zé)酨BS(具有Ca2+/Mg2+)中洗滌兩次。隨后，在總體積50μl的培養(yǎng)基中以1或5的感染復(fù)數(shù)(MOI)施用人鼻病毒16。使病毒在室溫下在輕輕振蕩下附著1小時(shí)。因此，用溫?zé)酨BS(具有Ca2+/Mg2+)洗掉病毒，并且將細(xì)胞在37℃下在添加或不添加γ-分泌酶抑制劑化合物A(S)-2-[2-(3,5-二氟苯基)-乙酰氨基]-N-((S)-1-甲基-2-氧代-5-苯基-2,3-二氫-1H-苯并[e][1,4]二氮雜?-3-基)-丙酰胺(Calbiochem目錄號(hào)565790)的情況下進(jìn)一步培養(yǎng)指定量的時(shí)間。基因表達(dá)的分析通過(guò)在Promega總RNA分離系統(tǒng)(Promega，目錄號(hào)Z3505)提供的RLT緩沖液中裂解細(xì)胞來(lái)制備來(lái)自ALI培養(yǎng)的COPDBEC的核糖核酸(RNA)。然后通過(guò)使用具有自動(dòng)化的制造商方案提取RNA。通過(guò)首先將肺在1mlTRIZOL?試劑中均質(zhì)化、然后用1-溴-3-氯丙烷(BCP)(MRC，目錄號(hào)BP151)進(jìn)行隨后的相分離來(lái)分離鼠總肺RNA。然后將水相與70％乙醇混合，并使用具有自動(dòng)化的Promega總RNA分離系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)最終的RNA提取。通過(guò)根據(jù)制造商的方案(AppliedBiosystems，目錄號(hào)4368814)使用MultiScribe?逆轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)引物的逆轉(zhuǎn)錄來(lái)合成互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)。通過(guò)使用TaqMan?基因表達(dá)系統(tǒng)(AppliedBiosystems目錄號(hào)4369510)和即用型TaqMan?引物/探針(參見(jiàn)表1)的定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)來(lái)進(jìn)行特定靶標(biāo)的擴(kuò)增。全基因表達(dá)分析通過(guò)使用人類基因組U133Plus2.0基因芯片的微陣列來(lái)進(jìn)行，并且由EpistemLtd.(Manchester,UK)或ExpressionAnalysis,Inc.(Durham,US)完成。使用具有GC-RMA歸一化算法的ArrayStudio軟件(OmicSoftCorporation,Cary,US)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。丟棄具有小于64的幾何平均值的強(qiáng)度的探針。隨后，采取滿足在任何條件之間至少1.2倍調(diào)節(jié)(支氣管刷數(shù)據(jù)集)或2倍調(diào)節(jié)(ALI培養(yǎng)物數(shù)據(jù)集)的標(biāo)準(zhǔn)的探針用于進(jìn)一步分析。通過(guò)以p≤0.05的截止過(guò)濾器進(jìn)行方差分析(ANOVA)來(lái)生成最終基因列表。蛋白表達(dá)的分析根據(jù)制造商的方案在MesoScaleDiscovery(MSD?)平臺(tái)上進(jìn)行分泌的蛋白的檢測(cè)。表2中提供了具體測(cè)定的列表。分別通過(guò)均購(gòu)自R&Dsystems(目錄號(hào)DY333和DRN00B)的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒檢測(cè)趨化因子CXCL6和CCL5。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行蛋白的細(xì)胞表面表達(dá)的分析。簡(jiǎn)言之，通過(guò)在37℃下StemProAccutase處理20分鐘(LifeTechnologies，目錄號(hào)A1110501)來(lái)解離在ALI處生長(zhǎng)的細(xì)胞。然后將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)至4x106個(gè)細(xì)胞/ml，并用AlexaFluor?488綴合的CD66a/c/e(克隆ASL-32，Biolegend)、BrilliantViolet?421綴合的CD271(C40-1457,BDPharmingen)、別藻藍(lán)蛋白(APC)綴合的CD133(克隆AC133,MiltenyiBiotec)和APC-Cy7綴合的CD56(克隆HCD56,Biolegend)進(jìn)行染色。所有抗刻缺蛋白受體抗體是未綴合的，并且因此通過(guò)用藻紅蛋白(PE)綴合的鏈霉抗生物素蛋白(Biolegend)或山羊抗兔抗體(LifeTechnologies)的二級(jí)染色來(lái)揭示。在一些情況下，使用PE-Cy7綴合的抗小鼠IgG1(克隆RMG1-1，Biolegend)。表3中提供了抗刻缺蛋白受體抗體的細(xì)節(jié)。分析型流式細(xì)胞術(shù)使用FACSCantoII(BecktonDickinson)進(jìn)行，并使用FlowJo軟件(TreeStar,Inc.Ashland,US)進(jìn)行分析。組織學(xué)和成像將ALI培養(yǎng)的BEC在4％多聚甲醛(PFA)中固定過(guò)夜。粘液負(fù)荷通過(guò)用阿爾新藍(lán)/過(guò)碘酸雪夫氏(AB/PAS)染色的組織學(xué)切片評(píng)估，并通過(guò)GSKPTS組織學(xué)核心設(shè)備進(jìn)行。為了檢測(cè)纖毛，將固定的膜用抗-β-微管蛋白IV抗體(克隆ONS.1A6，SigmaAldrich)染色，并通過(guò)驢抗小鼠IgGAlexaFluor?488抗體(LifeTechnologies)揭示。在由Zeiss制造的Axioskop2Plus顯微鏡上捕獲圖像。免疫組織化學(xué)將肺活檢組織固定在石蠟塊中，并且隨后在RM2235超薄切片機(jī)(LeicaBiosystems)上以3μm厚度切片。將載片在BenchMarkULTRA平臺(tái)(VentanaMedicalSystems)上處理和染色，并在由Zeiss制造的Axioskop2Plus顯微鏡上捕獲圖像。表4中提供了所用抗體的細(xì)節(jié)。表1.用于分析ALI培養(yǎng)的BEC或全鼠肺中靶基因的表達(dá)的TaqMan?引物/探針測(cè)定。表2.在MSD平臺(tái)上蛋白檢測(cè)的測(cè)定的細(xì)節(jié)。表3.用于評(píng)估ALI培養(yǎng)的BEC上的刻缺蛋白受體表達(dá)的抗刻缺蛋白受體抗體的細(xì)節(jié)?？倘钡鞍资荏w制造商目錄號(hào)克隆刻缺蛋白1Abcamab44986A6刻缺蛋白2MiltenyiBiotec130-096-980MHN2-25刻缺蛋白3Abcamab23426-刻缺蛋白4Abcamab134831-表4.用于評(píng)估COPD肺中的刻缺蛋白受體表達(dá)的抗刻缺蛋白受體抗體的細(xì)節(jié)?？倘钡鞍资荏w制造商目錄號(hào)克隆刻缺蛋白1Abcamab128076mN1A刻缺蛋白3Abcamab23426-刻缺蛋白4Abcamab134831-結(jié)果刻缺蛋白途徑的組分在來(lái)自COPD患者的支氣管上皮刷中差異表達(dá)，表明刻缺蛋白途徑和具體地刻缺蛋白3途徑可以在COPD中的上皮細(xì)胞的致病表型中起作用(圖2)。已經(jīng)表明通過(guò)γ-分泌酶抑制(通過(guò)用化合物A處理)干擾刻缺蛋白信號(hào)傳導(dǎo)減少粘液分泌并防止在氣-液界面(ALI)處培養(yǎng)并用人鼻病毒16(HRV16)感染的健康和COPD人支氣管上皮細(xì)胞(BEC)中的纖毛化的喪失(圖5和6)。此外，刻缺蛋白抑制減少這些細(xì)胞的HRV16誘導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞相關(guān)趨化因子的表達(dá)，而T-細(xì)胞趨化因子和抗病毒1型干擾素反應(yīng)保持完整(圖3、7和8)。因此，嗜中性粒細(xì)胞，但不是T-細(xì)胞趨化性，響應(yīng)于來(lái)自刻缺蛋白抑制的上皮細(xì)胞的上清液而降低(圖9)。這些作用對(duì)于刻缺蛋白途徑是特異性的，因?yàn)榭倘钡鞍谆砻猞?分泌酶調(diào)節(jié)劑(其缺乏針對(duì)刻缺蛋白受體的活性)不抑制刻缺蛋白靶基因，并且此外，在HRV16感染后不改變粘膜纖毛反應(yīng)，表明調(diào)節(jié)纖毛化和粘液產(chǎn)生的調(diào)節(jié)受刻缺蛋白信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)(圖4)。也已經(jīng)表明，刻缺蛋白信號(hào)傳導(dǎo)的抑制在體內(nèi)減少了HRV1b感染的小鼠的肺中的嗜中性粒細(xì)胞和粘蛋白表達(dá)(圖10)。此外，刻缺蛋白抑制減少體外BEC中細(xì)菌粘附受體在基因和蛋白水平的表達(dá)，表明對(duì)繼發(fā)性細(xì)菌感染的潛在影響(圖3和圖11)。最后，也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)上皮祖細(xì)胞主要在體外表達(dá)刻缺蛋白3受體(圖12)，反映COPD肺中的表達(dá)，其中已檢測(cè)到刻缺蛋白3的高表達(dá)和刻缺蛋白4的較低程度的表達(dá)?？倘钡鞍?和2在體外或體內(nèi)未檢測(cè)到(圖12、13和人蛋白圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)：(http://www.proteinatlas.org/ENSG00000134250-NOTCH2/tissue)。此外，刻缺蛋白基因3(NOTCH3)和其他刻缺蛋白靶基因(HES5和HEY1)的表達(dá)在體外和體內(nèi)響應(yīng)于刻缺蛋白抑制而被特異性調(diào)節(jié)?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明刻缺蛋白3或刻缺蛋白4或刻缺蛋白3和4信號(hào)傳導(dǎo)的組合在COPD氣道上皮細(xì)胞的病毒感染期間特異性調(diào)節(jié)病理性粘液纖毛和炎性反應(yīng)，且刻缺蛋白3或刻缺蛋白4或刻缺蛋白3和4的組合的抑制可以提供有效的治療干預(yù)以減少COPD惡化的這些標(biāo)志，同時(shí)保持基本免疫應(yīng)答完整。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3