本申請要求2014年8月15日提交的美國臨時申請No.62/037,880的優(yōu)先權(quán)，其全部內(nèi)容在此通過引用并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的領(lǐng)域大體上涉及結(jié)合R-Spondin蛋白1(RSPO1)的抗體和其它試劑。本發(fā)明大體上還涉及產(chǎn)生抗體的方法和使用所述抗體治療如癌癥等疾病的方法。
背景技術(shù)：
：R-Spondin(RSPO)蛋白家族在脊椎動物中是保守的，并且包括四個成員，RSPO1、RSPO2、RSPO3和RSPO4。這些蛋白質(zhì)被稱為各種名稱，包括頂壁特異性spondins(plate-specificspondin)、hPWTSR(hRSPO3)、THS2D(RSPO3)、Cristin1-4和Futrin1-4。RSPO是小分泌蛋白，其總體上共享約40-60％的序列同源性和結(jié)構(gòu)域組織。所有RSPO蛋白在N-末端含有兩個弗林蛋白酶樣富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域，隨后是血小板反應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域和堿性帶電的C-末端尾(Kimetal.,2006,CellCycle,5:23-26)。研究已經(jīng)顯示RSPO蛋白在脊椎動物發(fā)育期間(Kamataetal.,2004,Biochim.BiophysActa,1676:51-62)和非洲爪蟾肌細胞生成中(Kazanskayaetal.,2004,Dev.Cell,7:525-534)發(fā)揮作用。RSPO1也已顯示用作胃腸上皮細胞的有效絲裂原(Kimetal.,2005,Science,309:1256-1259)。已知RSPO蛋白激活與Wnt信號傳導(dǎo)類似的β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)，然而RSPO蛋白和Wnt信號之間的關(guān)系仍在研究中。已經(jīng)報道RSPO蛋白對Wnt配體具有正調(diào)節(jié)活性(Nametal.,2006,JBC281:13247-57)。該研究還報道了RSPO蛋白可以作為Frizzled8和LRP6受體配體起作用并誘導(dǎo)β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)(Nametal.,2006,JBC281:13247-57)。最近的研究已經(jīng)鑒定了RSPO蛋白和LGR(含有富亮氨酸重復(fù)，G蛋白-偶聯(lián)受體)蛋白質(zhì)例如LGR5(美國專利號8,158,758和8,158,757)之間的相互作用，并且這些數(shù)據(jù)提供了激活β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)的替代途徑。Wnt信號傳導(dǎo)途徑已被鑒定為癌癥治療的潛在靶標(biāo)。Wnt信號傳導(dǎo)途徑是胚胎模式形成、胚胎后組織維持和干細胞生物學(xué)的幾個關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素之一。更具體地，Wnt信號傳導(dǎo)在細胞極性產(chǎn)生和細胞命運決定中發(fā)揮重要作用，包括通過干細胞群體進行的自我更新。Wnt途徑的不受調(diào)節(jié)的激活與許多人類癌癥相關(guān)，在所述癌癥中認為激活可以改變細胞的發(fā)育命運。Wnt途徑的激活可以將腫瘤細胞維持在未分化狀態(tài)和/或?qū)е虏皇芸刂频脑鲋?。因此，癌發(fā)生可通過壓制(overtake)控制正常發(fā)育和組織修復(fù)的穩(wěn)態(tài)機制來進行(Reya和Clevers的綜述,2005,Nature,434:843-50；Beachyetal.,2004,Nature,432:324-31)。Wnt信號傳導(dǎo)途徑首先在果蠅發(fā)育突變無翅(wg)和鼠類原癌基因int-1，現(xiàn)在的Wnt1中被闡明(Nusse&Varmus,1982,Cell,31:99-109；VanOoyen&Nusse,1984,Cell,39:233-40；Cabreraetal.,1987,Cell,50:659-63；Rijsewijketal.,1987,Cell,50:649-57)。Wnt基因編碼分泌的脂質(zhì)修飾的糖蛋白，其中19種已在哺乳動物中鑒定。這些分泌的配體激活由Frizzled(FZD)受體家族成員和低密度脂蛋白(LDL)受體相關(guān)蛋白5或6(LRP5/6)組成的受體復(fù)合物。FZD受體是G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)超家族的七次跨膜結(jié)構(gòu)域蛋白，并且包含具有10個保守半胱氨酸的大胞外N末端配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，稱為富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域(CRD)或Fri結(jié)構(gòu)域。有十種人類FZD受體，F(xiàn)ZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9和FZD10。不同的FZDCRD對特異性Wnt蛋白具有不同的結(jié)合親和力(Wu&Nusse,2002,J.Biol.Chem.,277:41762-9)，并且FZD受體已被分組為激活規(guī)范β-連環(huán)蛋白途徑的FZD受體和激活非規(guī)范途徑的FZD受體(Milleretal.,1999,Oncogene,18:7860-72)。Wnt信號傳導(dǎo)在癌癥中的作用首先通過鑒定Wnt1(最初為int1)作為由附近插入鼠類病毒轉(zhuǎn)化的乳腺腫瘤中的致癌基因揭示(Nusse&Varmus,1982,Cell,31:99-109)。已經(jīng)積累有關(guān)Wnt信號傳導(dǎo)在乳腺癌中的作用的其他證據(jù)。例如，β-連環(huán)蛋白在乳腺中的轉(zhuǎn)基因過表達導(dǎo)致增生和腺癌(Imbertetal.,2001,J.CellBiol.,153:555-68；Michaelson&Leder,2001,Oncogene,20:5093-9)，而Wnt信號傳導(dǎo)的喪失破壞正常乳腺發(fā)育(Teperaetal.,2003,J.CellSci.,116:1137-49；Hatselletal.,2003,J.MammaryGlandBiol.Neoplasia,8:145-58)。在人乳腺癌中，超過50％的癌中β-連環(huán)蛋白積累涉及激活的Wnt信號傳導(dǎo)，并且雖然尚未鑒定特異性突變，但已觀察到Frizzled受體表達的上調(diào)(Brennan&Brown,2004,J.MammaryGlandBiol.Neoplasia,9:119-31；Malovanovicetal.,2004,Int.J.Oncol.,25:1337-42)。Wnt途徑的激活也與結(jié)腸直腸癌相關(guān)。所有結(jié)腸直腸癌中約5-10％是遺傳性的，其中一種主要形式是家族性腺瘤性息肉病(FAP)，其是常染色體顯性疾病，其中約80％的受影響個體在腺瘤性結(jié)腸息肉病(APC)基因中含有種系突變。還在其他Wnt途徑組分(包括Axin和β-連環(huán)蛋白)中鑒定出突變。個體腺瘤是含有第二個失活等位基因的上皮細胞的克隆生長，并且大量的FAP腺瘤不可避免地通過致癌基因和/或腫瘤抑制基因中的另外的突變導(dǎo)致腺癌的發(fā)展。此外，Wnt信號傳導(dǎo)途徑的激活，包括APC中的功能喪失突變和β-連環(huán)蛋白中的穩(wěn)定突變，可以誘導(dǎo)小鼠模型中的增生性發(fā)展和腫瘤生長(Oshimaetal.,1997,CancerRes.,57:1644-9；Haradaetal.,1999,EMBOJ.,18:5931-42)。與乳腺癌和結(jié)腸癌相似，黑素瘤通常具有Wnt途徑的組成型激活，如β-連環(huán)蛋白的核積累所示。在一些黑素瘤腫瘤和細胞系中Wnt/β-連環(huán)蛋白途徑的激活是由于途徑組分例如APC、ICAT、LEF1和β-連環(huán)蛋白的修飾導(dǎo)致(參見例如Larueetal.2006,FrontiersBiosci.,11:733-742)。然而，在文獻中關(guān)于Wnt/β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)在黑素瘤中的確切作用存在矛盾的報道。例如，一項研究發(fā)現(xiàn)，升高水平的核β-連環(huán)蛋白與來自黑素瘤的改善的存活相關(guān)，并且激活的Wnt/β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)與減少的細胞增殖相關(guān)(Chienetal.,2009,PNAS,106:1193-1198)。癌癥藥物研究的焦點轉(zhuǎn)向針對人類癌癥中涉及的基因、蛋白質(zhì)和途徑的靶向療法。需要靶向信號傳導(dǎo)途徑的新試劑和靶向多種途徑的試劑的新組合，其可以為癌癥患者提供治療益處。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供結(jié)合RSPO1蛋白的結(jié)合劑，例如抗體，以及包含結(jié)合劑的組合物，例如藥物組合物。在某些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑是新的多肽，例如抗體、抗體片段和與這樣的抗體相關(guān)的其他多肽。在一些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑是從生產(chǎn)和/或純化角度具有期望的和/或改善的性質(zhì)的抗體變體。在一些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑是具有所需性質(zhì)例如改善的溶解性或改善的穩(wěn)定性的抗體變體。在一些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑是從治療學(xué)角度具有期望的和/或改善的性質(zhì)的抗體變體。本發(fā)明還提供了通過向患有腫瘤的受試者施用RSPO1結(jié)合劑來抑制腫瘤生長的方法。本發(fā)明還提供了通過將RSPO1結(jié)合劑施用于有需要的受試者來治療癌癥的方法。在一些實施方式中，治療癌癥或抑制腫瘤生長的方法包括用RSPO1結(jié)合劑靶向癌癥干細胞。在某些實施方式中，所述方法包括降低腫瘤中癌癥干細胞的頻率，減少腫瘤中癌癥干細胞的數(shù)目，降低腫瘤的致瘤性，和/或通過減少腫瘤中癌癥干細胞的數(shù)目或頻率來降低腫瘤的致瘤性。在一個方面，本發(fā)明提供了特異性結(jié)合人RSPO1的結(jié)合劑，例如抗體。在某些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑結(jié)合在人RSPO1(SEQIDNO：1)的氨基酸21-263內(nèi)。在某些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑結(jié)合在人RSPO1(SEQIDNO：1)的氨基酸34-135內(nèi)。在某些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑結(jié)合在人RSPO1(SEQIDNO：1)的氨基酸34-85內(nèi)。在某些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑結(jié)合在人RSPO1(SEQIDNO：1)的氨基酸91-135內(nèi)。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑(例如，抗體)特異性結(jié)合選自由RSPO2、RSPO3和RSPO4組成的組中的至少一種其它人RSPO。在一些實施方式中，當(dāng)結(jié)合人RSPO1時，所述RSPO1結(jié)合劑或抗體(i)調(diào)節(jié)β-連環(huán)蛋白活性，(ii)是β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)的拮抗劑，(iii)抑制β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)，和/或(iv)抑制β-連環(huán)蛋白的激活。在一些實施方式中，當(dāng)結(jié)合RSPO1時，所述RSPO1結(jié)合劑抑制RSPO1信號傳導(dǎo)。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑抑制或干擾RSPO1與一種或多種LGR蛋白(例如LGR4、LGR5和/或LGR6)的結(jié)合。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑抑制RSPO1與LGR5的結(jié)合。在上述方面和實施方式中的每一個的某些實施方式中，以及本文所述的其它方面和實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑是抗體。在某些實施方式中，所述抗體是單克隆抗體。在某些實施方式中，所述抗體是人源化抗體。在某些實施方式中，所述抗體結(jié)合人RSPO1。在某些實施方式中，所述抗體結(jié)合人RSPO1和小鼠RSPO1。在某些實施方式中，所述抗體以小于1nM的KD結(jié)合人RSPO1，以小于1nM的KD結(jié)合小鼠RSPO1。在某些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑是包含含有TGYTMH(SEQIDNO：6)的重鏈CDR1，含有GINPNNGGTTYNQNFKG(SEQIDNO：7)的重鏈CDR2和含有KEFSDGYYFFAYSEQIDNO：8)的重鏈CDR3的抗體。在一些實施方式中，所述抗體進一步包含含有KASQDVIFAVA(SEQIDNO：9)的輕鏈CDR1，含有WASTRHT(SEQIDNO：10)的輕鏈CDR2和含有QQHYSTPW(SEQIDNO：11)的輕鏈CDR3。在某些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑是包含含有KASQDVIFAVA(SEQIDNO：9)的輕鏈CDR1，含有WASTRHT(SEQIDNO：10)的輕鏈CDR2和含有QQHYSTPWSEQIDNO：11)的輕鏈CDR3的抗體。在某些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑是包含以下的抗體：(a)與SEQIDNO：32具有至少90％序列同一性的重鏈可變區(qū)，和/或(b)與SEQIDNO：33具有至少90％的序列同一性的輕鏈可變區(qū)。在某些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑是包含以下的抗體：(a)與SEQIDNO：32具有至少95％序列同一性的重鏈可變區(qū)，和/或(b)與SEQIDNO：33具有至少95％的序列同一性的輕鏈可變區(qū)。在某些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑是包含以下的抗體：(a)與SEQIDNO：32具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重鏈可變區(qū)，和/或(b)與SEQIDNO：33具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的輕鏈可變區(qū)。在某些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑是包含與SEQIDNO：35具有至少90％序列同一性的重鏈和與SEQIDNO：37具有至少90％的序列同一性的輕鏈的抗體。在某些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑是包含與SEQIDNO：35具有至少95％序列同一性的重鏈和與SEQIDNO：37具有至少95％的序列同一性的輕鏈的抗體。在某些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑是包含與SEQIDNO：35具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重鏈和與SEQIDNO：37具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的輕鏈的抗體。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑是抗體89M5的人源化形式。單克隆抗體89M5由2011年6月30日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)保藏號為PTA-11970的雜交瘤細胞系89M5產(chǎn)生。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑是人源化單克隆抗體h89M5-H8L5。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑包含由2014年8月15日保藏于ATCC的保藏號為PTA-121494的質(zhì)粒編碼的重鏈可變區(qū)。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑包含由2014年8月15日保藏于ATCC的保藏號為PTA-121495的質(zhì)粒編碼的輕鏈可變區(qū)。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑包含由2014年8月15日保藏于ATCC的保藏號為PTA-121494的質(zhì)粒編碼的重鏈。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑包含由2014年8月15日保藏于ATCC的保藏號為PTA-121495的質(zhì)粒編碼的輕鏈。在另一方面，本發(fā)明提供了與本發(fā)明的抗體競爭與人RSPO蛋白特異性結(jié)合的結(jié)合劑(例如，抗體)。在一些實施方式中，所述結(jié)合劑(例如抗體)與包含含有SEQIDNO：32的重鏈可變區(qū)和含有SEQIDNO：33的輕鏈可變區(qū)的抗體競爭與人RSPO1的特異性結(jié)合。在一些實施方式中，與所述RSPO1結(jié)合劑競爭的抗體是h89M5-H8L5。在一些實施方式中，所述結(jié)合劑在體外競爭性結(jié)合測定中與本發(fā)明的抗體競爭與RSPO1的特異性結(jié)合。在某些實施方式中，所述抗體在RSPO1上結(jié)合與本發(fā)明的抗體(例如h89M5-H8L5)相同的表位或基本上相同的表位。在另一方面，所述結(jié)合劑是抗體，所述抗體結(jié)合的RSPO1上的表位與本發(fā)明的抗體(例如h89M5-H8L5)結(jié)合的RSPO1上的表位重疊。在上述方面中的每一個的某些實施方式中，以及本文其他地方描述的其它方面和/或?qū)嵤┓绞街校蛛x了所述RSPO1結(jié)合劑或抗體。在另一方面，本發(fā)明提供了包含SEQIDNO：32和/或SEQIDNO：33的多肽。在另一方面，本發(fā)明提供了包含SEQIDNO：34和/或SEQIDNO：36的多肽。在另一方面，本發(fā)明提供了包含SEQIDNO：35和/或SEQIDNO：37的多肽。在一些實施方式中，分離了所述多肽。在某些實施方式中，所述多肽是基本上純的。在某些實施方式中，所述多肽是抗體。在另一方面，本發(fā)明提供了分離的多核苷酸分子，其包含編碼上述方面中的每一個以及本文所述的其他方面和/或?qū)嵤┓绞降目贵w和/或多肽的多核苷酸。在一些實施方式中，所述多核苷酸包含編碼選自由SEQIDNO：32、SEQIDNO：33、SEQIDNO：34、SEQIDNO：35、SEQIDNO：36和SEQIDNO：37組成的組中的氨基酸序列的多核苷酸。在一些實施方式中，所述多核苷酸包含選自由SEQIDNO：38、SEQIDNO：39、SEQIDNO：40和SEQIDNO：41組成的組中的序列。本發(fā)明還提供了包含多核苷酸的表達載體，以及包含表達載體和/或多核苷酸的細胞。在一些實施方式中，所述細胞是雜交瘤細胞系。在其它方面，本發(fā)明提供了抑制腫瘤生長的方法，包括使腫瘤與有效量的RSPO1結(jié)合劑或抗體(包括本文所述的每一種)接觸。在另一方面，本發(fā)明提供了抑制受試者中腫瘤生長的方法，所述方法包括向受試者施用治療有效量的RSPO1結(jié)合劑或抗體，包括本文所述的每一種。在另一方面，本發(fā)明提供了抑制細胞中β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)的方法，所述方法包括使細胞與有效量的RSPO1結(jié)合劑或抗體(包括本文所述的每一種)接觸。在一些實施方式中，所述細胞是腫瘤細胞。在一些實施方式中，所述腫瘤是結(jié)腸直腸腫瘤。在一些實施方式中，所述腫瘤是卵巢腫瘤。在一些實施方式中，所述腫瘤是胰腺腫瘤。在一些實施方式中，所述腫瘤是肺腫瘤。在一些實施方式中，所述腫瘤表達升高水平的至少一種RSPO蛋白。在一些實施方式中，所述腫瘤表達升高水平的RSPO1。在一些實施方式中，所述腫瘤表達升高水平的RSPO2。在一些實施方式中，所述腫瘤表達升高水平的RSPO3。在某些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑例如通過減少腫瘤中癌干細胞的數(shù)量和/或頻率來抑制腫瘤的生長。在另一方面，本發(fā)明提供了治療受試者中癌癥的方法。在一些實施方式中，所述方法包括向受試者施用治療有效量的本文所述的任何RSPO1結(jié)合劑或抗體。在一些實施方式中，所述癌癥是胰腺癌。在一些實施方式中，所述癌癥是結(jié)腸直腸癌。在一些實施方式中，所述結(jié)腸直腸癌包含腺瘤性結(jié)腸息肉病(APC)基因中的失活性突變。在一些實施方式中，所述結(jié)腸直腸癌不包含APC基因中的失活突變。在一些實施方式中，所述結(jié)腸直腸癌包含野生型APC基因。在一些實施方式中，所述癌癥是卵巢癌。在一些實施方式中，所述癌癥是乳腺癌。在一些實施方式中，所述癌癥是肺癌。在一些實施方式中，所述癌癥表達升高水平的至少一種RSPO蛋白。在一些實施方式中，所述癌癥表達升高水平的RSPO1。在一些實施方式中，所述癌癥是表達升高水平的RSPO1的卵巢癌。在另一方面，本發(fā)明提供了治療受試者中的疾病的方法，其中所述疾病與β-連環(huán)蛋白的激活和/或異常的β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)相關(guān)，所述方法包括施用治療有效量的RSPO1結(jié)合劑或抗體，包括本文所述的每一種。在上述方面中的每一個的某些實施方式中，以及本文別處描述的其它方面和/或?qū)嵤┓绞街校鲋委煼椒òㄊ┯肦SPO1結(jié)合劑與至少一種另外的治療劑的組合。在一些實施方式中，所述治療方法包括施用RSPO1結(jié)合劑與第二RSPO結(jié)合劑例如RSPO2結(jié)合劑、RSPO3結(jié)合劑和/或RSPO4結(jié)合劑的組合。在一些實施方式中，所述治療方法包括施用RSPO1結(jié)合劑與RSPO2結(jié)合劑的組合。在一些實施方式中，所述治療方法包括施用RSPO1結(jié)合劑、RSPO2結(jié)合劑和至少一種化療劑的組合。在上述方面中的每一個的某些實施方式中，以及本文別處描述的其它方面和/或?qū)嵤┓绞街?，所述治療方法還包括確定腫瘤或癌癥中至少一種RSPO蛋白的表達水平的步驟。另一方面，本發(fā)明提供了鑒定人類受試者或選擇人類受試者以用RSPO1結(jié)合劑或抗體(包括但不限于本文所述的每一種)進行治療的的方法。在一些實施方式中，該方法包括確定受試者是否患有與RSPO蛋白的預(yù)定表達水平相比具有升高的特定RSPO(例如，RSPO1、RSPO2或RSPO3)表達水平的腫瘤。在一些實施方式中，如果所述腫瘤具有升高的RSPO表達水平，則所述方法包括鑒定受試者以進行治療或選擇受試者以進行治療。在一些實施方式中，所述方法包括確定受試者是否患有包含APC基因中的失活突變的腫瘤。在一些實施方式中，如果所述腫瘤包含APC基因中的失活性突變，則所述方法包括鑒定受試者以進行治療或選擇受試者以進行治療。還提供了包含本文所述的RSPO1結(jié)合劑或抗體的組合物。還提供了包含本文所述的RSPO1結(jié)合劑或抗體和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。提供了產(chǎn)生本文所述的RSPO1結(jié)合劑的細胞系。還提供了治療受試者(例如人)中的癌癥和/或抑制受試者(例如人)中的腫瘤生長的方法，所述方法包括向受試者施用有效量的包含RSPO1結(jié)合劑的藥物組合物。在本發(fā)明的方面或?qū)嵤┓绞礁鶕?jù)馬庫什組或其他替代組分別描述的情況下，本發(fā)明不僅包括作為整體列出的整個組，而且還獨立地包括組的每個成員和主要組的所有可能亞組，以及缺失一個或多個組成員的主組。本發(fā)明還設(shè)想明確排除所要求保護的發(fā)明中的任何組成員中的一個或多個。附圖說明圖1A和1B，與第二代抗RSPO人源化抗體h89M5-H8L5相比，第一代抗RSPO1人源化抗體h89M5-H2L2的氨基酸序列。圖1A–標(biāo)明CDR的重鏈氨基酸序列。圖1B–標(biāo)明CDR的輕鏈氨基酸序列。圖2，人源化抗RSPO1抗體的FACS分析。第一代抗RSPO1人源化抗體h89M5-H2L2和第二代抗RSPO1人源化抗體h89M5-H8L5的FACS分析。測試每種抗體的連續(xù)稀釋液。相對抗體結(jié)合顯示在y軸上，F(xiàn)LAG-RSPO1furin-CD4TM-GFP融合蛋白的表達顯示在x軸上。圖3，人源化抗RSPO1抗體的尺寸排阻色譜分析。底部譜線是第一代抗RSPO1抗體h89M5-H2L2。中間譜線是第二代抗RSPO1抗體h89M5-H8L5。頂部譜線是MW標(biāo)準(zhǔn)。具體實施方式本發(fā)明提供了結(jié)合RSPO蛋白(例如，人RSPO1、RSPO2和/或RSPO3)的新型試劑，包括但不限于多肽，例如抗體。RSPO1結(jié)合劑包括β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)的拮抗劑。還提供了相關(guān)多肽和多核苷酸、包含RSPO1結(jié)合劑的組合物，以及制備RSPO1結(jié)合劑的方法。進一步提供了使用所述新型RSPO1結(jié)合劑的方法，例如抑制腫瘤生長的方法、治療癌癥的方法、降低腫瘤中癌干細胞頻率的方法、抑制β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)的方法和/或鑒定和/或選擇用于治療的受試者的方法。I.定義為了便于理解本發(fā)明，以下定義了許多術(shù)語和短語。如本文所用的術(shù)語“拮抗劑”和“拮抗性”是指部分或完全阻斷、抑制、降低或中和靶標(biāo)和/或信號傳導(dǎo)途徑(例如，β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo))的生物活性的任何分子。本文使用的術(shù)語“拮抗劑”包括部分或完全阻斷、抑制、降低或中和蛋白質(zhì)(例如RSPO蛋白)活性的任何分子。合適的拮抗劑分子特別包括但不限于拮抗劑抗體或抗體片段。本文使用的術(shù)語“調(diào)節(jié)”和“進行調(diào)節(jié)”是指生物活性的變化或改變。調(diào)節(jié)包括但不限于刺激或抑制活性。調(diào)節(jié)可以是活性的增加或減少(例如，RSPO信號傳導(dǎo)的減少；β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)的減少)，結(jié)合特征的變化，或者與蛋白質(zhì)的活性、途徑或其它感興趣的生物點相關(guān)的生物學(xué)、功能或免疫學(xué)性質(zhì)的任何其他變化。如本文所用的術(shù)語“抗體”是指通過免疫球蛋白分子的可變區(qū)內(nèi)的至少一個抗原識別位點識別并特異性結(jié)合靶標(biāo)，例如蛋白質(zhì)、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂質(zhì)或前述組合的免疫球蛋白分子。如本文所用，該術(shù)語包括完整的多克隆抗體、完整的單克隆抗體、抗體片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段)、單鏈Fv(scFv)抗體、多特異性抗體例如由至少兩種抗體產(chǎn)生的雙特異性抗體、單特異性抗體、單價抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、包含抗體的抗原決定部分的融合蛋白，以及包含抗原識別位點的任何其他修飾的免疫球蛋白分子，只要該抗體表現(xiàn)出所需的生物活性即可。基于其分別稱為α、δ、ε、γ和μ的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域的同一性，抗體可以是免疫球蛋白的五種主要類別中的任一種：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM或其亞類(同種型)(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。不同類別的免疫球蛋白具有不同的和公知的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型。抗體可以是裸露的或與其他分子綴合，其他分子包括但不限于毒素和放射性同位素。術(shù)語“抗體片段”是指完整抗體的一部分，是指完整抗體的抗原決定可變區(qū)。抗體片段的實例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、線性抗體、單鏈抗體和由抗體片段形成的多特異性抗體。如本文所用的“抗體片段”包含抗原結(jié)合位點或表位結(jié)合位點。術(shù)語抗體的“可變區(qū)”指單獨或組合的抗體輕鏈的可變區(qū)，或抗體重鏈的可變區(qū)。重鏈和輕鏈的可變區(qū)各自由通過三個互補決定區(qū)(CDR)(也稱為“高變區(qū)”)連接的四個框架區(qū)(FR)組成。每條鏈中的CDR通過框架區(qū)一起保持緊密相鄰，并且通常與來自另一條鏈的CDR一起有助于抗體的抗原結(jié)合位點的形成。存在至少兩種用于確定CDR的技術(shù)：(1)基于跨物種序列變異性的方法(即Kabatetal.,1991,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEdition,NationalInstitutesofHealth,BethesdaMD.)，和(2)基于抗原-抗體復(fù)合物的晶體學(xué)研究的方法(Al-Lazikanietal.,1997,J.Mol.Biol.,273:927-948)。此外，本領(lǐng)域中有時使用這兩種方法的組合來確定CDR。本文所用的術(shù)語“單克隆抗體”是指參與單一抗原決定簇或表位的高度特異性識別和結(jié)合的同源抗體群體。這與多克隆抗體相反，多克隆抗體通常包括針對不同抗原決定簇的不同抗體的混合物。術(shù)語“單克隆抗體”包括完整和全長單克隆抗體以及抗體片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、單鏈(scFv)抗體、包含抗體部分的融合蛋白，和包含抗原識別位點(抗原結(jié)合位點)的任何其它經(jīng)修飾免疫球蛋白分子。此外，“單克隆抗體”是指通過任何數(shù)目的技術(shù)制備的此類抗體，所述技術(shù)包括但不限于雜交瘤生產(chǎn)、噬菌體選擇、重組表達和轉(zhuǎn)基因動物。本文使用的術(shù)語“人源化抗體”是指非人(例如鼠類)抗體的形式，其是包含最小非人序列的特異性免疫球蛋白鏈、嵌合免疫球蛋白或其片段。通常，人源化抗體是人免疫球蛋白，其中CDR的殘基被來自具有所需特異性、親和力和/或結(jié)合能力的非人物種(例如小鼠、大鼠、兔或倉鼠)的CDR的殘基替換。在一些情況下，人免疫球蛋白的框架區(qū)殘基被來自非人物種的抗體中的相應(yīng)殘基替換。人源化抗體可以通過在Fv框架區(qū)和/或在替換的非人殘基內(nèi)取代額外的殘基來進一步修飾，以改進和優(yōu)化抗體特異性、親和力和/或結(jié)合能力。通常，人源化抗體將包含含有對應(yīng)于非人免疫球蛋白的所有或基本上所有CDR的可變結(jié)構(gòu)域，而所有或基本上所有的框架區(qū)是人免疫球蛋白序列的那些框架區(qū)。人源化抗體還可以包含免疫球蛋白恒定區(qū)或結(jié)構(gòu)域(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)或結(jié)構(gòu)域。如本文所用的術(shù)語“人抗體”是指由人產(chǎn)生的抗體或由使用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)制備的具有對應(yīng)于由人產(chǎn)生的抗體的氨基酸序列的抗體。如本文所用的術(shù)語“嵌合抗體”是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列衍生自兩種或更多種物種的抗體。通常，輕鏈和重鏈的可變區(qū)對應(yīng)于衍生自具有所需特異性、親和力和/或結(jié)合能力的一種哺乳動物(例如小鼠、大鼠、兔等)的抗體的可變區(qū)，而恒定區(qū)與衍生自另一物種(通常為人)的抗體中的序列同源。本文使用的短語“親和力成熟抗體”是指與不具有以下那些改變的親本抗體相比，在其一個或多個CDR中具有一個或多個改變的抗體，其導(dǎo)致抗體對抗原的親和力的改善。優(yōu)選的親和力成熟的抗體對靶抗原具有納摩爾或甚至皮摩爾的親和力。親和力成熟抗體通過本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生，包括但不限于重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域重排、CDR和/或框架殘基的隨機誘變和CDR和/或框架殘基的定點誘變。術(shù)語“表位”和“抗原決定簇”在本文中可互換使用，是指能夠被特定抗體識別和特異性結(jié)合的抗原部分。當(dāng)抗原是多肽時，表位可以由相鄰氨基酸和通過蛋白質(zhì)的三級折疊并置的非相鄰氨基酸形成。由相鄰氨基酸(也稱為線性表位)形成的表位通常在蛋白質(zhì)變性時保留，而由三級折疊形成的表位(也稱為構(gòu)象表位)通常在蛋白質(zhì)變性時丟失。表位通常在獨特的空間構(gòu)象中包括至少3個，更通常地至少5或8-10個氨基酸。術(shù)語“選擇性結(jié)合”或“特異性結(jié)合”是指與另外的物質(zhì)(包括不相關(guān)或相關(guān)的蛋白質(zhì))相比，結(jié)合劑或抗體與表位、蛋白質(zhì)或靶分子更頻繁、更迅速、以更大的持續(xù)時間、更大的親和力或上述的某種組合反應(yīng)或締合。在某些實施方式中，“特異性結(jié)合”是指例如抗體以約0.1mM或更小、但更通常小于約1μM的KD結(jié)合蛋白質(zhì)。在某些實施方式中，“特異性結(jié)合”是指抗體有時以至少約0.1μM或更低，在其它時候至少約0.01μM或更低，以及在其它時候至少約1nM或更低的KD結(jié)合靶標(biāo)。由于不同物種中同源蛋白質(zhì)之間的序列同一性，特異性結(jié)合可以包括識別超過一種物種中的蛋白質(zhì)的抗體(例如，人RSPO1和小鼠RSPO1)。同樣，由于不同但相關(guān)蛋白質(zhì)的多肽序列的某些區(qū)域內(nèi)的同源性，特異性結(jié)合可以包括識別多于一種蛋白質(zhì)(例如，人RSPO1和人類RSPO2)的抗體(或其他多肽或結(jié)合劑)。應(yīng)當(dāng)理解，在某些實施方式中，特異性結(jié)合第一靶標(biāo)的抗體或結(jié)合部分可以或不可以特異性結(jié)合第二靶標(biāo)。因此，“特異性結(jié)合”不一定需要(盡管可以包括)排他性結(jié)合，即結(jié)合單個標(biāo)靶。因此，在某些實施方式中，抗體可特異性結(jié)合多于一個標(biāo)靶。在某些實施方式中，多個靶標(biāo)可以通過抗體上的相同抗原結(jié)合位點結(jié)合。例如，在某些情況下，抗體可以包含兩個相同的抗原結(jié)合位點，每個位點特異性結(jié)合兩個或多個蛋白質(zhì)(例如RSPO1和RSPO2)上的相同表位。在某些替代實施方式中，抗體可以是雙特異性或多特異性的，并且包含至少兩個具有不同特異性的抗原結(jié)合位點。作為非限制性實例，雙特異性抗體可以包含識別一個蛋白(例如，人RSPO1)上的表位的一個抗原結(jié)合位點，并且還包含識別第二蛋白上的不同表位的第二不同的抗原結(jié)合位點。通常但非必然的是，提及結(jié)合時是指特異性結(jié)合。術(shù)語“多肽”和“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，是指任何長度的氨基酸的聚合物。聚合物可以是直鏈或支鏈的，其可以包含修飾的氨基酸，并且其可以被非氨基酸中斷。該術(shù)語還包括已經(jīng)天然地或通過干預(yù)修飾的氨基酸聚合物；例如二硫鍵形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修飾，例如與標(biāo)記組分的綴合。還包括在定義內(nèi)的是例如含有一個或多個氨基酸類似物(包括例如非天然氨基酸)的多肽，以及本領(lǐng)域已知的其它修飾。應(yīng)當(dāng)理解，因為本發(fā)明的多肽可以基于抗體，在某些實施方式中，多肽可以作為單鏈或相關(guān)鏈存在。術(shù)語“多核苷酸”和“核酸”在本文中可互換使用，并且是指任何長度的核苷酸的聚合物，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經(jīng)修飾的核苷酸或堿基，和/或其類似物，或可以通過DNA或RNA聚合酶摻入聚合物的任何底物?！案邍栏裥詶l件”可以通過以下雜交條件鑒定：(1)于50℃使用低離子強度和高溫洗滌，例如15mM氯化鈉/1.5mM檸檬酸鈉/0.1％十二烷基硫酸鈉；(2)于42℃使用變性劑如甲酰胺，例如50％(v/v)甲酰胺具有0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/pH6.5的具有750mM氯化鈉、75mM檸檬酸鈉的50mM磷酸鈉緩沖液；或者(3)于42℃使用50％甲酰胺、5xSSC(0.75MNaCl、75mM檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH6.8)、0.1％焦磷酸鈉、5xDenhardt溶液、超聲處理的鮭魚精子DNA(50μg/ml)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，于42℃在0.2×SSC中和于55℃在50％甲酰胺中洗滌，隨后于55℃用含有EDTA的0.1×SSC組成的高嚴格性洗滌。在兩個或更多個核酸或多肽的上下文中，術(shù)語“相同”或百分比“同一性”是指當(dāng)為了最大對應(yīng)性而比較和比對(引入空位，如果必要)時，兩個或更多個相同或具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸殘基的序列或子序列，而不考慮任何保守氨基酸取代作為序列同一性的一部分。百分比同一性可以使用序列比較軟件或算法或通過目視檢查來測量?？捎糜讷@得氨基酸或核苷酸序列比對的各種算法和軟件是本領(lǐng)域熟知的。這些包括但不限于BLAST、ALIGN、Megalign、BestFit、GCGWisconsinPackage及其變體。在一些實施方式中，本發(fā)明的兩種核酸或多肽基本上相同，意味著它們具有如使用序列比較算法或通過目視檢查測量的至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％，并且在一些實施方式中，至少95％、96％、97％、98％、99％的核苷酸或氨基酸殘基同一性。在一些實施方式中，同一性在長度為至少約10個、至少約20個、至少約40-60個殘基、至少約60-80個殘基或之間的任何整數(shù)值個的序列區(qū)域上存在。在一些實施方式中，同一性存在于比60-80個殘基更長，例如至少約80-100個殘基的區(qū)域上，并且在一些實施方式中，所述序列在被比較序列的全長(例如核苷酸序列的編碼區(qū))上基本上相同?！氨Ｊ匕被崛〈笔瞧渲幸粋€氨基酸殘基被具有相似側(cè)鏈的另一個氨基酸殘基替換的取代。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族在本領(lǐng)域中已經(jīng)定義，包括堿性側(cè)鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)，酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)，不帶電的極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，β-分支側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳族側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。例如，苯丙氨酸取代酪氨酸被認為是保守取代。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽和抗體的序列中的保守取代不消除含有氨基酸序列的多肽或抗體與抗原(即所述多肽或抗體結(jié)合的一種或多種RSPO蛋白)的結(jié)合。鑒定不消除抗原結(jié)合的核苷酸和氨基酸保守取代的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。本文所用的術(shù)語“載體”是指能夠在宿主細胞中遞送并通常表達一種或多種目標(biāo)基因或序列的構(gòu)建體。載體的實例包括但不限于病毒載體、裸DNA或RNA表達載體、質(zhì)粒、粘?；蚴删w載體、與陽離子縮合劑相關(guān)的DNA或RNA表達載體，以及包封在脂質(zhì)體中的DNA或RNA表達載體。“分離的”多肽、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組合物是為在自然界中未發(fā)現(xiàn)形式的多肽、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組合物。分離的多肽、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組合物包括已經(jīng)純化至它們不再處于它們在自然界中發(fā)現(xiàn)形式的程度的那些多肽、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組合物。在一些實施方式中，多肽、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組合物是基本上純的。本文所用的術(shù)語“基本上純的”是指至少50％純(即，不含污染物)、至少90％純、至少95％純、至少98％純或至少99％純。本文使用的術(shù)語“癌癥”和“癌性”是指或描述哺乳動物中的生理狀況，其中細胞群的特征在于不受調(diào)節(jié)的細胞生長。癌癥的實例包括但不限于癌、胚細胞瘤、肉瘤和血液癌如淋巴瘤和白血病。本文所用的術(shù)語“腫瘤”和“贅生物”是指由過度細胞生長或增殖(包括癌前病變的良性(非癌性)或惡性(癌性)引起的任何組織塊。本文使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)移”是指癌癥從起始部位擴散或轉(zhuǎn)移到身體的其他區(qū)域，同時在新位置發(fā)展類似的癌性病變的過程?！稗D(zhuǎn)移性”或“正在轉(zhuǎn)移”細胞是失去與相鄰細胞的粘附性接觸并通過血流或淋巴從疾病的原發(fā)部位遷移以侵入鄰近身體結(jié)構(gòu)的細胞。術(shù)語“癌癥干細胞”和“CSC”和“腫瘤干細胞”和“腫瘤起始細胞”在本文中可互換使用，并且是指來自癌癥或腫瘤的細胞：(1)具有廣泛的增殖能力；2)能夠不對稱的細胞分裂以產(chǎn)生一種或多種類型的分化的細胞后代，其中分化的細胞具有降低的增殖或發(fā)育潛能；和(3)能夠進行對稱的細胞分裂以用于自我更新或自我維持。與未形成腫瘤的大多數(shù)腫瘤細胞相比，這些性質(zhì)賦予癌癥干細胞在連續(xù)移植到免疫受損的宿主(例如小鼠)中時形成或建立腫瘤或癌癥的能力。癌癥干細胞以混亂的方式經(jīng)歷自我更新與分化以形成具有異常細胞類型的腫瘤，其可隨著突變發(fā)生隨時間而改變。術(shù)語“癌細胞”和“腫瘤細胞”是指源自癌癥或腫瘤或癌前病變的細胞的總?cè)后w，包括包含癌細胞群體中大部分的非致瘤性細胞和致瘤性干細胞(癌干細胞)。如本文所用，當(dāng)單獨提及缺乏更新和分化以區(qū)分這些腫瘤細胞與癌癥干細胞的能力的那些細胞時，術(shù)語“癌細胞”或“腫瘤細胞”將通過術(shù)語“非致瘤性”修飾。本文使用的術(shù)語“致瘤性”是指癌癥干細胞的功能特征，包括自我更新(產(chǎn)生另外的致瘤性癌癥干細胞)和增殖以產(chǎn)生所有其他腫瘤細胞(產(chǎn)生分化的并因此非致瘤性的腫瘤細胞)的特性。本文所用的術(shù)語“致瘤能力”是指來自腫瘤的隨機樣品的細胞在連續(xù)移植到免疫受損的宿主(例如小鼠)中時形成可觸知的腫瘤的能力。術(shù)語“受試對象”是指將成為特定治療的接受者的任何動物(例如哺乳動物)，包括但不限于人、非人靈長類動物、犬科動物、貓科動物、嚙齒動物等。通常，術(shù)語“受試對象”和“患者”在本文中可互換使用，指人受試對象。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”是指由聯(lián)邦或州政府的管理機構(gòu)批準(zhǔn)或可批準(zhǔn)的或在美國藥典或其它公認的藥典中列出的用于動物(包括人)的。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的賦形劑、載劑或佐劑”或“可接受的藥物載劑”是指可以與本公開的至少一種結(jié)合劑(例如，抗體)一起施用給受試者的賦形劑、載劑或佐劑，并且它們不破壞其藥理活性，并且當(dāng)以足以遞送治療效果的劑量施用時是無毒的。通常，本領(lǐng)域技術(shù)人員和FDA認為藥學(xué)上可接受的賦形劑、載劑或佐劑是任何制劑的非活性成分。術(shù)語“有效量”或“治療有效量”或“治療效果”是指有效“治療”受試者或哺乳動物中的疾病或病癥的結(jié)合劑、抗體、多肽、多核苷酸、小有機分子或其它藥物的量。在癌癥的情況下，治療有效量的藥物(例如，抗體)具有治療效果，因此可以減少癌細胞的數(shù)量；降低致瘤性、致瘤頻率或致瘤能力；減少癌干細胞的數(shù)量或頻率；減小腫瘤尺寸；減少癌細胞群；抑制或阻止癌細胞浸潤到外周器官中，包括例如癌擴散到軟組織和骨中；抑制和阻止腫瘤或癌細胞轉(zhuǎn)移；抑制和阻止腫瘤或癌細胞生長；在一定程度上減輕與癌癥相關(guān)的一種或多種癥狀；降低發(fā)病率和死亡率；提高生活品質(zhì)；或這些效果的組合。到了試劑例如抗體阻止生長和/或殺死現(xiàn)有癌細胞的程度上時，其可以稱為細胞抑制和/或細胞毒性。術(shù)語“進行治療”或“治療”或“以治療”或“進行緩解”或“以緩解”是指1)治愈、減緩、減輕診斷的病理狀況或病癥的癥狀和/或停止其進展的治療措施，以及2)預(yù)防或減緩靶向病理狀況或病癥的發(fā)展的預(yù)防性或預(yù)防性措施。因此，需要治療的包括已經(jīng)患有病癥的；傾向于有障礙的；和其中要預(yù)防該病癥的。在一些實施方式中，如果患者顯示以下一種或多種，則根據(jù)本發(fā)明的方法成功地“治療”受試對象：癌細胞數(shù)量上的減少或完全不存在；腫瘤尺寸的減?。灰种苹虿淮嬖诎┘毎櫟酵庵芷鞴僦?，包括癌細胞擴散到軟組織和骨中；抑制或不存在腫瘤或癌細胞轉(zhuǎn)移；抑制或不存在癌生長；減輕與特定癌癥相關(guān)的一種或多種癥狀；降低發(fā)病率和死亡率；提高生活品質(zhì)；減少致瘤性；減少癌癥干細胞的數(shù)量或頻率；或一些效果的組合。如在本公開和權(quán)利要求中所使用的，除非上下文另有明確規(guī)定，單數(shù)形式“一”、“一個”和“該”包括復(fù)數(shù)形式。應(yīng)當(dāng)理解，在本文中使用語言“包括”描述實施方式的任何地方，還提供了以“由...組成”和/或“基本上由...組成”描述的類似實施方式。還應(yīng)當(dāng)理解，在本文中使用語言“基本上由......組成”來描述實施方式的任何地方，也提供以“由...組成”描述的類似實施方式。在短語例如“A和/或B”中使用的術(shù)語“和/或”旨在包括A和B；A或B；A(單獨)；和B(單獨)。同樣，在短語例如“A、B和/或C”中使用的術(shù)語“和/或”旨在包括以下實施方式中的每一個：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(單獨)；B(單獨)；和C(單獨)。II.RSPO1結(jié)合劑本發(fā)明提供了結(jié)合人RSPO1蛋白的試劑。這些試劑在本文中被稱為“RSPO1結(jié)合劑”。在一些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑是抗體。在一些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑是多肽。在某些實施方式中，RSPO1-試劑特異性結(jié)合至少一種其他人RSPO。在一些實施方式中，由RSPO1結(jié)合劑結(jié)合的至少一種其它人RSPO選自由RSPO2、RSPO3和RSPO4組成的組。人RSPO1的全長氨基酸(aa)序列是本領(lǐng)域已知的，并且在本文中提供為SEQIDNO：1。在某些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑是特異性結(jié)合在人RSPO1(SEQIDNO：1)的氨基酸21-263內(nèi)的抗體。在某些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑是特異性結(jié)合在人RSPO1(SEQIDNO：1)的氨基酸31-263內(nèi)的抗體。在某些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑是特異性結(jié)合在人RSPO1(SEQIDNO：1)的氨基酸34-135內(nèi)的抗體。在某些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑是特異性結(jié)合在人RSPO1(SEQIDNO：1)的氨基酸34-85內(nèi)的抗體。在某些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑是特異性結(jié)合在人RSPO1(SEQIDNO：1)的氨基酸91-135內(nèi)的抗體。在某些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑結(jié)合在SEQIDNO：1內(nèi)。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑結(jié)合在SEQIDNO：5內(nèi)。在某些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑結(jié)合RSPO1的Furin樣富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑結(jié)合RSPO1的Furin樣富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域內(nèi)的至少一個氨基酸。在某些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑結(jié)合在序列SEQIDNO：2或SEQIDNO：3內(nèi)。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑結(jié)合RSPO1的血小板反應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑結(jié)合RSPO1的血小板反應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域內(nèi)的至少一個氨基酸。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑結(jié)合在SEQIDNO：4內(nèi)。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑(例如，抗體)特異性結(jié)合人RSPO1和小鼠RSPO1。在某些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑(例如，抗體)以約1μM或更小、約100nM或更小、約40nM或更小、約20nM或更小、約10nM或更小、或約10nM或更小、或約1nM或更小，或約0.1nM或更小的解離常數(shù)(KD)結(jié)合RSPO1。在一些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑以約1nM或更小的KD結(jié)合RSPO1。在一些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑以約0.1nM或更小的KD結(jié)合RSPO1。在某些實施方式中，本文所述的RSPO1結(jié)合劑結(jié)合至少一種其它RSPO。在某些實施方式中，本文所述的結(jié)合至少一種其它RSPO的RSPO1結(jié)合劑以約100nM或更小、約20nM或更小、約10nM或更小、約1nM或更小或約0.1nM或更小的KD結(jié)合至少一種其它RSPO。例如，在一些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑還以約10nM或更小的KD結(jié)合RSPO2、RSPO3和/或RSPO4。在一些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑以約0.1nM或更小的KD結(jié)合人RSPO1。在一些實施方式中，RSPO結(jié)合劑以約10nM或更小的KD結(jié)合人RSPO和小鼠RSPO。在一些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑以約1nM或更小的KD結(jié)合人RSPO1和小鼠RSPO1。在一些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑以約0.1nM或更小的KD結(jié)合人RSPO1和小鼠RSPO1。在一些實施方式中，所述結(jié)合劑(例如，抗體)對RSPO1蛋白的解離常數(shù)是使用包含固定在Biacore芯片上的RSPO1蛋白的至少一部分的RSPO1融合蛋白確定的解離常數(shù)。在某些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑(例如，抗體)以約1μM或更低、約100nM或更小、約40nM或更小、約20nM或更小、約10nM或更小、約1nM或更小，或者約0.1nM或更小的半數(shù)最大有效濃度(EC50)與人RSPO1結(jié)合。在某些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑還以約40nM或更小、約20nM或更小、約10nM或更小、約1nM或更小，或者約0.1nM或更小的EC50與人RSPO2、RSPO3和/或RSPO4結(jié)合。在某些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑是抗體。在一些實施方式中，所述抗體是重組抗體。在一些實施方式中，所述抗體是單克隆抗體。在一些實施方式中，所述抗體是嵌合抗體。在一些實施方式中，所述抗體是人源化抗體。在一些實施方式中，所述抗體是人抗體。在某些實施方式中，所述抗體是IgG1抗體。在某些實施方式中，所述抗體是IgG2抗體。在某些實施方式中，所述抗體是包含抗原結(jié)合位點的抗體片段。在一些實施方式中，所述抗體是單價、單特異性、二價、雙特異性或多特異性的。在一些實施方式中，所述抗體與細胞毒性部分綴合。在一些實施方式中，所述抗體是分離的。在一些實施方式中，所述抗體基本上是純的。本發(fā)明的RSPO1結(jié)合劑(例如抗體)可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法測定特異性結(jié)合?？梢允褂玫拿庖邷y定包括但不限于使用諸如Biacore分析、FACS分析、免疫熒光、免疫細胞化學(xué)、Western印跡分析、放射免疫測定、ELISA、“夾心”免疫測定、免疫沉淀測定、沉淀反應(yīng)、凝膠擴散沉淀素反應(yīng)、免疫擴散測定、凝集測定、補體固定測定、免疫放射測定、熒光免疫測定和蛋白A免疫測定等技術(shù)的競爭性和非競爭性測定系統(tǒng)。這樣的測定是常規(guī)的并且是本領(lǐng)域公知的(參見例如Ausubel等人，編輯，1994-至今，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork,NY)。例如，可以使用ELISA確定抗體與人RSPO1的特異性結(jié)合。ELISA測定包括制備抗原，用抗原包被96孔微量滴定板的孔，向孔中加入與可檢測化合物如酶底物(例如辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶)綴合的抗RSPO1抗體，溫育一段時間并檢測與抗原結(jié)合的抗體的存在。在一些實施方式中，抗RSPO1抗體不與可檢測化合物綴合，而是將識別抗RSPO1抗體的第二綴合抗體添加至孔中。在一些實施方式中，代替用抗原包被孔的是，可以將抗RSPO1抗體包被到孔中，并且可以在將抗原加入到經(jīng)包被孔中之后加入與可檢測化合物綴合的第二抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道可以被改變的參數(shù)以增加檢測的信號以及本領(lǐng)域已知的ELISA的其他變化。在另一個實例中，可以使用FACS確定抗體與人RSPO1的特異性結(jié)合。FACS篩選測定可以包括產(chǎn)生表達抗原作為融合蛋白(例如，RSPO1-Fc或RSPO1-CD4TM)的cDNA構(gòu)建體，將構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到細胞中，在細胞表面上表達抗原，將抗RSPO1抗體與轉(zhuǎn)染的細胞混合，并溫育一段時間?？梢酝ㄟ^使用與可檢測化合物(例如，PE-綴合的抗Fc抗體)綴合的第二抗體和流式細胞儀來鑒定由抗RSPO1抗體結(jié)合的細胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解可以被改變的參數(shù)以優(yōu)化檢測的信號以及可以增強篩選(例如，篩選阻斷抗體)的FACS的其它變體。結(jié)合劑(例如，抗RSPO1抗體)與抗原(例如RSPO1蛋白)的結(jié)合親和力和結(jié)合劑-抗原相互作用的解離速率可以通過競爭性結(jié)合測定來確定。競爭性結(jié)合測定的一個實例是放射免疫測定，其包括在增加量的未標(biāo)記抗原存在下，用所關(guān)注的結(jié)合劑溫育經(jīng)標(biāo)記抗原(例如，用3H或125I標(biāo)記的RSPO1)或其片段或變體，隨后檢測與經(jīng)標(biāo)記抗原結(jié)合的試劑?？梢詮腟catchard圖分析的數(shù)據(jù)確定試劑對抗原(例如RSPO1蛋白)的親和力和結(jié)合解離速率。在一些實施方式中，使用Biacore動力學(xué)分析來確定結(jié)合抗原(例如RSPO1蛋白)的抗體的結(jié)合開啟和關(guān)閉速率。Biacore動力學(xué)分析包括分析來自芯片的抗體與經(jīng)固定抗原(例如，RSPO1蛋白)在其表面上的結(jié)合和解離。在某些實施方式中，本發(fā)明提供了特異性結(jié)合人RSPO1的RSPO1結(jié)合劑，其中所述RSPO1結(jié)合劑包含抗體89M5的一個、兩個、三個、四個、五個和/或六個CDR(參見表1)。在一些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑包含89M5的一個或更多個CDR，89M5的兩個或更多個CDR，89M5的三個或更多個CDR，89M5的四個或更多個CDR，89M5的五個或更多個CDR或89M5的所有6個CDR。表189M5HCCDR1TGYTMH(SEQIDNO:6)HCCDR2GINPNNGGTTYNQNFKG(SEQIDNO:7)HCCDR3KEFSDGYYFFAY(SEQIDNO:8)LCCDR1KASQDVIFAVA(SEQIDNO:9)LCCDR2WASTRHT(SEQIDNO:10)LCCDR3QQHYSTPW(SEQIDNO:11)在某些實施方式中，本發(fā)明提供了特異性結(jié)合人RSPO1的RSPO1結(jié)合劑(例如，抗體)，其中所述RSPO1結(jié)合劑包含含有TGYTMH(SEQIDNO：6)的重鏈CDR1，含有GINPNNGGTTYNQNFKG(SEQIDNO：7)的重鏈CDR2，和含有KEFSDGYYFFAY(SEQIDNO：8)的重鏈CDR3。在一些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑還包含含有KASQDVIFAVA(SEQIDNO：9)的輕鏈CDR1，含有WASTRHT(SEQIDNO：10)的輕鏈CDR2和含有QQHYSTPW(SEQIDNO：11)的輕鏈CDR3。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑包含含有KASQDVIFAVA(SEQIDNO：9)的輕鏈CDR1，含有WASTRHT(SEQIDNO：10)的輕鏈CDR2和含有QQHYSTPW(SEQIDNO：11)的輕鏈CDR3。在某些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑包含：(a)含有TGYTMH(SEQIDNO：6)的重鏈CDR1，含有GINPNNGGTTYNQNFKG(SEQIDNO：7)的重鏈CDR2和含有KEFSDGYYFFAY(SEQIDNO：8)的重鏈CDR3，和(b)含有KASQDVIFAVA(SEQIDNO：9)的輕鏈CDR1，含有WASTRHT(SEQIDNO：10)的輕鏈CDR2和含有QQHYSTPW(SEQIDNO：11)的輕鏈CDR3。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑是89M5抗體的修飾版本或變體。產(chǎn)生親本89M5抗體的雜交瘤細胞系在布達佩斯條約的條件下于2011年6月30日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，10801UniversityBoulevard，Manassas，VA，USA，并指定ATCC保藏號為PTA-11970。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑是從生產(chǎn)和/或純化角度具有期望的和/或改善的性質(zhì)的抗體變體。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑是具有所需性質(zhì)例如改善的溶解性或改善的穩(wěn)定性的抗體變體。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑是從治療學(xué)角度具有期望的和/或改善的性質(zhì)的抗體變體。在一些實施方式中，已被修飾或改變的RSPO1結(jié)合劑是89M5的人源化版本。在一些實施方式中，已經(jīng)修飾或改變的RSPO1結(jié)合劑是稱為h89M5-H8L5的人源化形式的89M5。編碼抗體h89M5-H8L5的重鏈和輕鏈的質(zhì)粒在布達佩斯條約的條件下于2014年8月15日保藏于ATCC，10801UniversityBoulevard，Manassas，VA，USA，并指定ATCC保藏號為PTA-121494和PTA-121495。在某些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑是89M5抗體的人源化形式。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑是已被修飾或改變以具有改善的溶解性的89M5抗體的人源化形式。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑是89M5抗體的人源化版本，其在重鏈可變區(qū)的框架區(qū)內(nèi)已被修飾或改變以具有改善的溶解性。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑是89M5抗體的人源化版本，其在輕鏈可變區(qū)的框架區(qū)內(nèi)經(jīng)過修飾或改變以具有改善的溶解性。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑是已經(jīng)在重鏈內(nèi)被修飾或改變以具有改善的溶解性的89M5抗體的人源化形式。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑是已經(jīng)在輕鏈內(nèi)被修飾或改變以具有改善的溶解性的89M5抗體的人源化形式。在一些實施方式中，已被修飾或改變以具有改善的溶解性的RSPO1結(jié)合劑是抗體h89M5-H8L5。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑是89M5抗體的人源化形式，其已經(jīng)被修飾或改變?yōu)榫哂型ㄟ^尺寸排阻色譜(SEC)評估的改善的抗體特性(profile)。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑是89M5抗體的人源化形式，其在重鏈可變區(qū)的框架區(qū)內(nèi)已經(jīng)被修飾或改變，以具有通過SEC評估的改善的抗體特性。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑是89M5抗體的人源化版本，其在輕鏈可變區(qū)的框架區(qū)內(nèi)經(jīng)過修飾或改變以具有通過SEC評估的改善的抗體特性。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑是89M5抗體的人源化形式，其在重鏈內(nèi)已被修飾或改變以具有通過SEC評估的改善的抗體特性。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑是89M5抗體的人源化形式，其在輕鏈內(nèi)已被修飾或改變以具有如通過SEC評估的改善的抗體性質(zhì)。在一些實施方式中，如通過SEC評估的，被修飾或改變以具有改善的抗體特性的RSPO1結(jié)合劑是抗體h89M5-H8L5。在某些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑包含抗體h89M5-H8L5的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。在某些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑包含抗體h89M5-H8L5(具有或不具有前導(dǎo)序列)的重鏈和輕鏈。在某些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑是抗體h89M5-H8L5。在某些實施方式中，本發(fā)明提供了特異性結(jié)合RSPO1的RSPO1結(jié)合劑(例如，抗體)，其中所述RSPO1結(jié)合劑包含與SEQIDNO：32具有至少約90％序列同一性的重鏈可變區(qū)，和/或與SEQIDNO：33具有至少90％序列同一性的輕鏈可變區(qū)。在某些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑包含與SEQIDNO：32具有至少約91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的重鏈可變區(qū)。在某些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑包含與SEQIDNO：33具有至少約91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的輕鏈可變區(qū)。在某些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑包含與SEQIDNO：32具有至少約95％序列同一性的重鏈可變區(qū)和/或與SEQIDNO：33具有至少約95％序列同一性的輕鏈可變區(qū)。在某些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑包含含有SEQIDNO：32的重鏈可變區(qū)和/或含有SEQIDNO：33的輕鏈可變區(qū)。在某些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑包含基本上由SEQIDNO：32組成的重鏈可變區(qū)和基本上由SEQIDNO：33組成的輕鏈可變區(qū)。在某些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑包含SEQIDNO：32的重鏈可變區(qū)和SEQIDNO：33的輕鏈可變區(qū)。在一些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑是包含與SEQIDNO：32具有至少90％序列同一性的重鏈可變區(qū)和與SEQIDNO：33具有至少90％序列同一性的輕鏈可變區(qū)的抗體，其中所述抗體包含含有TGYTMH(SEQIDNO：6)的重鏈CDR1，含有GINPNNGGTTYNQNFKG(SEQIDNO：7)的重鏈CDR2和含有KEFSDGYYFFAY(SEQIDNO：8)的重鏈CDR3，含有KASQDVIFAVA(SEQIDNO：9)的輕鏈CDR1，含有WASTRHT(SEQIDNO：10)的輕鏈CDR2和含有QQHYSTPW(SEQIDNO：11)的輕鏈CDR3。在某些實施方式中，本發(fā)明提供了特異性結(jié)合RSPO1的RSPO1結(jié)合劑(例如，抗體)，其中所述RSPO1結(jié)合劑包含與SEQIDNO：35具有至少90％序列同一性的重鏈和/或與SEQIDNO：37具有至少90％的序列同一性的輕鏈。在某些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑包含與SEQIDNO：35具有至少約91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的重鏈。在某些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑包含與SEQIDNO：37具有至少約約91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的輕鏈。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑包含與SEQIDNO：35具有至少95％序列同一性的重鏈和/或與SEQIDNO：37具有至少95％序列同一性的輕鏈。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑包含含有SEQIDNO：35的重鏈和/或含有SEQIDNO：37的輕鏈。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑包含基本上由SEQIDNO：35組成的重鏈和基本上由SEQIDNO：37組成的輕鏈。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑包含SEQIDNO：35的重鏈和SEQIDNO：37的輕鏈。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑是包含與SEQIDNO：35具有至少90％序列同一性的重鏈和與SEQIDNO：37具有至少90％序列同一性的輕鏈的抗體，其中所述抗體包含含有TGYTMH(SEQIDNO：6)的重鏈CDR1，含有GINPNNGGTTYNQNFKG(SEQIDNO：7)的重鏈CDR2和含有KEFSDGYYFFAY(SEQIDNO：8)的重鏈CDR3，含有KASQDVIFAVA(SEQIDNO：9)的輕鏈CDR1，含有WASTRHT(SEQIDNO：10)的輕鏈CDR2和含有QQHYSTPW(SEQIDNO：11)的輕鏈CDR3。本發(fā)明提供多肽，包括但不限于特異性結(jié)合人RSPO蛋白的抗體。在一些實施方式中，所述多肽結(jié)合人RSPO1。在某些實施方式中，所述多肽包含抗體89M5的一個、兩個、三個、四個、五個和/或六個CDR(參見本文表1)。在一些實施方式中，所述多肽包含每個CDR具有至多四個(即0、1、2、3或4個)氨基酸取代的CDR。在某些實施方式中，重鏈CDR包含在重鏈可變區(qū)內(nèi)。在某些實施方式中，輕鏈CDR包含在輕鏈可變區(qū)內(nèi)。在一些實施方式中，本發(fā)明提供了特異性結(jié)合人RSPO1的多肽，其中所述多肽包含與SEQIDNO：32具有至少約90％序列同一性的氨基酸序列，和/或與SEQIDNO：33具有至少約90％序列同一性的氨基酸序列。在某些實施方式中，所述多肽包含與SEQIDNO：32具有至少約95％、至少約97％或至少約99％的序列同一性的氨基酸序列。在某些實施方式中，所述多肽包含與SEQIDNO：33具有至少約95％、至少約97％或至少約99％的序列同一性的氨基酸序列。在某些實施方式中，所述多肽包含與SEQIDNO：32具有至少約95％序列同一性的氨基酸序列，和/或與SEQIDNO：33具有至少約95％序列同一性的氨基酸序列。在某些實施方式中，所述多肽包含含有SEQIDNO：32的氨基酸序列和/或含有SEQIDNO：33的氨基酸序列。在某些實施方式中，所述多肽包含SEQIDNO：32的氨基酸序列和/或SEQIDNO：33的氨基酸序列。在一些實施方式中，本發(fā)明提供了特異性結(jié)合人RSPO1的多肽，其中所述多肽包含與SEQIDNO：35具有至少約90％序列同一性的氨基酸序列，和/或與SEQIDNO：37具有至少約90％序列同一性的氨基酸序列。在一些實施方式中，所述多肽包含與SEQIDNO：34具有至少約90％序列同一性的氨基酸序列，和/或與SEQIDNO：36具有至少約90％序列同一性的氨基酸序列。在某些實施方式中，所述多肽包含與SEQIDNO：34具有至少約95％、至少約97％或至少約99％的序列同一性的氨基酸序列。在某些實施方式中，所述多肽包含與SEQIDNO：35具有至少約95％、至少約97％或至少約99％的序列同一性的氨基酸序列。在某些實施方式中，所述多肽包含與SEQIDNO：36具有至少約95％、至少約97％或至少約99％的序列同一性的氨基酸序列。在某些實施方式中，所述多肽包含與SEQIDNO：37具有至少約95％、至少約97％或至少約99％的序列同一性的氨基酸序列。在某些實施方式中，所述多肽包含與SEQIDNO：35具有至少約95％序列同一性的氨基酸序列和/或與SEQIDNO：37具有至少約95％序列同一性的氨基酸序列。在某些實施方式中，所述多肽包含與SEQIDNO：34具有至少約95％序列同一性的氨基酸序列和/或與SEQIDNO：36具有至少約95％序列同一性的氨基酸序列。在某些實施方式中，所述多肽包含含有SEQIDNO：35的氨基酸序列和/或含有SEQIDNO：37的氨基酸序列。在某些實施方式中，所述多肽包含含有SEQIDNO：34的氨基酸序列和/或含有SEQIDNO：36的氨基酸序列。在某些實施方式中，所述多肽基本上由SEQIDNO：35和/或SEQIDNO：37組成。在某些實施方式中，所述多肽基本上由SEQIDNO：34和/或SEQIDNO：36組成。在某些實施方式中，所述多肽是SEQIDNO：35和/或SEQIDNO：37。在某些實施方式中，所述多肽是SEQIDNO：34和/或SEQIDNO：36。在一些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑包含含有選自由SEQIDNO：32、SEQIDNO：33、SEQIDNO：34、SEQIDNO：35、SEQIDNO：36和SEQIDNO：37組成的組中的序列的多肽。在某些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑包含抗體h89M5-H8L5，基本上由抗體h89M5-H8L5組成或由抗體h89M5-H8L5組成。許多蛋白質(zhì)(包括抗體)含有指導(dǎo)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運到各種位置的信號序列。信號序列(也稱為信號肽或前導(dǎo)序列)位于新生多肽的N末端。它們將多肽靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并且蛋白質(zhì)被分選到其目的地，例如，到細胞器的內(nèi)部空間，到內(nèi)部膜，到細胞的外膜，或通過分泌到細胞外部。在蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后，大多數(shù)信號序列通過信號肽酶從蛋白質(zhì)切割。信號序列從多肽的切割通常發(fā)生在氨基酸序列中的特定位點，并且依賴于信號序列內(nèi)的氨基酸殘基。盡管通常有一個特異性切割位點，但是信號肽酶可以識別和/或使用多于一個切割位點可以，導(dǎo)致多肽的非同源N末端。例如，在信號序列內(nèi)使用不同的切割位點可以產(chǎn)生用不同的N-末端氨基酸表達的多肽。因此，在一些實施方式中，本文所述的多肽可以包含具有不同N-末端的多肽的混合物。在一些實施方式中，N末端的長度相差1、2、3、4或5個氨基酸。在一些實施方式中，所述多肽是基本上同質(zhì)的，即多肽具有相同的N-末端。在一些實施方式中，所述多肽的信號序列包含與“天然”或“親本”信號序列相比較的一個或多個(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)氨基酸取代和/或缺失。在一些實施方式中，所述多肽的信號序列包含允許一個切割位點是顯性的氨基酸取代和/或缺失，從而產(chǎn)生具有一個N末端的基本上同質(zhì)的多肽。在一些實施方式中，所述多肽的信號序列被不同的信號序列替代。在一些實施方式中，所述多肽的信號序列影響多肽的表達水平。在一些實施方式中，所述多肽的信號序列增加多肽的表達水平。在一些實施方式中，所述多肽的信號序列降低多肽的表達水平。在某些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑(例如抗體)與包含含有SEQIDNO：32的重鏈可變區(qū)和含有SEQIDNO：33的輕鏈可變區(qū)的抗體競爭與RSPO1的特異性結(jié)合。在某些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑與包含含有SEQIDNO：35的重鏈和包含SEQIDNO：37的輕鏈的抗體競爭與RSPO1的特異性結(jié)合。在某些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑與抗體h89M5-H8L5競爭與人RSPO1的特異性結(jié)合。在一些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑或抗體在體外競爭性結(jié)合測定中競爭與RSPO1的特異性結(jié)合。在一些實施方式中，所述RSPO1是人RSPO1。在一些實施方式中，所述RSPO1是小鼠RSPO1。在某些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑(例如抗體)與本發(fā)明的抗體在RSPO1上結(jié)合相同的表位或基本上相同的表位。在另一個實施方式中，RSPO1結(jié)合劑是在RSPO1上結(jié)合與由本發(fā)明的抗體結(jié)合的RSPO1上的表位重疊的表位的抗體。在某些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑(例如，抗體)在RSPO1上結(jié)合與抗體h89M5-H8L5相同的表位或基本上相同的表位。在另一個實施方式中，RSPO1結(jié)合劑是在RSPO1上結(jié)合與由抗體h89M5-H8L5結(jié)合的RSPO1上的表位重疊的表位的抗體。在某些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑是與由具有ATCC保藏號PTA-121494和PTA-121495的質(zhì)粒編碼的抗體(例如，在競爭性結(jié)合測定中)競爭與RSPO1特異性結(jié)合的試劑。在某些實施方式中，本文所述的RSPO1結(jié)合劑(例如，抗體)結(jié)合人RSPO1并調(diào)節(jié)RSPO1活性。在一些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑是RSPO1拮抗劑并降低RSPO1活性。在一些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑是RSPO1拮抗劑并降低β-連環(huán)蛋白活性。在某些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑(例如，抗體)是至少一種人RSPO蛋白的拮抗劑。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑是RSPO1的拮抗劑并且抑制RSPO1活性。在某些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑抑制RSPO1活性至少約10％、至少約20％、至少約30％、至少約50％、至少約75％、至少約90％或約100％。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑抑制一種、兩種、三種或四種RSPO蛋白的活性。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑抑制人RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4的活性。在某些實施方式中，抑制人RSPO1活性的RSPO1結(jié)合劑是抗體h89M5-H8L5。在某些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑抑制RSPO1信號傳導(dǎo)至少約10％、至少約20％、至少約30％、至少約50％、至少約75％、至少約90％或約100％。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑抑制一種、兩種、三種或四種RSPO蛋白的信號傳導(dǎo)。在一些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑抑制人RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4的信號傳導(dǎo)。在某些實施方式中，抑制RSPO1信號傳導(dǎo)的RSPO1結(jié)合劑是抗體h89M5-H8L5。在某些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑(例如，抗體)是β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)的拮抗劑。在某些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑抑制β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)至少約10％、至少約20％、至少約30％、至少約50％、至少約75％、至少約90％或約100％。在某些實施方式中，抑制β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)的RSPO1結(jié)合劑是抗體h89M5-H8L5。在某些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑(例如抗體)抑制至少一種RSPO蛋白與受體的結(jié)合。在某些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑抑制人RSPO1與其一種或多種受體的結(jié)合。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑抑制RSPO1與至少一種LGR蛋白的結(jié)合。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑抑制RSPO1與LGR4、LGR5和/或LGR6的結(jié)合。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑抑制RSPO1與LGR4的結(jié)合。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑抑制RSPO1與LGR5的結(jié)合。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑抑制RSPO1與LGR6的結(jié)合。在某些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑與至少一種LGR蛋白的結(jié)合的抑制是至少約10％、至少約25％、至少約50％、至少約75％、至少約90％、或至少約95％。在某些實施方式中，抑制RSPO1與至少一種LGR蛋白結(jié)合的RSPO1結(jié)合劑進一步抑制β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)。在某些實施方式中，抑制人RSPO1與至少一種LGR蛋白結(jié)合的RSPO1結(jié)合劑是抗體h89M5-H8L5。在某些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑(例如抗體)阻斷至少一種RSPO與受體的結(jié)合。在某些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑阻斷人RSPO1與其一種或多種受體的結(jié)合。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑阻斷RSPO1與至少一種LGR蛋白的結(jié)合。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑阻斷RSPO1與LGR4、LGR5和/或LGR6的結(jié)合。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑阻斷RSPO1與LGR4的結(jié)合。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑阻斷RSPO1與LGR5的結(jié)合。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑阻斷RSPO1與LGR6的結(jié)合。在某些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑與至少一種LGR蛋白的結(jié)合的阻斷為至少約10％、至少約25％、至少約50％、至少約75％、至少約90％、或至少約95％。在某些實施方式中，阻斷RSPO1與至少一種LGR蛋白結(jié)合的RSPO1結(jié)合劑進一步抑制β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)。在某些實施方式中，阻斷人RSPO1與至少一種LGR蛋白結(jié)合的RSPO1結(jié)合劑是抗體h89M5-H8L5。在某些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑(例如，抗體)抑制β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)。應(yīng)當(dāng)理解，在某些實施方式中，抑制β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)的RSPO1結(jié)合劑可以抑制β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)途徑中的一種或多種受體的信號傳導(dǎo)，但不一定抑制所有受體的信號傳導(dǎo)。在某些替代性實施方式中，可以抑制所有人受體的β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)。在某些實施方式中，抑制選自由LGR4、LGR5和LGR6組成的組中的一種或多種受體的β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)。在某些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑對β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)的抑制是β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)的水平降低至少約10％、至少約25％、至少約50％、至少約75％、至少約90％或至少約95％。在一些實施方式中，抑制β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)的RSPO1結(jié)合劑是抗體h89M5-H8L5。在某些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑(例如，抗體)抑制β-連環(huán)蛋白的激活。應(yīng)當(dāng)理解，在某些實施方式中，抑制β-連環(huán)蛋白激活的RSPO1結(jié)合劑可以通過一種或多種受體抑制β-連環(huán)蛋白的激活，但不一定抑制所有受體對β-連環(huán)蛋白的激活。在某些替代實施方式中，可以抑制所有人受體對β-連環(huán)蛋白的激活。在某些實施方式中，抑制選自由LGR4、LGR5和LGR6組成的組中的一種或多種受體對β-連環(huán)蛋白的激活。在某些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑對β-連環(huán)蛋白激活的抑制是β-連環(huán)蛋白的激活水平降低至少約10％、至少約25％、至少約50％、至少約75％，至少約90％或至少約95％。在一些實施方式中，抑制β-連環(huán)蛋白的激活的RSPO1結(jié)合劑是抗體h89M5-H8L5。用于確定RSPO1結(jié)合劑(或候選RSPO1結(jié)合劑)是否抑制β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)的體內(nèi)和體外測定是本領(lǐng)域已知的。例如，基于細胞的熒光素酶報道分子測定可用于體外測定β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)水平，該測定使用含有位于螢火蟲螢光素酶報道基因上游的TCF結(jié)合結(jié)構(gòu)域多拷貝的TCF/Luc報道載體(Gazitetal.,1999,Oncogene,18；5959-66；TOPflash,Millipore,BillericaMA)。在存在或不存在RSPO蛋白或RSPO條件培養(yǎng)基的情況下，在存在一種或多種Wnt(例如，由轉(zhuǎn)染細胞表達或由Wnt條件培養(yǎng)基提供的Wnt)的情況下，將RSPO1結(jié)合劑存在時的β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)的水平與不存在RSPO結(jié)合劑的信號水平進行比較。除了TCF/Luc報告物測定之外，通過測量試劑對β-連環(huán)蛋白調(diào)節(jié)基因(例如c-myc，細胞周期蛋白D1和/或纖連蛋白)信號傳導(dǎo)的表達水平的影響，可以體外或體內(nèi)測量RSPO1結(jié)合劑(或候選試劑)對β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)的影響。在某些實施方式中，還可以通過測量試劑對Dishevelled-1、Dishevelled-2、Dishevelled-3、LRP5、LRP6和/或β-連環(huán)蛋白的磷酸化狀態(tài)的影響從而測量RSPO1結(jié)合劑對β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)的影響。在某些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑具有一種或多種以下效果：抑制腫瘤細胞的增殖、抑制腫瘤生長、降低腫瘤的致瘤性、通過降低腫瘤中癌癥干細胞的頻率來降低腫瘤的致瘤性、抑制腫瘤生長、觸發(fā)腫瘤細胞的細胞死亡、誘導(dǎo)腫瘤中的細胞分化、將致瘤細胞分化為非致瘤性狀態(tài)、誘導(dǎo)腫瘤細胞中分化標(biāo)記物的表達、防止腫瘤細胞轉(zhuǎn)移或降低腫瘤細胞存活。在某些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑能夠抑制腫瘤生長。在某些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑能夠在體內(nèi)(例如在異種移植物小鼠模型中和/或在患有癌癥的人中)抑制腫瘤生長。在某些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑能夠降低腫瘤的致瘤性。在某些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑或抗體能夠降低動物模型(例如小鼠異種移植物模型)中含有癌癥干細胞的腫瘤的致瘤性。在某些實施方式中，腫瘤中癌癥干細胞的數(shù)量或頻率與對照組相比降低至少約2倍、約3倍、約5倍、約10倍、約50倍、約100倍、或約1000倍。在某些實施方式中，通過使用動物模型的有限稀釋測定來確定癌癥干細胞的數(shù)量或頻率的減少。關(guān)于使用有限稀釋測定來確定腫瘤中癌癥干細胞的數(shù)量或頻率減少的其它實例和指導(dǎo)可以參見例如國際公開號WO2008/042236、美國專利公開號2008/0064049和美國專利公開號2008/0178305。在某些實施方式中，本文所述的RSPO1結(jié)合劑在小鼠、食蟹猴或人中具有至少約5小時、至少約10小時、至少約24小時、至少約3天、至少約1周、或至少約2周的循環(huán)半衰期。在某些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑是在小鼠、食蟹猴或人中具有至少約5小時、至少約10小時、至少約10小時、至少約24小時、至少約3天、至少約1周或至少約2周的循環(huán)半衰期的IgG(例如，IgG1或IgG2)抗體。增加(或降低)試劑例如多肽和抗體的半衰期的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，增加IgG抗體的循環(huán)半衰期的已知方法包括在Fc區(qū)中引入突變，其在pH6.0下增加抗體對新生兒Fc受體(FcRn)的pH依賴性結(jié)合。增加缺少Fc區(qū)的抗體片段的循環(huán)半衰期的已知方法包括例如PEG化的技術(shù)。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑是多克隆抗體。多克隆抗體可以通過任何已知的方法制備。在一些實施方式中，通過多次皮下或腹膜內(nèi)注射相關(guān)抗原(例如，純化的肽片段、全長重組蛋白或多肽)來免疫動物(例如兔、大鼠、小鼠、山羊、驢)融合蛋白)來產(chǎn)生多克隆抗體。所述抗原可以可選地與載劑例如鑰孔血藍蛋白(KLH)或血清白蛋白綴合。將抗原(有或沒有載體蛋白)在無菌鹽水中稀釋，并通常與佐劑(例如完全或不完全弗氏佐劑)組合以形成穩(wěn)定的乳劑。在足夠的時間后，從免疫動物的血液、腹水等中回收多克隆抗體。多克隆抗體可以根據(jù)本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法從血清或腹水中純化，包括但不限于親和色譜、離子交換色譜、凝膠電泳和透析。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑是單克隆抗體。單克隆抗體可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的雜交瘤方法制備。在一些實施方式中，使用雜交瘤方法，如上所述免疫小鼠、倉鼠或其他合適的宿主動物，以從淋巴細胞中產(chǎn)生將特異性結(jié)合免疫抗原的抗體。在一些實施方式中，可以在體外免疫淋巴細胞。在一些實施方式中，所述免疫抗原可以是人蛋白或其部分。在一些實施方式中，所述免疫抗原可以是小鼠蛋白或其部分。免疫后，分離淋巴細胞并使用例如聚乙二醇與合適的骨髓瘤細胞系融合以形成雜交瘤細胞，然后可從未融合的淋巴細胞和骨髓瘤細胞中選擇。產(chǎn)生特異性針對所選抗原的單克隆抗體的雜交瘤可以通過多種方法鑒定，包括但不限于免疫沉淀、免疫印跡和體外結(jié)合測定(例如，流式細胞術(shù)、FACS、ELISA和放射免疫測定)。所述雜交瘤可以使用標(biāo)準(zhǔn)方法在體外培養(yǎng)中繁殖，或者在動物體內(nèi)作為腹水腫瘤繁殖?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法從培養(yǎng)基或腹水中純化單克隆抗體，包括但不限于親和色譜、離子交換色譜、凝膠電泳和透析。在某些實施方式中，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的重組DNA技術(shù)制備單克隆抗體。編碼單克隆抗體的多核苷酸分離自成熟B細胞或雜交瘤細胞，例如通過使用特異性擴增編碼抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸引物的RT-PCR來分離，并且使用常規(guī)技術(shù)確定它們的序列。然后將編碼重鏈和輕鏈的分離的多核苷酸克隆到合適的表達載體中，當(dāng)轉(zhuǎn)染到不另外產(chǎn)生免疫球蛋白的宿主細胞如大腸桿菌、猿COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞中時，產(chǎn)生單克隆抗體。在其他實施方式中，重組單克隆抗體或其片段可以從表達所需物種的CDR的噬菌體展示文庫中分離。編碼單克隆抗體的多核苷酸可以進一步以多種不同的方式使用重組DNA技術(shù)進行修飾以產(chǎn)生替代抗體。在一些實施方式中，例如小鼠單克隆抗體的輕鏈和重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域可以替代例如人抗體的那些區(qū)域以產(chǎn)生嵌合抗體，或替代非免疫球蛋白多肽以產(chǎn)生融合抗體。在一些實施方式中，截短或去除恒定區(qū)以產(chǎn)生單克隆抗體的所需抗體片段?？勺儏^(qū)的定點誘變或高密度誘變可用于優(yōu)化單克隆抗體的特異性、親和力等。在一些實施方式中，針對人RSPO1的單克隆抗體是人源化抗體。通常，人源化抗體是人免疫球蛋白，其中使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法將來自CDR的殘基用具有期望的特異性、親和力和/或結(jié)合能力的來自非人物種(例如小鼠、大鼠、兔、倉鼠等)的CDR的殘基進行替換。在一些實施方式中，人免疫球蛋白的框架區(qū)殘基被來自非人物種的抗體中的相應(yīng)殘基替代。在一些實施方式中，人源化抗體可以通過在構(gòu)架區(qū)和/或已替換的非人殘基內(nèi)替代額外的殘基來進一步修飾，以改進和優(yōu)化抗體特異性、親和力和/或能力。通常，人源化抗體將包含基本上所有對應(yīng)于非人免疫球蛋白的CDR，而所有或基本上所有的框架區(qū)是人免疫球蛋白序列的那些框架區(qū)。在一些實施方式中，人源化抗體還可以包含免疫球蛋白恒定區(qū)或結(jié)構(gòu)域(例如Fc區(qū))的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)或結(jié)構(gòu)域。在某些實施方式中，這樣的人源化抗體是治療性使用的，因為當(dāng)施用于人類受試者時，它們可以降低抗原性和HAMA(人抗小鼠抗體)應(yīng)答。在某些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑是人抗體。人抗體可以使用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)直接制備。在一些實施方式中，可以產(chǎn)生在體外免疫或從免疫個體分離的產(chǎn)生針對靶抗原的抗體的永生化人B淋巴細胞。在一些實施方式中，人抗體可以選自噬菌體文庫，其中該噬菌體文庫表達人抗體。作為選擇，噬菌體展示技術(shù)可用于在體外從來自未免疫供體的免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域基因庫制備人抗體和抗體片段。用于產(chǎn)生和使用抗體噬菌體文庫的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。包括但不限于鏈改組和定點誘變的親和力成熟策略是本領(lǐng)域已知的，并且可用于產(chǎn)生高親和力人抗體。在一些實施方式中，可以在含有人免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因小鼠中制備人抗體。這些小鼠在免疫后能夠在不產(chǎn)生內(nèi)源性免疫球蛋白的情況下產(chǎn)生人抗體的全部組成成分。本發(fā)明還包括特異性識別至少一種人RSPO蛋白的雙特異性抗體。雙特異性抗體能夠特異性識別和結(jié)合至少兩種不同的表位。不同的表位可以在同一分子內(nèi)(例如，人RSPO1上的兩個表位)或在不同分子上(例如RSPO1上的一個表位和RSPO2上的一個表位)。在一些實施方式中，所述雙特異性抗體是單克隆人或單克隆人源化抗體。在一些實施方式中，抗體可以特異性識別和結(jié)合第一抗原靶標(biāo)(例如RSPO1)以及第二抗原靶標(biāo)，例如白細胞上的效應(yīng)子分子(例如CD2、CD3、CD28、CD80或CD86)或Fc受體(例如CD64、CD32或CD16)，以便將細胞防御機制聚焦于表達第一抗原靶標(biāo)的細胞。在一些實施方式中，抗體可用于將細胞毒性劑導(dǎo)向表達特定靶抗原的細胞。這些抗體具有抗原結(jié)合臂和結(jié)合細胞毒性劑或放射性核素螯合劑(例如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA)的臂。在某些實施方式中，所述雙特異性抗體特異性結(jié)合RSPO1，以及選自由RSPO2、RSPO3和RSPO4組成的組中的另外的RSPO蛋白。用于制備雙特異性抗體的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。雙特異性抗體可以是完整抗體或抗體片段。還涵蓋具有多于兩個化合價的抗體。例如，可以制備三特異性抗體。因此，在某些實施方式中，RSPO1的抗體是多特異性的。在某些實施方式中，本文所述的抗體(或其他多肽)可以是單特異性的。例如，在某些實施方式中，抗體含有的一個或多個抗原結(jié)合位點中的每一個能夠結(jié)合(或結(jié)合)RSPO蛋白上的同源表位。在某些實施方式中，本文所述的單特異性抗體的抗原結(jié)合位點能夠結(jié)合(或結(jié)合)例如RSPO1和RSPO2(即，在RSPO1和RSPO2蛋白上都發(fā)現(xiàn)相同的表位)。在某些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑是抗體片段。抗體片段可以具有與完整抗體不同的功能或能力；例如，抗體片段可以具有增加的腫瘤滲透。已知用于產(chǎn)生抗體片段的各種技術(shù)，包括但不限于完整抗體的蛋白水解消化。在一些實施方式中，抗體片段包括通過抗體分子的胃蛋白酶消化產(chǎn)生的F(ab')2片段。在一些實施方式中，抗體片段包括通過還原F(ab')2片段的二硫鍵產(chǎn)生的Fab片段。在其他實施方式中，抗體片段包括通過用木瓜蛋白酶和還原劑處理抗體分子產(chǎn)生的Fab片段。在某些實施方式中，重組地產(chǎn)生抗體片段。在一些實施方式中，抗體片段包括Fv或單鏈Fv(scFv)片段。Fab、Fv和scFv抗體片段可以在大腸桿菌或其他宿主細胞中表達和分泌，從而允許產(chǎn)生大量的這些片段。在一些實施方式中，從本文所討論的抗體噬菌體文庫分離抗體片段。例如，可以使用方法構(gòu)建Fab表達文庫以允許快速和有效鑒定對RSPO蛋白或其衍生物、片段、類似物或同源物具有所需特異性的單克隆Fab片段。在一些實施方式中，抗體片段是線性抗體片段。在某些實施方式中，抗體片段是單特異性或雙特異性的。在某些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑是scFv。多種技術(shù)可用于產(chǎn)生對一種或多種人類RSPO具有特異性的單鏈抗體。特別是在抗體片段的情況下，進一步期望修飾抗體以增加其血清半衰期。這可以如下實現(xiàn)，例如通過將挽救(salvage)受體結(jié)合表位通過抗體片段中適當(dāng)區(qū)域的突變引入抗體片段中，或者通過將表位引入肽標(biāo)簽中，所述肽標(biāo)簽然后在任一端或在中間與抗體片段融合(例如，通過DNA或肽合成)。異源偶聯(lián)抗體也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。異源偶聯(lián)抗體由兩個共價連接的抗體組成。例如，已經(jīng)提出這樣的抗體將免疫細胞靶向不想要的細胞。還預(yù)期可以使用合成蛋白質(zhì)化學(xué)中的已知方法，包括涉及交聯(lián)劑的那些，在體外制備異源偶聯(lián)抗體。例如，免疫毒素可以使用二硫化物交換反應(yīng)或通過形成硫醚鍵來構(gòu)建。用于該目的的合適試劑的實例包括亞氨基硫醇鹽和甲基-4-巰基丁亞胺酸鹽。為了本發(fā)明的目的，應(yīng)當(dāng)理解，修飾的抗體可以包括提供抗體與靶標(biāo)(即，人RSPO1)締合的任何類型的可變區(qū)。在這方面，所述可變區(qū)可以包含或來自任何類型的哺乳動物，所述哺乳動物可以被誘導(dǎo)產(chǎn)生體液應(yīng)答并產(chǎn)生針對所需腫瘤相關(guān)抗原的免疫球蛋白。因此，修飾的抗體的可變區(qū)可以是例如人、鼠類、非人靈長類動物(例如食蟹猴、獼猴等)或兔來源的。在一些實施方式中，修飾的免疫球蛋白的可變區(qū)和恒定區(qū)都是人的。在其它實施方式中，可以工程化或特別定制相容抗體的可變區(qū)(通常來自非人源)，以改善分子的結(jié)合特性或降低分子的免疫原性。在這方面，可用于本發(fā)明的可變區(qū)可以通過包括導(dǎo)入的氨基酸序列而被人源化或以其它方式改變。在某些實施方式中，重鏈和輕鏈兩者中的可變結(jié)構(gòu)域通過一個或多個CDR的至少部分置換而改變，并且如果必要，通過部分框架區(qū)替換和序列修飾和/或改變來改變。盡管CDR可以衍生自與衍生框架區(qū)的抗體相同類別或甚至亞類的抗體，但是設(shè)想CDR將衍生自不同類型的抗體，并且優(yōu)選衍生自不同物種的抗體。可能不需要將所有CDR用來自供體可變區(qū)的所有CDR替換，以將一個可變結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合能力轉(zhuǎn)移到另一個。相反，可能僅需要轉(zhuǎn)移維持抗原結(jié)合位點的活性所必需的那些殘基。在某些實施方式中，重鏈和輕鏈兩者中的可變結(jié)構(gòu)域通過置換CDR外部的一個或多個氨基酸殘基而改變。在某些實施方式中，通過置換CDR外的一個或多個氨基酸殘基來改變重鏈和輕鏈。在某些實施方式中，在人源化過程中，使用不同的重鏈或輕鏈框架序列，同時保持親本抗體的CDR完整。盡管對可變區(qū)進行了改變，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，本發(fā)明的修飾抗體將包括如下的抗體(例如全長抗體或其免疫反應(yīng)性片段)，在所述抗體中一個或多個恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的至少一部分被刪除或以其它方式改變，以便與包含天然或未改變的恒定區(qū)的具有大致相同的免疫原性的抗體相比時提供所需的生化特性，例如增加的腫瘤定位或增加的血清半衰期。在一些實施方式中，經(jīng)修飾抗體的恒定區(qū)將包含人恒定區(qū)。對與本發(fā)明相容的恒定區(qū)的修飾包括一個或多個結(jié)構(gòu)域中一個或多個氨基酸的添加、缺失或取代。本文公開的經(jīng)修飾抗體可以包含對三個重鏈恒定結(jié)構(gòu)域(CH1、CH2或CH3)和/或輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(CL)中的一個或多個的改變或修飾。在一些實施方式中，一個或多個結(jié)構(gòu)域從經(jīng)修飾抗體的恒定區(qū)部分或完全缺失。在一些實施方式中，經(jīng)修飾抗體將包含其中整個CH2結(jié)構(gòu)域已被去除的結(jié)構(gòu)域缺失構(gòu)建體或變體(ΔCH2構(gòu)建體)。在一些實施方式中，省略的恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域由短氨基酸間隔子(例如，10個氨基酸殘基)替代，其提供通常由缺失恒定區(qū)賦予的一些分子柔性。在一些實施方式中，修飾的抗體被工程化以將CH3結(jié)構(gòu)域直接融合到抗體的鉸鏈區(qū)。在其它實施方式中，肽間隔子插入在鉸鏈區(qū)和經(jīng)修飾的CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域之間。例如，可以表達構(gòu)建體，其中CH2結(jié)構(gòu)域已經(jīng)缺失，剩余的CH3結(jié)構(gòu)域(經(jīng)修飾或未修飾的)通過5-20個氨基酸的間隔子與鉸鏈區(qū)連接?？梢蕴砑舆@樣的間隔子以確保恒定結(jié)構(gòu)域的調(diào)節(jié)元件保持游離和可接近或者鉸鏈區(qū)保持柔性。然而，應(yīng)當(dāng)注意，在一些情況下，氨基酸間隔子可證明是免疫原性的，并引發(fā)針對該構(gòu)建體的不期望的免疫應(yīng)答。因此，在某些實施方式中，添加到構(gòu)建體中的任何間隔子將是相對非免疫原性的，以便維持經(jīng)修飾抗體的所需生物學(xué)特性。在一些實施方式中，經(jīng)修飾抗體可以僅具有恒定結(jié)構(gòu)域的部分缺失或少數(shù)或甚至單個氨基酸的取代。例如，在CH2結(jié)構(gòu)域的選定區(qū)域中單個氨基酸的突變可足以顯著降低Fc結(jié)合，從而增加癌細胞定位和/或腫瘤穿透。類似地，可能需要簡單地刪除控制特定效應(yīng)子功能(例如補體C1q結(jié)合)的一個或多個恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的部分。恒定區(qū)的這種部分缺失可以改善抗體的選定特征(血清半衰期)，同時保留與受試者恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域完整相關(guān)的其它期望的功能。此外，如上所述，所公開的抗體的恒定區(qū)可以通過突變或取代一個或多個能增強所得構(gòu)建體的特性的氨基酸來修飾。在這方面，有可能破壞由保守的結(jié)合位點提供的活性(例如Fc結(jié)合)，同時基本上保持修飾的抗體的構(gòu)型和免疫原性特性。在某些實施方式中，經(jīng)修飾抗體包括向恒定區(qū)添加一個或多個氨基酸以增強期望的特征，例如降低或增加效應(yīng)子功能或提供更多的細胞毒素或碳水化合物附著位點。本領(lǐng)域已知恒定區(qū)介導(dǎo)幾種效應(yīng)子功能。例如，補體的C1組分與IgG或IgM抗體的Fc區(qū)(與抗原結(jié)合)的結(jié)合激活補體系統(tǒng)。補體的激活在細胞病原體的調(diào)理和裂解中是重要的。補體的激活也刺激炎癥反應(yīng)，也可以參與自身免疫性超敏反應(yīng)。另外，抗體的Fc區(qū)可以結(jié)合表達Fc受體(FcR)的細胞。存在許多Fc受體對不同類別的抗體，包括IgG(γ受體)、IgE(ε受體)、IgA(α受體)和IgM(μ受體)具有特異性。抗體與細胞表面上的Fc受體的結(jié)合引發(fā)許多重要和多樣的生物反應(yīng)，包括抗體包被的顆粒的吞噬和破壞、免疫復(fù)合物的清除、殺傷細胞對抗體包被的靶細胞的裂解(稱為抗體依賴性細胞毒性或ADCC)、炎癥介質(zhì)的釋放、胎盤轉(zhuǎn)移和免疫球蛋白產(chǎn)生的控制。在某些實施方式中，RSPO1結(jié)合抗體提供改變的效應(yīng)子功能，其進而影響施用的抗體的生物學(xué)特性。例如，在一些實施方式中，恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的缺失或失活(通過點突變或其它方式)可以降低循環(huán)修飾抗體的Fc受體結(jié)合，從而增加癌細胞定位和/或腫瘤穿透。在其他實施方式中，恒定區(qū)修飾增加或減少抗體的血清半衰期。在一些實施方式中，修飾恒定區(qū)以消除二硫鍵或寡糖部分。根據(jù)本發(fā)明對恒定區(qū)的修飾可以容易地使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的生物化學(xué)或分子工程技術(shù)進行。在某些實施方式中，作為抗體的RSPO1結(jié)合劑不具有一種或多種效應(yīng)子功能。例如，在一些實施方式中，抗體不具有ADCC活性，和/或沒有補體依賴性細胞毒性(CDC)活性。在某些實施方式中，抗體不結(jié)合Fc受體和/或補體因子。在某些實施方式中，抗體不具有效應(yīng)子功能。本發(fā)明還包括與本文所述的嵌合、人源化和人抗體或其抗體片段基本上同源的變體和等同物。這些可以包含例如保守取代突變，即一個或多個氨基酸被相似氨基酸取代。例如，保守取代指氨基酸被相同一般類別內(nèi)的另一種氨基酸取代，例如一個酸性氨基酸被另一個酸性氨基酸取代，一個堿性氨基酸被另一個堿性氨基酸取代，或一個中性氨基酸被另一種中性氨基酸取代。保守氨基酸取代所指代的含義是本領(lǐng)域熟知的并且在本文中描述。因此，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生結(jié)合RSPO1的抗體的方法。在一些實施方式中，用于產(chǎn)生結(jié)合RSPO1的抗體的方法包括使用雜交瘤技術(shù)。在一些實施方式中，提供了用于產(chǎn)生結(jié)合人RSPO1的抗體的方法。在一些實施方式中，所述方法包括使用人RSPO1的氨基酸31-263。在一些實施方式中，所述方法包括使用SEQIDNO：1的氨基酸31-263。在一些實施方式中，產(chǎn)生結(jié)合至少一種人RSPO蛋白的抗體的方法包括篩選人噬菌體文庫。本發(fā)明還提供鑒定結(jié)合RSPO1的抗體的方法。在一些實施方式中，通過FACS篩選結(jié)合RSPO1或其部分來鑒定抗體。在一些實施方式中，通過使用ELISA篩選結(jié)合RSPO1來鑒定抗體。在一些實施方式中，通過FACS篩選阻斷RSPO1與人LGR蛋白的結(jié)合來鑒定抗體。在一些實施方式中，通過篩選β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)的抑制或阻斷來鑒定抗體。在一些實施方式中，產(chǎn)生針對人RSPO1蛋白的抗體的方法包括用包含人RSPO1(SEQIDNO：1)的氨基酸31-263的多肽免疫哺乳動物。在一些實施方式中，產(chǎn)生針對人RSPO1蛋白的抗體的方法包括用包含人RSPO1(SEQIDNO：1)的氨基酸21-263的至少一部分的多肽免疫哺乳動物。在一些實施方式中，所述方法還包括從哺乳動物分離抗體或產(chǎn)生抗體的細胞。在一些實施方式中，產(chǎn)生結(jié)合RSPO1蛋白的單克隆抗體的方法包括：(a)用包含人RSPO1(SEQIDNO：1)的氨基酸21-263的至少一部分的多肽免疫哺乳動物；(b)從免疫的哺乳動物中分離抗體產(chǎn)生細胞；(c)將抗體產(chǎn)生細胞與骨髓瘤細胞系的細胞融合以形成雜交瘤細胞。在一些實施方式中，所述方法還包括(d)選擇表達結(jié)合RSPO1蛋白的抗體的雜交瘤細胞。在一些實施方式中，人RSPO1的氨基酸21-263的至少一部分選自由SEQIDNO：2-SEQIDNO：5組成的組。在一些實施方式中，人RSPO1的氨基酸21-263的至少一部分是SEQIDNO：5。在一些實施方式中，人RSPO1的氨基酸21-263的至少一部分是SEQIDNO：2或SEQIDNO：3。在某些實施方式中，哺乳動物是小鼠。在一些實施方式中，使用包含人RSPO1(SEQIDNO：1)的氨基酸21-263的至少一部分的多肽來選擇抗體。在某些實施方式中，用于選擇的包含人RSPO1的氨基酸21-263的至少一部分的多肽選自由SEQIDNO：2-SEQIDNO：5組成的組。在一些實施方式中，所述抗體結(jié)合RSPO1和至少一種其它RSPO蛋白。在某些實施方式中，所述至少一種其它RSPO蛋白選自由RSPO2、RSPO3和RSPO4組成的組。在某些實施方式中，所述抗體結(jié)合RSPO1和RSPO2。在某些實施方式中，所述抗體結(jié)合RSPO1和RSPO3。在某些實施方式中，所述抗體結(jié)合RSPO1和RSPO4。在某些實施方式中，所述抗體結(jié)合RSPO1、RSPO2和RSPO3。在某些實施方式中，所述抗體結(jié)合RSPO1、RSPO2和RSPO4。在某些實施方式中，所述抗體結(jié)合RSPO1、RSPO3和RSPO4。在一些實施方式中，所述抗體結(jié)合人RSPO1和小鼠RSPO1。在一些實施方式中，通過本文所述的方法產(chǎn)生的抗體是RSPO1拮抗劑。在一些實施方式中，通過本文所述的方法產(chǎn)生的抗體抑制β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)。在一些實施方式中，產(chǎn)生針對至少一種人RSPO蛋白的抗體的方法包括使用包含單一抗原結(jié)合位點的膜結(jié)合異二聚體分子來鑒定抗體。在一些非限制性實施方式中，使用國際公布WO2011/100566中描述的方法和多肽鑒定抗體。在一些實施方式中，產(chǎn)生針對至少一種人RSPO蛋白的抗體的方法包括篩選抗體表達文庫中與人RSPO蛋白結(jié)合的抗體。在一些實施方式中，表達抗體的文庫是噬菌體文庫。在一些實施方式中，篩選包括淘選。在一些實施方式中，使用人RSPO1(SEQIDNO：1)的氨基酸21-263的至少一部分篩選抗體表達文庫(例如噬菌體文庫)。在一些實施方式中，使用不同的RSPO蛋白再次篩選在第一篩選中鑒定的抗體，從而鑒定結(jié)合RSPO1和第二RSPO蛋白的抗體。在某些實施方式中，用于篩選的多肽包含選自由SEQIDNO：2-SEQIDNO：5組成的組的人RSPO1的氨基酸21-263的至少一部分。在一些實施方式中，篩選中鑒定的抗體結(jié)合RSPO1和至少一種其它RSPO蛋白。在某些實施方式中，所述至少一種其它RSPO蛋白選自由RSPO2、RSPO3和RSPO4組成的組。在某些實施方式中，篩選中鑒定的抗體結(jié)合RSPO1和RSPO2。在某些實施方式中，在篩選中鑒定的抗體結(jié)合RSPO1和RSPO3。在某些實施方式中，篩選中鑒定的抗體結(jié)合RSPO1和RSPO4。在一些實施方式中，篩選中鑒定的抗體結(jié)合人RSPO1和小鼠RSPO1。在一些實施方式中，篩選中鑒定的抗體是RSPO1拮抗劑。在一些實施方式中，篩選中鑒定的抗體抑制由RSPO1誘導(dǎo)的β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)。在某些實施方式中，本文所述的抗體是分離的。在某些實施方式中，本文所述的抗體是基本上純的。在本發(fā)明的一些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑是多肽。所述多肽可以是重組多肽、天然多肽或包含結(jié)合人RSPO1的抗體或其片段的合成多肽。在本領(lǐng)域中將認識到，本發(fā)明的一些氨基酸序列可以在不顯著影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能的情況下改變。因此，本發(fā)明還包括顯示顯著活性或包括抗人RSPO1的抗體或其片段的區(qū)域的多肽的變體。在一些實施方式中，RSPO1結(jié)合多肽的氨基酸序列變異包括缺失、插入、倒位、重復(fù)和/或其它類型的取代?？梢赃M一步修飾多肽、其類似物和變體以包含通常不是多肽一部分的另外的化學(xué)部分。衍生化的部分可以改善多肽的溶解性、生物半衰期和/或吸收。所述部分還可以減少或消除多肽和變體的任何不期望的副作用?；瘜W(xué)部分的綜述可以在Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,22stEdition,2012,PharmaceuticalPress,London中找到。本文所述的分離的多肽可以通過本領(lǐng)域已知的任何合適的方法產(chǎn)生。此類方法的范圍從直接蛋白質(zhì)合成方法到構(gòu)建編碼多肽序列的DNA序列并在合適的宿主中表達這些序列。在一些實施方式中，使用重組技術(shù)通過分離或合成編碼目標(biāo)野生型蛋白質(zhì)的DNA序列來構(gòu)建DNA序列。任選地，可以通過位點特異性誘變來誘變序列以提供其功能類似物。在一些實施方式中，編碼目的多肽的DNA序列可以通過使用寡核苷酸合成儀的化學(xué)合成來構(gòu)建?？梢曰谒瓒嚯牡陌被嵝蛄性O(shè)計寡核苷酸，并選擇在宿主細胞中偏好的那些密碼子，其中將產(chǎn)生感興趣的重組多肽?？梢詰?yīng)用標(biāo)準(zhǔn)方法來合成編碼分離的目的多肽的多核苷酸序列。例如，完整的氨基酸序列可用于構(gòu)建反向翻譯的基因。此外，可以合成包含編碼特定分離多肽的核苷酸序列的DNA寡聚物。例如，可以合成編碼所需多肽的一部分的幾個小寡核苷酸，然后連接。單個寡核苷酸通常含有用于互補組裝的5'或3'突出端。一旦組裝(通過合成，定點誘變或另一種方法)，可將編碼特定目的多肽的多核苷酸序列插入表達載體中，并可操作地連接到適于在所需宿主中表達蛋白質(zhì)的表達控制序列。正確的裝配可以通過核苷酸測序，限制酶作圖和/或在合適的宿主中生物活性多肽的表達來確認。如本領(lǐng)域眾所周知的，為了在宿主中獲得轉(zhuǎn)染基因的高表達水平，基因必須可操作地連接到在選擇的表達宿主中有功能的轉(zhuǎn)錄和翻譯表達控制序列。在某些實施方式中，重組表達載體用于擴增和表達編碼針對人RSPO1的抗體或其片段的DNA。例如，重組表達載體可以是可復(fù)制的DNA構(gòu)建體，其具有合成的或cDNA衍生的DNA片段，其編碼RSPO1結(jié)合劑、抗RSPO1抗體或其片段的多肽鏈，其可操作地連接到源自哺乳動物、微生物、病毒或昆蟲基因的合適的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯調(diào)節(jié)元件。轉(zhuǎn)錄單元通常包含下述組件：(1)在基因表達中具有調(diào)節(jié)作用的遺傳元件，例如轉(zhuǎn)錄啟動子或增強子，(2)轉(zhuǎn)錄成mRNA并翻譯成蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或編碼序列，和(3)合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯起始和終止序列組成的組件。調(diào)節(jié)元件可以包括控制轉(zhuǎn)錄的操縱子序列。在宿主中復(fù)制的能力通常由復(fù)制起點賦予，可以另外并入選擇基因以用于促進轉(zhuǎn)化體識別。當(dāng)DNA區(qū)域在功能上彼此相關(guān)時，它們是“可操作地連接的”。例如，如果信號肽(分泌前導(dǎo)序列)的DNA表達為參與多肽分泌的前體，則其可操作地連接于多肽的DNA；如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，則啟動子可操作地連接于編碼序列；或者如果核糖體結(jié)合位點被定位以允許翻譯，則其與編碼序列可操作地連接。在一些實施方式中，預(yù)期用于酵母表達系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)元件包括能夠由宿主細胞細胞外分泌翻譯的蛋白質(zhì)的前導(dǎo)序列。在其他實施方式中，其中重組蛋白質(zhì)在沒有前導(dǎo)序列或轉(zhuǎn)運序列的情況下表達，其可以包括N-末端甲硫氨酸殘基。該殘基可任選地隨后從表達的重組蛋白質(zhì)切割以提供最終產(chǎn)物。表達控制序列和表達載體的選擇取決于宿主的選擇?？梢允褂枚喾N表達宿主/載體組合。用于真核宿主的有用的表達載體包括例如包含來自SV40、牛乳頭瘤病毒、腺病毒和巨細胞病毒的表達控制序列的載體。用于細菌宿主的有用的表達載體包括已知的細菌質(zhì)粒，例如來自大腸桿菌的質(zhì)粒，包括pCR1、pBR322、pMB9及其衍生物，以及更寬的宿主范圍質(zhì)粒，例如M13和其他絲狀單鏈DNA噬菌體。用于表達RSPO1結(jié)合多肽或抗體(或用作抗原的RSPO1蛋白)的合適宿主細胞包括在適當(dāng)啟動子控制下的原核生物、酵母細胞、昆蟲細胞或高等真核細胞。原核生物包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物，例如大腸桿菌或芽孢桿菌。高等真核細胞包括如下所述的哺乳動物來源的建立的細胞系。也可以使用無細胞翻譯系統(tǒng)。用于細菌、真菌、酵母和哺乳動物細胞宿主的合適的克隆和表達載體由Pouwels等人描述(1985,CloningVectors:ALaboratoryManual,Elsevier,NewYork,NY)。關(guān)于蛋白質(zhì)生產(chǎn)(包括抗體生產(chǎn))的方法的其它信息可以在例如美國專利公開號2008/0187954、美國專利號6,413,746和6,660,501以及國際專利公開號WO04009823中找到。各種哺乳動物或昆蟲細胞培養(yǎng)系統(tǒng)用于表達重組多肽。重組蛋白在哺乳動物細胞中的表達可以是優(yōu)選的，因為這樣的蛋白通常正確折疊、適當(dāng)修飾并功能完全。合適的哺乳動物宿主細胞系的實例包括COS-7(源自猴腎)、L-929(源自鼠類成纖維細胞)、C127(源自鼠類乳腺腫瘤)、3T3(源自類鼠成纖維細胞)、CHO(源自中國倉鼠卵巢)、HeLa(源自人宮頸癌)、BHK(源自倉鼠腎成纖維細胞)和HEK-293(源自人胚腎)細胞系及其變體。哺乳動物表達載體可以包含非轉(zhuǎn)錄元件，例如復(fù)制起點，與待表達的基因連接的合適的啟動子和增強子，以及其它5'或3'側(cè)翼非轉(zhuǎn)錄序列，以及5'或3'翻譯序列，例如必需的核糖體結(jié)合位點、多腺苷酸化位點、剪接供體和受體位點，和轉(zhuǎn)錄終止序列。重組蛋白在昆蟲細胞培養(yǎng)系統(tǒng)(例如桿狀病毒)中的表達還提供了用于產(chǎn)生正確折疊和生物功能性蛋白質(zhì)的魯棒方法。用于在昆蟲細胞中產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)的桿狀病毒系統(tǒng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。因此，本發(fā)明提供了包含本文所述的RSPO1結(jié)合劑的細胞。在一些實施方式中，所述細胞產(chǎn)生本文所述的RSPO1結(jié)合劑。在某些實施方式中，所述細胞產(chǎn)生抗體。在某些實施方式中，所述細胞產(chǎn)生抗體h89M5-H8L5?？梢愿鶕?jù)任何合適的方法純化由轉(zhuǎn)化的宿主產(chǎn)生的蛋白質(zhì)(例如，抗RSPO1抗體)。標(biāo)準(zhǔn)方法包括色譜法(例如離子交換、親和和體積柱色譜)、離心、差示溶解性，或通過用于蛋白質(zhì)純化的任何其它標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)?？梢詫⒂H和標(biāo)簽例如六組氨酸、麥芽糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域、流感衣殼序列和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶連接至蛋白質(zhì)，以允許通過經(jīng)過合適的親和柱容易地純化。分離的蛋白質(zhì)也可以使用諸如蛋白水解、質(zhì)譜(MS)、核磁共振(NMR)、高效液相色譜(HPLC)和x射線晶體學(xué)的技術(shù)進行物理表征。在一些實施方式中，可以首先使用市售的蛋白質(zhì)濃縮過濾器，例如Amicon或MilliporePellicon超濾單元濃縮來自將重組蛋白分泌到培養(yǎng)基中的表達系統(tǒng)的上清液。在濃縮步驟之后，可以將濃縮物施加到合適的純化基質(zhì)。在一些實施方式中，可以使用陰離子交換樹脂，例如，具有懸垂的二乙基氨基乙基(DEAE)基團的基質(zhì)或基質(zhì)。基質(zhì)可以是丙烯酰胺、瓊脂糖、葡聚糖、纖維素或蛋白質(zhì)純化中常用的其它類型。在一些實施方式中，可以采用陽離子交換步驟。合適的陽離子交換劑包括各種包含磺丙基或羧甲基的不溶性基質(zhì)。在一些實施方式中，可以使用羥基磷灰石介質(zhì)，包括但不限于陶瓷羥基磷灰石(CHT)。在某些實施方式中，使用疏水性RP-HPLC介質(zhì)(例如具有懸垂的甲基或其它脂族基團的硅膠)的一個或多個反相HPLC步驟可用于進一步純化RSPO結(jié)合劑。一些或所有前述純化步驟，以各種組合，也可以用于提供均勻的重組蛋白。在一些實施方式中，可以分離細菌培養(yǎng)物中產(chǎn)生的重組蛋白，例如通過從細胞球團中初步提取，隨后進行一個或多個濃縮、鹽析、水性離子交換或尺寸排阻色譜步驟。HPLC可用于最終純化步驟。用于表達重組蛋白的微生物細胞可以通過任何方便的方法破碎，包括冷凍-解凍循環(huán)、超聲處理、機械破碎或使用細胞裂解劑。在某些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑是不為抗體的多肽。用于鑒定和產(chǎn)生以高親和力結(jié)合蛋白質(zhì)靶標(biāo)的非抗體多肽的多種方法是本領(lǐng)域已知的。在某些實施方式中，噬菌體展示技術(shù)可用于產(chǎn)生和/或鑒定RSPO1結(jié)合多肽。在某些實施方式中，多肽包含選自蛋白A、蛋白G、脂籠蛋白、纖連蛋白結(jié)構(gòu)域、錨蛋白共有重復(fù)結(jié)構(gòu)域和硫氧還蛋白的類型的蛋白質(zhì)支架。在某些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑或抗體可以以許多綴合的(即免疫綴合物或放射性綴合物)或非綴合形式中的任一種使用。在某些實施方式中，抗體可以以非綴合形式使用以利用受試者的天然防御機制，包括補體依賴性細胞毒性和抗體依賴性細胞毒性以消除惡性或癌細胞。在一些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑(例如，抗體或多肽)與細胞毒劑綴合。在一些實施方式中，細胞毒性劑是化療劑，包括但不限于甲氨蝶呤、阿霉素、多柔比星、美法侖、絲裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔紅霉素或其它插入劑。在一些實施方式中，細胞毒性劑是細菌、真菌、植物或動物來源的酶活性毒素或其片段，包括但不限于白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α-帚曲霉素、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陸蛋白(PAPI，PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制劑、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制劑、白樹毒素、米托菌素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素(phenomycin)、伊諾霉素和單端孢霉烯。在一些實施方式中，細胞毒性劑是放射性同位素以產(chǎn)生放射性綴合物或放射性綴合的抗體。各種放射性核素可用于產(chǎn)生放射性綴合的抗體，包括但不限于90Y、125I、131I、123I、111In、131In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re、188Re和212Bi。也可以使用抗體和一種或多種小分子毒素的綴合物，例如加利車霉素、美登木素生物堿、單端孢霉烯和CC1065，以及這些具有毒素活性的毒素的衍生物。使用多種雙功能蛋白偶聯(lián)劑，例如N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(SPDP)、亞氨基四氫噻吩(IT)、亞氨酸酯的雙官能衍生物(例如二甲基己二酰亞胺酯HCL)、活性酯(例如二琥珀酰亞胺基辛二酸酯)、醛(例如戊二醛)、雙疊氮化合物(例如雙(對疊氮苯甲酰基)己二胺)，雙重氮衍生物(例如雙-(對重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二異氰酸酯(例如甲苯2,6-二異氰酸酯)和雙活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)來制備抗體和細胞毒性劑的綴合物。III.多核苷酸在某些實施方式中，本發(fā)明涵蓋多核苷酸，其包括編碼特異性結(jié)合至少一種人RSPO或這種多肽的片段的多肽的多核苷酸。術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”涵蓋僅包括多肽的編碼序列的多核苷酸，以及包括另外的編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。例如，本發(fā)明提供了包含編碼針對人RSPO蛋白的抗體或編碼這樣的抗體的片段的多核苷酸序列的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸可以是RNA的形式或DNA的形式。DNA包括cDNA、基因組DNA和合成DNA；并且可以是雙鏈或單鏈，并且如果單鏈可以是編碼鏈或非編碼(反義)鏈。在一些實施方式中，多核苷酸包含編碼本文所述的特異性結(jié)合人RSPO1的抗體的核苷酸序列。在某些實施方式中，多核苷酸包含編碼包含選自由SEQIDNO：32、SEQIDNO：33、SEQIDNO：34、SEQIDNO：35、SEQIDNO：36和SEQIDNO：37組成的組中的序列的多肽的多核苷酸。在一些實施方式中，多核苷酸包含選自由SEQIDNO：38、SEQIDNO：39、SEQIDNO：40和SEQIDNO：41組成的組中的多核苷酸序列。在一些實施方式中，質(zhì)粒包含含有SEQIDNO：38的多核苷酸。在一些實施方式中，質(zhì)粒包含含有多核苷酸序列SEQIDNO：39的多核苷酸。在一些實施方式中，質(zhì)粒包含含有多核苷酸序列SEQIDNO：40的多核苷酸。在一些實施方式中，質(zhì)粒包含含有多核苷酸序列SEQIDNO：41的多核苷酸。在一些實施方式中，質(zhì)粒包含編碼包含SEQIDNO：32和/或SEQIDNO：33的氨基酸序列的多核苷酸。在一些實施方式中，質(zhì)粒包括編碼包含SEQIDNO：34和/或SEQIDNO：36的氨基酸序列的多核苷酸。在一些實施方式中，質(zhì)粒包含編碼包含SEQIDNO：35和/或SEQIDNO：37的氨基酸序列的多核苷酸。在某些實施方式中，所述多核苷酸包含具有與包含選自由SEQIDNO：39、SEQIDNO：39、SEQIDNO：40和SEQIDNO：41組成的組中的序列的多核苷酸為至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性，并且在一些實施方式中至少96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列的多核苷酸。還提供了包含與SEQIDNO：38、SEQIDNO：39、SEQIDNO：40或SEQIDNO：41雜交的多核苷酸的多核苷酸。在某些實施方式中，雜交在高嚴格條件下進行。在一些實施方式中，抗體由包含SEQIDNO：38和SEQIDNO：39的多核苷酸編碼。在一些實施方式中，抗體由包含SEQIDNO：40和SEQIDNO：41的多核苷酸編碼。在一些實施方式中，抗體包含由ATCC保藏為PTA-121494的質(zhì)粒編碼的重鏈可變區(qū)。在一些實施方式中，抗體包含由ATCC保藏為PTA-121494的質(zhì)粒編碼的重鏈。在一些實施方式中，抗體包含由ATCC保藏為PTA-121495的質(zhì)粒編碼的輕鏈可變區(qū)。在一些實施方式中，抗體包含由ATCC保藏為PTA-121495的質(zhì)粒編碼的輕鏈。在一些實施方式中，抗體包含由ATCC保藏為PTA-121494的質(zhì)粒編碼的重鏈可變區(qū)和由ATCC保藏為PTA-121495的質(zhì)粒編碼的輕鏈可變區(qū)。在一些實施方式中，抗體包含由ATCC保藏為PTA-121494的質(zhì)粒編碼的重鏈和由ATCC保藏為PTA-121495的質(zhì)粒編碼的輕鏈。在某些實施方式中，所述多核苷酸包含成熟多肽的編碼序列，其在相同閱讀框中與輔助例如多肽從宿主細胞表達和分泌的多核苷酸融合(例如，作為控制多肽從細胞轉(zhuǎn)運的分泌序列的前導(dǎo)序列或信號序列)。具有前導(dǎo)序列的多肽是前蛋白，并且可以具有被宿主細胞切割以形成多肽的成熟形式的前導(dǎo)序列。多核苷酸還可以編碼原蛋白，其是成熟蛋白加上另外的5'氨基酸殘基。具有原序列的成熟蛋白是原蛋白并且是蛋白的無活性形式。一旦原序列被切割，活性成熟蛋白質(zhì)保留。在某些實施方式中，所述多核苷酸包含成熟多肽的編碼序列，其在相同閱讀框中與允許例如純化所編碼的多肽的標(biāo)記序列融合。例如，標(biāo)記序列可以是由pQE-9載體提供的六組氨酸標(biāo)簽，以提供在細菌宿主的情況下與標(biāo)記融合的成熟多肽的純化，或當(dāng)使用哺乳動物宿主(例如，COS-7細胞)時，標(biāo)記序列可以是來自流感血凝素蛋白血凝素(HA)標(biāo)簽，。在一些實施方式中，所述標(biāo)記序列是FLAG標(biāo)簽，其可以與其他親和標(biāo)簽聯(lián)合使用。本發(fā)明還涉及編碼例如片段、類似物和/或衍生物的上述多核苷酸的變體。在某些實施方式中，本發(fā)明提供了多核苷酸，其包括與編碼包含本文所述的RSPO結(jié)合劑(例如抗體)或其片段的多肽的多核苷酸具有至少約80％相同、至少約85％相同、至少約90％相同、至少約95％相同，并且在一些實施方式中，至少具有約96％、97％、98％或99％的同一性的核苷酸序列的多核苷酸。如本文所用，短語具有與參考核苷酸序列至少例如95％“同一性”的核苷酸序列的多核苷酸意圖表示多核苷酸的核苷酸序列與參考序列相同，除了所述多核苷酸序列可以包括至多5個點突變/每100個參考核苷酸序列的核苷酸。換言之，為了獲得具有與參考核苷酸序列至少95％同一性的核苷酸序列的多核苷酸，參考序列中至多5％的核苷酸可以缺失或用另一個核苷酸取代，或可以將參考序列中總核苷酸的至多5％的核苷酸數(shù)目插入?yún)⒖夹蛄兄?。參考序列的這些突變可以發(fā)生在參考核苷酸序列的5'或3'末端位置或在那些末端位置之間的任何位置，單個地散布在參考序列的核苷酸之間或參考序列內(nèi)的一個或多個鄰接基團中。多核苷酸變體可以在編碼區(qū)、非編碼區(qū)或兩者中包含改變。在一些實施方式中，多核苷酸變體含有產(chǎn)生沉默取代、添加或缺失，但不改變所編碼多肽的性質(zhì)或活性的改變。在一些實施方式中，通過由于遺傳密碼的簡并性的沉默取代產(chǎn)生核苷酸變體。在一些實施方式中，核苷酸變體包含導(dǎo)致表達差異(例如，增加或降低的表達)的核苷酸序列，即使氨基酸序列沒有改變?？梢猿鲇诙喾N原因產(chǎn)生多核苷酸變體，例如，為了優(yōu)化特定宿主的密碼子表達(即將人類mRNA中的密碼子改變?yōu)榧毦拗魅绱竽c桿菌優(yōu)選的密碼子)。在某些實施方式中，所述多核苷酸是分離的。在某些實施方式中，所述多核苷酸是基本上純的。還提供了包含本文所述的多核苷酸的載體和細胞。在一些實施方式中，表達載體包含多核苷酸分子。在一些實施方式中，宿主細胞包含含有多核苷酸分子的表達載體。在一些實施方式中，宿主細胞包含多核苷酸分子。IV.使用方法和藥物組合物本發(fā)明的RSPO1結(jié)合劑(包括多肽和抗體)可用于多種應(yīng)用，包括但不限于治療性治療方法，例如癌癥的治療。在某些實施方式中，所述試劑可用于抑制β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)、抑制腫瘤生長、誘導(dǎo)分化、減少腫瘤體積、降低腫瘤中癌干細胞的頻率和/或降低腫瘤的致瘤性。使用的方法可以是體外、離體或體內(nèi)方法。在某些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑是人RSPO1的拮抗劑。在某些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑用于治療與β-連環(huán)蛋白激活、增加的β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)和/或異常的β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)相關(guān)的疾病。在某些實施方式中，所述疾病是依賴于β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)的疾病。在某些實施方式中，所述疾病是依賴于β-連環(huán)蛋白激活的疾病。在某些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑用于治療以增加的干細胞和/或祖細胞水平為特征的疾病。在一些實施方式中，所述方法包括向受試者施用治療有效量的RSPO1結(jié)合劑(例如抗體)。在一些實施方式中，受試者是人。在某些實施方式中，本文所述的方法包括向受試者施用治療有效量的抗RSPO1抗體，其包含含有TGYTMH(SEQIDNO：6)的重鏈CDR1、含有GINPNNGGTTYNQNFKG(SEQIDNO：7)和含有KEFSDGYYFFAY(SEQIDNO：8)的重鏈CDR3，和/或含有KASQDVIFAVA(SEQIDNO：9)的輕鏈CDR1、含有WASTRHT(SEQIDNO：10)的輕鏈CDR2和含有QQHYSTPW(SEQIDNO：11)的輕鏈CDR3。在一些實施方式中，本文所述的方法包括向受試者施用治療有效量的抗RSPO1抗體，其包含含有SEQIDNO：32的重鏈可變區(qū)和含有SEQIDNO：33的輕鏈可變區(qū)。在一些實施方式中，本文所述的方法包括向受試者施用治療有效量的抗RSPO1抗體，其包含含有SEQIDNO：35的重鏈和含有SEQIDNO：37的輕鏈。本發(fā)明提供了使用本文所述的RSPO1結(jié)合劑抑制腫瘤生長的方法。在某些實施方式中，抑制腫瘤生長的方法包括在體外使細胞與RSPO1結(jié)合劑接觸。例如，永生化細胞系或癌細胞系在添加有RSPO1結(jié)合劑以抑制腫瘤生長的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在一些實施方式中，從患者樣品(例如組織活檢、胸腔積液或血液樣品)中分離腫瘤細胞，并在添加了RSPO1結(jié)合劑以抑制腫瘤生長的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑是抗RSPO1抗體。在一些實施方式中，所述抗RSPO1抗體是抗體h89M5-H8L5。在一些實施方式中，抑制腫瘤生長的方法包括使腫瘤或腫瘤細胞與RSPO1結(jié)合劑在體內(nèi)接觸。在某些實施方式中，在動物模型中進行腫瘤或腫瘤細胞與RSPO1結(jié)合劑的接觸。例如，可以將RSPO1結(jié)合劑施用于具有腫瘤異種移植物的免疫受損小鼠(例如NOD/SCID小鼠)。在一些實施方式中，從患者樣品，例如組織活檢、胸腔積液或血液樣品中分離癌細胞或癌干細胞，并注射到免疫受損的小鼠中，然后向其施用RSPO1結(jié)合劑以抑制腫瘤細胞生長。在一些實施方式中，向動物施用RSPO1結(jié)合劑。在一些實施方式中，在將致瘤細胞引入動物中的同時或不久施用RSPO1結(jié)合劑以防止腫瘤生長(“預(yù)防模型”)。在一些實施方式中，在腫瘤生長至指定大小后，將RSPO1結(jié)合劑作為治療劑施用(“治療模型”)。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑是抗RSPO1抗體。在一些實施方式中，所述抗RSPO1抗體是抗體h89M5-H8L5。在某些實施方式中，抑制腫瘤生長的方法包括向受試者施用治療有效量的RSPO1結(jié)合劑。在某些實施方式中，受試者是人。在某些實施方式中，受試者具有腫瘤或具有移除的腫瘤。在一些實施方式中，受試者具有至少一種RSPO蛋白(例如RSPO1、RSPO2或RSPO3)的表達水平升高的腫瘤。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑是抗RSPO1抗體。在一些實施方式中，所述抗RSPO1抗體是抗體h89M5-H8L5。在某些實施方式中，腫瘤是其中β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)激活的腫瘤。在一些實施方式中，腫瘤是其中β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)異常的腫瘤。在某些實施方式中，腫瘤包含APC腫瘤抑制基因中的失活突變(例如，截短突變)。在某些實施方式中，腫瘤不包含APC腫瘤抑制基因中的失活性突變。在一些實施方式中，腫瘤包含野生型APC基因。在一些實施方式中，腫瘤不包含β-連環(huán)蛋白基因中的激活突變。在某些實施方式中，對受試者進行治療所針對的癌癥涉及這樣的腫瘤。在某些實施方式中，腫瘤表達RSPO1結(jié)合劑或抗體結(jié)合的RSPO1。在某些實施方式中，腫瘤具有升高的RSPO1表達水平或過表達RSPO1。在一些實施方式中，腫瘤具有高表達水平的RSPO1。一般來說，短語“腫瘤具有升高的表達水平”的蛋白質(zhì)(或類似短語)是指與所述蛋白質(zhì)的預(yù)定表達水平相比，腫瘤中蛋白質(zhì)的表達水平。在一些實施方式中，預(yù)定表達水平是相同組織類型的正常組織中蛋白質(zhì)的表達水平。然而，在一些實施方式中，蛋白質(zhì)的預(yù)定表達水平是蛋白質(zhì)在組織類型組內(nèi)的平均表達水平。在一些實施方式中，預(yù)定的表達水平是相同組織類型或不同組織類型的其它腫瘤中蛋白質(zhì)的表達水平。在某些實施方式中，腫瘤具有升高的RSPO2表達水平或過表達RSPO2。在一些實施方式中，腫瘤具有高表達水平的RSPO2。在某些實施方式中，腫瘤具有升高的RSPO3表達水平或過表達RSPO3。在一些實施方式中，腫瘤具有高表達水平的RSPO3。在某些實施方式中，腫瘤具有升高的RSPO4表達水平或過表達RSPO4。在一些實施方式中，腫瘤具有高表達水平的RSPO4。在一些實施方式中，與在正常組織中表達的RSPO水平相比，腫瘤表達升高的RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4水平。在一些實施方式中，正常組織是與腫瘤相同組織類型的組織。此外，本發(fā)明提供了抑制受試者中腫瘤生長的方法，包括向受試者施用治療有效量的RSPO1結(jié)合劑。在某些實施方式中，腫瘤包含癌癥干細胞。在某些實施方式中，腫瘤中癌干細胞的頻率通過施用RSPO1結(jié)合劑而降低。本發(fā)明還提供了減少腫瘤中癌干細胞頻率的方法，包括使腫瘤與有效量的RSPO1結(jié)合劑接觸。在一些實施方式中，提供了降低受試者腫瘤中癌干細胞頻率的方法，包括向受試者施用治療有效量的RSPO1結(jié)合劑(例如抗RSPO1抗體)。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑是抗RSPO1抗體。在一些實施方式中，所述抗RSPO1抗體是抗體h89M5-H8L5。在一些實施方式中，所述腫瘤是實體瘤。在某些實施方式中，所述腫瘤是選自由結(jié)腸直腸腫瘤、胰腺腫瘤、肺腫瘤、卵巢腫瘤、肝腫瘤、乳腺腫瘤、腎腫瘤、前列腺腫瘤、胃腸腫瘤、黑素瘤、子宮頸腫瘤、膀胱腫瘤、成膠質(zhì)細胞瘤和頭頸部腫瘤組成的組中的腫瘤。在某些實施方式中，所述腫瘤是結(jié)腸直腸腫瘤。在某些實施方式中，所述腫瘤是卵巢腫瘤。在一些實施方式中，所述腫瘤是肺腫瘤。在某些實施方式中，所述腫瘤是胰腺腫瘤。在一些實施方式中，所述腫瘤是包含APC基因中的失活性突變的結(jié)腸直腸腫瘤。在一些實施方式中，所述腫瘤是不包含APC基因中的失活性突變的結(jié)腸直腸腫瘤。在一些實施方式中，所述腫瘤是具有升高的RSPO1表達水平的卵巢腫瘤。在一些實施方式中，所述腫瘤是具有升高的RSPO2表達水平的胰腺腫瘤。在一些實施方式中，所述腫瘤是具有升高的RSPO2表達水平的結(jié)腸腫瘤。在一些實施方式中，所述腫瘤是具有升高的RSPO2表達水平的肺腫瘤。在一些實施方式中，所述腫瘤是具有升高的RSPO2表達水平的黑素瘤腫瘤。在一些實施方式中，所述腫瘤是具有升高的RSPO2表達水平的乳腺腫瘤。在一些實施方式中，所述腫瘤是具有升高的RSPO3表達水平的肺腫瘤。在一些實施方式中，所述腫瘤是具有升高的RSPO3表達水平的卵巢腫瘤。在一些實施方式中，所述腫瘤是具有升高的RSPO3表達水平的乳腺腫瘤。在一些實施方式中，所述腫瘤是具有升高的RSPO3表達水平的結(jié)腸腫瘤。在一些實施方式中，所述腫瘤是具有升高的RSPO4表達水平的乳腺腫瘤。在一些實施方式中，所述腫瘤是具有升高的RSPO4表達水平的肺腫瘤。在一些實施方式中，所述腫瘤是具有升高的RSPO4表達水平的卵巢腫瘤。在一些實施方式中，所述腫瘤是具有高表達水平的RSPO1的卵巢腫瘤。在一些實施方式中，所述腫瘤是具有高表達水平的RSPO2的胰腺腫瘤。在一些實施方式中，所述腫瘤是具有高表達水平的RSPO2的結(jié)腸腫瘤。在一些實施方式中，所述腫瘤是具有高表達水平的RSPO2的肺腫瘤。在一些實施方式中，所述腫瘤是具有高表達水平的RSP02的黑素瘤腫瘤。在一些實施方式中，所述腫瘤是具有高表達水平的RSPO2的乳腺腫瘤。在一些實施方式中，所述腫瘤是具有高表達水平的RSPO3的肺腫瘤。在一些實施方式中，所述腫瘤是具有高表達水平的RSPO3的卵巢腫瘤。在一些實施方式中，所述腫瘤是具有高表達水平的RSPO3的乳腺腫瘤。在一些實施方式中，所述腫瘤是具有高表達水平的RSPO3的結(jié)腸腫瘤。在一些實施方式中，所述腫瘤是具有高表達水平的RSPO4的乳腺腫瘤。在一些實施方式中，所述腫瘤是具有高表達水平的RSPO4的肺腫瘤。在一些實施方式中，所述腫瘤是具有高表達水平的RSPO4的卵巢腫瘤。本發(fā)明還提供了治療癌癥的方法，包括向受試者施用治療有效量的RSPO1結(jié)合劑。在某些實施方式中，所述癌癥的特征在于與預(yù)定水平的蛋白質(zhì)相比，表達至少一種RSPO蛋白水平升高的細胞。在一些實施方式中，預(yù)定表達水平是相同RSPO蛋白在正常組織中的表達水平。在某些實施方式中，所述癌癥的特征在于過表達RSPO1的細胞。在某些實施方式中，所述癌癥的特征在于過表達RSPO2的細胞。在某些實施方式中，所述癌癥的特征在于過表達RSPO3的細胞。在某些實施方式中，所述癌癥過表達選自由RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4組成的組中的至少一種RSPO蛋白。在某些實施方式中，所述癌癥的特征在于表達β-連環(huán)蛋白的細胞，其中RSPO1結(jié)合劑干擾RSPO誘導(dǎo)的β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)和/或激活。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑結(jié)合RSPO1，并抑制或減少癌癥的生長。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑結(jié)合RSPO1、干擾RSPO1/LGR相互作用，并抑制或減少癌癥的生長。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑結(jié)合RSPO1、抑制β-連環(huán)蛋白激活，并抑制或減少癌癥的生長。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑結(jié)合RSPO1，并降低癌癥中癌癥干細胞的頻率。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑是抗RSPO1抗體。在一些實施方式中，所述抗RSPO1抗體是抗體h89M5-H8L5。本發(fā)明提供了治療癌癥的方法，包括向受試者(例如，需要治療的受試者)施用治療有效量的RSPO1結(jié)合劑。在某些實施方式中，所述受試者是人。在某些實施方式中，所述受試者具有癌性腫瘤。在某些實施方式中，所述受試者已經(jīng)移除了腫瘤。在一些實施方式中，治療癌癥的方法包括向受試者施用治療有效量的RSPO1結(jié)合劑，其中受試者具有至少一種RSPO蛋白表達升高的腫瘤。在一些實施方式中，所述受試者患有具有升高的RSPO1表達的卵巢腫瘤，并施用RSPO1結(jié)合劑。在一些實施方式中，所述受試者患有具有升高的RSPO1表達的卵巢腫瘤，并施用抗RSPO1抗體。在一些實施方式中，所述受試者患有具有升高的RSPO1表達的卵巢腫瘤并施用抗體h89M5-H8L5。在某些實施方式中，所述癌癥是選自由結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、腎癌、前列腺癌、胃腸癌、黑素瘤、子宮頸癌、膀胱癌、膠質(zhì)母細胞瘤和頭頸癌組成的組中的癌。在某些實施方式中，所述癌癥是胰腺癌。在某些實施方式中，所述癌癥是卵巢癌。在某些實施方式中，所述癌癥是結(jié)腸直腸癌。在某些實施方式中，所述癌癥是乳腺癌。在某些實施方式中，所述癌癥是前列腺癌。在某些實施方式中，所述癌癥是肺癌。此外，本發(fā)明提供了降低受試者中腫瘤的致瘤性的方法，包括向受試者施用治療有效量的RSPO1結(jié)合劑。在某些實施方式中，腫瘤包含癌癥干細胞。在一些實施方式中，通過降低腫瘤中癌干細胞的頻率來降低腫瘤的致瘤性。在一些實施方式中，所述方法包括使用本文所述的RSPO1結(jié)合劑。在某些實施方式中，腫瘤中癌干細胞的頻率通過施用RSPO1結(jié)合劑而降低。在某些實施方式中，所述方法還包括確定腫瘤或癌癥中至少一種RSPO蛋白的表達水平的步驟。在一些實施方式中，確定RSPO在腫瘤或癌癥中的表達水平的步驟包括確定RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4的表達水平。在一些實施方式中，將腫瘤或癌癥中的RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4的表達水平與RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4的預(yù)定表達水平進行比較。在一些實施方式中，預(yù)定表達水平是RSPO1、RSPO2、RSPO3和/或RSPO4在正常組織中的表達水平。在某些實施方式中，所述方法還包括確定腫瘤或癌癥是否在APC基因中具有失活突變的步驟。在一些實施方式中，所述方法還包括確定腫瘤或癌癥是否在β-連環(huán)蛋白基因中具有激活突變的步驟。在一些實施方式中，在治療之前進行RSPO表達水平的確定。在一些實施方式中，如果與相同RSPO蛋白的預(yù)定表達水平相比，腫瘤或癌癥具有升高的RSPO表達水平，則向受試者施用本文所述的RSPO1結(jié)合劑或抗體。在一些實施方式中，如果腫瘤或癌癥在APC基因中具有突變，則向受試者施用本文所述的RSPO結(jié)合劑或抗體。此外，本發(fā)明提供鑒定用RSPO1結(jié)合劑治療的人類受試者的方法，包括確定受試者是否具有與相同RSPO蛋白的預(yù)定表達水平相比具有升高的RSPO表達水平的腫瘤。在一些實施方式中，如果腫瘤具有升高的RSPO表達水平，則選擇受試者用特異性結(jié)合RSPO1的抗體治療。在一些實施方式中，如果選擇用于治療，則向受試者施用本文所述的RSPO1結(jié)合劑或抗體。在某些實施方式中，受試者已經(jīng)移除了腫瘤。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑是抗RSPO1抗體。在一些實施方式中，所述抗RSPO1抗體是抗體h89M5-H8L5。本發(fā)明還提供了治療人受試者中的癌癥的方法，所述方法包括：(a)至少部分地基于具有RSPO1升高或高表達水平的癌癥的受試者選擇用于治療的受試者，和(b)向受試者施用治療有效量的本文所述的RSPO1結(jié)合劑。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑是抗RSPO1抗體。在一些實施方式中，所述抗RSPO1抗體是抗體h89M5-H8L5。用于測定細胞、腫瘤或癌癥中RSPO表達水平的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。這些方法包括但不限于用于核酸表達的基于PCR的測定、微陣列分析和核苷酸測序(例如，NextGen測序)。其它方法包括但不限于蛋白質(zhì)印跡分析、蛋白質(zhì)陣列、ELISA和用于蛋白質(zhì)表達的FACS。用于確定腫瘤或癌癥是否具有升高的或高水平的RSPO表達的方法可以使用各種樣品。在一些實施方式中，所述樣品取自患有腫瘤或癌癥的受試者。在一些實施方式中，所述樣品是新鮮的腫瘤/癌樣品。在一些實施方式中，所述樣品是冷凍的腫瘤/癌樣品。在一些實施方式中，所述樣品是福爾馬林固定的石蠟包埋的樣品。在一些實施方式中，將所述樣品處理成細胞裂解物。在一些實施方式中，將所述樣品處理成DNA或RNA。還提供了治療受試者中的疾病或病癥的方法，其中所述疾病或病癥與異常(例如水平升高)β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)相關(guān)。還提供了治療受試者中的疾病或病癥的方法，其中所述疾病或病癥的特征在于干細胞和/或祖細胞的水平增加。在一些實施方式中，所述治療方法包括向受試者施用治療有效量的RSPO1結(jié)合劑。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑是抗RSPO1抗體。在一些實施方式中，所述抗RSPO1抗體是抗體h89M5-H8L5。本發(fā)明還提供了抑制細胞中β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)的方法，所述方法包括使細胞與有效量的RSPO1結(jié)合劑接觸。在某些實施方式中，所述細胞是腫瘤細胞。在某些實施方式中，所述方法是體內(nèi)方法，其中使細胞與RSPO1結(jié)合劑接觸的步驟包括向受試者施用治療有效量的RSPO1結(jié)合劑。在一些實施方式中，所述方法是體外或離體方法。在某些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑抑制β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑抑制β-連環(huán)蛋白的激活。在某些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑干擾RSPO/LGR相互作用。在某些實施方式中，LGR是LGR4、LGR5和/或LGR6。在某些實施方式中，LGR是LGR4。在某些實施方式中，LGR是LGR5。在某些實施方式中，LGR是LGR6。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑是抗RSPO1抗體。在一些實施方式中，所述抗RSPO1抗體是抗體h89M5-H8L5。還提供了本文所述的RSPO1結(jié)合劑誘導(dǎo)細胞分化的用途，包括但不限于腫瘤細胞。在一些實施方式中，誘導(dǎo)細胞分化的方法包括使細胞與有效量的本文所述的RSPO1結(jié)合劑接觸。在某些實施方式中，誘導(dǎo)受試者的腫瘤中的細胞分化的方法包括向受試者施用治療有效量的RSPO1結(jié)合劑。在一些實施方式中，在腫瘤細胞上誘導(dǎo)分化標(biāo)記物的方法包括施用治療有效量的RSPO1結(jié)合劑。在一些實施方式中，所述腫瘤是實體瘤。在一些實施方式中，所述腫瘤選自由結(jié)腸直腸腫瘤、胰腺腫瘤、肺腫瘤、卵巢腫瘤、肝腫瘤、乳腺腫瘤、腎腫瘤、前列腺腫瘤、胃腸腫瘤、黑素瘤、子宮頸腫瘤、膀胱腫瘤、成膠質(zhì)細胞瘤和頭頸部腫瘤組成的組。在某些實施方式中，所述腫瘤是卵巢腫瘤。在某些其他實施方式中，所述腫瘤是結(jié)腸腫瘤。在一些實施方式中，所述腫瘤是肺腫瘤。在某些實施方式中，所述方法是體內(nèi)方法。在某些實施方式中，所述方法是體外方法。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑是抗RSPO1抗體。在一些實施方式中，所述抗RSPO1抗體是抗體h89M5-H8L5。本發(fā)明還提供將致瘤細胞分化為非致瘤細胞的方法，所述方法包括使致瘤細胞與RSPO1結(jié)合劑接觸。在一些實施方式中，所述方法包括將RSPO1結(jié)合劑施用于具有包含致瘤細胞的腫瘤或已移除這種腫瘤的腫瘤的受試者。在某些實施方式中，所述致瘤細胞是卵巢腫瘤細胞。在某些實施方式中，所述致瘤細胞是結(jié)腸腫瘤細胞。在一些實施方式中，所述致瘤細胞是肺腫瘤細胞。在一些實施方式中，所述RSPO1結(jié)合劑是抗RSPO1抗體。在一些實施方式中，所述抗RSPO1抗體是抗體h89M5-H8L5。在某些實施方式中，用本文所述的RSPO1結(jié)合劑治療的疾病不是癌癥。例如，所述疾病可以是代謝性疾病，例如肥胖癥或糖尿病(例如，II型糖尿病)(JinT.,2008,Diabetologia,51:1771-80)?；蛘撸黾膊】梢允枪遣“Y，例如骨質(zhì)疏松癥，骨關(guān)節(jié)炎或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(CorrM.,2008,Nat.Clin.Pract.Rheumatol.,4:550-6；Dayetal.,2008,BoneJointSurg.Am.,90Suppl1:19-24)。該疾病還可以是腎病癥，例如多囊腎病(Harrisetal.,2009,Ann.Rev.Med.,60:321-337；Schmidt-Ottetal.,2008,KidneyInt.,74:1004-8；Benzingetal.,2007,J.Am.Soc.Nephrol.,18:1389-98)?；蛘?，可以治療眼部疾病，包括但不限于黃斑變性和家族性滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變(Ladetal.,2009,StemCellsDev.,18:7-16)。還可以治療心血管疾病，包括心肌梗塞，動脈粥樣硬化和瓣膜疾病(Al-AlyZ.,2008,Transl.Res.,151:233-9；Kobayashietal.,2009,Nat.CellBiol.,11:46-55；vanGijnetal.,2002,Cardiovasc.Res.,55:16-24；Christmanetal.,2008,Am.J.Physiol.HeartCirc.Physiol.,294:H2864-70)。在一些實施方式中，所述疾病是肺病癥，例如特發(fā)性肺動脈高血壓或肺纖維化(Laumannsetal.,2008,Am.J.Respir.CellMol.Biol.,2009,40:683-691；etal.,2008,PLoSONE,3:e2142)。在一些實施方式中，用RSPO1結(jié)合劑治療的疾病是肝病，例如肝硬化或肝纖維化(Chengetal.,2008,Am.J.Physiol.Gastrointest.LiverPhysiol.,294:G39-49)。本發(fā)明提供了包含本文所述的RSPO1結(jié)合劑的組合物。本發(fā)明還提供了包含本文所述的RSPO1結(jié)合劑的藥物組合物。在某些實施方式中，所述藥物組合物包含藥學(xué)上可接受的載體。這些藥物組合物可用于抑制受試者(例如，人類患者)中的腫瘤生長和治療癌癥。通過將本發(fā)明的純化抗體或試劑與藥學(xué)上可接受的載體(例如載劑或賦形劑)組合來制備用于儲存和使用的制劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員通常認為藥學(xué)上可接受的載劑、賦形劑和/或穩(wěn)定劑是制劑或藥物組合物的非活性成分。合適的藥學(xué)上可接受的載體包括但不限于無毒緩沖液，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機酸；鹽，例如氯化鈉；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑如十八烷基二甲基芐基氯化銨、六甲基氯化銨、苯扎氯銨、芐索氯銨、苯酚、丁基醇或芐醇、對羥基苯甲酸烷基酯如對羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯、鄰苯二酚、間苯二酚、環(huán)己醇、3-戊醇和間甲酚；低分子量多肽(例如，小于約10個氨基酸殘基)；蛋白質(zhì)如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；碳水化合物如單糖、二糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽抗衡離子如鈉；金屬絡(luò)合物如Zn-蛋白復(fù)合物；和非離子表面活性劑如TWEEN或聚乙二醇(PEG)。(Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,22stEdition,2012,PharmaceuticalPress,London)。本發(fā)明的藥物組合物可以以多種方式施用用于局部或全身治療?？梢酝ㄟ^表皮或透皮貼劑、軟膏、洗劑、霜劑、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體和粉末；通過吸入或吹入粉末或氣霧劑，包括通過霧化器、氣管內(nèi)和鼻內(nèi)；腸胃外，包括靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、腫瘤內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)(例如注射或輸注)或顱內(nèi)(例如鞘內(nèi)或心室內(nèi))。治療制劑可以是單位劑型。這樣的制劑包括在水或非水介質(zhì)中的片劑、丸劑、膠囊、粉劑、顆粒劑、溶液或懸浮液，或栓劑。在固體組合物如片劑中，主要活性成分與藥物載體混合。常規(guī)的制片成分包括玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂、磷酸二鈣或樹膠，以及稀釋劑(例如水)。這些可以用于形成含有本發(fā)明化合物或其無毒的藥學(xué)上可接受的鹽的均勻混合物的固體預(yù)配制組合物。然后將固體預(yù)配制組合物細分為上述類型的單位劑型。制劑或組合物的片劑、丸劑等可以被包衣或以其它方式復(fù)合以提供提供延長作用的優(yōu)點的劑型。例如，片劑或丸劑可包含被外部組分覆蓋的內(nèi)部組合物。此外，兩種組分可以通過腸溶層分開，腸溶層用于抵抗崩解并且允許內(nèi)部組分完整地通過胃或延遲釋放。各種材料可以用于這種腸溶層或包衣，這種材料包括許多聚合酸和聚合酸與諸如蟲膠、鯨蠟醇和乙酸纖維素的材料的混合物。本文所述的RSPO1結(jié)合劑也可以包埋在微膠囊中。這樣的微膠囊例如通過凝膠技術(shù)或通過界面聚合制備，例如分別在膠體藥物遞送系統(tǒng)(例如脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳劑、納米顆粒和納米膠囊等)中的羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊或在如Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,22stEdition,2012,PharmaceuticalPress,London中所述的巨乳液(macroemulsion)中。在某些實施方式中，藥物制劑包括與脂質(zhì)體復(fù)合的本發(fā)明的RSPO1結(jié)合劑(例如，抗體)。產(chǎn)生脂質(zhì)體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，一些脂質(zhì)體可以通過用包含磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂質(zhì)組合物的反相蒸發(fā)來產(chǎn)生。脂質(zhì)體可以通過規(guī)定孔徑的過濾器擠出以產(chǎn)生具有所需直徑的脂質(zhì)體。在某些實施方式中，可以產(chǎn)生包含本文所述的RSPO-1結(jié)合劑的持續(xù)釋放制劑。持續(xù)釋放制劑的合適實例包括含有RSPO結(jié)合劑(例如抗體)的固體疏水性聚合物的半透性基質(zhì)，其中基質(zhì)為成形制品(例如膜或微膠囊)的形式。持續(xù)釋放基質(zhì)的實例包括聚酯、水凝膠如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇)、聚丙交酯、L-谷氨酸和7乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、非降解性的乙烯-乙酸乙烯酯、降解性的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRONDEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林組成的可注射微球)、蔗糖乙酸異丁酸酯和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。在某些實施方式中，除了施用RSPO1結(jié)合劑(例如，抗體)之外，方法或治療還包括施用至少一種另外的治療劑。另外的治療劑可以在施用RSPO1結(jié)合劑之前、同時和/或之后施用。還提供了包含另外的治療劑的藥物組合物。在一些實施方式中，所述至少一種另外的治療劑包含1、2、3或更多種其它治療劑。使用兩種或更多種治療劑的聯(lián)合療法通常使用通過不同作用機制起作用的藥劑，盡管這不是必需的。使用具有不同作用機制的藥劑的聯(lián)合療法可導(dǎo)致加成或協(xié)同效應(yīng)。聯(lián)合療法可允許每種藥劑的劑量低于單一療法中使用的劑量，從而減少毒性副作用和/或增加藥劑的治療指數(shù)。聯(lián)合療法可以降低抗性癌細胞發(fā)育的可能性。在一些實施方式中，聯(lián)合療法包括影響(例如，抑制或殺死)非致瘤性細胞的治療劑和影響(例如，抑制或殺死)致瘤性CSCs的治療劑。在一些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑和至少一種另外的治療劑的組合產(chǎn)生加和或協(xié)同的結(jié)果。在一些實施方式中，聯(lián)合治療導(dǎo)致RSPO1結(jié)合劑的治療指數(shù)的增加。在一些實施方式中，聯(lián)合治療導(dǎo)致另外的試劑的治療指數(shù)的增加。在一些實施方式中，聯(lián)合治療導(dǎo)致RSPO1結(jié)合劑的毒性和/或副作用的降低。在一些實施方式中，聯(lián)合治療導(dǎo)致另外的藥物的毒性和/或副作用的降低?？膳cRSPO1結(jié)合劑組合使用的有用類型的治療劑包括例如抗微管蛋白劑、耳抑素(auristatin)、DNA小溝結(jié)合劑、DNA復(fù)制抑制劑、烷基化劑(例如鉑絡(luò)合物如順鉑、單(鉑)、雙(鉑)和三核鉑絡(luò)合物和卡鉑)、蒽環(huán)霉素、抗生素、抗葉酸劑、抗代謝物、化療敏化劑、多卡霉素、依托泊苷、氟化嘧啶、離子載體、來紅菌素(lexitropsins)、亞硝基脲、platinols、嘌呤抗代謝物、嘌呤霉素、放射敏化劑、類固醇、紫杉烷、拓撲異構(gòu)酶抑制劑、長春花生物堿等。在某些實施方式中，另外的治療劑是烷基化劑、抗代謝物、抗有絲分裂劑、拓撲異構(gòu)酶抑制劑或血管生成抑制劑。在一些實施方式中，另外的治療劑是鉑絡(luò)合物，例如卡鉑或順鉑。在一些實施方式中，另外的治療劑是與紫杉烷組合的鉑絡(luò)合物?？梢耘cRSPO1結(jié)合劑聯(lián)合施用的治療劑包括化療劑。因此，在一些實施方式中，所述方法或治療包括與多種不同化療劑的化療劑或混合物聯(lián)合施用本發(fā)明的RSPO1結(jié)合劑或抗體。使用RSPO1結(jié)合劑(例如，抗體)的治療可以在施用化學(xué)療法之前、同時或之后進行。聯(lián)合施用可以包括以單一藥物制劑或使用單獨的制劑共同施用，或者以任何順序但通常在一段時間內(nèi)連續(xù)施用，使得所有活性劑可以同時發(fā)揮其生物活性?？筛鶕?jù)制造商的說明書，遵循標(biāo)準(zhǔn)的護理程序，或由技術(shù)人員根據(jù)經(jīng)驗確定，使用這些化療劑的制備和給藥方案。這種化療的制備和給藥方案也描述于TheChemotherapySourceBook,4thEdition,2008,M.C.Perry,Editor,Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,PA中?？捎糜诒景l(fā)明的化療劑包括但不限于烷基化劑，例如塞替派和環(huán)磷酰胺(CYTOXAN)；烷基磺酸鹽，例如白消安、右苯丙胺和哌泊舒凡(piposufan)；氮丙啶，例如苯并多巴、卡波醌、美珠替康和烏瑞替派(uredopa)；乙烯亞胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺、三亞乙基蜜胺、三亞乙基磷酰胺、三亞乙基硫代磷酰胺和三羥甲基蜜胺；氮芥類，例如苯丁酸氮芥、氯噠嗪、膽磷酰胺、雌莫司汀、異環(huán)磷酰胺、氮芥、鹽酸氮芥、鹽酸美法侖、諾維霉素、苯芥膽甾醇(phenesterine)、潑尼氮芥、曲磷胺、尿嘧啶芥子；亞硝脲，例如卡莫司汀、氯唑菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素，例如阿克拉希新霉素、放線菌素、滅草霉素、重氮絲氨酸、博萊霉素、松節(jié)霉素、加利車霉素、卡拉霉素、洋紅霉素(caminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素、更生霉素、柔紅霉素、地多柔比星、6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、阿霉素、伊達比星、馬賽洛霉素、絲裂霉素、霉酚酸、諾加霉素、橄欖霉素、培羅霉素、波非羅霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、昆來霉素(quelamycin)、羅多比星、鏈黑菌素、鏈佐星、結(jié)核菌素、烏苯美司、凈司他丁、佐柔比星；抗代謝物，例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，例如蝶呤、甲氨蝶呤、蝶呤、三甲曲沙；嘌呤類似物，例如氟達拉濱、6-巰基嘌呤、硫柳寧、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，例如阿糖胞苷、阿扎胞苷、6-氮尿嘧啶、卡莫氟、胞嘧啶阿拉伯糖苷、二脫氧尿苷、脫氧尿苷、依諾他濱、氟尿苷、5-FU；雄激素，例如卡魯斯特、丙酸二溴托酚酮、表薄荷醇、美雄烷、睪內(nèi)酯；抗腎上腺藥，例如氨魯米特、米托坦、三氟烷；葉酸補充劑，例如亞葉酸；乙酰鎵柳酮；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；比曲比新(bestrabucil)；聯(lián)苯菊酯；依達曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛；亞胺醌(diaziquone)；elformithine；依利醋銨；依托格魯；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖；氯尼達明；美托拉宗；米托蒽醌；莫匹達醇；二胺硝吖啶(nitracrine)；噴司他??；蛋氨氮齊(phenamet)；吡柔比星；足葉草酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK；丙亞胺；(sizofuran)；鍺螺胺；細交鏈孢菌酮酸；三嗪酮；2,2',2”-三氯三乙胺；尿烷；長春地辛；達卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴衛(wèi)矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(Ara-C)；紫杉烷，例如紫杉醇(TAXOL)和多西紫杉醇(TAXOTERE)；苯丁酸氮芥；吉西他濱；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；鉑類似物如順鉑和卡鉑；長春花堿；鉑；依托泊苷(VP-16)；異環(huán)磷酰胺；絲裂霉素C；米托蒽醌；長春新堿；長春瑞濱；去甲替林；替尼泊苷；道諾霉素；氨基喋呤；伊班膦酸鹽；CPT11；拓撲異構(gòu)酶抑制劑RFS2000；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；視黃酸；埃斯波霉素；卡培他濱(XELODA)；以及任何上述的藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物?；焺┻€包括用于調(diào)節(jié)或抑制激素對腫瘤的作用的抗激素劑，例如抗雌激素，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制4(5)-咪唑、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮和托瑞米芬(FARESTON)；和抗雄激素，例如氟他胺、尼魯米特、比卡魯胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及任何上述的藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。在某些實施方式中，另外的治療劑是順鉑。在某些實施方式中，另外的治療劑是卡鉑。在某些實施方式中，另外的治療劑是紫杉醇。在一些實施方式中，方法包括施用抗RSPO1抗體h89M5-H8L5與順鉑的組合。在某些實施方式中，化療劑是拓撲異構(gòu)酶抑制劑。拓撲異構(gòu)酶抑制劑是干擾拓撲異構(gòu)酶(例如拓撲異構(gòu)酶I或II)作用的化療劑。拓撲異構(gòu)酶抑制劑包括但不限于鹽酸多柔比星、檸檬酸柔紅霉素、鹽酸米托蒽醌、放線菌素D、依托泊苷、鹽酸托泊替康、替尼泊苷(VM-26)和伊立替康，以及它們的任何藥學(xué)上可接受的鹽，酸或衍生物。在一些實施方式中，另外的治療劑是伊立替康。因此，在一些實施方式中，方法包括施用RSPO1結(jié)合劑與拓撲異構(gòu)酶抑制劑的組合。在一些實施方式中，方法包括聯(lián)合伊立替康施用抗RSPO1抗體h89M5-H8L5。在某些實施方式中，化療劑是抗代謝物。抗代謝物是具有類似于正常生化反應(yīng)所需的代謝物的結(jié)構(gòu)的化學(xué)品，但是足夠不同以干擾細胞的一種或多種正常功能，例如細胞分裂?？勾x物包括但不限于吉西他濱、氟尿嘧啶、卡培他濱(XELODA)、甲氨蝶呤鈉、雷利曲沙、培美曲塞、替加氟、胞嘧啶阿拉伯糖苷、硫鳥嘌呤、5-氮雜胞苷、6-巰基嘌呤、硫唑嘌呤、6-硫鳥嘌呤、噴司他丁、磷酸氟達拉濱和克拉屈濱，以及它們的任何藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。在某些實施方式中，另外的治療劑是吉西他濱。因此，在一些實施方式中，方法包括施用RSPO1結(jié)合劑與抗代謝物的組合。在一些實施方式中，方法包括聯(lián)合吉西他濱施用抗RSPO1抗體h89M5-H8L5。在某些實施方式中，化療劑是抗有絲分裂劑，包括但不限于結(jié)合微管蛋白的試劑。在一些實施方式中，所述試劑是紫杉烷。在某些實施方式中，所述試劑是紫杉醇或多西紫杉醇，或紫杉醇或多西他賽的藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。在某些實施方式中，試劑是紫杉醇(TAXOL)、多西他賽(TAXOTERE)、白蛋白結(jié)合的紫杉醇(ABRAXANE)、DHA-紫杉醇或PG-紫杉醇。在某些替代實施方式中，抗有絲分裂劑包括長春花生物堿，例如長春新堿、長春堿、長春瑞濱或長春地辛，或其藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。在一些實施方式中，抗有絲分裂劑是驅(qū)動蛋白Eg5的抑制劑或有絲分裂激酶例如AuroraA或Plk1的抑制劑。在某些實施方式中，其中與RSPO結(jié)合劑聯(lián)合施用的化療劑是抗有絲分裂劑，所治療的癌癥或腫瘤是乳腺癌或乳腺腫瘤。在一些實施方式中，另外的治療劑包括試劑例如小分子。例如，治療可包括聯(lián)合施用本發(fā)明的RSPO1結(jié)合劑(例如抗體)與作為針對其它腫瘤相關(guān)抗原的抑制劑的小分子，所述腫瘤相關(guān)抗原包括但不限于EGFR、ErbB2、HER2和/或VEGF。在某些實施方式中，另外的治療劑是抑制癌癥干細胞途徑的小分子。在一些實施方式中，另外的治療劑是Notch途徑的抑制劑。在一些實施方式中，另外的治療劑是Wnt途徑的抑制劑。在一些實施方式中，另外的治療劑是BMP途徑的抑制劑。在一些實施方式中，另外的治療劑是抑制β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)的分子。在一些實施方式中，另外的治療劑包括生物分子，例如抗體。例如，治療可包括將本發(fā)明的RSPO1結(jié)合劑(例如抗體)與針對其它腫瘤相關(guān)抗原的其它抗體聯(lián)合施用，其它抗體包括但不限于結(jié)合EGFR、ErbB2、HER2和/或VEGF。在一些實施方式中，另外的治療劑是第二抗RSPO抗體。在一些實施方式中，另外的治療劑是與抗RSPO1抗體組合使用的抗RSP02抗體、抗RSPO3抗體和/或抗RSPO4抗體。在某些實施方式中，另外的治療劑是對抗癌干細胞標(biāo)記物特異的抗體。在一些實施方式中，另外的治療劑是結(jié)合Notch途徑的組分的抗體。在一些實施方式中，另外的治療劑是結(jié)合Wnt通路的組分的抗體。在某些實施方式中，另外的治療劑是抑制癌癥干細胞途徑的抗體。在一些實施方式中，另外的治療劑是Notch途徑的抑制劑。在一些實施方式中，另外的治療劑是Wnt途徑的抑制劑。在一些實施方式中，另外的治療劑是BMP途徑的抑制劑。在一些實施方式中，另外的治療劑是抑制β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)的抗體。在某些實施方式中，另外的治療劑是作為血管生成抑制劑的抗體(例如，抗VEGF或VEGF受體抗體)。在某些實施方式中，另外的治療劑是貝伐單抗(AVASTIN)、曲妥單抗(HERCEPTIN)、帕尼單抗(VECTIBIX)或西妥昔單抗(ERBITUX)。在一些實施方式中，本文所述的方法包括施用治療有效量的RSPO1結(jié)合劑與Wnt途徑抑制劑的組合。在一些實施方式中，Wnt途徑抑制劑是卷曲蛋白(FZD)蛋白結(jié)合劑，“FZD結(jié)合劑”。FZD結(jié)合劑的非限制性實例可以在美國專利號7,982,013中找到。FZD結(jié)合劑可以包括但不限于抗FZD抗體。在一些實施方式中，方法包括施用RSPO1結(jié)合劑與抗FZD抗體的組合。在一些實施方式中，方法包括施用與抗FZD抗體18R5組合的RSPO1結(jié)合劑。在一些實施方式中，Wnt途徑抑制劑是Wnt蛋白結(jié)合劑，“Wnt結(jié)合劑”。Wnt結(jié)合劑的非限制性實例可以在美國專利號7,723,477和7,947,277；以及國際公開WO2011/088127和WO2011/088123中找到。Wnt結(jié)合劑可以包括但不限于抗Wnt抗體和FZD-Fc可溶性受體。在一些實施方式中，方法包括施用RSPO1結(jié)合劑與FZD-Fc可溶性受體的組合。在一些實施方式中，方法包括施用RSPO1結(jié)合劑與FZD8-Fc可溶性受體的組合。在一些實施方式中，方法包括施用RSPO1結(jié)合劑與抗FZD抗體的組合。在一些實施方式中，方法包括聯(lián)合施用抗RSPO1抗體h89M5-H8L5與抗FZD抗體。在一些實施方式中，方法包括聯(lián)合施用抗RSPO1抗體h89M5-H8L5與抗FZD抗體18R5。在一些實施方式中，方法包括與FZD-Fc可溶性受體聯(lián)合施用抗RSPO1抗體h89M5-H8L5。在一些實施方式中，方法包括與FZD8-Fc可溶性受體聯(lián)合施用抗RSPO1抗體h89M5-H8L5。此外，用本文所述的RSPO1結(jié)合劑治療可包括與其它生物分子(例如一種或多種細胞因子(例如淋巴因子，白細胞介素，腫瘤壞死因子和/或生長因子))的聯(lián)合治療，或可伴隨手術(shù)切除腫瘤、癌細胞或治療醫(yī)生認為必要的任何其他治療。在某些實施方式中，治療包括與放射治療組合施用本發(fā)明的RSPO1結(jié)合劑(例如抗體)。使用RSPO結(jié)合劑的治療可以在施用放射治療之前、同時或之后進行。這種放射治療的給藥計劃可以由技術(shù)醫(yī)生確定。應(yīng)當(dāng)理解，RSPO1結(jié)合劑和至少一種另外的治療劑的組合可以以任何順序或同時施用。在一些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑將施用于先前已經(jīng)用第二治療劑治療的患者。在某些其它實施方式中，RSPO1結(jié)合劑和第二治療劑將基本上同時或同時施用。例如，可以在經(jīng)歷用第二治療劑(例如化學(xué)療法)的治療過程的同時向受試者給予RSPO1結(jié)合劑(例如，抗體)。在某些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑將在用第二治療劑治療的1年內(nèi)施用。在某些替代性實施方式中，RSPO1結(jié)合劑將在用第二治療劑的任何治療的10、8、6、4或2個月內(nèi)施用。在某些其它實施方式中，RSPO1結(jié)合劑將在使用第二治療劑的任何治療的第4、3、2或1周內(nèi)施用。在一些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑將在使用第二治療劑的任何治療的5、4、3、2或1天內(nèi)施用。還應(yīng)當(dāng)理解，兩種(或更多種)藥劑或治療可以在幾小時或幾分鐘內(nèi)(即基本上同時)給予受試者。在一些實施方式中，治療或給藥方案可以限于特定數(shù)量的給藥或“周期”?！爸芷凇笨梢允潜绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知或通常用于標(biāo)準(zhǔn)護理治療劑的給藥方案。例如，紫杉醇的一個周期可以是一個月的周期內(nèi)一周一次施用三周(每月有一周沒有施用)。在本文所述的方法的一些實施方式中，RSPO1結(jié)合劑被施用2、3、4、5、6、7、8或更多個周期。在本文所述的方法的一些實施方式中，另外的治療劑施用2、3、4、5、6、7、8或更多個周期。對于疾病的治療，本發(fā)明的RSPO1結(jié)合劑(例如，抗體)的適當(dāng)劑量取決于待治療的疾病的類型、疾病的嚴重程度和病程、疾病的反應(yīng)性、是否出于治療或預(yù)防目的施用RSPO1結(jié)合劑或抗體、先前的治療、患者的臨床史等，所有這些都由治療醫(yī)師決定。RSPO1結(jié)合劑或抗體可以施用一次或持續(xù)幾天至幾個月的一系列治療，或直到實現(xiàn)治愈或?qū)崿F(xiàn)疾病狀態(tài)的減弱(例如腫瘤尺寸減小)。最佳給藥方案可以根據(jù)患者體內(nèi)藥物累積的測量來計算，并且將根據(jù)單個抗體或試劑的相對效力而變化。施用醫(yī)師可以容易地確定最佳劑量、給藥方法和重復(fù)率。在某些實施方式中，劑量為0.01μg至100mg/kg體重，0.1μg至100mg/kg體重，1μg至100mg/kg體重，1mg至100mg/kg體重，1mg至80mg/kg體重，10mg至100mg/kg體重，10mg至75mg/kg體重或10mg至50mg/kg體重。在某些實施方式中，抗體或其它RSPO1結(jié)合劑的劑量為約0.1mg至約20mg/kg體重。在某些實施方式中，劑量可以每天、每周、每月或每年給予一次或多次。在某些實施方式中，抗體或其它RSPO1結(jié)合劑每周給予一次，每兩周一次或每三周一次。在一些實施方式中，一種RSPO1結(jié)合劑(例如抗體)可以以初始較高的“加載”劑量給藥，接著是一個或多個更低的劑量。在一些實施方式中，給藥的頻率也可以改變。在一些實施方式中，給藥方案可以包括施用初始劑量，隨后是每周一次、每兩周一次、每三周一次或每月一次的額外劑量(或“維持”劑量)。例如，給藥方案可以包括給予初始加載劑量，然后給予例如初始劑量的一半的每周維持劑量?；蛘呓o藥方案可以包括給予初始加載劑量，然后給予維持劑量，例如每隔一周初始劑量的一半?；蛘呓o藥方案可以包括施用三個初始劑量3周，然后每隔一周施用例如相同量的維持劑量。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，施用任何治療劑可能導(dǎo)致副作用和/或毒性。在一些情況下，副作用和/或毒性如此嚴重，以至阻止以治療有效劑量施用特定藥劑。在一些情況下，藥物治療必須停止，并且可以嘗試其他試劑。然而，相同治療類別中的許多藥劑經(jīng)常顯示類似的副作用和/或毒性，這意味著患者必須停止治療，或者如果可能的話，經(jīng)受與治療劑相關(guān)的令人不快的副作用。因此，本發(fā)明提供了治療受試者中的癌癥的方法，包括使用間歇給藥策略來施用一種或多種試劑，其可以減少與施用RSPO1結(jié)合劑、化療劑等相關(guān)的副作用和/或毒性。在一些實施方式中，用于治療人受試者中的癌癥的方法包括向受試者施用治療有效劑量的RSPO1結(jié)合劑與治療有效劑量的化療劑的組合，其中一種或兩種試劑根據(jù)間歇給藥策略進行施用。在一些實施方式中，間歇給藥策略包括向受試者施用初始劑量的RSPO1結(jié)合劑，并且約每2周一次施用隨后劑量的RSPO1結(jié)合劑。在一些實施方式中，間歇給藥策略包括向受試者施用初始劑量的RSPO1結(jié)合劑，并且約每3周一次施用隨后劑量的RSPO1結(jié)合劑。在一些實施方式中，間歇給藥策略包括向受試者施用初始劑量的RSPO1結(jié)合劑，并且約每4周一次施用隨后劑量的RSPO1結(jié)合劑。在一些實施方式中，使用間歇給藥策略施用RSPO1結(jié)合劑，并每周施用化療劑。V.包含RSPO1結(jié)合劑的試劑盒本發(fā)明提供了包含本文所述的RSPO1結(jié)合劑(例如抗體)并且可以用于執(zhí)行本文所述的方法的試劑盒。在某些實施方式中，試劑盒在一個或多個容器中包含至少一種針對人RSPO1的純化抗體。在一些實施方式中，所述試劑盒包含進行檢測測定而言必要和/或充分的所有組分，包括所有對照，進行測定的說明書，以及用于分析和呈現(xiàn)結(jié)果的任何必要的軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地認識到，本發(fā)明公開的RSPO1結(jié)合劑可以容易地并入本領(lǐng)域熟知的已建立的試劑盒形式之一。還提供了包含RSPO1結(jié)合劑(例如抗RSPO1抗體)以及至少一種另外的治療劑的試劑盒。在某些實施方式中，第二(或更多)治療劑是化療劑。在某些實施方式中，第二(或更多)治療劑是Wnt途徑抑制劑。在某些實施方式中，第二(或更多)治療劑是血管生成抑制劑。本公開的實施方式可以通過參考以下非限制性實施例進一步定義，其詳細描述本公開的某些抗體的制備和使用本公開的抗體的方法。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，在不脫離本公開的范圍的情況下，可以實踐對材料和方法的許多修改。實施例實施例1產(chǎn)生抗RSPO1單克隆抗體已經(jīng)描述了抗RSPO1抗體的產(chǎn)生(參見例如美國專利號8,802,097和國際公開號WO2013/012747)。表達抗RSPO1抗體89M5的雜交瘤細胞系在布達佩斯條約的條件下于2011年6月30日保藏于ATCC，10801UniversityBoulevard,Manassas,VA,USA，并指定ATCC保藏號為PTA-11970。89M5的重鏈和輕鏈CDR列于本文表1中。89M5的重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列是SEQIDNO：12和SEQIDNO：13。89M5的重鏈和輕鏈的氨基酸序列是SEQIDNO：14和SEQIDNO：16；89M5的重鏈和輕鏈的核苷酸序列是SEQIDNO：20和SEQIDNO：21(具有預(yù)測的信號序列)。產(chǎn)生抗RSPO1抗體89M5的第一代人源化版本并命名為h89M5-H2L2。隨后，當(dāng)通過尺寸排阻色譜(SEC)表征時，觀察到抗RSPO1抗體h89M5-H2L2具有異常抗體譜。此外，當(dāng)配制用于體內(nèi)使用時，觀察到該抗體具有低于期望的低溶解性。因此，產(chǎn)生并表征了89M5的另外的第二代人源化形式。編碼第二代人源化抗體h89M5-H8L5的重鏈和輕鏈的質(zhì)粒在布達佩斯條約的條件下于2014年8月15日保藏于ATCC，10801UniversityBoulevard,Manassas,VA,USA，并指定ATCC保藏號為PTA-121494和PTA-121495。第一代人源化抗RSPO1抗體h89M5-H2L2和第二代人源化抗RSPO1抗體h89M5-H8L5的重鏈和輕鏈之間的氨基酸序列差異顯示于圖1A和1B中。這些抗體在其重鏈(H2和H8)和它們的輕鏈(L2和L5)的序列方面不同，但保留相同的重鏈和輕鏈CDR氨基酸序列。實施例2抗RSPO1抗體的FACS結(jié)合用編碼FLAG-RSPO1furin-CD4TM-GFP的表達載體瞬時轉(zhuǎn)染HEK-293細胞。FLAG-RSPO1furin-CD4TM-GFP是能夠使人RSPO1的N-末端Furin樣結(jié)構(gòu)域的細胞表面表達的嵌合融合蛋白。在第一代人源化抗RSPO1抗體h89M5-H2L2和第二代人源化抗RSPO1抗體h89M5-H8L5存在下溫育FLAG-RSPO1furin-CD4TM-GFP轉(zhuǎn)染的細胞。檢測每種抗體的系列稀釋液結(jié)合RSPO1表達細胞的能力。將細胞用別藻藍蛋白(APC)綴合的抗IgG染色以檢測由抗體結(jié)合的細胞。在FACSCalibur儀器(BDBiosciences，SanJose，CA)上分析細胞，并使用FlowJo軟件處理數(shù)據(jù)。如圖2所示，該研究表明第二代人源化抗RSPO1抗體h89M5-H8L5以劑量依賴性方式結(jié)合人RSPO1，并具有與第一代抗RSPO1抗體h89M5-H2L2相似的活性。實施例3抗RSPO1抗體的尺寸排阻色譜法抗RSPO1抗體OMP-89M5的人源化形式進行尺寸排阻色譜(SEC)分析。尺寸排阻色譜法可用于通過區(qū)分單體(即完整)抗體與較小抗體片段和/或較大抗體聚集體來評估抗體的純度。制備第一代人源化抗體h89M5-H2L2，純化，并在50mM組氨酸，2.5％PEG400，pH6.0中以20.9mg/ml的濃度配制。第二代人源化抗體h89M5-H8L5從穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞庫中表達，通過蛋白A色譜純化，并且在0.1M甘氨酸/BisTris，pH5.0中以2.8mg/ml的濃度配制。使用具有雙波長UV檢測器的WatersUPLC系統(tǒng)(AcquityUPLCH-classBiosystem)分析樣品h89M5-H2L2和h89M5-H8L5。在SEC緩沖液(100mM磷酸鈉，150mMNaCl，pH6.8)中制備濃度為1mg/ml的樣品。將10μl每種樣品注射到WatersAcquityUPLCBEH200SEC1.7μm4.6×150mm柱上，并以0.4ml/min等度(isocratically)運行7分鐘。作為標(biāo)準(zhǔn)品運行BioRad分子量(MW)標(biāo)記物。用UV檢測器在215nm檢測蛋白質(zhì)峰。圖3顯示了h89M5-H2L2和h89M5-H8L5的UV215nm波長軌跡的重疊圖。該圖還顯示了MW標(biāo)準(zhǔn)物的UV跡線，MW標(biāo)準(zhǔn)物是MW為1350至670,000的蛋白質(zhì)的混合物(BioRadGelFiltrationStandards，目錄號151-1901)。顯示了在大約MW150,000的IgG標(biāo)準(zhǔn)峰。如實施例1所述，觀察到第一代抗體h89R5-H2L2具有比IgG標(biāo)準(zhǔn)峰晚得多洗脫的主峰，表明分子量比預(yù)期的150,000更低。觀察到第二代抗體h89R5-H8L5具有更接近預(yù)期MW150,000的主峰。雖然峰比IgG標(biāo)準(zhǔn)峰洗脫的晚，但是h89M5-H8L5峰洗脫時間落在對于其它抗體觀察到的范圍內(nèi)，這可以至少部分地通過每個抗體的流體動力學(xué)半徑的差異來解釋。第一代抗體h89M5-H2L2的洗脫曲線顯著超出正常范圍。應(yīng)當(dāng)注意，第二代抗體h89M5-H8L5使用包括質(zhì)譜和非還原SDS-PAGE的其它測定法表征，并且顯示具有約150,000的分子量。重要的是，第二代抗體h89M5-H8L5也顯示具有增加的溶解性，并且可以以更高的濃度配制用于體內(nèi)使用。實施例4抗RSPO1抗體的結(jié)合測定將高結(jié)合96孔板(NalgeNuncInternational)用包被緩沖液(1XPBS，pH7.4)中的0.5μg/ml重組人RSPO1(R&DSystems)在2-8℃包被過夜。在每個步驟后，用300μl/孔的1XPBS，0.05％Tween-20，pH7.4將板洗滌3-6次。包被后，將板在室溫(19-25℃)下用250μl/孔的封閉緩沖液(1XPBS，0.1％明膠，0.1％TWEEN-20，pH7.4)溫育60分鐘±10分鐘。洗滌板，并在室溫下用100μl/孔的第一代人源化抗RSPO1抗體h89M5-H2L2和第二代人源化抗體h89M5-H8L5溫育120分鐘±10分鐘。第一代人源化抗RSPO1抗體h89M5-H2L2用作參照標(biāo)準(zhǔn)品和陽性對照?？贵w以2.5μg/ml的初始濃度制備，并且連續(xù)稀釋3倍，范圍為2.5μg/ml至0.014ng/ml。每個樣品一式兩份測試，實驗進行3次。為了檢測人源化抗RSPO1抗體與RSPO1的結(jié)合，將羊F(ab)’2抗人IgGFc-HRP綴合物(JacksonImmunoResearch)在封閉緩沖液中稀釋，并在室溫下以100μl/孔加入60分鐘±10分鐘。將板用TMB底物(ThermoScientificPierce)顯色，并用2MH2SO4終止反應(yīng)。使用ELISA平板讀數(shù)器(MolecularDevices)，通過在450nm和650nm處的吸光度測量抗體與RSPO1的結(jié)合。使用4-參數(shù)曲線擬合分析結(jié)果，并通過比較參照物與樣品的EC50值來確定相對結(jié)合效力。發(fā)現(xiàn)第二代人源化抗RSPO1抗體h89M5-H8L5的結(jié)合效力優(yōu)于第一代抗體h89M5-H2L2的(120％平均效價)。應(yīng)當(dāng)理解，本文所述的實施例和實施方式僅用于說明性目的，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員將建議對其進行各種修改或改變，并且這些修改或改變包括在本申請的精神和范圍內(nèi)。包括本文引用的多核苷酸和多肽序列的所有出版物、專利、專利申請、互聯(lián)網(wǎng)站點和登錄號/數(shù)據(jù)庫序列通過引用整體并入本文用于所有目的、程度如同每個單獨的出版物、專利、專利申請、互聯(lián)網(wǎng)站點或登錄號/數(shù)據(jù)庫序列被具體地和單獨地指示為通過引用并入。以下是本申請中公開的序列：具有預(yù)測信號序列(下劃線)的人RSPO1蛋白序列(SEQIDNO：1)MRLGLCVVALVLSWTHLTISSRGIKGKRQRRISAEGSQACAKGCELCSEVNGCLKCSPKLFILLERNDIRQVGVCLPSCPPGYFDARNPDMNKCIKCKIEHCEACFSHNFCTKCKEGLYLHKGRCYPACPEGSSAANGTMECSSPAQCEMSEWSPWGPCSKKQQLCGFRRGSEERTRRVLHAPVGDHAACSDTKETRRCTVRRVPCPEGQKRRKGGQGRRENANRNLARKESKEAGAGSRRRKGQQQQQQQGTVGPLTSAGPA人RSPO1Furin-樣結(jié)構(gòu)域1(SEQIDNO：2)AEGSQACAKGCELCSEVNGCLKCSPKLFILLERNDIRQVGVCLPSCPPGYFD人RSPO1Furin-樣結(jié)構(gòu)域2(SEQIDNO：3)MNKCIKCKIEHCEACFSHNFCTKCKEGLYLHKGRCYPACPEGSSA人RSPO1血小板反應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO：4)QCEMSEWSPWGPCSKKQQLCGFRRGSEERTRRVLHAPVGDHAACSDTKETRRCTVRRVPCP人RSPO1氨基酸31-263(SEQIDNO：5)RISAEGSQACAKGCELCSEVNGCLKCSPKLFILLERNDIRQVGVCLPSCPPGYFDARNPDMNKCIKCKIEHCEACFSHNFCTKCKEGLYLHKGRCYPACPEGSSAANGTMECSSPAQCEMSEWSPWGPCSKKQQLCGFRRGSEERTRRVLHAPVGDHAACSDTKETRRCTVRRVPCPEGQKRRKGGQGRRENANRNLARKESKEAGAGSRRRKGQQQQQQQGTVGPLTSAGPA89M5重鏈CDR1(SEQIDNO:6)TGYTMH89M5重鏈CDR2(SEQIDNO:7)GINPNNGGTTYNQNFKG89M5重鏈CDR3(SEQIDNO:8)KEFSDGYYFFAY89M5輕鏈CDR1(SEQIDNO:9)KASQDVIFAVA89M5輕鏈CDR2(SEQIDNO:10)WASTRHT89M5輕鏈CDR3(SEQIDNO:11)QQHYSTPW89M5重鏈可變區(qū)(SEQIDNO:12)EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYTFTGYTMHWVRQSHGKTLEWIGGINPNNGGTTYNQNFKGKATLTVEKSSTTAYLELRSLTSEDSALYYCARKEFSDGYYFFAYWGQGTLVTVSA89M5輕鏈可變區(qū)(SEQIDNO:13)DIVMTQSHKFMSTSVGDRVNITCKASQDVIFAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSVSGTDYTLTISSVQAEDLALYYCQQHYSTPWTFGGGTKLEIK具有預(yù)測信號序列(下劃線)的89M5重鏈氨基酸序列(SEQIDNO:14)MGWSWIFLFLLSGTAGVLSEVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYTFTGYTMHWVRQSHGKTLEWIGGINPNNGGTTYNQNFKGKATLTVEKSSTTAYLELRSLTSEDSALYYCARKEFSDGYYFFAYWGQGTLVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK不具有預(yù)測信號序列的89M5重鏈氨基酸序列(SEQIDNO:15)EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYTFTGYTMHWVRQSHGKTLEWIGGINPNNGGTTYNQNFKGKATLTVEKSSTTAYLELRSLTSEDSALYYCARKEFSDGYYFFAYWGQGTLVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK具有預(yù)測信號序列(下劃線)的89M5輕鏈氨基酸序列(SEQIDNO:16)MGFKMESQIQAFVFVFLWLSGVDGDIVMTQSHKFMSTSVGDRVNITCKASQDVIFAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSVSGTDYTLTISSVQAEDLALYYCQQHYSTPWTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC不具有預(yù)測信號序列的89M5輕鏈氨基酸序列(SEQIDNO:17)DIVMTQSHKFMSTSVGDRVNITCKASQDVIFAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSVSGTDYTLTISSVQAEDLALYYCQQHYSTPWTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC89M5重鏈可變區(qū)核苷酸序列(SEQIDNO:18)GAGGTCCAGCTGCAACAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGACTTCTGGATACACATTCACTGGATACACCATGCACTGGGTGAGGCAGAGCCATGGAAAGACCCTTGAGTGGATTGGAGGTATTAATCCTAACAATGGTGGTACTACTTACAACCAGAACTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGAGAAGTCCTCCACCACAGCCTACTTGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGATTCTGCACTCTATTACTGTGCAAGAAAGGAGTTCTCTGATGGTTACTACTTTTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA89M5輕鏈可變區(qū)核苷酸序列(SEQIDNO:19)GACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTGGGAGACAGGGTCAACATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTGATTTTTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGACAATCTCCTAAACTACTGATTTACTGGGCATCCACCCGGCACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGTATCTGGGACAGATTATACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCACTTTATTACTGTCAGCAACATTATAGCACTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA89M5重鏈核苷酸序列(SEQIDNO:20)ATGGGATGGAGCTGGATCTTTCTCTTTCTCCTGTCAGGAACTGCAGGTGTCCTCTCTGAGGTCCAGCTGCAACAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGACTTCTGGATACACATTCACTGGATACACCATGCACTGGGTGAGGCAGAGCCATGGAAAGACCCTTGAGTGGATTGGAGGTATTAATCCTAACAATGGTGGTACTACTTACAACCAGAACTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGAGAAGTCCTCCACCACAGCCTACTTGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGATTCTGCACTCTATTACTGTGCAAGAAAGGAGTTCTCTGATGGTTACTACTTTTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGGACACAGATGGCTCTTACTTCGTCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTAAATGATAA89M5輕鏈核苷酸序列(SEQIDNO:21)ATGGGCTTCAAGATGGAGTCACAGATTCAGGCATTTGTATTCGTGTTTCTCTGGTTGTCTGGTGTTGACGGAGACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTGGGAGACAGGGTCAACATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTGATTTTTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGACAATCTCCTAAACTACTGATTTACTGGGCATCCACCCGGCACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGTATCTGGGACAGATTATACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCACTTTATTACTGTCAGCAACATTATAGCACTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTAGTGA人源化h89M5-H2L2重鏈可變區(qū)氨基酸序列(SEQIDNO:22)QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTGYTMHWVRQAPGQRLEWMGGINPNNGGTTYNQNFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARKEFSDGYYFFAYWGQGTLVTVSSh89M5-H2L2輕鏈可變區(qū)氨基酸序列(SEQIDNO:23)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVIFAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSTPWTFGGGTKVEIK具有預(yù)測信號序列(下劃線)的h89M5-H2L2重鏈氨基酸序列(SEQIDNO:24)MDWTWRILFLVAAATGAHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTGYTMHWVRQAPGQRLEWMGGINPNNGGTTYNQNFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARKEFSDGYYFFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK不具有預(yù)測信號序列的h89M5-H2L2重鏈氨基酸序列(SEQIDNO:25)QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTGYTMHWVRQAPGQRLEWMGGINPNNGGTTYNQNFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARKEFSDGYYFFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK具有預(yù)測信號序列(下劃線)的h89M5-H2L2輕鏈氨基酸序列(SEQIDNO:26)MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVIFAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSTPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSNTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC不具有預(yù)測信號序列的h89M5-H2L2輕鏈氨基酸序列(SEQIDNO:27)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVIFAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSG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cggcacact240ggagtccctgatcgcttcacaggcagtgtatctgggacagattatactctcaccatcagc300agtgtgcaggctgaagacctggcactttattactgtcagcaacattatagcactccgtgg360acgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaacgggctgatgctgcaccaactgtatcc420atcttcccaccatccagtgagcagttaacatctggaggtgcctcagtcgtgtgcttcttg480aacaacttctaccccaaagacatcaatgtcaagtggaagattgatggcagtgaacgacaa540aatggcgtcctgaacagttggactgatcaggacagcaaagacagcacctacagcatgagc600agcaccctcacgttgaccaaggacgagtatgaacgacataacagctatacctgtgaggcc660actcacaagacatcaacttcacccattgtcaagagcttcaacaggaatgagtgttagtga720<210>22<211>121<212>PRT<213>人工序列<220><223>人源化h89M5-H2L2重鏈可變區(qū)氨基酸序列<400>22GlnValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlyAla151015SerValLysValSerCysLysThrSerGlyTyrThrPheThrGlyTyr202530ThrMetHisTrpValArgGlnAlaProGlyGlnArgLeuGluTrpMet354045GlyGlyIleAsnProAsnAsnGlyGlyThrThrTyrAsnGlnAsnPhe505560LysGlyArgValThrIleThrArgAspThrSerAlaSerThrAlaTyr65707580MetGluLeuSerSerLeuArgSerGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaArgLysGluPheSerAspGlyTyrTyrPhePheAlaTyrTrpGly100105110GlnGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>23<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>h89M5-H2L2輕鏈可變區(qū)氨基酸序列<400>23AspIleGlnMetThrGlnSerProSerSerLeuSerAlaSerValGly151015AspArgValThrIleThrCysLysAlaSerGlnAspValIlePheAla202530ValAlaTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAlaProLysLeuLeuIle354045TyrTrpAlaSerThrArgHisThrGlyValProSerArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspTyrThrLeuThrIleSerSerLeuGlnPro65707580GluAspPheAlaThrTyrTyrCysGlnGlnHisTyrSerThrProTrp859095ThrPheGlyGlyGlyThrLysValGluIleLys100105<210>24<211>466<212>PRT<213>人工序列<220><223>h89M5-H2L2重鏈氨基酸序列<220><221>信號<222>(1)..(19)<223>預(yù)測信號序列<400>24MetAspTrpThrTrpArgIleLeuPheLeuValAlaAlaAlaThrGly151015AlaHisSerGlnValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLys202530ProGlyAlaSerValLysValSerCysLysThrSerGlyTyrThrPhe354045ThrGlyTyrThrMetHisTrpValArgGlnAlaProGlyGlnArgLeu505560GluTrpMetGlyGlyIleAsnProAsnAsnGlyGlyThrThrTyrAsn65707580GlnAsnPheLysGlyArgValThrIleThrArgAspThrSerAlaSer859095ThrAlaTyrMetGluLeuSerSerLeuArgSerGluAspThrAlaVal100105110TyrTyrCysAlaArgLysGluPheSerAspGlyTyrTyrPhePheAla115120125TyrTrpGlyGlnGlyThrLeuValThrValSerSerAlaSerThrLys130135140GlyProSerValPheProLeuAlaProCysSerArgSerThrSerGlu145150155160SerThrAlaAlaLeuGlyCysLeuValLysAspTyrPheProGluPro165170175ValThrValSerTrpAsnSerGlyAlaLeuThrSerGlyValHisThr180185190PheProAlaValLeuGlnSerSerGlyLeuTyrSerLeuSerSerVal195200205ValThrValProSerSerAsnPheGlyThrGlnThrTyrThrCysAsn210215220ValAspHisLysProSerAsnThrLysValAspLysThrValGluArg225230235240LysCysCysValGluCysProProCysProAlaProProValAlaGly245250255ProSerValPheLeuPheProProLysProLysAspThrLeuMetIle260265270SerArgThrProGluValThrCysValValValAspValSerHisGlu275280285AspProGluValGlnPheAsnTrpTyrValAspGlyValGluValHis290295300AsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnPheAsnSerThrPheArg305310315320ValValSerValLeuThrValValHisGlnAspTrpLeuAsnGlyLys325330335GluTyrLysCysLysValSerAsnLysGlyLeuProAlaProIleGlu340345350LysThrIleSerLysThrLysGlyGlnProArgGluProGlnValTyr355360365ThrLeuProProSerArgGluGluMetThrLysAsnGlnValSerLeu370375380ThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSerAspIleAlaValGluTrp385390395400GluSerAsnGlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThrThrProProMet405410415LeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSerLysLeuThrValAsp420425430LysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnValPheSerCysSerValMetHis435440445GluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeuSerLeuSerPro450455460GlyLys465<210>25<211>447<212>PRT<213>人工序列<220><223>不具有預(yù)測信號序列的h89M5-H2L2重鏈氨基酸序列<400>25GlnValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlyAla151015SerValLysValSerCysLysThrSerGlyTyrThrPheThrGlyTyr202530ThrMetHisTrpValArgGlnAlaProGlyGlnArgLeuGluTrpMet354045GlyGlyIleAsnProAsnAsnGlyGlyThrThrTyrAsnGlnAsnPhe505560LysGlyArgValThrIleThrArgAspThrSerAlaSerThrAlaTyr65707580MetGluLeuSerSerLeuArgSerGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaArgLysGluPheSerAspGlyTyrTyrPhePheAlaTyrTrpGly100105110GlnGlyThrLeuValThrValSerSerAlaSerThrLysGlyProSer115120125ValPheProLeuAlaProCysSerArgSerThrSerGluSerThrAla130135140AlaLeuGlyCysLeuValLysAspTyrPheProGluProValThrVal145150155160SerTrpAsnSerGlyAlaLeuThrSerGlyValHisThrPheProAla165170175ValLeuGlnSerSerGlyLeuTyrSerLeuSerSerValValThrVal180185190ProSerSerAsnPheGlyThrGlnThrTyrThrCysAsnValAspHis195200205LysProSerAsnThrLysValAspLysThrValGluArgLysCysCys210215220ValGluCysProProCysProAlaProProValAlaGlyProSerVal225230235240PheLeuPheProProLysProLysAspThrLeuMetIleSerArgThr245250255ProGluValThrCysValValValAspValSerHisGluAspProGlu260265270ValGlnPheAsnTrpTyrValAspGlyValGluValHisAsnAlaLys275280285ThrLysProArgGluGluGlnPheAsnSerThrPheArgValValSer290295300ValLeuThrValValHisGlnAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLys305310315320CysLysValSerAsnLysGlyLeuProAlaProIleGluLysThrIle325330335SerLysThrLysGlyGlnProArgGluProGlnValTyrThrLeuPro340345350ProSerArgGluGluMetThrLysAsnGlnValSerLeuThrCysLeu355360365ValLysGlyPheTyrProSerAspIleAlaValGluTrpGluSerAsn370375380GlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThrThrProProMetLeuAspSer385390395400AspGlySerPhePheLeuTyrSerLysLeuThrValAspLysSerArg405410415TrpGlnGlnGlyAsnValPheSerCysSerValMetHisGluAlaLeu420425430HisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeuSerLeuSerProGlyLys435440445<210>26<211>236<212>PRT<213>人工序列<220><223>h89M5-H2L2輕鏈氨基酸序列<220><221>信號<222>(1)..(22)<223>預(yù)測信號序列<400>26MetAspMetArgV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erLeuArgIleSerCysLysGlySerGlyTyrSerPheThrGlyTyr202530ThrMetHisTrpValArgGlnMetProGlyLysGlyLeuGluTrpMet354045GlyGlyIleAsnProAsnAsnGlyGlyThrThrTyrAsnGlnAsnPhe505560LysGlyHisValThrIleSerAlaAspLysSerIleSerThrAlaTyr65707580LeuGlnTrpSerSerLeuLysAlaSerAspThrAlaMetTyrTyrCys859095AlaArgLysGluPheSerAspGlyTyrTyrPhePheAlaTyrTrpGly100105110GlnGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>33<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>h89M5-H8L5輕鏈可變區(qū)氨基酸序列<400>33AspIleValMetThrGlnSerProAspSerLeuAlaValSerLeuGly151015GluArgAlaThrIleAsnCysLysAlaSerGlnAspValIlePheAla202530ValAlaTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnProProLysLeuLeuIle354045TyrTrpAlaSerThrArgHisThrGlyValProAspArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerSerLeuGlnAla65707580GluAspValAlaValTyrTyrCysGlnGlnHisTyrSerThrProTrp859095ThrPheGlyGlyGlyThrLysValGluIleLys100105<210>34<211>470<212>PRT<213>人工序列<220><223>h89M5-H8L5重鏈氨基酸序列<220><221>信號<222>(1)..(19)<223>預(yù)測信號序列<400>34MetAspTrpThrTrpArgIleLeuPheLeuValAlaAlaAlaThrGly151015AlaHisSerGluValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLys202530ProGlyGluSerLeuArgIleSerCysLysGlySerGlyTyrSerPhe354045ThrGlyTyrThrMetHisTrpValArgGlnMetProGlyLysGlyLeu505560GluTrpMetGlyGlyIleAsnProAsnAsnGlyGlyThrThrTyrAsn65707580GlnAsnPheLysGlyHisValThrIleSerAlaAspLysSerIleSer859095ThrAlaTyrLeuGlnTrpSerSerLeuLysAlaSerAspThrAlaMet100105110TyrTyrCysAlaArgLysGluPheSerAspGlyTyrTyrPhePheAla115120125TyrTrpGlyGlnGlyThrLeuValThrValSerSerAlaSerThrLys130135140GlyProSerValPheProLeuAlaProSerSerLysSerThrSerGly145150155160GlyThrAlaAlaLeuGlyCysLeuValLysAspTyrPheProGluPro165170175ValThrValSerTrpAsnSerGlyAlaLeuThrSerGlyValHisThr180185190PheProAlaValLeuGlnSerSerGlyLeuTyrSerLeuSerSerVal195200205ValThrValProSerSerSerLeuGlyThrGlnThrTyrIleCysAsn210215220ValAsnHisLysProSerAsnThrLysValAspLysArgValGluPro225230235240LysSerCysAspLysThrHisThrCysProProCysProAlaProGlu245250255LeuLeuGlyGlyProSerValPheLeuPheProProLysProLysAsp260265270ThrLeuMetIleSerArgThrProGluValThrCysValValValAsp275280285ValSerHisGluAspProGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGly290295300ValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnTyrAsn305310315320SerThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeuHisGlnAspTrp325330335LeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeuPro340345350AlaProIleGluLysThrIleSerLysAlaLysGlyGlnProArgGlu355360365ProGlnValTyrThrLeuProProSerArgGluGluMetThrLysAsn370375380GlnValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSerAspIle385390395400AlaValGluTrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThr405410415ThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSerLys420425430LeuThrValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnValPheSerCys435440445SerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeu450455460SerLeuSerProGlyLys465470<210>35<211>451<212>PRT<213>人工序列<220><223>不具有預(yù)測信號序列的h89M5-H8L5重鏈氨基酸序列<400>35GluValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlyGlu151015SerLeuArgIleSerCysLysGlySerGlyTyrSerPheThrGlyTyr202530ThrMetHisTrpValArgGlnMetProGlyLysGlyLeuGluTrpMet354045GlyGlyIleAsnProAsnAsnGlyGlyThrThrTyrAsnGlnAsnPhe505560LysGlyHisValThrIleSerAlaAspLysSerIleSerThrAlaTyr65707580LeuGlnTrpSerSerLeuLysAlaSerAspThrAlaMetTyrTyrCys859095AlaArgLysGluPheSerAspGlyTyrTyrPhePheAlaTyrTrpGly100105110GlnGlyThrLeuValThrValSerSerAlaSerThrLysGlyProSer115120125ValPheProLeuAlaProSerSerLysSerThrSerGlyGlyThrAla130135140AlaLeuGlyCysLeuValLysAspTyrPheProGluProValThrVal145150155160SerTrpAsnSerGlyAlaLeuThrSerGlyValHisThrPheProAla165170175ValLeuGlnSerSerGlyLeuTyrSerLeuSerSerValValThrVal180185190ProSerSerSerLeuGlyThrGlnThrTyrIleCysAsnValAsnHis195200205LysProSerAsnThrLysValAspLysArgValGluProLysSerCys210215220AspLysThrHisThrCysProProCysProAlaProGluLeuLeuGly225230235240GlyProSerValPheLeuPheProProLysProLysAspThrLeuMet245250255IleSerArgThrProGluValThrCysValValValAspValSerHis260265270GluAspProGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGlyValGluVal275280285HisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnTyrAsnSerThrTyr290295300ArgValValSerValLeuThrValLeuHisGlnAspTrpLeuAsnGly305310315320LysGluTyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeuProAlaProIle325330335GluLysThrIleSerLysAlaLysGlyGlnProArgGluProGlnVal340345350TyrThrLeuProProSerArgGluGluMetThrLysAsnGlnValSer355360365LeuThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSerAspIleAlaValGlu370375380TrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThrThrProPro385390395400ValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSerLysLeuThrVal405410415AspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnValPheSerCysSerValMet420425430HisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeuSerLeuSer435440445ProGlyLys450<210>36<211>234<212>PRT<213>人工序列<220><223>h89M5-H8L5輕鏈氨基酸序列<220><221>信號<222>(1)..(20)<223>預(yù)測信號序列<400>36MetValLeuGlnThrGlnValPheIleSerLeuLeuLeuTrpIleSer151015GlyAlaTyrGlyAspIleValMetThrGlnSerProAspSerLeuAla202530ValSerLeuGlyGluArgAlaThrIleAsnCysLysAlaSerGlnAsp354045ValIlePheAlaValAlaTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnProPro505560LysLeuLeuIleTyrTrpAlaSerThrArgHisThrGlyValProAsp65707580ArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSer859095SerLeuGlnAlaGluAspValAlaValTyrTyrCysGlnGlnHisTyr100105110SerThrProTrpThrPheGlyGlyGlyThrLysValGluIleLysArg115120125ThrValAlaAlaProSerValPheIlePheProProSerAspGluGln130135140LeuLysSerGlyThrAlaSerValValCysLeuLeuAsnAsnPheTyr145150155160ProArgGluAlaLysValGlnTrpLysValAspAsnAlaLeuGlnSer165170175GlyAsnSerGlnGluSerValThrGluGlnAspSerLysAspSerThr180185190TyrSerLeuSerAsnThrLeuThrLeuSerLysAlaAspTyrGluLys195200205HisLysValTyrAlaCysGluValThrHisGlnGlyLeuSerSerPro210215220ValThrLysSerPheAsnArgGlyGluCys225230<210>37<211>214<212>PRT<213>人工序列<220><223>不具有預(yù)測信號序列的h89M5-H8L5輕鏈氨基酸序列<400>37AspIleValMetThrGlnSerProAspSerLeuAlaValSerLeuGly151015GluArgAlaThrIleAsnCysLysAlaSerGlnAspValIlePheAla202530ValAlaTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnProProLysLeuLeuIle354045TyrTrpAlaSerThrArgHisThrGlyValProAspArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerSerLeuGlnAla65707580GluAspValAlaValTyrTyrCysGlnGlnHisTyrSerThrProTrp859095ThrPheGlyGlyGlyThrLysValGluIleLysArgThrValAlaAla100105110ProSerValPheIlePheProProSerAspGluGlnLeuLysSerGly115120125ThrAlaSerValValCysLeuLeuAsnAsnPheTyrProArgGluAla130135140LysValGlnTrpLysValAspAsnAlaLeuGlnSerGlyAsnSerGln145150155160GluSerValThrGluGlnAspSerLysAspSerThrTyrSerLeuSer165170175AsnThrLeuThrLeuSerLysAlaAspTyrGluLysHisLysValTyr180185190AlaCysGluValThrHisGlnGlyLeuSerSerProValThrLysSer195200205PheAsnArgGlyGluCys210<210>38<211>363<212>DNA<213>人工序列<220><223>h89M5-H8L5重鏈可變區(qū)核苷酸序列<400>38gaagtgcagctggtgcagtctggagcagaggtcaaaaagcccggggagtctctgaggatc60tcctgcaagggttctggatacagctttactggatacaccatgcactgggtgcgccagatg120cccgggaaaggactggagtggatggggggtattaatcctaacaatggtggtactacttac180aaccagaacttcaagggccacgtcaccatctcagctgacaagtccatcagcactgcctac240ctgcaatggagcagcctgaaggcttctgacaccgccatgtattactgtgcaagaaaggag300ttctctgatggatactacttttttgcttactggggccaagggaccctggtgaccgtcagc360tca363<210>39<211>321<212>DNA<213>人工序列<220><223>h89M5-H8L5輕鏈可變區(qū)核苷酸序列<400>39gacatcgtgatgacccagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggccacc60atcaactgcaaggcttcccaggacgtgatttttgctgttgcctggtatcagcagaaacca120ggacagcctcctaagctgctcatttactgggcatctacccgccacactggggtccctgac180cgcttcagtggcagcgggtctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctccaggct240gaagatgtggcagtttattactgtcagcaacattatagcactccttggactttcggcgga300gggaccaaggtggagatcaaa321<210>40<211>1413<212>DNA<213>人工序列<220><223>h89M5-H8L5重鏈核苷酸序列<400>40atggactggacctggaggatactctttctcgtggcggcagccacaggagcccactccgaa60gtgcagctggtgcagtctggagcagaggtcaaaaagcccggggagtctctgaggatctcc120tgcaagggttctggatacagctttactggatacaccatgcactgggtgcgccagatgccc180gggaaaggactggagtggatggggggtattaatcctaacaatggtggtactacttacaac240cagaacttcaagggccacgtcaccatctcagctgacaagtccatcagcactgcctacctg300caatggagcagcctgaaggcttctgacaccgccatgtattactgtgcaagaaaggagttc360tctgatggatactacttttttgcttactggggccaagggaccctggtgaccgtcagctca420gccagcacaaagggcccctccgtgttccctctggccccttcctccaagtccacctccggc480ggcaccgccgctctgggctgcctggtgaaggactacttccctgagcctgtgaccgtgtcc540tggaactctggcgcactgacctctggcgtgcacaccttcccagccgtgctccagtcctcc600ggcctgtactccctgtcctccgtcgtcaccgtgccttcctcctccctgggcacccagacc660tacatctgcaacgtgaaccacaagccttccaacacaaaggtggacaagcgggtggagcct720aagtcctgcgacaagacccacacctgccctccctgccctgcccctgagctgctgggcgga780ccttccgtgttcctgttccctcctaagcctaaggacaccctgatgatctcccggacccct840gaagtgacatgcgtggtggtggacgtgtcccacgaggaccctgaggtgaagttcaactgg900tatgtggacggcgtggaggtgcacaacgctaagaccaagccgagggaggagcagtacaac960tccacctaccgggtggtgtctgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaa1020gaatacaagtgcaaggtctccaacaaggccctgcccgctcccatcgagaaaaccatcagc1080aaggcaaagggccagcctcgcgagcctcaggtgtacaccctgccacccagccgggaggag1140atgaccaagaaccaggtgtccctgacctgtctggtgaagggcttttacccttccgatatt1200gccgtggagtgggagtctaacggccagcccgagaacaactacaagaccacccctcctgtg1260ctggactccgacggctccttcttcctgtactccaagctgaccgtggacaagtcccggtgg1320cagcagggcaacgtgttctcctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacc1380cagaagagcctgtctctgtctcctggcaagtga1413<210>41<211>705<212>DNA<213>人工序列<220><223>h89M5-H8L5輕鏈核苷酸序列<400>41atggtgctccagacccaggtcttcatttctctgctcctctggatctctggtgcctacggg60gacatcgtgatgacccagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggccacc120atcaactgcaaggcttcccaggacgtgatttttgctgttgcctggtatcagcagaaacca180ggacagcctcctaagctgctcatttactgggcatctacccgccacactggggtccctgac240cgcttcagtggcagcgggtctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctccaggct300gaagatgtggcagtttattactgtcagcaacattatagcactccttggactttcggcgga360gggaccaaggtggagatcaaacggactgtggctgcaccatctgtcttcatcttccctcca420tctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctat480cccagagaggccaaagtccagtggaaggtggataacgccctccaatccggtaactcccag540gagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcaacaccctgaca600ctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctatgcctgcgaagtcacccatcagggc660ctgtcttcccccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgctaa705權(quán)利要求書(按照條約第19條的修改)1.一種特異性結(jié)合人類R-spondin1(RSPO1)的分離的抗體，其包含與SEQIDNO：32具有至少90％序列同一性的重鏈可變區(qū)和與SEQIDNO：33具有至少90％序列同一性的輕鏈可變區(qū)，其中所述抗體包含含有TGYTMH(SEQIDNO：6)的重鏈CDR1、含有GINPNNGGTTYNQNFKG(SEQIDNO：7)的重鏈CDR2和含有KEFSDGYYFFAY(SEQIDNO：8)的重鏈CDR3、含有KASQDVIFAVA(SEQIDNO：9)的輕鏈CDR1、含有WASTRHT(SEQIDNO：10)的輕鏈CDR2和含有QQHYSTPW(SEQIDNO：11)的輕鏈CDR3。2.如權(quán)利要求1所述的抗體，其包含含有SEQIDNO：32的重鏈可變區(qū)和含有SEQIDNO：33的輕鏈可變區(qū)。3.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的抗體，其是IgG1抗體、IgG2抗體、包含抗原結(jié)合位點的抗體片段、單克隆抗體、嵌合抗體或雙特異性抗體。4.一種抗體，其包含由ATCC保藏為PTA-121494的質(zhì)粒編碼的重鏈可變區(qū)和由ATCC保藏為PTA-121495的質(zhì)粒編碼的輕鏈可變區(qū)。5.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的抗體，其抑制RSPO1與至少一種含有富亮氨酸重復(fù)的G蛋白偶聯(lián)受體(LGR)的結(jié)合。6.如權(quán)利要求5所述的抗體，其中，所述LGR選自由LGR4、LGR5和LGR6組成的組。7.如權(quán)利要求1-6中任一項所述的抗體，其：(a)抑制RSPO1信號傳導(dǎo)；(b)抑制β-連環(huán)蛋白的激活；和/或(c)抑制β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)。8.如權(quán)利要求1-7中任一項所述的抗體，其抑制腫瘤生長。9.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-6中任一項所述的抗體和藥學(xué)上可接受的載劑。10.一種分離的細胞，其包含或產(chǎn)生權(quán)利要求1-6中任一項所述的抗體。11.一種分離的多核苷酸分子，其包含編碼權(quán)利要求1-6中任一項所述的抗體的核苷酸序列。12.一種細胞，其包含權(quán)利要求11所述的多核苷酸。13.一種抑制腫瘤生長的方法，其中，所述方法包括使所述腫瘤與有效量的權(quán)利要求1-6中任一項所述的抗體接觸。14.一種抑制受試者中腫瘤生長的方法，其中，所述方法包括向所述受試者施用治療有效量的權(quán)利要求1-6中任一項所述的抗體。15.一種抑制細胞中β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)的方法，所述方法包括使所述細胞與有效量的權(quán)利要求1-6中任一項所述的抗體接觸。16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述細胞是腫瘤細胞。17.如權(quán)利要求13、14或16中任一項所述的方法，其中，所述腫瘤選自由結(jié)腸直腸腫瘤、卵巢腫瘤、胰腺腫瘤、肺腫瘤、肝腫瘤、乳腺腫瘤、腎腫瘤、前列腺腫瘤、胃腸腫瘤、黑素瘤、子宮頸腫瘤、膀胱腫瘤、成膠質(zhì)細胞瘤和頭頸部腫瘤組成的組。18.一種治療受試者中的癌癥的方法，其中，所述方法包括向所述受試者施用治療有效量的權(quán)利要求1-6中任一項所述的抗體。19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述癌癥選自由結(jié)腸直腸癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、腎癌、前列腺癌、胃腸癌、黑素瘤、子宮頸癌、膀胱癌、成膠質(zhì)細胞瘤和頭頸癌組成的組。20.如權(quán)利要求13、14或16-19中任一項所述的方法，其中與預(yù)定的RSPO1水平相比，所述腫瘤或所述癌癥表達升高的RSPO1水平。21.如權(quán)利要求13-20中任一項所述的方法，其還包括施用至少一種另外的治療劑。22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述另外的治療劑是化療劑、血管生成抑制劑或第二抗RSPO抗體。23.一種選擇用結(jié)合RSPO1的抗體治療的人類受試者的方法，所述方法包括：確定所述受試者是否具有RSPO1表達水平升高的腫瘤，其中如果所述腫瘤具有升高的RSPO1表達水平，則選擇所述受試者以用權(quán)利要求1-6中任一項所述的抗體進行治療。24.保藏于ATCC并指定保藏號為PTA-121494的質(zhì)粒。25.保藏于ATCC并指定保藏號為PTA-121495的質(zhì)粒。當(dāng)前第1頁1 2 3