本發(fā)明主張以下優(yōu)先權(quán)：美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)案美國(guó)申請(qǐng)序號(hào)(USSN)62/003,908，申請(qǐng)于2014年5月28日、USSN 62/020,199，申請(qǐng)于2014年7月2日、USSN 62/110,338，申請(qǐng)于2015年1月30日。其內(nèi)容各自以全文引用方式并入本文中。

背景技術(shù)：

Fc醣基化已成為治療性單株抗體領(lǐng)域中的重要主題。Fc醣基化可顯著改質(zhì)Fc效應(yīng)物功能(例如Fc受體結(jié)合及補(bǔ)體活化)，且由此影響治療抗體的活體內(nèi)安全及功效特征。

基于基因改造的若干表達(dá)系統(tǒng)已報(bào)導(dǎo)會(huì)產(chǎn)生治療性單株抗體。這些表達(dá)系統(tǒng)包含酵母(例如嗜甲醇酵母菌)、昆蟲細(xì)胞系及甚至細(xì)菌。然而，這些表達(dá)系統(tǒng)具有諸多可不利地影響治療抗體的效應(yīng)物功能的缺陷。

大部分經(jīng)批準(zhǔn)生物藥物是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中產(chǎn)生以遞送具有具有期望醣基化模式的蛋白質(zhì)且由此確保減小的免疫原性及較高活體內(nèi)功效及穩(wěn)定性。非哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)(例如CHO或NS0細(xì)胞)具有添加復(fù)雜人類型聚醣所需的機(jī)制。然而，這些系統(tǒng)中所產(chǎn)生的聚醣可不同于人類中所產(chǎn)生的聚醣。其醣基化機(jī)制通常添加不期望碳水化合物污染物，此可改變蛋白質(zhì)折迭，誘導(dǎo)免疫原性，且減小藥物的循環(huán)壽命。顯而易見，呈N-乙?；窠?jīng)胺酸形式的唾液酸不能有效添加于大部分哺乳動(dòng)物細(xì)胞中且6-鏈接在這些細(xì)胞中丟失。唾液酸轉(zhuǎn)移所需的具有各種酶活性的改造細(xì)胞尚未成功提供醣型至蛋白質(zhì)藥物的人類樣模式。迄今為止，需要將動(dòng)物細(xì)胞或醣蛋白改造成盡可能類似于人類蛋白質(zhì)的高度唾液酸化產(chǎn)物。

另外，哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)遞送并不皆具有相同性質(zhì)的醣基化模式的異質(zhì)混合物。這些醣基化模式可影響諸如治療性蛋白質(zhì)的安全性、功效及血清半衰期等性質(zhì)。

自體免疫性病癥是重大且廣泛的醫(yī)學(xué)問題。TNFα(壞死因子α)是自體免疫性疾病(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、克羅恩氏病(Crohn's disease)及牛皮癬)中的發(fā)炎的主要促成者。

TNF在發(fā)炎中的重要性已藉由抗TNF抗體在控制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及其他發(fā)炎性病狀中的疾病活性中的功效突出顯示。當(dāng)前存在4種批準(zhǔn)用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的抗TNFα mAb，包含REMICADE^TM(英夫利昔單抗(Infliximab))、嵌合抗TNFα mAb、ENBREL^TM(依那西普(Etanercept))、TNFR-Ig Fc融合蛋白、HUMIRA^TM(阿達(dá)木單抗(Adalimumab))、人類抗TNFα mAb及(賽妥珠單抗(Certolizumab pegol))、聚乙二醇化Fab片段。

阿達(dá)木單抗是藉由基因技術(shù)改造的人類源重組IgG1單株抗體。阿達(dá)木單抗結(jié)合至TNF-α但并不結(jié)合至TNF-β且具有大約2周的半衰期。其已在2002年12月31日批準(zhǔn)用于RA患者。

阿達(dá)木單抗是在中國(guó)倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中產(chǎn)生且在Fc結(jié)構(gòu)域中的醣基化模式具有高度異質(zhì)性。異質(zhì)混合物中的每一IgG分子可能并不皆具有相同性質(zhì)，且某些結(jié)合至治療蛋白的N-連接寡醣可在患者中觸發(fā)不期望效應(yīng)，由此可視為安全問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

因此，本揭示內(nèi)容的一態(tài)樣是關(guān)于抗TNFα醣抗體的組合物，其包括在每一Fc上具有相同N-聚醣的抗TNFα IgG分子的均質(zhì)群體。本發(fā)明的抗TNFα醣抗體可自抗TNFα單株抗體由Fc醣改造產(chǎn)生。重要的是，與未醣改造的相應(yīng)單株抗體相比，本文所闡述的抗TNFα醣抗體具有改良的治療價(jià)值以及增加的TNFα結(jié)合親和力。

在優(yōu)選實(shí)施例中，N-聚醣連接至Fc區(qū)的Asn-297。

在一些實(shí)施例中，本文所闡述的抗TNFα醣抗體包括具有SEQ ID NO:1中所陳述氨基酸序列的重鏈及具有SEQ ID NO:2中所陳述氨基酸序列的輕鏈。在一優(yōu)選實(shí)施例中，所述醣抗體包括阿達(dá)木單抗的輕鏈序列及重鏈序列。

本文揭示衍生自阿達(dá)木單抗的功能活性抗TNFα醣抗體。這些抗TNFα醣抗體與阿達(dá)木單抗相比展現(xiàn)類似或改良的TNFα結(jié)合親和力。

在一些實(shí)施例中，本發(fā)明醣抗體中的N-聚醣具有雙觸角(biantennary)結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施例中，N-聚醣包括二等分(bisecting)GlcNAc。

在一些實(shí)施例中，本文所闡述的N-聚醣包括至少一個(gè)α2-6末端唾液酸。在某些實(shí)施例中，N-聚醣包括一個(gè)α2-6末端唾液酸。在一優(yōu)選實(shí)施例中，N-聚醣包括兩個(gè)α2-6末端唾液酸。

在一些實(shí)施例中，本文所闡述的N-聚醣包括至少一個(gè)α2-3末端唾液酸。在某些實(shí)施例中，N-聚醣包括一個(gè)α2-3末端唾液酸。在一優(yōu)選實(shí)施例中，N-聚醣包括兩個(gè)α2-3末端唾液酸。

在一些實(shí)施例中，本文所闡述的N-聚醣包括至少一種半乳醣。在某些實(shí)施例中，N-聚醣包括一種半乳醣。在一優(yōu)選實(shí)施例中，N-聚醣包括兩種半乳醣。

在優(yōu)選實(shí)施例中，N-聚醣發(fā)生巖藻醣基化。在一些實(shí)施例中，N-聚醣發(fā)生去巖藻醣基化。

在一些實(shí)施例中，N-聚醣具有選自由以下組成的群的聚醣序列：Sia₂(α2-6)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂、Sia(α2-6)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂、Sia(α2-6)GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc₂、Sia₂(α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂、Sia(α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂、Sia(α2-6)GalGlcNAc₃Man₃GlcNAc₂、Sia₂(α2-3)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂、Sia(α2-3)GalGlcNAc₃Man₃GlcNAc₂、Sia₂(α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂、Sia(α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂、Sia₂(α2-3/α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂、Sia₂(α2-6/α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂、Sia₂(α2-3/α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂、Sia₂(α2-6/α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂、Sia₂(α2-6)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(F)、Sia(α2-6)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(F)、Sia(α2-6)GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(F)、Sia₂(α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂(F)、Sia(α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂(F)、Sia(α2-6)GalGlcNAc₃Man₃GlcNAc₂(F)、Sia₂(α2-3)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(F)、Sia(α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂(F)、Sia₂(α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂(F)、Sia(α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂(F)、Sia₂(α2-3/α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂(F)、Sia₂(α2-6/α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂(F)、Sia₂(α2-3/α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂(F)及Sia₂(α2-6/α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂(F)。

在優(yōu)選實(shí)施例中，N-聚醣具有選自由以下組成的群的聚醣序列：Sia₂(α2-6)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂、Sia(α2-6)GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc₂、Sia₂(α2-3)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂、Sia2(α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂、Sia₂(α2-3/α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂、Sia₂(α2-6/α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂、Sia₂(α2-6)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(F)、Sia(α2-6)GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(F)、Sia₂(α2-3)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(F)、Sia₂(α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂(F)、Sia₂(α2-3/α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂(F)及Sia₂(α2-6/α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂(F)。

本揭示內(nèi)容的另一態(tài)樣描述一種醫(yī)藥組合物，其包括本文所闡述的抗TNFα醣抗體的組合物及醫(yī)藥上可接受的載劑。

本揭示內(nèi)容的醫(yī)藥組合物可用于治療。本文所揭示者包含治療人類患者的TNF介導(dǎo)的發(fā)炎性疾病的方法，所述方法包括向有需要的人類投與有效量的本文所闡述的醫(yī)藥組合物。

在一些實(shí)施例中，所述投與包括向所述人類經(jīng)口投與所述醫(yī)藥組合物。TNF介導(dǎo)的發(fā)炎性疾病的實(shí)例包含但不限于發(fā)炎性腸病(包含潰瘍性結(jié)腸炎及克羅恩氏病)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎及幼年型特發(fā)性關(guān)節(jié)炎。

在一些實(shí)施例中，本文所闡述的治療方法進(jìn)一步包括向患者投與抗TNFα治療劑。在一些實(shí)施例中，抗TNFα治療劑是阿達(dá)木單抗、英夫利昔單抗或依那西普。

本發(fā)明的抗TNFα醣抗體可自在細(xì)胞中產(chǎn)生的抗TNFα單株抗體生成。在優(yōu)選實(shí)施例中，抗TNFα單株抗體用于治療應(yīng)用。在一些實(shí)施例中，治療性單株抗體市面有售或處于研發(fā)中。抗TNFα單株抗體可為人類化、人類或嵌合抗體。

可在活體外產(chǎn)生本文所闡述的抗TNFα醣抗體。可藉由Fc醣改造生成抗TNFα醣抗體。在某些實(shí)施例中，自在諸如哺乳動(dòng)物細(xì)胞等細(xì)胞中產(chǎn)生的抗TNFα單株抗體以酶方式或以化學(xué)酶方式改造抗TNFα醣抗體。

本文闡述制備巖藻醣基化醣抗體的方法，所述方法包括以下步驟：(a)使單株抗體與至少一種醣苷內(nèi)切酶接觸，由此得到在Fc上具有二醣(GlcNAc-Fuc)的抗體，及(b)在適宜條件下將碳水化合物部分添加至二醣的GlcNAc中。

本文所闡述者亦包含制備去巖藻醣基化醣抗體的方法，所述方法包括以下步驟：(a)使單株抗體與α-巖藻醣苷酶及至少一種醣苷內(nèi)切酶接觸，由此得到在Fc上具有單醣(GlcNAc)的抗體，及(b)在適宜條件下將碳水化合物部分添加至GlcNAc中。

本發(fā)明方法中的單株抗體可為抗TNFα單株抗體。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明方法中的抗TNFα單株抗體是阿達(dá)木單抗、英夫利昔單抗或依那西普。

在一些實(shí)施例中，碳水化合物部分是選自由以下組成的群：Sia₂(α2-6)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc、Sia(α2-6)GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc、Sia₂(α2-3)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc、Sia2(α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc、Sia₂(α2-3/α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc、Sia₂(α2-6/α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc、Sia₂(α2-6)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc(F)、Sia(α2-6)GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc(F)、Sia₂(α2-3)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc(F)、Sia₂(α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc(F)、Sia₂(α2-3/α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc(F)及Sia₂(α2-6/α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc(F)。

可藉由轉(zhuǎn)醣苷酶實(shí)施步驟(b)中的添加。轉(zhuǎn)醣苷酶包含但不限于EndoS、EndoH、EndoA、EndoM、EndoF1、EndoF2及EndoF3。

在一些實(shí)施例中，本發(fā)明方法中的醣苷內(nèi)切酶是EndoA、EndoF、EndoF1、EndoF2、EndoF3、EndoH、EndoM、EndoS或其變體。

在一些實(shí)施例中，α-巖藻醣苷酶包括具有與SEQ ID NO:5至少約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％一致的氨基酸序列的多肽。

在某些實(shí)施例中，α-巖藻醣苷酶是重組類桿菌(Bacteroides)α-巖藻醣苷酶。

在一些實(shí)施例中，碳水化合物部分是醣惡唑啉。

本發(fā)明一或多個(gè)實(shí)施例的詳細(xì)內(nèi)容陳述于下文說明書中。根據(jù)下列圖式及若干實(shí)施例的詳細(xì)說明亦及隨附申請(qǐng)專利范圍，本發(fā)明的其他特征或優(yōu)點(diǎn)將顯而易見。

附圖說明

圖1.抗TNFα GAb 201及101(上圖)以及GAb 200及401(下圖)的SDS-PAGE分析?？筎NFα GAb 101(上圖)及GAb 401(下圖)的N-聚醣特征分析。

圖2.展示TNFα與抗TNFα GAb 200、401及阿達(dá)木單抗的結(jié)合親和力。

具體實(shí)施方式

因此，仍需要使用改良的抗TNFα抗體來改良單株抗體療法。醣基化模式的異質(zhì)混合物中的少數(shù)特異性醣型已知會(huì)賦予期望生物功能。因此，極為關(guān)注生成含有充分定義的聚醣結(jié)構(gòu)及序列作為用于治療目的的期望醣型的治療抗體。

本揭示內(nèi)容是關(guān)于新穎種類的單株抗體(稱為「醣抗體」)的研發(fā)。術(shù)語「醣抗體」是由發(fā)明者Dr.Chi-Huey Wong創(chuàng)造，其是指在Fc上具有單一均勻醣型的單株抗體(優(yōu)選地治療性單株抗體)的均質(zhì)群體。構(gòu)成均質(zhì)群體的個(gè)別醣抗體相同，結(jié)合相同表位，且含有具有充分定義的聚醣結(jié)構(gòu)及序列的相同F(xiàn)c聚醣。

除非另外指示，否則本發(fā)明實(shí)踐將采用熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者熟知的分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA及免疫學(xué)的習(xí)用技術(shù)。這些技術(shù)全面闡釋于文獻(xiàn)中。例如參見Molecular Cloning A Laboratory Manual，第2版，由Sambrook、Fritsch及Maniatis編輯(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)；DNA Cloning，第I及II卷(D.N.Glover編輯，1985)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney,Alan R.Liss公司，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,1986)；B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；the treatise,Methods In Enzymology(Academic Press公司，N.Y.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller及M.P.Calos編輯，1987,Cold Spring Harbor Laboratory)；Methods In Enzymology，第154及155卷(Wu等人，編輯),Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer及Walker編輯，Academic Press,London,1987)；Antibodies:A Laboratory Manual，Harlow及Lanes(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988)；及Handbook Of Experimental Immunology，第I-IV卷(D.M.Weir及C.C.Blackwell，編輯，1986)。

定義：

如本文中所使用，術(shù)語「抗TNFα醣抗體」(「anti-TNFα glycoantibodies，抗TNFα GAbs」)是指在Fc上具有相同醣型的抗TNFα IgG分子的均質(zhì)群體。術(shù)語「抗TNFα醣抗體」(「anti-TNFα glycoantibody，抗TNFα GAb」)是指抗TNFα醣抗體(anti-TNFα glycoantibodies)中的個(gè)別IgG分子。

如本文中所使用，術(shù)語「聚醣」是指多醣、寡醣或單醣。聚醣可為醣殘基的單體或聚合物且可為直鏈或具支鏈。聚醣可包含天然醣殘基(例如葡萄醣、N-乙酰基葡醣胺、N-乙酰基神經(jīng)胺酸、半乳醣、甘露醣、巖藻醣、己醣、阿拉伯醣、核醣、木醣等)及/或改質(zhì)醣(例如2′-氟核醣、2′-脫氧核醣、磷酸甘露醣、6′硫N-乙?；硝卑返?。如本文中所使用，術(shù)語「聚醣」是指多醣、寡醣或單醣。聚醣可為醣殘基的單體或聚合物且可為直鏈或具支鏈。聚醣可包含天然醣殘基(例如葡萄醣、N-乙?；硝卑?、N-乙?；窠?jīng)胺酸、半乳醣、甘露醣、巖藻醣、己醣、阿拉伯醣、核醣、木醣等)及/或改質(zhì)醣(例如2′-氟核醣、2′-脫氧核醣、磷酸甘露醣、6′硫N-乙?；硝卑返?。聚醣在本文中亦用于是指醣偶聯(lián)物(例如醣蛋白、醣脂、醣肽、醣蛋白質(zhì)組、肽多醣、脂多醣或蛋白聚醣)的碳水化合物部分。聚醣通常僅由單醣之間的O-醣苷鏈接組成。舉例而言，纖維素是由β-1,4-連接D-葡萄醣構(gòu)成的聚醣(或更具體而言葡聚醣)，且甲殼質(zhì)是由β-1,4-連接N-乙?；?D-葡醣胺構(gòu)成的聚醣。聚醣可為單醣殘基的均聚物或異聚物，且可為直鏈或具支鏈。聚醣可發(fā)現(xiàn)連接至蛋白質(zhì)，如在醣蛋白及蛋白聚醣中。其通常發(fā)現(xiàn)于細(xì)胞之外表面上。O-及N-連接聚醣極常見于真核細(xì)胞中，但亦可發(fā)現(xiàn)(但較不常見)于原核細(xì)胞中。N-連接聚醣發(fā)現(xiàn)連接至序列子中天門冬酰胺的R-基團(tuán)氮(N)。序列子是Asn-X-Ser或Asn-X-Thr序列，其中X是除堅(jiān)果醣外的任一氨基酸。

如本文中所使用，術(shù)語「巖藻醣」、「核心巖藻醣」及「核心巖藻醣殘基」可互換使用且是指在α1,6-位連接至N-乙?；硝卑返膸r藻醣。

如本文中所使用，術(shù)語「巖藻醣基化」是指在Fc的N-聚醣中存在核心巖藻醣，而術(shù)語「去巖藻醣基化」是指在Fc的N-聚醣中不存在核心巖藻醣。

如本文中所使用，術(shù)語「N-聚醣」、「N-連接聚醣」、「N-連接醣基化」、「Fc聚醣」及「Fc醣基化」可互換使用且是指由連接至含F(xiàn)c多肽中天門冬酰胺殘基的酰胺氮的N-乙酰基葡醣胺(GlcNAc)連接的N-連接寡醣。術(shù)語「含F(xiàn)c多肽」是指包括Fc區(qū)的多肽(例如抗體)。

如本文中所使用，術(shù)語「醣基化模式」及「醣基化特征」可互換使用且是指以酶方式或以化學(xué)方式自醣蛋白或抗體釋放且然后(例如)使用LC-HPLC或MALDI-TOF MS及諸如此類分析碳水化合物結(jié)構(gòu)的N-聚醣物質(zhì)的特征性「指紋」。例如參見Current Analytical Chemistry，第1卷，第1期(2005)，第28-57頁中的綜述；其全部?jī)?nèi)容以引用方式并入本文中。

如本文中所使用，術(shù)語「醣改造Fc」在本文中使用時(shí)是指Fc區(qū)上的N-聚醣以酶方式或以化學(xué)方式改變或改造。本文所用的術(shù)語「Fc醣改造」是指用于制備醣改造Fc的酶或化學(xué)制程。改造的方法實(shí)例闡述于(例如)Wong等人，USSN12/959,351中，其內(nèi)容以引用方式并入本文中。在某些實(shí)施例中，聚醣可藉由使用內(nèi)-GlcNACase及巖藻醣苷酶，然后藉由使用內(nèi)-S突變體及聚醣惡唑啉制得。

本文所用的術(shù)語「效應(yīng)物功能」是指源自抗體Fc區(qū)與Fc受體或配體的相互作用的生物化學(xué)事件?！感?yīng)物功能」實(shí)例包括C1q結(jié)合、補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性、Fc受體結(jié)合、抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)、吞噬作用、細(xì)胞表面受體(例如B細(xì)胞受體、BCR)下調(diào)。可使用業(yè)內(nèi)已知的各種分析法來分析這些效應(yīng)物功能。

如本文中所使用，「抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性」或「ADCC」是指以下細(xì)胞毒性形式：其中與存在于某些細(xì)胞毒性細(xì)胞(例如自然殺手(NK)細(xì)胞、嗜中性球及巨噬球)上的Fc受體(FcR)結(jié)合的分泌Ig使這些細(xì)胞毒性效應(yīng)細(xì)胞能夠特異性結(jié)合帶抗原靶細(xì)胞且隨后利用細(xì)胞毒素殺死所述靶細(xì)胞?？贵w「武裝」這些細(xì)胞毒性細(xì)胞且為所述殺死過程絕對(duì)所需。用于介導(dǎo)ADCC的原代細(xì)胞(NK細(xì)胞)僅表達(dá)FcγRIII，而單核球表達(dá)FcγRI、FcγRII及FcγRIII。FcR于造血細(xì)胞上的表達(dá)匯總于Ravetch及Kinet，Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)的第464頁表3中。為評(píng)估所關(guān)注分子的ADCC活性，可實(shí)施活體外ADCC分析，例如闡述于美國(guó)專利第5,500,362號(hào)或美國(guó)專利第5,821,337號(hào)中者?？捎糜谶@些分析的效應(yīng)細(xì)胞包含周邊血單核細(xì)胞(PBMC)及自然殺手(NK)細(xì)胞。另一選擇為或另外，可在活體內(nèi)(例如在諸如揭示于Clynes等人，PNAS(USA)95:652-656(1998)中的動(dòng)物模型中)評(píng)估所關(guān)注分子的ADCC活性。

本文所用的術(shù)語「補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性」或「CDC」是指靶細(xì)胞在補(bǔ)體存在下的裂解。經(jīng)典補(bǔ)體途徑的活化是藉由補(bǔ)體系統(tǒng)的第一補(bǔ)體(C1q)與抗體(適當(dāng)亞類)的結(jié)合來起始，這些抗體結(jié)合其同族抗原。為評(píng)估補(bǔ)體活化，可實(shí)施CDC分析，例如如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202:163(1996)中所闡述。

「誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡」的抗體是誘導(dǎo)計(jì)劃性細(xì)胞死亡者，如藉由膜聯(lián)蛋白V結(jié)合、DNA斷裂、細(xì)胞收縮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹、細(xì)胞斷裂及/或膜囊(稱為凋亡小體)的形成所測(cè)定。優(yōu)選地，細(xì)胞是感染細(xì)胞。各種方法可用于評(píng)估與細(xì)胞凋亡有關(guān)的細(xì)胞事件。舉例而言，可藉由膜聯(lián)蛋白結(jié)合量測(cè)磷脂酰絲胺酸(PS)異位；可經(jīng)由DNA解鏈評(píng)估DNA斷裂；且可藉由亞二倍體細(xì)胞的任何增加評(píng)估細(xì)胞核/染色質(zhì)凝集以及DNA斷裂。優(yōu)選地，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的抗體是在膜聯(lián)蛋白結(jié)合分析中相對(duì)于未處理細(xì)胞產(chǎn)生約2至50倍、優(yōu)選地約5至50倍及最佳地約10至50倍的膜聯(lián)蛋白結(jié)合誘導(dǎo)者。

「嵌合」抗體(免疫球蛋白)中重鏈及/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w種類或亞類的抗體的相應(yīng)序列相同或同源，而所述(等)鏈的其余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w種類或亞類的抗體的相應(yīng)序列相同或同源；且包含這些抗體的片段，只要其展現(xiàn)期望生物活性即可(美國(guó)專利第4,816,567號(hào)；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81:6851-6855(1984))。本文所用的人類化抗體是嵌合抗體的子組。

「人類化」形式的非人類(例如鼠類)抗體是含有最少量源自非人類免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。在極大程度上，人類化抗體是如下人類免疫球蛋白(接受者或受體抗體)：其中接受者的超變區(qū)殘基由來自非人類物種(例如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物)的超變區(qū)(供體抗體)的具有期望特異性、親和力及容量的殘基所代替。在一些情況下，人類免疫球蛋白的Fv框架區(qū)(FR)殘基由相應(yīng)非人類殘基代替。另外，人類化抗體可包括未在接受者抗體或供體抗體中發(fā)現(xiàn)的殘基。作出這些改質(zhì)以進(jìn)一步改善抗體性能，例如結(jié)合親和力。通常，人類化抗體將包括實(shí)質(zhì)上全部的至少一個(gè)且通常兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其中全部或?qū)嵸|(zhì)上全部超變環(huán)對(duì)應(yīng)于非人類免疫球蛋白的彼等超變環(huán)，且全部或?qū)嵸|(zhì)上全部FR區(qū)為人類免疫球蛋白序列的彼等FR區(qū)，但FR區(qū)可包含改良結(jié)合親和力的一或多個(gè)氨基酸取代。FR中的這些氨基酸取代的數(shù)量通常在H鏈中不超過6，且在L鏈中不超過3。人類化抗體視情況亦包括通常人類免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)的至少一部分。其他細(xì)節(jié)參見Jones等人，Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332:323-329(1988)；及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。

治療「(treating或treatment)」或「緩解」是指治療性治療及預(yù)防性(prophylactic或preventative)措施；其中目標(biāo)是預(yù)防或減緩(減弱)靶定病理學(xué)病狀或病癥。彼等需要治療者包含彼等已患有病癥者以及彼等易于患有病癥者或彼等擬預(yù)防病癥者。若在接受治療量的本發(fā)明方法的抗體之后，患者展示下列情形中的一或多者的可觀察及/或可量測(cè)減小或不存在，則個(gè)體或哺乳動(dòng)物成功「治療」感染：減小感染細(xì)胞數(shù)量或不存在感染細(xì)胞；減小總感染細(xì)胞的百分比；及/或減輕(至一定程度)一或多種與特定感染有關(guān)的癥狀；減小發(fā)病率及死亡率；及改良生活質(zhì)量問題。用于評(píng)估疾病的成功治療及改良的上述參數(shù)可易于藉由醫(yī)師熟知的常規(guī)程序量測(cè)。

與一或多種其他治療劑「組合」投與包含以任一順序同時(shí)(并行)及連續(xù)投與。

本文所用的「載劑」包含在所用劑量及濃度下對(duì)所暴露細(xì)胞或哺乳動(dòng)物無毒的醫(yī)藥上可接受的載劑、賦形劑或穩(wěn)定劑。通常，生理學(xué)上可接受的載劑是pH緩沖水溶液。生理學(xué)上可接受的載劑的實(shí)例包含緩沖劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機(jī)酸；抗氧化劑，包含抗壞血酸，低分子量(小于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯啶酮；氨基酸，例如甘胺酸、麩酰胺酸、天門冬酰胺、精胺酸或離胺酸；單醣、二醣及其他碳水化合物，包含葡萄醣、甘露醣或糊精；螯合劑，例如EDTA；醣醇，例如甘露醣醇或山梨醣醇；形成鹽的抗衡離子，例如鈉；及/或非離子型表面活性劑，例如TWEEN^TM、聚乙二醇(PEG)及PLURONICS^TM。

術(shù)語「醣抗體」是由發(fā)明者Dr.Chi-Huey Wong創(chuàng)造，其是指具有結(jié)合Fc區(qū)的單一均勻醣型的單株抗體(優(yōu)選地治療性單株抗體)的均質(zhì)群體。構(gòu)成基本上均質(zhì)群體的個(gè)別醣抗體相同，結(jié)合相同表位，且含有具有充分定義的聚醣結(jié)構(gòu)及序列的相同F(xiàn)c聚醣。

在Fc區(qū)醣基化特征背景中的術(shù)語「均質(zhì)」、「均勻」、「均勻地」及「均質(zhì)性」可互換使用且欲指由一種期望N-聚醣物質(zhì)代表的單一醣基化模式，其中具有較少或并無痕量前體N-聚醣。在某些實(shí)施例中，前體N-聚醣的痕量是小于約2％。

「基本上純」蛋白質(zhì)意指基于組合物的總重量包括至少約90重量％(包含(例如)至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％或至少約99重量％)的蛋白質(zhì)的組合物。

「基本上均質(zhì)」蛋白質(zhì)意指基于組合物的總重量包括至少約98重量％的蛋白質(zhì)(包含(例如)至少約98.5％、至少約99％)的組合物。在某些實(shí)施例中，蛋白質(zhì)是抗體、結(jié)構(gòu)變體及/或其抗原結(jié)合片段。

如本文中所使用，術(shù)語「IgG」、「IgG分子」、「單株抗體」、「免疫球蛋白」及「免疫球蛋白分子」可互換使用。

如本文中所使用，術(shù)語「Fc受體」或「FcR」闡述結(jié)合抗體的Fc區(qū)的受體。優(yōu)選FcR是原始序列人類FcR。另外，優(yōu)選FcR是結(jié)合IgG抗體者(γ受體)且包含F(xiàn)cγRI(CD64)、FcγRII(CD32)及FcγRIII(CD16)亞類的受體，包含這些受體的對(duì)偶基因變體及選擇性剪接形式。FcγRII受體包含F(xiàn)cγRIIA(「活化型受體」)及FcγRIIB(「抑制型受體」)，二者具有類似氨基酸序列，其主要差異在于其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域上?；罨褪荏wFcγRIIA在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中含有免疫受體酪胺酸活化基序(ITAM)。抑制型受體FcγRIIB在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中含有免疫受體酪胺酸抑制基序(ITIM)。(參見M.inAnnu.Rev.Immunol.15:203-234(1997)中的綜述)。在Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)；Capel等人，Immunomethods 4:25-34(1994)；及de Haas等人，J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)中對(duì)FcR進(jìn)行綜述。本文的術(shù)語「FcR」涵蓋其他FcR，包含彼等欲在將來鑒別者。所述術(shù)語亦包含新生兒受體(FcRn)，所述受體負(fù)責(zé)將母體IgG轉(zhuǎn)移至胎兒體內(nèi)(Guyer等人，J.Immunol.117:587(1976)及Kim等人，J.Immunol.24:249(1994))。

如本文中所使用，術(shù)語「抗原」定義為任一能夠誘發(fā)免疫反應(yīng)的物質(zhì)。如本文中所使用，術(shù)語「抗原特異性」是指特定抗原或抗原片段的供應(yīng)產(chǎn)生特異性細(xì)胞增殖的細(xì)胞群體的性質(zhì)。

如本文中所使用，術(shù)語「免疫原性」是指免疫原、抗原或疫苗刺激免疫反應(yīng)的能力。

如本文中所使用，術(shù)語「表位」定義為抗原分子中接觸抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)或T細(xì)胞受體的部分。

如本文中所使用，術(shù)語「特異性結(jié)合」是指結(jié)合對(duì)(例如抗體及抗原)的間的相互作用。在各種情況下，特異性結(jié)合可體現(xiàn)為親和力常數(shù)為約10^-6莫耳/公升、約10^-7莫耳/公升或約10^-8莫耳/公升或更小。

「分離」抗體是已經(jīng)鑒定并自其天然環(huán)境組份中分離及/或回收的抗體。其天然環(huán)境的污染組份是會(huì)干擾抗體的研究、診斷或治療用途的材料，且可包含酶、激素及其他蛋白質(zhì)性溶質(zhì)或非蛋白質(zhì)性溶質(zhì)。

本文所用的詞組「實(shí)質(zhì)上類似」、「實(shí)質(zhì)上相同」、「等效」或「實(shí)質(zhì)上等效」表示兩個(gè)數(shù)值(例如一個(gè)值與分子有關(guān)且另一者與參考/對(duì)比分子有關(guān))之間具有足夠高相似度，從而熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者會(huì)認(rèn)為所述兩個(gè)值之間的差異在藉由這些值(例如Kd值、抗病毒效應(yīng)等)所量測(cè)生物特性的背景下具有較少或不具有生物及/或統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。所述兩個(gè)值之間的差異是(例如)小于約50％、小于約40％、小于約30％、小于約20％及/或小于約10％，其隨參考/對(duì)比分子的值而變化。

本文所用的詞組「實(shí)質(zhì)上減少」或「實(shí)質(zhì)上不同」表示兩個(gè)數(shù)值(通常一個(gè)值與分子有關(guān)且另一值與參考/對(duì)比分子有關(guān))之間具有足夠高差異度，從而熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者會(huì)認(rèn)為所述兩個(gè)值之間的差異在藉由這些值(例如Kd值)所量測(cè)生物學(xué)特性的背景下具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。所述兩個(gè)值之間的差異是(例如)大于約10％、大于約20％、大于約30％、大于約40％及/或大于約50％，其隨參考/對(duì)比分子的值而變化。

「結(jié)合親和力」通常是指分子(例如抗體)的單一結(jié)合位點(diǎn)與其結(jié)合配偶體(例如抗原)之間的非共價(jià)相互作用的總強(qiáng)度。除非另外指示，否則本文所用的「結(jié)合親和力」是指固有結(jié)合親和力，其反映結(jié)合對(duì)的成員(例如抗體及抗原)之間的1:1相互作用。分子X對(duì)于其配偶體Y的親和力通?？杀硎緸榻怆x常數(shù)(Kd)。可藉由業(yè)內(nèi)已知的常用方法(包含彼等闡述于本文中者)來量測(cè)親和力。低親和力抗體通常緩慢地結(jié)合抗原且往往易于解離，而高親和力抗體通常較快結(jié)合抗原且往往較長(zhǎng)時(shí)間保持結(jié)合。多種量測(cè)結(jié)合親和力的方法為業(yè)內(nèi)已知，其任一者皆可用于本發(fā)明目的。具體闡釋性實(shí)施例闡述于下文中。

抗體的「可變區(qū)」或「可變結(jié)構(gòu)域」是指抗體重鏈或輕鏈的胺基末端結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)構(gòu)域通常是抗體的最可變部分且含有抗原結(jié)合位點(diǎn)。

術(shù)語「可變」是指如下事實(shí)：在抗體之間可變結(jié)構(gòu)域的某些部分于序列上存在廣泛差異且可用于實(shí)現(xiàn)每一特定抗體對(duì)其特定抗原的結(jié)合及特異性。然而，可變性在整個(gè)抗體可變結(jié)構(gòu)域中并非均勻分布。在輕鏈及重鏈可變結(jié)構(gòu)域二者中所述可變性均集中在三個(gè)稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)或超變區(qū)的區(qū)段上?？勺兘Y(jié)構(gòu)域的保守程度較高的部分稱為框架(FR)。原始重鏈及輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域各自包括4個(gè)由三個(gè)CDR連結(jié)的主要采用β薄片構(gòu)形的FR區(qū)，這些CDR形成連結(jié)且在一些情形下形成β薄片結(jié)構(gòu)的一部分的環(huán)。每一鏈中的CDR藉助FR區(qū)保持緊密靠近，且與來自另一鏈的CDR一起促進(jìn)形成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)(參見Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，National Institutes of Health，Bethesda，Md(1991))。恒定結(jié)構(gòu)域并不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但展現(xiàn)各種效應(yīng)物功能，例如抗體參與抗體依賴性細(xì)胞毒性。

抗體的木瓜酶消化產(chǎn)生兩個(gè)相同抗原結(jié)合片段，稱為「Fab」片段，其各自具有單一抗原結(jié)合位點(diǎn)；及殘余「Fc」片段，其名稱反映其易于結(jié)晶的能力。經(jīng)胃蛋白酶處理產(chǎn)生F(ab’)2片段，所述片段具有兩個(gè)抗原組合位點(diǎn)且仍然能夠交聯(lián)抗原。

「Fv」是含有完全抗原識(shí)別及結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。在雙鏈Fv物質(zhì)中，此區(qū)域是由一個(gè)重鏈可變結(jié)構(gòu)域與一個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的緊密非共價(jià)結(jié)合二聚體組成。在單鏈Fv物質(zhì)中，一個(gè)重鏈可變結(jié)構(gòu)域及一個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域可藉由柔性肽連接體共價(jià)連接，從而這些輕鏈及重鏈可以與雙鏈Fv物質(zhì)中類似的「二聚體」結(jié)構(gòu)來締合。每一可變結(jié)構(gòu)域的3個(gè)CDR以此構(gòu)形相互作用以界定VH-VL二聚體的表面上的抗原結(jié)合位點(diǎn)。六個(gè)CDR共同賦予了所述抗體抗原結(jié)合特異性。然而，即使單一可變結(jié)構(gòu)域(或Fv的一半，其僅包括三個(gè)對(duì)抗原具有特異性的CDR)亦具有識(shí)別并結(jié)合抗原的能力，但其親和力低于完整結(jié)合位點(diǎn)。

Fab片段亦含有輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域及重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域(CH1)。Fab'片段與Fab片段的不同處在于在重鏈CH1結(jié)構(gòu)域的羧基末端添加幾個(gè)殘基，包含一或多個(gè)來自抗體鉸鏈區(qū)的半胱胺酸。在本文中，F(xiàn)ab'-SH是恒定結(jié)構(gòu)域中的半胱胺酸殘基具有游離硫醇基的Fab'的名稱。F(ab')2抗體片段最初是作為在其間具有鉸鏈半胱胺酸的Fab'片段對(duì)產(chǎn)生。亦已知抗體片段的其他化學(xué)偶合。

根據(jù)恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，可將來自任何脊椎動(dòng)物物種的抗體(免疫球蛋白)的「輕鏈」指定為兩種完全不同類型(稱為卡帕(κ)及蘭布達(dá)(λ))中的一種。

端視抗體(免疫球蛋白)重鏈中恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，可將抗體(免疫球蛋白)指定為不同種類。存在5大類抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且這些類別中的若干可進(jìn)一步分成子類(同種型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對(duì)應(yīng)于不同類別的免疫球蛋白的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。不同種類的免疫球蛋白的亞單位結(jié)構(gòu)及三維構(gòu)形已眾所周知且通常闡述于(例如)Abbas等人，Cellular及Mol.Immunology，第4版(2000)中?？贵w可為較大融合分子的一部分，其是藉由抗體與一或多種其他蛋白質(zhì)或肽的共價(jià)或非共價(jià)締合來形成。

術(shù)語「全長(zhǎng)抗體」、「完整抗體」與「全抗體」在本文中可互換使用，其是指呈實(shí)質(zhì)上完整形式的抗體，且不為如下文所定義的抗體片段。這些術(shù)語尤其是指重鏈含有Fc區(qū)的抗體。

「抗體片段」僅包括完整抗體的一部分，其中所述部分保留至少一種及(至多)大部分或所有通常在存在于完整抗體中時(shí)與所述部分有關(guān)的功能。在一實(shí)施例中，抗體片段包括完整抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)且由此保留結(jié)合抗原的能力。在另一實(shí)施例中，抗體片段(例如包括Fc區(qū)者)在存在于完整抗體中時(shí)保留通常與Fc區(qū)有關(guān)的至少一種生物功能，例如FcRn結(jié)合、抗體半衰期調(diào)變、ADCC功能及補(bǔ)體結(jié)合。在一實(shí)施例中，抗體片段是活體內(nèi)半衰期實(shí)質(zhì)上類似于完整抗體的單價(jià)抗體。舉例而言，此一抗體片段可包括連接至能賦予片段活體內(nèi)穩(wěn)定性的Fc序列的抗原結(jié)合臂。

本文所用的術(shù)語「單株抗體」是指自實(shí)質(zhì)上均質(zhì)抗體的群體(亦即，構(gòu)成所述群體的個(gè)別抗體除了可能少量存在的可能天然突變外，其余均相同)獲得的抗體。因此，修飾語「單株」指示抗體的特征并非個(gè)別抗體的混合物。所述單株抗體通常包括一種包含會(huì)結(jié)合靶的多肽序列的抗體，其中所述靶結(jié)合多肽序列是藉由一種包含自多個(gè)多肽序列選擇單一靶結(jié)合多肽序列的方法獲得。舉例而言，選拔方法可為自多個(gè)純系(例如一組集合的雜交瘤純系、噬菌體純系或重組DNA純系)選拔一個(gè)獨(dú)特純系。應(yīng)理解，可進(jìn)一步改變所選的靶結(jié)合序列，以例如改良對(duì)靶的親和力、人類化所述靶結(jié)合序列、改良其在細(xì)胞培養(yǎng)中的生產(chǎn)、降低其活體內(nèi)免疫原性、產(chǎn)生多特異性抗體，等等，且所述包括改變的靶結(jié)合序列的抗體亦是本發(fā)明的單株抗體。與通常包含針對(duì)不同決定基(表位)的不同抗體的多株抗體制劑相比，單株抗體制劑的每一單株抗體是針對(duì)抗原上的單一決定基。除特異性外，單株抗體制劑的優(yōu)勢(shì)在于其通常未經(jīng)其他免疫球蛋白污染。修飾語「單株」指示抗體的特征是自實(shí)質(zhì)上均質(zhì)的抗體群體獲得，且不應(yīng)解釋為需要藉由任一特定方法來產(chǎn)生所述抗體。舉例而言，擬用于本發(fā)明的單株抗體可由各種技術(shù)制得，包括例如雜交瘤方法(例如Kohler等人，Nature,256:495(1975)；Harlow等人，Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版，1988)；Hammerling等人，Monoclonal Antibodies and T-Cell hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981))、重組DNA方法(參見例如美國(guó)專利第4,816,567號(hào))、噬菌體展示技術(shù)(參見例如Clackson等人，Nature,352:624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；及Lee等人，J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004))，及用于在具有一部分或所有編碼人類免疫球蛋白序列的人類免疫球蛋白基因座或基因的動(dòng)物中產(chǎn)生人類或人類樣抗體的技術(shù)(參見例如WO98/24893；WO96/34096；WO96/33735；WO91/10741；Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993)；Jakobovits等人，Nature 362:255-258(1993)；Bruggemann等人，Year in Immunol.7:33(1993)；美國(guó)專利第5,545,807號(hào)、第5,545,806號(hào)、第5,569,825號(hào)、第5,625,126號(hào)、第5,633,425號(hào)、第5,661,016號(hào)；Marks等人，Bio.Technology 10:779-783(1992)；Lonberg等人，Nature 368:856-859(1994)；Morrison,Nature 368:812-813(1994)；Fishwild等人，Nature Biotechnol.14:845-851(1996)；Neuberger,Nature Biotechnol.14:826(1996)及Lonberg及Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。

具體而言，本文的單株抗體包含「嵌合」抗體，其中重鏈及/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w種類或亞類的抗體的相應(yīng)序列相同或同源，而所述(等)鏈的其余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w種類或亞類的抗體的相應(yīng)序列相同或同源；以及這些抗體的片段，只要其展現(xiàn)期望生物學(xué)活性即可(美國(guó)專利第4,816,567號(hào)；及Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81:6851-6855(1984))。

亦參見下列綜述文件及其中所引用的參考文獻(xiàn)：Vaswani及Hamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions 23:1035-1038(1995)；Hurle及Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)。

本文所用的術(shù)語「超變區(qū)」、「HVR」或「HV」是指抗體可變結(jié)構(gòu)域中序列超變及/或結(jié)構(gòu)上形成所定義環(huán)的區(qū)域。通常，抗體包括6個(gè)超變區(qū)；3個(gè)位于VH中(H1、H2、H3)，且3個(gè)位于VL中(L1、L2、L3)。本文使用且涵蓋多個(gè)超變區(qū)的描述。Kabat互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)是基于序列可變性且使用最為廣泛(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。而Chothia是指結(jié)構(gòu)環(huán)的位置(Chothia及Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbM超變區(qū)代表Kabat CDR與Chothia結(jié)構(gòu)環(huán)之間的折衷方案且用于Oxford Molecular的AbM抗體建模軟件中?！附佑|」超變區(qū)是基于對(duì)可獲得復(fù)雜晶體結(jié)構(gòu)的分析。來自這些超變區(qū)中每一者的殘基如下所述。

Loop Kabat AbM Chothia Contact

L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36

L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55

L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96

H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B

(Kabat編號(hào))

H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35

(Chothia編號(hào))

H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58

H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101

超變區(qū)可包括如下「經(jīng)延伸超變區(qū)」：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56或49-56(L2)及89-97或89-96(L3)以及VH中的26-35(H1)、50-65或49-65(H2)及93-102、94-102或95-102(H3)。對(duì)于這些定義中的每一者，根據(jù)Kabat等人(見上文)對(duì)可變結(jié)構(gòu)域殘基編號(hào)。

「框架」或「FR」殘基是彼等除如本文所定義超變區(qū)殘基外的可變結(jié)構(gòu)域殘基。

術(shù)語「依Kabat中的可變結(jié)構(gòu)域殘基編號(hào)」或「依Kabat中的氨基酸位置編號(hào)」及其變化形式是指在Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)中用于抗體編譯的重鏈可變結(jié)構(gòu)域或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的編號(hào)系統(tǒng)。使用此編號(hào)系統(tǒng)，實(shí)際線性氨基酸序列可含有較少或額外的對(duì)應(yīng)于可變結(jié)構(gòu)域FR或HVR的縮短或插入的氨基酸。舉例而言，重鏈可變結(jié)構(gòu)域可包含在H2的殘基52后的單氨基酸插入(根據(jù)Kabat編號(hào)的殘基52a)及重鏈FR殘基82后的插入殘基(例如，根據(jù)Kabat編號(hào)的殘基82a、82b及82c等)。可藉由將抗體序列的同源區(qū)與「標(biāo)準(zhǔn)」Kabat編號(hào)序列比對(duì)來確定所指定抗體殘基的Kabat編號(hào)。

單鏈「Fv」或「scFv」抗體片段包括抗體的VH及VL結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域是以單一多肽鏈存在。通常，scFv多肽進(jìn)一步包括VH結(jié)構(gòu)域與VL結(jié)構(gòu)域之間的多肽連接體，其使得scFv能夠形成用于結(jié)合抗原的期望結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv的綜述，參見Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編輯，Springer-Verlag,New York，第269-315頁(1994)。

術(shù)語「雙價(jià)抗體」是指具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小抗體片段，這些片段包括在同一多肽鏈(VH-VL)中與輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)鏈接的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)。藉由使用過短而不容許在同一鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間配對(duì)的連接體，迫使這些結(jié)構(gòu)域與另一鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)并產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。雙價(jià)抗體更全面地闡述于(例如)EP 404,097；WO93/1161；及Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)中。

「人類抗體」指其擁有的氨基酸序列是對(duì)應(yīng)于由人類產(chǎn)生的抗體的氨基酸序列及/或是使用如本文所揭示制備人類抗體的任一技術(shù)所制備者。此人類抗體的定義明確排除包括非人類抗原結(jié)合殘基的人類化抗體。

「親和力成熟」抗體是在其一或多個(gè)HVR中存在一或多處改變的抗體，這些改變的結(jié)果會(huì)使這些抗體比沒有彼等改變的親代抗體更改良對(duì)抗原的親和力。在一實(shí)施例中，親和力成熟抗體對(duì)靶抗原具有毫微莫耳或甚至皮莫耳親和力。親和力成熟抗體是藉由業(yè)內(nèi)已知程序產(chǎn)生。Marks等人，Bio/Technology 10:779-783(1992)闡述藉由VH及VL結(jié)構(gòu)域改組達(dá)成親和力成熟。CDR及/或框架殘基的隨機(jī)突變誘發(fā)闡述于以下文獻(xiàn)中：Barbas等人，Proc Nat.Acad.Sci.USA 91:3809-3813(1994)；Schier等人，Gene 169:147-155(1995)；Yelton等人，J.Immunol.155:1994-2004(1995)；Jackson等人，J.Immunol.154(7):3310-9(1995)；及Hawkins等人，J.Mol.Biol.226:889-896(1992)。

「阻斷性」抗體或「拮抗劑」抗體是抑制或降低所結(jié)合抗原的生物活性的抗體。某些阻斷性抗體或拮抗劑抗體實(shí)質(zhì)上或完全地抑制抗原的生物活性。

本文所用的「激動(dòng)劑抗體」是模擬所關(guān)注多肽的功能活性中的至少一者的抗體。

「病癥」是任一受益于本發(fā)明抗體的治療的病狀。此包含慢性及急性病癥或疾病，包含使哺乳動(dòng)物易患所討論病癥的彼等病理學(xué)病狀。本文擬治療病癥的非限制性實(shí)例包含癌癥。

術(shù)語「細(xì)胞增殖性病癥」及「增殖性病癥」是指與一定程度的異常細(xì)胞增殖有關(guān)的病癥。在一實(shí)施例中，細(xì)胞增殖性病癥是癌癥。

本文所用的「腫瘤」是指所有腫瘤性細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖(無論是惡性的抑還是良性的)以及所有癌前期及癌性細(xì)胞及組織。本文中所提及的術(shù)語「癌癥」、「癌性」、「細(xì)胞增殖性病癥」、「增殖性病癥」及「腫瘤」并不相互排斥。

術(shù)語「癌癥」及「癌性」通常是指或闡述哺乳動(dòng)物的特征通常在于細(xì)胞生長(zhǎng)/增殖失調(diào)的生理學(xué)病狀。癌癥的實(shí)例包含但不限于癌瘤、淋巴瘤(例如何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)及非何杰金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma))、母細(xì)胞瘤、肉瘤及白血病。這些癌癥的更特定實(shí)例包含鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌、肺鱗狀癌瘤、腹膜癌、肝細(xì)胞癌、胃腸癌、胰臟癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細(xì)胞瘤、乳癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜或子宮癌瘤、唾液腺癌瘤、腎癌、肝癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌瘤、白血病及其他淋巴組織增殖性病癥及各種類型的頭頸癌。

如本文中所使用，術(shù)語「抗原」定義為任一能夠誘發(fā)免疫反應(yīng)的物質(zhì)。

如本文中所使用，術(shù)語「抗原特異性」是指供應(yīng)特定抗原或抗原片段造成特異性細(xì)胞增殖的一種細(xì)胞群體的性質(zhì)。

如本文中所使用，「治療」是指試圖改變所治療個(gè)體或細(xì)胞的自然過程的臨床介入，且可用于預(yù)防或在臨床病理學(xué)過程期間實(shí)施。治療的期望效應(yīng)包含防止疾病發(fā)生或復(fù)發(fā)、緩解癥狀、減少疾病的任何直接或間接病理結(jié)果、防止或降低發(fā)炎及/或組織/器官損害、降低疾病進(jìn)展速率、改善或緩和疾病狀態(tài)，及緩解或改良預(yù)后。在一些實(shí)施例中，使用本發(fā)明抗體來延遲疾病或病癥的發(fā)生。

「?jìng)€(gè)體(individual或subject)」是脊椎動(dòng)物。在某些實(shí)施例中，脊椎動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物包含(但不限于)農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物(例如牛)、運(yùn)動(dòng)動(dòng)物、寵物(例如貓、狗及馬)、靈長(zhǎng)類動(dòng)物、小鼠及大鼠。在某些實(shí)施例中，脊椎動(dòng)物是人類。

用于治療目的的「哺乳動(dòng)物」是指任何歸類為哺乳動(dòng)物的動(dòng)物，包含人類、家畜及農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物，以及動(dòng)物園動(dòng)物、運(yùn)動(dòng)動(dòng)物或?qū)櫸?例如狗、馬、貓、牛等)。在某些實(shí)施例中，哺乳動(dòng)物是人類。

「有效量」是指在所需劑量及時(shí)間段內(nèi)有效達(dá)成期望治療或預(yù)防結(jié)果的量。

本發(fā)明的物質(zhì)/分子的「治療有效量」可根據(jù)諸如以下因素而變化：個(gè)體的疾病狀態(tài)、年齡、性別及體重，以及物質(zhì)/分子于所述個(gè)體內(nèi)引發(fā)期望反應(yīng)的能力。治療有效量亦為物質(zhì)/分子的治療有益效應(yīng)勝過其任何毒性或有害效應(yīng)的量。「預(yù)防有效量」是指在所需劑量及時(shí)間段內(nèi)有效達(dá)成期望預(yù)防結(jié)果的量。通常(但未必)，因預(yù)防劑量是在患病之前或患病早期用于個(gè)體中，故預(yù)防有效量會(huì)小于治療有效量。

本文所用的術(shù)語「細(xì)胞毒性劑」是指抑制或阻止細(xì)胞功能及/或引起細(xì)胞破壞的物質(zhì)。所述術(shù)語意欲包含放射性同位素(例如At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²、Pb²¹²及Lu的放射性同位素)；化學(xué)治療劑(例如胺甲蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamicin)、長(zhǎng)春花生物堿(長(zhǎng)春新堿(vincristine)、長(zhǎng)春堿(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法侖(melphalan)、絲裂霉素C(mitomycin C)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、道諾霉素(daunorubicin)或其他嵌入劑)；酶及其片段，例如溶核酶；抗生素；及毒素，例如細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物來源的小分子毒素或酶活性毒素，包含其片段及/或變體；及下文所揭示的各種抗腫瘤劑或抗癌劑。其他細(xì)胞毒性劑闡述于下文中。殺腫瘤劑引起腫瘤細(xì)胞破壞。

「化學(xué)治療劑」是可用于治療癌癥的化學(xué)化合物。化學(xué)治療劑的實(shí)例包含烷基化劑，例如噻替哌(thiotepa)及(環(huán)磷酰胺(cyclosphosphamide))；磺酸烷基酯，例如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮雜環(huán)丙烷，例如苯得哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米得哌(meturedopa)及烏得哌(uredopa)；伸乙基亞胺及甲基蜜胺，包含六甲蜜胺(altretamine)、三伸乙基嘧胺、三伸乙基磷酰胺、三伸乙基硫代磷酰胺及三羥甲基嘧胺；多聚乙酰(尤其布拉他辛(bullatacin)及布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氫大麻酚(屈大麻酚(dronabinol)、)；β-拉帕醌(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙堿(colchicine)；樺木酸；喜樹堿(camptothecin)(包含合成類似物托泊替康(topotecan)CPT-11(伊立替康(irinotecan)，)、乙酰基喜樹堿(acetylcamptothecin)、莨菪素及9-胺基喜樹堿)；苔蘚蟲素(bryostatin)；卡利司他汀(callystatin)；CC-1065(包含其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)及比折來新(bizelesin)合成類似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸；替尼泊苷(teniposide)；念珠藻素(cryptophycin)(尤其念珠藻素1及念珠藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；多卡米星(duocarmycin)(包含合成類似物KW-2189及CB1-TM1)；艾榴素(eleutherobin)；水鬼蕉堿(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海綿抑制素(spongistatin)；氮芥，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlomaphazine)、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥、美法侖、新氮芥(novembichin)、苯乙酸氮芥膽甾醇酯(phenesterine)、潑尼氮芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；亞硝基脲，例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)及雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，例如烯二炔抗生素(例如卡奇霉素(calicheamicin)，尤其卡奇霉素γ1I及卡奇霉素ωI 1(例如參見Agnew,Chem.Intl.Ed.Engl.,33:183-186(1994))；達(dá)內(nèi)霉素(dynemicin)，包含達(dá)內(nèi)霉素A；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素發(fā)色團(tuán)(neocarzinostatin chromophore)及有關(guān)色蛋白烯二炔抗生素發(fā)色團(tuán))、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放線菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、偶氮絲胺酸、博來霉素(bleomycin)、放線菌素c(cactinomycin)、卡拉比星(carabicin)、洋紅霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、更生霉素(dactinomycin)、道諾霉素、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-側(cè)氧基-L-正白胺基、多柔比星(包含嗎啉基-多柔比星、氰基嗎啉基-多柔比星、2-吡咯啉并-多柔比星及脫氧阿霉素)、泛艾霉素(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、埃達(dá)霉素(idarubicin)、麻西羅霉素(marcellomycm)、絲裂霉素(例如絲裂霉素C)、霉酚酸、諾加霉素(nogalamycin)、橄欖霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、波弗霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三鐵阿霉素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈脲菌素(streptozocin)、殺結(jié)核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、凈司他汀(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝劑，例如胺甲蝶呤及5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，例如二甲葉酸(denopterin)、胺甲蝶呤、蝶羅呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，例如氟達(dá)拉濱(fludarabine)、6-巰嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，例如安西他濱(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-阿扎尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿醣胞苷(cytarabine)、二脫氧尿苷、脫氧氟尿苷、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素，例如卡普睪酮(calusterone)、丙酸甲雄烷酮(dromostanolone propionate)、環(huán)硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪內(nèi)酯(testolactone)；抗腎上腺劑，例如胺魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補(bǔ)充劑，例如亞葉酸；醋葡醛內(nèi)酯；醛磷酰胺醣苷；胺基酮戊酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；貝斯特布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依達(dá)曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鳥胺酸(elfornithine)；依利乙銨(elliptinium acetate)；埃坡霉素(epothilone)；依托格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；香菇多醣；氯尼達(dá)明(lonidamine)；類美坦辛(maytansinoids)，例如美坦辛(maytansine)及安絲菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；美得眠(mopidanmol)；硝基胺；噴司他汀(pentostatin)；蛋胺氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；多醣復(fù)合物(JHS Natural Products,Eugene,Oreg.)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofuran)；鍺螺胺(spirogermanium)；替奴佐酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2′,2″-三氯三乙胺；單端孢霉烯(trichothecene)(尤其T-2毒素、疣孢菌素A(verracurin A)、桿孢菌素A(roridin A)及蛇形菌索(anguidine))；烏拉坦(urethan)；長(zhǎng)春地辛(vindesine)達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)；甘露氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛(wèi)矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加賽特辛(gacytosine)；阿醣胞苷(arabinoside)(「Ara-C」)；噻替哌(thiotepa)；類紫杉醇(taxoid)，例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、太平洋紫杉醇的無克列莫佛(Cremophor)、經(jīng)白蛋白改造的奈米顆粒調(diào)配物(ABRAXANE^TM)(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Ill.)及多西紫杉醇(doxetaxel)(-Poulenc Rorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥；吉西他濱(gemcitabine)6-硫鳥嘌呤；巰嘌呤；胺甲蝶呤；鉑類似物，例如順鉑(cisplatin)及卡鉑(carboplatin)；長(zhǎng)春堿鉑；依托泊苷(VP-16)；異環(huán)磷酰胺；米托蒽醌；長(zhǎng)春新堿奧沙利鉑(oxaliplatin)；醛氫葉酸；長(zhǎng)春瑞濱(vinorelbine)諾肖林(novantrone)；依達(dá)曲沙(edatrexate)；道諾霉素(daunomycin)；胺基蝶呤(aminopterin)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；類視色素，例如視黃酸；卡培他濱(capecitabine)上述藥劑中任一者的醫(yī)藥上可接受的鹽、酸或衍生物；以及上述藥劑中的兩者或更多者的組合，例如環(huán)磷酰胺、多柔比星、長(zhǎng)春新堿及潑尼松龍(prednisolone)的組合療法的縮寫CHOP及利用與5-FU及醛氫葉酸組合的奧沙利鉑(ELOXATIN^TM)的治療方案的縮寫FOLFOX。

如本文中所使用，「治療」是指試圖改變所治療個(gè)體或細(xì)胞的自然過程的臨床介入，且可用于預(yù)防或在臨床病理學(xué)過程期間實(shí)施。治療的期望效應(yīng)包含防止疾病發(fā)生或復(fù)發(fā)、緩解癥狀、減少疾病的任何直接或間接病理結(jié)果、防止或降低發(fā)炎及/或組織/器官損害、降低疾病進(jìn)展速率、改善或緩和疾病狀態(tài)及緩解或改良預(yù)后。在一些實(shí)施例中，使用本發(fā)明抗體來延遲疾病或病癥的發(fā)生。

「?jìng)€(gè)體(individual或subject)」是脊椎動(dòng)物。在某些實(shí)施例中，脊椎動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物包含(但不限于)農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物(例如牛)、運(yùn)動(dòng)動(dòng)物、寵物(例如貓、狗及馬)、靈長(zhǎng)類動(dòng)物、小鼠及大鼠。在某些實(shí)施例中，脊椎動(dòng)物是人類。

用于治療目的的「哺乳動(dòng)物」是指任何歸類為哺乳動(dòng)物的動(dòng)物，包含人類、家畜及農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物，以及動(dòng)物園動(dòng)物、運(yùn)動(dòng)動(dòng)物或?qū)櫸?例如狗、馬、貓、牛等)。在某些實(shí)施例中，哺乳動(dòng)物是人類。

「有效量」是指在所需劑量及時(shí)間段內(nèi)有效達(dá)成期望治療或預(yù)防結(jié)果的量。

本發(fā)明的物質(zhì)/分子的「治療有效量」可根據(jù)諸如以下因素而變化：個(gè)體的疾病狀態(tài)、年齡、性別及體重，以及物質(zhì)/分子于所述個(gè)體內(nèi)引發(fā)期望反應(yīng)的能力。治療有效量亦為物質(zhì)/分子的治療有益效應(yīng)勝過其任何毒性或有害效應(yīng)的量?！割A(yù)防有效量」是指在所需劑量及時(shí)間段內(nèi)有效達(dá)成期望預(yù)防結(jié)果的量。通常(但未必)，因預(yù)防劑量是在患病之前或患病早期用于個(gè)體中，故預(yù)防有效量會(huì)小于治療有效量。

本文所用的術(shù)語「細(xì)胞毒性劑」是指抑制或阻止細(xì)胞功能及/或引起細(xì)胞破壞的物質(zhì)。所述術(shù)語意欲包含放射性同位素(例如At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²、Pb²¹²及Lu的放射性同位素)；化學(xué)治療劑(例如胺甲蝶呤、阿霉素、長(zhǎng)春花生物堿(長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、依托泊苷)、多柔比星、美法侖、絲裂霉素C、苯丁酸氮芥、道諾霉素或其他嵌入劑)；酶及其片段，例如溶核酶；抗生素；及毒素，例如來自細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物來源的小分子毒素或酶活性毒素，包含其片段及/或變體；及下文所揭示的各種抗腫瘤劑或抗癌劑。其他細(xì)胞毒性劑闡述于下文中。殺腫瘤劑引起腫瘤細(xì)胞破壞。

與一或多種其他治療劑「組合」投與包含以任一順序同時(shí)(并行)及連續(xù)投與。

醣抗體

自培養(yǎng)物中的哺乳動(dòng)物細(xì)胞所產(chǎn)生重組蛋白的醣基化是確保有效使用治療抗體的重要過程(Goochee等人，1991；Jenkins及Curling,1994)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)遞送并不皆具有相同性質(zhì)的醣基化模式的異質(zhì)混合物。這些醣基化模式可影響諸如治療性蛋白質(zhì)的安全性、功效及血清半衰期等性質(zhì)。已藉由研發(fā)新穎種類的單株抗體(稱為「醣抗體」)來成功解決醣型異質(zhì)性問題。

術(shù)語「醣抗體」是由發(fā)明者Dr.Chi-Huey Wong創(chuàng)造，其是指在Fc上具有單一均勻醣型的單株抗體(優(yōu)選地治療性單株抗體)的均質(zhì)群體。構(gòu)成均質(zhì)群體的個(gè)別醣抗體相同，結(jié)合相同表位，且含有具有充分定義的聚醣結(jié)構(gòu)及序列的相同F(xiàn)c聚醣。

可自在細(xì)胞中產(chǎn)生的單株抗體、優(yōu)選地治療性單株抗體生成醣抗體。醣抗體可市面有售或處于研發(fā)中。用于治療性應(yīng)用的單株抗體可為人類化、人類或嵌合單株抗體。用于治療應(yīng)用的經(jīng)批準(zhǔn)單株抗體的實(shí)例包含但不限于莫羅單抗(Muromomab)、阿昔單抗(Abciximab)、利妥昔單抗(Rituximab)、達(dá)克珠單抗(Daclizumab)、巴利昔單抗(Basiliximab)、帕利珠單抗(Palivizumab)、英夫利昔單抗、曲妥珠單抗(Trastuzumab)、依那西普、吉姆單抗(Gemtuzumab)、阿來組單抗(Alemtuzumab)、伊布莫單抗(Ibritomomab)、阿達(dá)木單抗、阿來塞普(Alefacept)、奧馬珠單抗(Omalizumab)、依法珠單抗(Efalizumab)、西妥昔單抗(Cetuximab)、貝伐珠單抗(Bevacizumab)、那他珠單抗(Natalizumab)、蘭尼單抗(Ranibizumab)、帕尼單抗(Panitumumab)、艾庫珠單抗(Eculizumab)及賽妥珠單抗。

本文闡述藉由Fc醣改造衍生自治療性單株抗體的功能活性醣抗體。具有優(yōu)化醣型的醣抗體與治療性單株抗體相比展現(xiàn)類似或優(yōu)選的活性。具有優(yōu)化醣型的醣抗體預(yù)計(jì)可提供用于治療性應(yīng)用的替代方式。

抗TNFα醣抗體

單核球及巨噬球因應(yīng)于內(nèi)毒素或其他刺激分泌稱為腫瘤壞死因子-α(TNFα)及腫瘤壞死因子-β(TNFβ)的細(xì)胞介素。TNFα是17kD蛋白質(zhì)亞單位的可溶性同源三聚體(Smith,等人，J.Biol.Chem.262:6951-6954(1987))。亦存在膜結(jié)合26kD前體形式的TNF(Kriegler等人，Cell 53:45-53(1988))。TNF-α是發(fā)炎性反應(yīng)的強(qiáng)力誘導(dǎo)劑，是先天免疫性的關(guān)鍵調(diào)控劑且在調(diào)控針對(duì)細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌及某些病毒感染的Th1免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。然而，失調(diào)TNF亦可有助于諸多病理學(xué)情況。這些病理性情況包含免疫介導(dǎo)的發(fā)炎性疾病(IMID)，包含類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克羅恩氏病(Crohn's disease)、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、潰瘍性結(jié)腸炎及嚴(yán)重慢性斑塊狀牛皮癬。

本揭示內(nèi)容描述新穎種類的抗TNFα單株抗體，稱為「抗TNFα醣抗體」(「抗TNFα GAb」)?？筎NFα醣抗體可自抗TNFα單株抗體(「親代抗體」)由Fc醣改造生成。本文所用的術(shù)語「親代抗體」是指用于產(chǎn)生抗TNFα醣抗體的抗TNFα單株抗體。構(gòu)成均質(zhì)群體的個(gè)別抗TNFα醣抗體相同且含有具有充分定義的聚醣結(jié)構(gòu)及序列的相同F(xiàn)c聚醣。本發(fā)明的抗TNFα醣抗體可結(jié)合人類TNFα抗原的相同表位作為其親代抗體。

親代抗體可在諸如哺乳動(dòng)物細(xì)胞、嗜甲醇酵母菌或昆蟲細(xì)胞等細(xì)胞中產(chǎn)生。優(yōu)選地，親代抗體是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生。親代抗體可為FDA批準(zhǔn)或正處于研發(fā)中。經(jīng)批準(zhǔn)或處于研發(fā)中的抗TNFα單株抗體包含英夫利昔單抗、阿達(dá)木單抗、戈利木單抗(Golimumab)、CDP870(賽妥珠單抗)、TNF-TeAb及CDP571。

本發(fā)明的抗TNFα醣抗體可包括具有SEQ ID NO:1中所陳述氨基酸序列的重鏈及具有SEQ ID NO:2中所陳述氨基酸序列的輕鏈。本發(fā)明的抗TNFα醣抗體可包括阿達(dá)木單抗的輕鏈序列及重鏈序列。

下表1展示阿達(dá)木單抗的重鏈及輕鏈序列

表1.

如本文所闡述，N-聚醣可連接至Fc區(qū)的Asn-297。

本發(fā)明的N-聚醣具有Man₃GlcNAc₂的共有五醣核心，其亦稱為「三甘露醣核心」或「五醣核心」，其中「Man」是指甘露醣，「Glc」是指葡萄醣，「NAc」是指N-乙酰基，且GlcNAc是指N-乙酰基葡醣胺。

本文所闡述的N-聚醣可具有雙觸角結(jié)構(gòu)。

N-聚醣可具有鏈內(nèi)取代，包括「二等分(bisecting)」GlcNAc。在聚醣于三甘露醣核心上包括二等分GlcNAc時(shí)，所述結(jié)構(gòu)表示為Man₃GlcNAc₃。在聚醣包括連接至三甘露醣核心的核心巖藻醣時(shí)，所述結(jié)構(gòu)表示為Man₃GlcNAc₂(F)。N-聚醣可包括一或多個(gè)末端唾液酸(例如N-乙?；窠?jīng)胺酸)。表示為「Sia」的結(jié)構(gòu)是指末端唾液酸。唾液酸化可發(fā)生于雙觸角結(jié)構(gòu)的α1-3或α1-6臂上。

本文所闡述的N-聚醣可包括至少一個(gè)α2–6末端唾液酸。在一些實(shí)施例中，N-聚醣包括一個(gè)α2-6末端唾液酸。在一優(yōu)選實(shí)施例中，N-聚醣包括兩個(gè)α2-6末端唾液酸。

N-聚醣可包括至少一個(gè)α2–3末端唾液酸。在某些實(shí)施例中，N-聚醣包括一個(gè)α2-3末端唾液酸。在一優(yōu)選實(shí)施例中，N-聚醣包括兩個(gè)α2-3末端唾液酸。

N-聚醣可包括至少一種半乳醣。在某些實(shí)施例中，N-聚醣包括一種半乳醣。在一優(yōu)選實(shí)施例中，N-聚醣包括兩種半乳醣。

N-聚醣可發(fā)生巖藻醣基化或去巖藻醣基化。優(yōu)選地，N-聚醣發(fā)生巖藻醣基化。

表2列示抗TNFα醣抗體中的實(shí)例性N-聚醣。本揭示內(nèi)容實(shí)施例可包含或不包含本文所列示的任一N-聚醣。

表2.

實(shí)例性抗TNFα醣抗體的制備

本發(fā)明的抗TNFα醣抗體可自抗TNFα單株抗體(「親代抗體」)由Fc醣改造產(chǎn)生。在一些實(shí)施例中，親代抗體是阿達(dá)木單抗

本文闡述制備巖藻醣基化醣抗體的方法，所述方法包括以下步驟：(a)使單株抗體與至少一種醣苷內(nèi)切酶接觸，由此得到在Fc上具有二醣(GlcNAc-Fuc)的抗體，及(b)在適宜條件下將碳水化合物部分添加至二醣的GlcNAc中。

本發(fā)明方法中的單株抗體可為抗TNFα單株抗體。在一些實(shí)施例中，抗TNFα單株抗體是阿達(dá)木單抗、英夫利昔單抗或依那西普。

本發(fā)明方法中所使用的醣苷內(nèi)切酶可為EndoA、EndoF、EndoF1、EndoF2、EndoF3、EndoH、EndoM、EndoS或其變體。

在本發(fā)明方法中，藉由向GlcNAc中添加碳水化合物部分以延伸醣鏈來實(shí)施步驟(b)中使用轉(zhuǎn)醣苷酶之后續(xù)酶介導(dǎo)的醣基化。轉(zhuǎn)醣苷酶的實(shí)例包含(但不限于)EndoA、EndoF、EndoF1、EndoF2、EndoF3、EndoH、EndoM、EndoS及其變體。

業(yè)內(nèi)眾所周知，使用醣惡唑啉作為醣供體進(jìn)行醣基化可用于合成寡醣，因?yàn)轷被磻?yīng)是加成反應(yīng)且其進(jìn)行并不伴隨任何酸、水或諸如此類的去除(Fujita等人，Biochim.Biophys.Acta 2001,1528,9–14)。

在一些實(shí)施例中，碳水化合物部分是醣惡唑啉。

在一些實(shí)施例中，碳水化合物部分是選自由以下組成的群：Sia₂(α2-6)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc、Sia(α2-6)GalGlcNAc₂Man₃Glc NAc、Sia₂(α2-3)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc、Sia2(α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc、Sia₂(α2-3/α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc、Sia₂(α2-6/α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc、Sia₂(α2-6)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc(F)、Sia(α2-6)GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc(F)、Sia₂(α2-3)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc(F)、Sia₂(α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc(F)、Sia₂(α2-3/α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc(F)及Sia₂(α2-6/α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc(F)。

本文所述者亦包含制備去巖藻醣基化醣抗體的改良方法，所述方法包括以下步驟：(a)使單株抗體與α-巖藻醣苷酶及至少一種醣苷內(nèi)切酶接觸，由此得到在Fc上具有單醣(GlcNAc)的抗體，及(b)在適宜條件下將碳水化合物部分添加至GlcNAc中。

本發(fā)明改良方法中的單株抗體可為抗TNFα單株抗體。在一些實(shí)施例中，抗TNFα單株抗體是阿達(dá)木單抗。

本發(fā)明改良方法的α-巖藻醣苷酶包括含有與SEQ ID NO:5的序列具有至少85％一致性的氨基酸序列的多肽、其功能變體。

α-巖藻醣苷酶可包括含有與SEQ ID NO:5的序列(列示于表3中)具有至少約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％一致性的氨基酸序列的多肽、其變體或片段。在某些實(shí)施例中，α-巖藻醣苷酶是重組類桿菌α-巖藻醣苷酶。

應(yīng)理解，本發(fā)明的α-巖藻醣苷酶的多肽可進(jìn)行衍生或改質(zhì)以有助于其分離或純化。因此，在本發(fā)明的一實(shí)施例中，藉由添加能夠直接及特異性結(jié)合分離構(gòu)件的配體來衍生或改質(zhì)用于本發(fā)明的多肽。另一選擇為，藉由添加結(jié)合對(duì)的一個(gè)成員來衍生或改質(zhì)多肽且分離構(gòu)件包括藉由添加結(jié)合對(duì)的另一成員來衍生或改質(zhì)的試劑?？墒褂萌魏芜m宜結(jié)合對(duì)。在藉由添加結(jié)合對(duì)的一個(gè)成員來衍生或改質(zhì)用于本發(fā)明的多肽的一優(yōu)選實(shí)施例中，多肽優(yōu)選地加組胺酸卷標(biāo)或加生物素卷標(biāo)。通常，在基因?qū)用嫔习M胺酸或生物素卷標(biāo)的氨基酸編碼序列且蛋白質(zhì)重組表達(dá)于大腸桿菌(E.coli.)中。組胺酸或生物素標(biāo)簽通常存在于多肽的一端(在N-末端或C-末端處)。組胺酸標(biāo)簽通常是由6個(gè)組胺酸殘基組成，但其可長(zhǎng)于此長(zhǎng)度(通常長(zhǎng)達(dá)7、8、9、10或20個(gè)氨基酸)或較短(例如5、4、3、2或1個(gè)氨基酸)。另外，組胺酸標(biāo)簽可含有一或多種氨基酸取代、優(yōu)選地如上文所定義的保守取代。

如本文所闡述的變體多肽是彼等氨基酸序列自SEQ ID NO:5中的氨基酸序列有所變化者，但與包括具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽的酶展現(xiàn)相同或類似功能。

如本文中所使用，關(guān)于序列的序列一致性百分比(％)定義為在比對(duì)序列且引入間隙(若需要)以達(dá)成最大百分比序列之后，候選多肽序列中與參考多肽序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的一致性百分比。出于確定序列一致性百分比的目的，比對(duì)可以熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者所熟知的多種方式來達(dá)成，例如使用可公開獲得的計(jì)算機(jī)軟件，例如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟件。彼等熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者可測(cè)定用于量測(cè)比對(duì)的適當(dāng)參數(shù)，包含在所比較序列的全長(zhǎng)范圍內(nèi)達(dá)成最大比對(duì)所需要的任何算法。

本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施例顯示于實(shí)例中。

醫(yī)藥組合物及調(diào)配物

在制備如本文所闡述的抗TNFα GAb之后，可產(chǎn)生「預(yù)凍干調(diào)配物」。用于制備調(diào)配物的抗TNFα GAb優(yōu)選地基本上純且期望地基本上均質(zhì)(亦即不含污染蛋白質(zhì)等)。「基本上純」蛋白質(zhì)意指基于組合物的總重量包括至少約90重量％蛋白質(zhì)、優(yōu)選地至少約95重量％的組合物?！富旧暇|(zhì)」蛋白質(zhì)意指基于組合物的總重量包括至少約99重量％蛋白質(zhì)的組合物。在某些實(shí)施例中，蛋白質(zhì)是抗體。

考慮期望劑量體積、投與模式等來確定預(yù)凍干調(diào)配物中的抗TNFα GAb量。在所選蛋白質(zhì)是完整抗體(全長(zhǎng)抗體)的情形下，約2mg/mL至約50mg/mL、優(yōu)選地約5mg/mL至約40mg/mL及最佳地約20-30mg/mL是實(shí)例性起始蛋白質(zhì)濃度。蛋白質(zhì)通常存在于溶液中。舉例而言，蛋白質(zhì)可存在于pH為約4-8及優(yōu)選地約5-7的pH緩沖溶液中。實(shí)例性緩沖劑包含組胺酸、磷酸鹽、Tris、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽及其他有機(jī)酸。緩沖劑濃度可為約1mM至約20mM或約3mM至約15mM，此端視(例如)緩沖劑及調(diào)配物(例如復(fù)原調(diào)配物)的期望等滲性而定。優(yōu)選緩沖劑是組胺酸，其中如下文所顯示此可具有凍干保護(hù)性質(zhì)。經(jīng)證實(shí)，琥珀酸鹽為另一有用緩沖劑。

將凍干保護(hù)劑添加至預(yù)凍干調(diào)配物中。在優(yōu)選實(shí)施例中，凍干保護(hù)劑是非還原醣，例如蔗醣或海藻醣。預(yù)凍干調(diào)配物中凍干保護(hù)劑的量通常應(yīng)使得在復(fù)原后所得調(diào)配物等滲。然而，高滲復(fù)原調(diào)配物亦可適宜。此外，凍干保護(hù)劑的量不應(yīng)過低而使蛋白質(zhì)在凍干后發(fā)生不可接受的程度的降解/聚集。在凍干保護(hù)劑是醣(例如蔗醣或海藻醣)且蛋白質(zhì)是抗體的情形下，預(yù)凍干調(diào)配物中的實(shí)例性凍干保護(hù)劑濃度為約10mM至約400mM及優(yōu)選地約30mM至約300mM及最佳地約50mM至約100mM。

選擇用于每一蛋白質(zhì)及凍干保護(hù)劑的蛋白質(zhì)對(duì)凍干保護(hù)劑的組合比率。在使用抗體作為所選蛋白質(zhì)且使用醣(例如蔗醣或海藻醣)作為凍干保護(hù)劑以用于生成具有高蛋白質(zhì)濃度的等滲復(fù)原調(diào)配物的情形下，凍干保護(hù)劑對(duì)抗體的莫耳比率可為約100莫耳至約1500莫耳凍干保護(hù)劑對(duì)1莫耳抗體及優(yōu)選地約200莫耳至約1000莫耳凍干保護(hù)劑對(duì)1莫耳抗體、例如約200莫耳至約600莫耳凍干保護(hù)劑對(duì)1莫耳抗體。

在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，已發(fā)現(xiàn)期望將表面活性劑添加至預(yù)凍干調(diào)配物中。另一選擇為，或此外，可將表面活性劑添加至凍干調(diào)配物及/或復(fù)原調(diào)配物中。實(shí)例性表面活性劑包含非離子型表面活性劑，例如聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20或80)；泊洛沙姆(poloxamer)(例如泊洛沙姆188)；曲拉通(Triton)；十二烷基硫酸鈉(SDS)；月桂基硫酸鈉；辛基醣苷鈉；月桂基-、肉豆蔻基-、亞麻油基-或硬脂?；?磺基甜菜堿；月桂基-、肉豆蔻基-、亞麻油基-或硬脂?；?肌胺酸；亞麻油基-、肉豆蔻基-或鯨蠟基-甜菜堿；月桂酰胺基丙基-、椰子酰胺基丙基-、亞麻油酰胺基丙基-、肉豆蔻酰胺基丙基-、棕櫚油酰胺基丙基-或異硬脂酰胺基丙基-甜菜堿(例如月桂酰胺基丙基)；肉豆蔻酰胺基丙基-、棕櫚油酰胺基丙基-或異硬脂酰胺基丙基-二甲胺；甲基椰油基牛黃酸鈉或甲基油基?；撬岫c；及MONAQUAT系列(Mona Industries公司，Paterson,N.J.)、聚乙二醇、聚丙二醇及乙二醇與丙二醇的共聚物(例如Pluronics、PF68等)。所添加表面活性劑的量應(yīng)可減少?gòu)?fù)原蛋白質(zhì)的聚集并使在復(fù)原后微粒的形成最小化。舉例而言，表面活性劑可以約0.001-0.5％及優(yōu)選地約0.005-0.05％的量存在于預(yù)凍干調(diào)配物中。

在本發(fā)明的某些實(shí)施例中，在制備預(yù)凍干調(diào)配物時(shí)使用凍干保護(hù)劑(例如蔗醣或海藻醣)及增積劑(例如甘露醇或甘胺酸)的混合物。增積劑可使得產(chǎn)生均勻凍干餅狀物且其中并無過量氣穴等。

其他醫(yī)藥上可接受的載劑、賦形劑或穩(wěn)定劑(例如彼等闡述于Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.編輯(1980)中者)可包含于預(yù)凍干調(diào)配物(及/或凍干調(diào)配物及/或復(fù)原調(diào)配物)中，前提是其不會(huì)不利地影響調(diào)配物的期望特性?？山邮艿妮d劑、賦形劑或穩(wěn)定劑在所用劑量及濃度下對(duì)接受者無毒且包含：額外緩沖劑；防腐劑；共溶劑；抗氧化劑，包含抗壞血酸及甲硫胺酸；螯合劑，例如EDTA；金屬錯(cuò)合物(例如Zn-蛋白質(zhì)錯(cuò)合物)；生物可降解聚合物，例如聚酯；及/或成鹽抗衡離子，例如鈉。

本文所闡述的醫(yī)藥組合物及調(diào)配物優(yōu)選地較為穩(wěn)定?！阜€(wěn)定」調(diào)配物/組合物是以下物質(zhì)：其中抗體在儲(chǔ)存后基本上保持其物理及化學(xué)穩(wěn)定性及完整性。用于量測(cè)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的各種分析技術(shù)在業(yè)內(nèi)可獲得且綜述于Peptide and Protein Drug Delivery,247-301,Vincent Lee編輯，Marcel Dekker公司，New York,N.Y.,Pubs.(1991)及Jones,A.Adv.Drug Delivery Rev.10:29-90(1993)中。可于所選時(shí)間段的所選溫度下量測(cè)穩(wěn)定性。

用于活體內(nèi)投與的調(diào)配物必須無菌。此易于藉由過濾經(jīng)由無菌過濾膜在凍干及復(fù)原之前或之后達(dá)成。另一選擇為，舉例而言，可藉由在約120℃下對(duì)除蛋白質(zhì)外的成份實(shí)施高壓滅菌約30分鐘來達(dá)成整個(gè)混合物的無菌性。

在將蛋白質(zhì)、凍干保護(hù)劑及其他可選組份混合至一起之后，將調(diào)配物凍干。許多不同凍干劑可用于此目的，例如(Hull,USA)或(Leybold-Heraeus,Germany)凍干劑。冷凍-干燥是藉由冷凍調(diào)配物且隨后使來自冷凍內(nèi)容物的冰在適于初級(jí)干燥的溫度下升華來達(dá)成。在此條件下，產(chǎn)物溫度低于調(diào)配物的共熔點(diǎn)或陷縮溫度。通常，在通常介于約50毫托至250毫托之間的適宜壓力下，用于初級(jí)干燥的擱板溫度將介于約-30℃至25℃之間(前提是產(chǎn)物在初級(jí)干燥期間保持冷凍)。容納試樣的容器(例如玻璃小瓶)的調(diào)配物、大小及類型以及液體體積主要取決于干燥所需之時(shí)間，其可介于幾小時(shí)至數(shù)天(例如40-60hr)之間。二級(jí)干燥階段可在約0-40℃下實(shí)施，其主要取決于容器的類型及大小及所采用蛋白質(zhì)的類型。然而，在本文中發(fā)現(xiàn)，二級(jí)干燥步驟可能未必需要。舉例而言，凍干的整個(gè)除水期中的擱板溫度可介于約15℃-30℃(例如約20℃)之間。二級(jí)干燥所需的時(shí)間及壓力將使得產(chǎn)生適宜凍干餅狀物，此端視(例如)溫度及其他參數(shù)而定。二級(jí)干燥時(shí)間取決于產(chǎn)物中的期望殘余水分含量，且通常持續(xù)至少約5小時(shí)(例如10-15小時(shí))。壓力可與初級(jí)干燥步驟期間所采用的壓力相同。冷凍-干燥條件可端視調(diào)配物及小瓶大小而變化。

在一些情況下，可期望在容器中凍干蛋白質(zhì)調(diào)配物，其中復(fù)原蛋白質(zhì)以避免轉(zhuǎn)移步驟。此情況下的容器可為(例如)3、5、10、20、50或100cc小瓶。作為一般主張，凍干將得到凍干調(diào)配物，其中其水分含量小于約5％及優(yōu)選地小于約3％。

在期望階段、通常在向患者投與蛋白質(zhì)時(shí)，可使用稀釋劑復(fù)原凍干調(diào)配物，從而復(fù)原調(diào)配物中的蛋白質(zhì)濃度為至少50mg/mL、例如約50mg/mL至約400mg/mL、更佳地約80mg/mL至約300mg/mL及最佳地約90mg/mL至約150mg/mL。復(fù)原調(diào)配物中的這些高蛋白質(zhì)濃度可視為尤其可用于預(yù)期皮下遞送復(fù)原調(diào)配物的情形。然而，對(duì)于其他投與途徑(例如靜脈內(nèi)投與)而言，可能期望復(fù)原調(diào)配物中的蛋白質(zhì)濃度較低(例如在復(fù)原調(diào)配物中約5-50mg/mL或約10-40mg/mL蛋白質(zhì))。在某些實(shí)施例中，復(fù)原調(diào)配物中的蛋白質(zhì)濃度顯著高于預(yù)凍干調(diào)配物。舉例而言，復(fù)原調(diào)配物中的蛋白質(zhì)濃度可為預(yù)凍干調(diào)配物的約2-40倍、優(yōu)選地3-10倍及最佳地3-6倍(例如至少三倍或至少四倍)。

此外，本揭示內(nèi)容亦提供適于單一療法或組合療法的組合醫(yī)藥組合物，其包括本文所闡述的實(shí)質(zhì)上均質(zhì)醣抗體及其他抗體及/或其他治療劑。醫(yī)藥組合物可以共同調(diào)配物形式投與或以共同投與治療方案使用。

通常在約25℃的溫度下進(jìn)行復(fù)原，以確保完全水合，但可視需要采用其他溫度。復(fù)原所需的時(shí)間將端視(例如)稀釋劑的類型、賦形劑及蛋白質(zhì)的量而定。稀釋劑實(shí)例包含無菌水、注射用抑菌水(BWFI)、pH緩沖溶液(例如磷酸鹽緩沖鹽水)、無菌鹽水溶液、林格氏溶液(Ringer's solution)或右旋糖溶液。稀釋劑視情況含有防腐劑。防腐劑實(shí)例已在上文中加以闡述，且諸如芐醇或酚醇等芳族醇為優(yōu)選防腐劑。藉由評(píng)估不同防腐劑濃度與蛋白質(zhì)及防腐劑功效測(cè)試的兼容性來決定所采用防腐劑的量。舉例而言，若防腐劑是芳族醇(例如芐醇)，則其可以約0.1％-2.0％及優(yōu)選地約0.5％-1.5％但最佳地約1.0％-1.2％的量存在。優(yōu)選地，復(fù)原調(diào)配物具有小于6000個(gè)顆粒/小瓶，這些顆粒的大小>10μm。

免疫偶聯(lián)物

在另一態(tài)樣中，本發(fā)明提供免疫偶聯(lián)物或抗體-藥物偶聯(lián)物(ADC)，其包括偶聯(lián)至細(xì)胞毒性劑(例如化學(xué)治療劑)、藥物、生長(zhǎng)抑制劑、毒素(例如細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物來源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(亦即放射性偶聯(lián)物)的抗體。

使用抗體-藥物偶聯(lián)物局部遞送細(xì)胞毒性劑或細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑(亦即在癌癥治療中殺死或抑制腫瘤細(xì)胞的藥物)(Syrigos及Epenetos(1999)Anticancer Research 19:605-614；Niculescu-Duvaz及Springer(1997)Adv.Drg Del.Rev.26:151-172；美國(guó)專利第4,975,278號(hào))容許藥物部分體靶向遞送至腫瘤且累積在細(xì)胞內(nèi)，而全身性投與這些未偶聯(lián)藥物藥劑則可能對(duì)正常細(xì)胞及欲消除的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生不可接受程度的毒性(Baldwin等人(1986)Lancet(Mar.15,1986):第603-05頁；Thorpe,(1985)「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review」,Monoclonal Antibodies'84:Biological And Clinical Applications,A.Pinchera等人(編輯)，第475-506頁)。由此尋求具有最小毒性的最大功效。已報(bào)導(dǎo)多株抗體及單株抗體二者均可用于這些策略中(Rowland等人(1986)Cancer Immunol.Immunother.,21:183-87)。這些方法中所使用的藥物包含道諾霉素、多柔比星、胺甲喋呤及長(zhǎng)春地辛(Rowland等人(1986)，見上文)?？贵w-毒素偶聯(lián)物中所使用的毒素包含細(xì)菌毒素(例如白喉毒素(diphtheria toxin))、植物毒素(例如蓖麻毒素)、小分子毒素(例如格爾德霉素(geldanamycin)(Mandler等人(2000)Jour.of the Nat.Cancer Inst.92(19):1573-1581；Mandler等人(2000)Bioorganic&Med.Chem.Letters 10:1025-1028；Mandler等人(2002)Bioconjugate Chem.13:786-791)、類美登素(maytansinoid)(EP 1391213；Liu等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:8618-8623))及卡奇霉素(calicheamicin)(Lode等人(1998)Cancer Res.58:2928；Hinman等人(1993)Cancer Res.53:3336-3342)。毒素可藉由包含微管蛋白結(jié)合、DNA結(jié)合或拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制的機(jī)制來實(shí)現(xiàn)其細(xì)胞毒性及細(xì)胞生長(zhǎng)抑制效應(yīng)。當(dāng)偶聯(lián)至大抗體或蛋白質(zhì)受體配體時(shí)，一些細(xì)胞毒性藥物傾向?yàn)闊o活性或具有較小活性。

抗體衍生物

可進(jìn)一步改質(zhì)本發(fā)明抗體以含有業(yè)內(nèi)已知且易于獲得的其他非蛋白質(zhì)性部分。在一實(shí)施例中，適于衍生抗體的部分是水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性實(shí)例包含但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纖維素、右旋糖酐、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯啶酮、聚-1,3-二氧雜環(huán)戊烷、聚-1,3,6-三惡烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或無規(guī)共聚物)及右旋糖酐或聚(n-乙烯基吡咯啶酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚環(huán)氧丙烷/環(huán)氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛可因其在水中具有穩(wěn)定性而在制造方面具有優(yōu)勢(shì)。聚合物可具有任何分子量，且可為具支鏈或不具支鏈。連接至抗體的聚合物的數(shù)量可有所變化，且若連接一個(gè)以上的聚合物，則聚合物可為相同或不同分子。通常，用于衍生的聚合物的數(shù)量及/或類型可基于包含但不限于以下在內(nèi)的考慮因素來確定：欲改良抗體的特定性質(zhì)或功能、抗體衍生物是否將用于界定條件下的療法等。

在另一實(shí)施例中，提供抗體與非蛋白質(zhì)性部分的偶聯(lián)物，其可藉由暴露于輻射來選擇性加熱。在一實(shí)施例中，非蛋白質(zhì)性部分是碳奈米管(Kam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.102:11600-11605(2005))。輻射可具有任一波長(zhǎng)，且包含但不限于如下波長(zhǎng)的輻射：其不會(huì)危害正常細(xì)胞，但將非蛋白質(zhì)性部分加熱至可將毗鄰抗體-非蛋白質(zhì)性部分的細(xì)胞殺死的溫度。

治療應(yīng)用

自體免疫性病癥是重大且廣泛的醫(yī)學(xué)問題。舉例而言，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是在美國(guó)影響200萬以上人的自體免疫性疾病。RA引起關(guān)節(jié)的慢性發(fā)炎且通常是可引起關(guān)節(jié)破壞及功能失能的進(jìn)展性病況。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病因未知，但基因誘因、感染劑及環(huán)境因素皆與疾病的病因有關(guān)。在活動(dòng)性RA中，癥狀可包含疲乏、食欲缺乏、低熱、肌肉及關(guān)節(jié)疼痛與僵硬。另外，在疾病發(fā)作期間，因滑膜發(fā)炎，關(guān)節(jié)通常變得發(fā)紅、腫脹、疼痛及觸痛。另外，因RA是全身性疾病，故發(fā)炎可影響身體中除關(guān)節(jié)外的器官及區(qū)域，包含眼睛及口腔的腺、肺內(nèi)襯、心包及血管。

腫瘤壞死因子α(TNF-α)是藉由諸多細(xì)胞類型(包含單核球及巨噬球)產(chǎn)生的細(xì)胞介素，其最初是基于其誘導(dǎo)某些小鼠腫瘤的壞死的能力來鑒別。隨后，稱為惡病質(zhì)素的因子(與惡病質(zhì)有關(guān))展示與TNF-α相同。TNF-α與諸多其他人類疾病及病癥(包含休克、敗血癥、感染、自體免疫性疾病、RA、克羅恩氏病、移植排斥及移植物抗宿主病)的病理生理學(xué)有關(guān)。

本揭示內(nèi)容提供治療人類的TNF介導(dǎo)的發(fā)炎性疾病的方法，所述方法包括向有需要的人類投與發(fā)炎有效量的實(shí)例性抗TNFα醣抗體或其抗原結(jié)合片段及本文所闡述的其醫(yī)藥調(diào)配物/組合物。

本發(fā)明方法的實(shí)例性發(fā)炎性疾病可選自以下群：發(fā)炎性腸病(包含潰瘍性結(jié)腸炎及克羅恩氏病)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎及幼年型特發(fā)性關(guān)節(jié)炎。

本發(fā)明一或多個(gè)實(shí)施例的詳細(xì)內(nèi)容陳述于下文說明書中。根據(jù)下列圖式及若干實(shí)施例的詳細(xì)說明亦及隨附申請(qǐng)專利范圍，本發(fā)明的其他特征或優(yōu)點(diǎn)將顯而易見。

本發(fā)明包含下列實(shí)例以證明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例。彼等熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者應(yīng)了解，下列實(shí)例中揭示的技術(shù)代表本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)在實(shí)踐本發(fā)明中運(yùn)行良好的技術(shù)，且因此可認(rèn)為構(gòu)成其實(shí)踐的優(yōu)選方式。然而，彼等熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者借助于本揭示內(nèi)容應(yīng)了解，可對(duì)所揭示特定實(shí)施例作出多種改變且仍獲得相同或類似結(jié)果，此并不背離本發(fā)明的精神及范圍。

實(shí)例

實(shí)例1：用于分析抗TNFα的N-醣基化的一般程序

研發(fā)質(zhì)譜方法以藉由施加至醣肽前體的碰撞誘導(dǎo)解離(CID)能量監(jiān)測(cè)寡醣源片段離子(水合氫離子)的產(chǎn)率。水合氫離子的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)方法可達(dá)成對(duì)未來生物類似治療劑的常規(guī)質(zhì)量控制分析的規(guī)章性要求。

將5ug阿達(dá)木單抗(購(gòu)自Abbvie)溶于25ul 2M胍-HCl中，且添加二硫蘇醣醇(DTT)至最終濃度為5mM。在110℃培育10分鐘之后，將經(jīng)還原半胱胺酸殘基在37℃下于10mM碘乙酰胺(IAA)中實(shí)施烷基化1小時(shí)。添加5mM DTT以在室溫下淬滅過量IAA 10分鐘。將產(chǎn)物在50mM碳酸氫銨中稀釋15次，然后使用旋轉(zhuǎn)管柱進(jìn)行微量離心(10kDa蛋白質(zhì)截留MW)。使用1:25(w/w)的酶:蛋白質(zhì)比率在37℃下實(shí)施胰蛋白酶消化4小時(shí)。將試樣在-20℃下冷凍以用于LC-MS/MS分析。

儀器

藉由m/z 204水合氫離子(HexNAc)監(jiān)測(cè)使用具有Aglient 1200 HPLC系統(tǒng)的4000QTrap三相四極柱質(zhì)譜儀(AB Sciex)實(shí)施醣肽量化。為相對(duì)量化醣肽微異質(zhì)性，在計(jì)算機(jī)上獲得前體離子m/z，其涵蓋所有可能聚醣組合物，且監(jiān)測(cè)每一前體離子的單一定量轉(zhuǎn)變(Q3m/z＝204)。

MS數(shù)據(jù)分析

使用Analyst 1.5(AB Sciex)處理所獲取原始數(shù)據(jù)。將每一轉(zhuǎn)變的質(zhì)量層析圖且藉由峰面積進(jìn)行量化。針對(duì)所有組合組份的總和來計(jì)算每一組份的百分比組成。

實(shí)例2：實(shí)例性抗TNFα GAb的生成

抗TNFα GAb301

藉助PNGase F自阿達(dá)木單抗的Fc區(qū)完全去除Asn²⁹⁷處的N-連接聚醣，且使用4-12％Bis-Tris NeuPAGE及來自經(jīng)改質(zhì)及未改質(zhì)IgG的胰蛋白酶醣肽的LC-MS/MS分析進(jìn)行評(píng)估。使用胰蛋白酶醣肽的分子量測(cè)定每一天門冬酰胺酸處的N-連接醣基化的潛在位點(diǎn)且有助于闡明主要聚醣的物質(zhì)。

抗TNFα GAb200

將存于磷酸鈉緩沖劑(50mM,pH 7.0,1.25mL)中的阿達(dá)木單抗(2.5mg)與Endo S(125μg)在37℃下一起培育5h以得到阿達(dá)木單抗(抗TNFα GAb200)的Fc上的二醣(GlcNAc-Fuc)。在使用磷酸鈉緩沖劑(20mM,pH 7.0)預(yù)平衡的蛋白質(zhì)A-瓊脂樹脂(1mL)的管柱上對(duì)反應(yīng)混合物實(shí)施親和層析。使用磷酸鈉緩沖劑(20mM,pH 7.0,10mL)洗滌管柱。使用甘胺酸-HCl(50mM,pH 3.0,10mL)釋放結(jié)合的IgG，且立即使用Tris-Cl緩沖劑(1.0M,pH 8.3)中和洗脫部分。合并含有Fc片段的部分且藉由離心過濾(Amicon Ultra離心過濾器，Millipore,Billerica,MA)濃縮以得到抗TNFα GAb201。產(chǎn)物經(jīng)過胰蛋白酶處理，且使用奈米噴霧LC/MS分析醣肽TKPREEQYNSTYR及EEQYNSTYR以證實(shí)GAb200的醣基化模式?？筎NFα GAb200的N-聚醣特征分析的結(jié)果展示于圖1中。

抗TNFα GAb201

將存于磷酸鈉緩沖劑(50mM,pH 7.0,1.25mL)中的阿達(dá)木單抗(2.5mg)與Endo S(125μg)及重組類桿菌α-L-巖藻醣苷酶(2.5mg)的混合物在37℃下一起培育5h以得到阿達(dá)木單抗(抗TNFα GAb201)的Fc上的單醣(GlcNAc)。在使用磷酸鈉緩沖劑(20mM,pH 7.0)預(yù)平衡的蛋白質(zhì)A-瓊脂樹脂(1mL)的管柱上對(duì)反應(yīng)混合物實(shí)施親和層析。使用磷酸鈉緩沖劑(20mM,pH 7.0,10mL)洗滌管柱。使用甘胺酸-HCl(50mM,pH 3.0,10mL)釋放結(jié)合的IgG，且立即使用Tris-Cl緩沖劑(1.0M,pH 8.3)中和洗脫部分。合并含有Fc片段的部分且藉由離心過濾(Amicon Ultra離心過濾器，Millipore,Billerica,MA)濃縮以得到抗TNFα GAb201。產(chǎn)物經(jīng)過胰蛋白酶處理，且使用奈米噴霧LC/MS分析醣肽、TKPREEQYNSTYR及EEQYNSTYR以證實(shí)GAb201的醣基化模式。

抗TNFα GAb101

根據(jù)公開方法自雞蛋黃分離唾液酸醣肽(SGP)。簡(jiǎn)言之，離心雞蛋黃的酚提取物，過濾，且藉由層析管柱(包含Sephadex G-50、Sephadex G-25、DEAE-Toyoperarl 650M、CM-Sephadex C-25及Sephadex G-25)純化。將存于磷酸鈉緩沖劑(50mM,pH 6.0,5mM)中的唾液酸醣肽(SGP)(52mg)的溶液與Endo M(53μg)在37℃下一起培育。在7小時(shí)之后，在藉由水洗脫的Sephadex G-25管柱上對(duì)反應(yīng)混合物實(shí)施凝膠過濾層析。合并含有產(chǎn)物的部分且凍干以得到白色粉末產(chǎn)物(聚醣-101)(30mg，產(chǎn)率為82％)。

將存于水中的聚醣-101(Sia₂(α2-6)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc)(30mg)、2-氯-1,3-二甲基咪唑啉鎓氯化物(DMC)(62.7mg)及Et₃N(89μL)的溶液在4℃下攪拌1h。在Sephadex G-25管柱上對(duì)反應(yīng)混合物實(shí)施凝膠過濾層析且藉由0.05％Et₃N水溶液洗脫。合并含有產(chǎn)物的部分(聚醣惡唑啉-101)且凍干以得到白色粉末。

將聚醣惡唑啉-101添加至存于50mM Tris緩沖劑(pH 7.8)中的醣苷內(nèi)切酶及Gab 201的混合物中且在室溫下培育一小時(shí)。使用蛋白質(zhì)A親和力管柱純化反應(yīng)混合物，隨后使用陰離子交換管柱capto Q純化以收集期望產(chǎn)物抗TNFα GAb101。產(chǎn)物經(jīng)過胰蛋白酶處理，且使用奈米噴霧LC/MS分析醣肽、TKPREEQYNSTYR及EEQYNSTYR以證實(shí)GAb101的醣基化模式。

抗TNFα GAb104

將存于水中的聚醣-104(Sia₂(α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc)(30mg)、2-氯-1,3-二甲基咪唑啉鎓氯化物(DMC)(64mg)及Et₃N(95μL)的溶液在4℃下攪拌1h。在Sephadex G-25管柱上對(duì)反應(yīng)混合物實(shí)施凝膠過濾層析且藉由0.05％Et₃N水溶液洗脫。合并含有產(chǎn)物的部分(聚醣惡唑啉-104)且凍干以得到白色粉末。

將聚醣惡唑啉-104添加至存于50mM Tris緩沖劑(pH 7.8)中的醣苷內(nèi)切酶及GAb201的混合物中且在室溫下培育一小時(shí)。使用蛋白質(zhì)A親和力管柱純化反應(yīng)混合物，隨后使用陰離子交換管柱capto Q純化以收集期望產(chǎn)物抗TNFα GAb104。產(chǎn)物經(jīng)過胰蛋白酶處理，且使用奈米噴霧LC/MS分析醣肽、TKPREEQYNSTYR及EEQYNSTYR以證實(shí)GAb104的醣基化模式。

抗TNFα GAb107

將存于水中的聚醣-107(Sia₂(α2-3)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc)(30mg)、2-氯-1,3-二甲基咪唑啉鎓氯化物(DMC)(62.7mg)及Et₃N(89μL)的溶液在4℃下攪拌1h。在Sephadex G-25管柱上對(duì)反應(yīng)混合物實(shí)施凝膠過濾層析且藉由0.05％Et₃N水溶液洗脫。合并含有產(chǎn)物的部分(聚醣惡唑啉-107)且凍干以得到白色粉末。

將聚醣惡唑啉-107添加至存于50mM Tris緩沖劑(pH 7.8)中的醣苷內(nèi)切酶及GAb201的混合物中且在室溫下培育一小時(shí)。使用蛋白質(zhì)A親和力管柱純化反應(yīng)混合物，隨后使用陰離子交換管柱capto Q純化以收集期望產(chǎn)物抗TNFα GAb107。產(chǎn)物經(jīng)過胰蛋白酶處理，且使用奈米噴霧LC/MS分析醣肽、TKPREEQYNSTYR及EEQYNSTYR以證實(shí)GAb107的醣基化模式。

抗TNFα GAb109

將存于水中的聚醣-109(Sia₂(α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc)(30mg)、2-氯-1,3-二甲基咪唑啉鎓氯化物(DMC)(64mg)及Et₃N(95μL)的溶液在4℃下攪拌1h。在Sephadex G-25管柱上對(duì)反應(yīng)混合物實(shí)施凝膠過濾層析且藉由0.05％Et₃N水溶液洗脫。合并含有產(chǎn)物的部分(聚醣惡唑啉-109)且凍干以得到白色粉末。

將聚醣惡唑啉-109添加至存于50mM Tris緩沖劑(pH 7.8)中的醣苷內(nèi)切酶及GAb201的混合物中且在室溫下培育一小時(shí)。使用蛋白質(zhì)A親和力管柱純化反應(yīng)混合物，隨后使用陰離子交換管柱capto Q純化以收集期望產(chǎn)物抗TNFα GAb109。產(chǎn)物經(jīng)過胰蛋白酶處理，且使用奈米噴霧LC/MS分析醣肽、TKPREEQYNSTYR及EEQYNSTYR以證實(shí)GAb109的醣基化模式。

抗TNFα GAb401

根據(jù)公開方法自雞蛋黃分離唾液酸醣肽(SGP)。簡(jiǎn)言之，離心雞蛋黃的酚提取物，過濾，且藉由層析管柱(包含Sephadex G-50、Sephadex G-25、DEAE-Toyoperarl 650M、CM-Sephadex C-25及Sephadex G-25)純化。將存于磷酸鈉緩沖劑(50mM,pH 6.0,5mM)中的唾液酸醣肽(SGP)(52mg)的溶液與Endo M(53μg)在37℃下一起培育。在7小時(shí)之后，在藉由水洗脫的Sephadex G-25管柱上對(duì)反應(yīng)混合物實(shí)施凝膠過濾層析。合并含有產(chǎn)物的部分且凍干以得到白色粉末產(chǎn)物(聚醣-101)(30mg，產(chǎn)率為82％)。

將存于水中的聚醣-101(Sia₂(α2-6)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc)(30mg)、2-氯-1,3-二甲基咪唑啉鎓氯化物(DMC)(62.7mg)及Et₃N(89μL)的溶液在4℃下攪拌1h。在Sephadex G-25管柱上對(duì)反應(yīng)混合物實(shí)施凝膠過濾層析且藉由0.05％Et₃N水溶液洗脫。合并含有產(chǎn)物的部分(聚醣惡唑啉-401)且凍干以得到白色粉末。

將聚醣惡唑啉-401添加至存于50mM Tris緩沖劑(pH 7.8)中的醣苷內(nèi)切酶及GAb 200的混合物中且在室溫下培育一小時(shí)。使用蛋白質(zhì)A親和力管柱純化反應(yīng)混合物，隨后使用陰離子交換管柱capto Q純化以收集期望產(chǎn)物抗TNFα GAb401。產(chǎn)物經(jīng)過胰蛋白酶處理，且使用奈米噴霧LC/MS分析醣肽、TKPREEQYNSTYR及EEQYNSTYR以證實(shí)GAb401的醣基化模式。N-聚醣特征分析的結(jié)果展示于圖1中。

抗TNFα GAb404

將存于水中的聚醣-104(Sia₂(α2-6)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc)(30mg)、2-氯-1,3-二甲基咪唑啉鎓氯化物(DMC)(64mg)及Et₃N(95μL)的溶液在4℃下攪拌1h。在Sephadex G-25管柱上對(duì)反應(yīng)混合物實(shí)施凝膠過濾層析且藉由0.05％Et₃N水溶液洗脫。合并含有產(chǎn)物的部分(聚醣惡唑啉-404)且凍干以得到白色粉末。

將聚醣惡唑啉-404添加至存于50mM Tris緩沖劑(pH 7.8)中的醣苷內(nèi)切酶及GAb200的混合物中且在室溫下培育一小時(shí)。使用蛋白質(zhì)A親和力管柱純化反應(yīng)混合物，隨后使用陰離子交換管柱capto Q純化以收集期望產(chǎn)物抗TNFα GAb404。產(chǎn)物經(jīng)過胰蛋白酶處理，且使用奈米噴霧LC/MS分析醣肽、TKPREEQYNSTYR及EEQYNSTYR以證實(shí)GAb404的醣基化模式。

抗TNFα GAb407

將存于水中的聚醣-107(Sia₂(α2-3)Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc)(30mg)、2-氯-1,3-二甲基咪唑啉鎓氯化物(DMC)(62.7mg)及Et₃N(89μL)的溶液在4℃下攪拌1h。在Sephadex G-25管柱上對(duì)反應(yīng)混合物實(shí)施凝膠過濾層析且藉由0.05％Et₃N水溶液洗脫。合并含有產(chǎn)物的部分(聚醣惡唑啉-407)且凍干以得到白色粉末。

將聚醣惡唑啉-407添加至存于50mM Tris緩沖劑(pH 7.8)中的醣苷內(nèi)切酶及Gab 200的混合物中且在室溫下培育一小時(shí)。使用蛋白質(zhì)A親和力管柱純化反應(yīng)混合物，隨后使用陰離子交換管柱capto Q純化以收集期望產(chǎn)物抗TNFα GAb407。產(chǎn)物經(jīng)過胰蛋白酶處理，且使用奈米噴霧LC/MS分析醣肽、TKPREEQYNSTYR及EEQYNSTYR以證實(shí)GAb407的醣基化模式。

抗TNFα GAb409

將存于水中的聚醣-109(Sia₂(α2-3)Gal₂GlcNAc₃Man₃GlcNAc)(30mg)、2-氯-1,3-二甲基咪唑啉鎓氯化物(DMC)(64mg)及Et₃N(95μL)的溶液在4℃下攪拌1h。在Sephadex G-25管柱上對(duì)反應(yīng)混合物實(shí)施凝膠過濾層析且藉由0.05％Et₃N水溶液洗脫。合并含有產(chǎn)物的部分(聚醣惡唑啉-409)且凍干以得到白色粉末。

將聚醣惡唑啉-409添加至存于50mM Tris緩沖劑(pH 7.8)中的醣苷內(nèi)切酶及Gab 200的混合物中且在室溫下培育一小時(shí)。使用蛋白質(zhì)A親和力管柱純化反應(yīng)混合物，隨后使用陰離子交換管柱capto Q純化以收集期望產(chǎn)物抗TNFα GAb409。產(chǎn)物經(jīng)過胰蛋白酶處理，且使用奈米噴霧LC/MS分析醣肽、TKPREEQYNSTYR及EEQYNSTYR以證實(shí)GAb409的醣基化模式。

實(shí)例3：實(shí)例性抗TNFα GAb的結(jié)合親和力

在大腸桿菌(PROSPEC)中產(chǎn)生含有158個(gè)氨基酸的人類重組TNF-α(MW＝17.5kDa)且純化。滴定重組人類TNF-α蛋白質(zhì)且在HBS-EP緩沖劑中制備50nM、25nM、12.5nM、6.25nM及3.125nM的連續(xù)稀釋液。將阿達(dá)木單抗及抗TNFα GAb 200及401在HBS-EP緩沖劑中稀釋至10μg/ml的濃度，且然后捕獲至預(yù)固定抗人類Fc結(jié)構(gòu)域抗體的CM5芯片上。然后以30μl/min的流速注入連續(xù)濃度的重組人類TNF-α作為分析物且結(jié)合至芯片上的所捕獲抗體。在結(jié)合之后，藉由再生緩沖劑10mM pH1.5甘胺酸-HCl以50μl/min的流速洗滌抗體-分析物復(fù)合物。將CM5芯片在4℃下維持于pH7.4PBS中以共進(jìn)一步使用。使用Biacore T200評(píng)估軟件將單一循環(huán)動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)擬合至1:1結(jié)合模型以量測(cè)平衡常數(shù)(Ka/Kd)。圖2中的結(jié)果展示，GAb200、GAb401及阿達(dá)木單抗的結(jié)合親和力常數(shù)相當(dāng)且介于1.27至1.95E-11M之間。

實(shí)例4：實(shí)例性抗TNFα GAb與FcγRIIIA的結(jié)合親和力

自經(jīng)轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞系純化FcγRIIIA重組蛋白，且然后以0.5ug/mL在ELISA涂覆緩沖劑(50mM Na₂CO₃,50mM NaHCO₃,pH10)中制備。將抗TNFα GAb在2％BSA/PBST中自150nM 5倍滴定至1.54*10^-5nM，且然后施加至預(yù)固定重組FcγRIIIA的ELISA板上。在室溫下培育1小時(shí)之后，使用抗人類IgG-HRP在室溫下于2％BSA/TBST中將板處理0.5hr。在使用TBST洗滌3次之后，添加色原體以產(chǎn)生顏色且然后藉由添加2.5N H₂SO₄終止。在OD450下讀取吸亮度，且藉由軟件SoftMax Pro 6.0獲得EC₅₀。表4中之結(jié)果展示，抗TNFα GAb101及GAb401與Humira相比在EC₅₀及最大結(jié)合程度方面展現(xiàn)較強(qiáng)FcγRIIIA結(jié)合親和力。

表4.

·相對(duì)于Humira的增加倍數(shù)。

實(shí)例性實(shí)施例中的Fc受體結(jié)合增加至少約1.35倍、1.5倍、1.75倍、2倍、2.5倍、3倍或更高。

序列表

<110> 中央研究院

<120> 抗TNF-α醣抗體及其用途

<130> G2112-00902

<140> PCT/US2015/032737

<141> 2015-05-27

<150> 62/110,338

<151> 2015-01-30

<150> 62/020,199

<151> 2014-07-02

<150> 62/003,908

<151> 2014-05-28

<160> 6

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 224

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述:合成多肽

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

<210> 2

<211> 248

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述:合成多肽

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

210 215 220

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr

225 230 235 240

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

245

<210> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述:合成肽

<400> 3

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

1 5 10

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述:合成肽

<400> 4

Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

1 5

<210> 5

<211> 414

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述:合成多肽

<400> 5

Gln Gln Lys Tyr Gln Pro Thr Glu Ala Asn Leu Lys Ala Arg Ser Glu

1 5 10 15

Phe Gln Asp Asn Lys Phe Gly Ile Phe Leu His Trp Gly Leu Tyr Ala

20 25 30

Met Leu Ala Thr Gly Glu Trp Thr Met Thr Asn Asn Asn Leu Asn Tyr

35 40 45

Lys Glu Tyr Ala Lys Leu Ala Gly Gly Phe Tyr Pro Ser Lys Phe Asp

50 55 60

Ala Asp Lys Trp Val Ala Ala Ile Lys Ala Ser Gly Ala Lys Tyr Ile

65 70 75 80

Cys Phe Thr Thr Arg His His Glu Gly Phe Ser Met Phe Asp Thr Lys

85 90 95

Tyr Ser Asp Tyr Asn Ile Val Lys Ala Thr Pro Phe Lys Arg Asp Val

100 105 110

Val Lys Glu Leu Ala Asp Ala Cys Ala Lys His Gly Ile Lys Leu His

115 120 125

Phe Tyr Tyr Ser His Ile Asp Trp Tyr Arg Glu Asp Ala Pro Gln Gly

130 135 140

Arg Thr Gly Arg Arg Thr Gly Arg Pro Asn Pro Lys Gly Asp Trp Lys

145 150 155 160

Ser Tyr Tyr Gln Phe Met Asn Asn Gln Leu Thr Glu Leu Leu Thr Asn

165 170 175

Tyr Gly Pro Ile Gly Ala Ile Trp Phe Asp Gly Trp Trp Asp Gln Asp

180 185 190

Ile Asn Pro Asp Phe Asp Trp Glu Leu Pro Glu Gln Tyr Ala Leu Ile

195 200 205

His Arg Leu Gln Pro Ala Cys Leu Val Gly Asn Asn His His Gln Thr

210 215 220

Pro Phe Ala Gly Glu Asp Ile Gln Ile Phe Glu Arg Asp Leu Pro Gly

225 230 235 240

Glu Asn Thr Ala Gly Leu Ser Gly Gln Ser Val Ser His Leu Pro Leu

245 250 255

Glu Thr Cys Glu Thr Met Asn Gly Met Trp Gly Tyr Lys Ile Thr Asp

260 265 270

Gln Asn Tyr Lys Ser Thr Lys Thr Leu Ile His Tyr Leu Val Lys Ala

275 280 285

Ala Gly Lys Asp Ala Asn Leu Leu Met Asn Ile Gly Pro Gln Pro Asp

290 295 300

Gly Glu Leu Pro Glu Val Ala Val Gln Arg Leu Lys Glu Val Gly Glu

305 310 315 320

Trp Met Ser Lys Tyr Gly Glu Thr Ile Tyr Gly Thr Arg Gly Gly Leu

325 330 335

Val Ala Pro His Asp Trp Gly Val Thr Thr Gln Lys Gly Asn Lys Leu

340 345 350

Tyr Val His Ile Leu Asn Leu Gln Asp Lys Ala Leu Phe Leu Pro Ile

355 360 365

Val Asp Lys Lys Val Lys Lys Ala Val Val Phe Ala Asp Lys Thr Pro

370 375 380

Val Arg Phe Thr Lys Asn Lys Glu Gly Ile Val Leu Glu Leu Ala Lys

385 390 395 400

Val Pro Thr Asp Val Asp Tyr Val Val Glu Leu Thr Ile Asp

405 410

<210> 6

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述:合成 6xHis 標(biāo)記

<220>

<223> 取代及優(yōu)選態(tài)樣的詳細(xì)描述見申請(qǐng)時(shí)說明書

<400> 6

His His His His His His

1 5