本申請(qǐng)主張于2014年8月27日提出的美國臨時(shí)申請(qǐng)No.62/042,710、2014年12月2日提出的美國臨時(shí)申請(qǐng)No.62/086,376及2015年3月18日提出的美國臨時(shí)申請(qǐng)No.62/134,661的優(yōu)先權(quán)，各申請(qǐng)通過引用整體并入本發(fā)明。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明提供了包括組合治療的用于治療癌癥的方法。特別地，本發(fā)明提供了包含Wnt途徑抑制劑與有絲分裂抑制劑組合的方法用于治療癌癥和其他疾病。

背景技術(shù)：

癌癥是發(fā)達(dá)國家的主要死因之一，僅在美國每年就有大約160萬人被診斷出癌癥而且有超過500,000例死亡。整體來說，預(yù)期每3人中超過1人會(huì)在有生之年發(fā)展出某些形式的癌。有超過200種不同的癌癥，其中四種：乳癌、肺癌、結(jié)直腸癌及前列腺癌，占美國所有新病例的一半以上(Siegel et al.,2012,CA:A Cancer J.for Clin.,62:10-29)。

信號(hào)傳導(dǎo)途徑通常連接細(xì)胞外信號(hào)至細(xì)胞核，導(dǎo)致直接或間接控制細(xì)胞生長、分化、存活、及死亡的基因表達(dá)。在許多種類的癌癥中，信號(hào)傳導(dǎo)途徑失調(diào)且可能與腫瘤起始以及/或進(jìn)展有關(guān)。與人癌癥發(fā)生有關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑包括但不限于Wnt途徑、Ras-Raf-MEK-ERK或MAPK途徑、PI3K-AKT途徑、CDKN2A/CDK4途徑、Bcl-2/TP53途徑、及缺口(Notch)途徑。

Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑已被鑒定為癌癥治療的目標(biāo)。Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑是胚胎模式形成、后胚胎組織維持及干細(xì)胞生物學(xué)的若干重要調(diào)節(jié)因子之一。更特別地，Wnt信號(hào)傳導(dǎo)在細(xì)胞極性的產(chǎn)生和包括干細(xì)胞族群自我更新的細(xì)胞命運(yùn)決定中發(fā)揮重要作用。未受調(diào)節(jié)的Wnt途徑活化與許多人癌癥有關(guān)，一般相信該活化可改變細(xì)胞的發(fā)育命運(yùn)。活化Wnt途徑可能使腫瘤細(xì)胞維持在未分化狀態(tài)以及/或?qū)е虏皇芸刂频脑錾?。癌癥通過破壞控制正常發(fā)育及組織修復(fù)的恒定機(jī)構(gòu)而發(fā)生和進(jìn)展(于Reya&Clevers,2005,Nature,434:843-50；Beachy et al.,2004,Nature,432:324-31中評(píng)述)。

Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑首先在果蠅發(fā)育突變無翅(wg)以及小鼠原致癌基因int-1(現(xiàn)稱Wnt1)中闡述(Nusse&Varmus,1982,Cell,31:99-109；Van Ooyen&Nusse,1984,Cell,39:233-40；Cabrera et al.,1987,Cell,50:659-63；Rijsewijk et al.,1987,Cell,50:649-57)。Wnt基因編碼經(jīng)脂質(zhì)修飾的分泌糖蛋白，在哺乳動(dòng)物中已識(shí)別出其中的19種。這些分泌型配體活化由卷曲(FZD)受體家族成員及低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5或6(LRP5/6)組成的受體復(fù)合體。FZD受體是G蛋白偶合受體(GPCR)超家族的七個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，以及包含胞外N端配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，N端配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有10個(gè)保守性半胱氨酸，被稱為多半胱氨酸區(qū)(CRD)或Fri結(jié)構(gòu)域。有十種人FZD受體，F(xiàn)ZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9及FZD10。不同的FZD CRD對(duì)特定Wnt蛋白有不同的結(jié)合親和性(Wu&Nusse,2002,J.Biol.Chem.,277:41762-9)，并且，F(xiàn)ZD受體已被分成活化典型β-鏈蛋白途徑者及活化非典型途徑者(Miller et al.,1999,Oncogene,18:7860-72)。

Wnt信號(hào)傳導(dǎo)在癌癥中的角色，首先是因?yàn)樽R(shí)別Wnt1(原名int1)為通過鄰近插入小鼠病毒而轉(zhuǎn)化的乳房腫瘤的致癌基因而被發(fā)現(xiàn)(Nusse&Varmus,1982,Cell,31:99-109)。Wnt信號(hào)傳導(dǎo)在乳癌中的角色的其他證據(jù)已隨著時(shí)間的推移而累積。舉例來說，β-鏈蛋白于小鼠乳腺中的轉(zhuǎn)基因過度表達(dá)導(dǎo)致增生及腺癌(Imbert et al.,2001,J.Cell Biol.,153:555-68；Michaelson&Leder,2001,Oncogene,20:5093-9)，然而喪失Wnt信號(hào)傳導(dǎo)擾亂正常乳腺發(fā)育(Tepera et al.,2003,J.Cell Sci.,116:1137-49；Hatsell et al.,2003,J.Mammary Gland Biol.Neoplasia,8:145-58)。在人乳癌中，β-鏈蛋白累積表明超過50％的癌中有經(jīng)活化的Wnt信號(hào)傳導(dǎo)，雖然特定突變尚未被識(shí)別，但已觀察到卷曲受體表達(dá)上調(diào)(Brennan&Brown,2004,J.Mammary Gland Biol.Neoplasia,9:119-31；Malovanovic et al.,2004,Int.J.Oncol.,25:1337-42)。

Wnt途徑的活化亦與大腸直腸癌有關(guān)。所有大腸直腸癌中的大約5至10％為遺傳性，其中主要形式之一為家族性腺瘤息肉癥(FAP)。FAP是一種體染色體顯性疾病，其中大約80％的受影響個(gè)體包含大腸腺瘤息肉(APC)基因的種系突變。另外也在包括Axin及β-鏈蛋白的其他Wnt途徑成分發(fā)現(xiàn)突變。個(gè)別腺瘤為包含第二失活等位基因的上皮細(xì)胞的種系過度生長，并且大量FAP腺瘤不可避免地導(dǎo)致腺癌經(jīng)由致癌基因以及/或抑瘤基因的額外突變發(fā)生。另外，Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑的活化，其包括APC的功能喪失突變及β-鏈蛋白的穩(wěn)定突變，可誘導(dǎo)小鼠模型中的增生發(fā)育及腫瘤生長(Oshima et al.,1997,Cancer Res.,57:1644-9；Harada et al.,1999,EMBO J.,18:5931-42)。

在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中，β-鏈蛋白和APC突變是罕見的，但是Wnt信號(hào)傳導(dǎo)在NSCLC細(xì)胞系中是重要的，并且Wnt抑制降低增殖。若干Wnt蛋白和其他Wnt途徑組分的過表達(dá)在切除的NSCLC中是常見的，并且與不良預(yù)后相關(guān)。Wnt抑制劑的下調(diào)(例如通過高甲基化)在NSCLC腫瘤細(xì)胞系和被切除的樣品中是常見的，并且可能與不良預(yù)后相關(guān)。因此，數(shù)據(jù)表明Wnt信號(hào)傳導(dǎo)影響NSCLC腫瘤發(fā)生、預(yù)后和對(duì)治療的抗性(Tennis et al.,2007,J.of Thoracic Oncology,2:889-892；Stewart,2014,JNCI,106:djt356)。

本發(fā)明的目標(biāo)之一是提供改進(jìn)的癌癥治療的方法，特別是使用Wnt途徑抑制劑與有絲分裂抑制劑組合的策略性時(shí)間間隔(即交錯(cuò)或順序)給藥的方案。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了治療疾病的方法，其包括向有需求的受試者(subject)施用Wnt途徑抑制劑與有絲分裂抑制劑的組合。利用至少兩種治療劑的組合治療通常使用通過不同作用機(jī)理起作用和/或靶向不同的途徑并可導(dǎo)致加和或協(xié)同效應(yīng)的劑。組合治療可允許每種劑的劑量低于單一療法中使用的劑量，從而減少毒性副作用和/或增加藥劑的治療指數(shù)。組合治療可以降低對(duì)藥劑形成抗性的可能性。組合治療可以允許一種劑通過第二劑使腫瘤細(xì)胞(包括癌癥干細(xì)胞)敏化以增強(qiáng)活性。此外，每種治療劑的施用順序和/或時(shí)間會(huì)影響藥物組合的總體功效。

所述方法包括Wnt途徑抑制劑，包括但不限于結(jié)合至少一種Wnt蛋白的抗體和其他多肽，結(jié)合至少一種FZD蛋白的抗體和其他多肽，以及Wnt結(jié)合可溶性受體。所述方法還包括作為小分子的Wnt途徑抑制劑。所述方法包括有絲分裂抑制劑，包括但不限于紫杉烷(taxanes)、長春花生物堿(vinca alkaloids)、埃坡霉素(epothilones)和艾日布林甲磺酸鹽(eribulinmesylate)。提供了包含Wnt途徑抑制劑和/或有絲分裂抑制劑的組合物。提供了包含Wnt途徑抑制劑或有絲分裂抑制劑的藥物組合物。

在一方面，本發(fā)明提供了抑制腫瘤生長的方法。在一些實(shí)施方案中，方法包括使腫瘤細(xì)胞與有效量的Wnt途徑抑制劑以及有效量的有絲分裂抑制劑的組合接觸，其中所述抑制劑以交錯(cuò)給藥方案使用，并且其中首先使用Wnt途徑抑制劑，其次使用有絲分裂抑制劑。該方法可以是體內(nèi)或體外的。在某些實(shí)施方案中，腫瘤在受試者中，并且使腫瘤細(xì)胞與Wnt途徑抑制劑以及有絲分裂抑制劑接觸包括向受試者施用治療有效量的每種抑制劑。

在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了減小腫瘤尺寸的方法。在一些實(shí)施方案中，方法包括使腫瘤細(xì)胞與有效量的Wnt途徑抑制劑以及有效量的有絲分裂抑制劑的組合接觸，其中所述抑制劑以交錯(cuò)給藥方案使用，并且其中首先使用Wnt途徑抑制劑，其次使用有絲分裂抑制劑。該方法可以是體內(nèi)或體外的。在某些實(shí)施方案中，腫瘤在受試者中，并且使腫瘤細(xì)胞與Wnt途徑抑制劑以及有絲分裂抑制劑接觸包括向受試者施用治療有效量的每種抑制劑。

在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了誘導(dǎo)腫瘤消退的方法。在一些實(shí)施方案中，方法包括使腫瘤細(xì)胞與有效量的Wnt途徑抑制劑以及有效量的有絲分裂抑制劑的組合接觸，其中所述抑制劑以交錯(cuò)給藥方案使用，并且其中首先使用Wnt途徑抑制劑，其次使用有絲分裂抑制劑。該方法可以是體內(nèi)或體外的。在某些實(shí)施方案中，腫瘤在受試者中，并且使腫瘤細(xì)胞與Wnt途徑抑制劑和有絲分裂抑制劑接觸包括向受試者施用治療有效量的每種抑制劑。

在另一方面，本發(fā)明提供了治療癌癥的方法。在一些實(shí)施方案中，治療癌癥的方法包括給受試者施用治療有效量的Wnt途徑抑制劑與治療有效量的有絲分裂抑制劑的組合。在一些實(shí)施方案中，治療癌癥的方法包括給受試者施用治療有效量的Wnt途徑抑制劑和治療有效量的有絲分裂抑制劑，其中首先施用Wnt途徑抑制劑，然后再施用有絲分裂抑制劑。在一些實(shí)施方案中，治療癌癥的方法包括向受試者施用治療有效量的Wnt途徑抑制劑和治療有效量的有絲分裂抑制劑，其中Wnt途徑抑制劑和有絲分裂抑制劑使用交錯(cuò)給藥方案施用，并且首先施用Wnt途徑抑制劑。

在一些實(shí)施方案中，治療癌癥的方法包括向受試者施用治療有效量的Wnt途徑抑制劑和治療有效量的有絲分裂抑制劑，其中Wnt途徑抑制劑和有絲分裂抑制劑使用交錯(cuò)給藥方案施用，并且Wnt途徑抑制劑首先施用；且其中所述Wnt途徑抑制劑是特異性結(jié)合至少一種人卷曲(FZD)蛋白的抗體或包含人FZD蛋白的Fri結(jié)構(gòu)域的可溶性受體。

在另一方面，本發(fā)明提供了提高有絲分裂抑制劑在治療受試者的癌癥中的功效的方法，其包括在向受試者施用Wnt途徑抑制劑后約1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天施用有絲分裂抑制劑。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了提高有絲分裂抑制劑在治療受試者的癌癥中的功效的方法，其包括：(a)向受試者施用Wnt途徑抑制劑；以及(b)在施用Wnt途徑抑制劑后約1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天向受試者施用有絲分裂抑制劑。

另一方面，本發(fā)明提供了治療與Wnt途徑活化相關(guān)的疾病的方法，其包括向受試者施用治療有效量的Wnt途徑抑制劑和治療有效量的有絲分裂抑制劑，其中Wnt途徑抑制劑和有絲分裂抑制劑以交錯(cuò)給藥方式施用，并且首先施用Wnt途徑抑制劑。

在本文所述的方法的一些實(shí)施方案中，在施用Wnt途徑抑制劑后至少1天施用有絲分裂抑制劑。在本文所述的方法的一些實(shí)施方案中，在施用Wnt途徑抑制劑后至少2天施用有絲分裂抑制劑。在本文所述的方法的一些實(shí)施方案中，在施用Wnt途徑抑制劑后至少3天施用有絲分裂抑制劑。

在上述方面中的每一個(gè)的一些實(shí)施方案中，以及本文其他地方描述的其他方面和實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑和有絲分裂抑制劑協(xié)同作用。在本文所述方法的一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑使癌細(xì)胞對(duì)有絲分裂抑制劑敏感。在本文所述方法的一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑使癌細(xì)胞(包括癌癥干細(xì)胞)對(duì)有絲分裂抑制劑敏感。在本文所述方法的一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑在G2/M檢查點(diǎn)抑制或阻止細(xì)胞周期的進(jìn)展，并提高有絲分裂抑制劑的功效。在本文所述方法的一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑在M期抑制或阻止細(xì)胞周期進(jìn)展并提高有絲分裂抑制劑的功效。

在本文所述方法的一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑與有絲分裂抑制劑的組合的交錯(cuò)給藥方案增加腫瘤細(xì)胞的凋亡。在本文所述的方法的一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑與有絲分裂抑制劑的組合的交錯(cuò)給藥方案使得Wnt途徑抑制劑能在腫瘤部位積累。在本文所述方法的一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑與有絲分裂抑制劑的組合的交錯(cuò)給藥方案使得Wnt途徑抑制劑和有絲分裂抑制劑的抗腫瘤活性能同步。

在本文所述方法的一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑約每3周施用一次。在本文所述方法的一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑約每4周施用一次。在本文所述的方法中，有絲分裂抑制劑約每周施用一次，約每兩周施用一次，約每3周施用一次，約每4周施用一次，或在4周(即28天)的周期內(nèi)約每3周施用一次。在本文所述方法的一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑被施用2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)或更多個(gè)周期。在本文所述方法的一些實(shí)施方案中，有絲分裂抑制劑被施用2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)或更多個(gè)周期。

在本文所述方法的一些實(shí)施方案中，所述Wnt途徑抑制劑以約2mg/kg至約10mg/kg的劑量施用于所述受試者。在本文所述方法的一些實(shí)施方案中，所述Wnt途徑抑制劑以約2mg/kg至約5mg/kg的劑量施用。在本文所述方法的一些實(shí)施方案中，所述Wnt途徑抑制劑以約3mg/kg至約7.5mg/kg的劑量施用。在本文所述方法的一些實(shí)施方案中，所述Wnt途徑抑制劑每3周以約2mg/kg至約5mg/kg的劑量施用。在本文所述方法的一些實(shí)施方案中，所述Wnt途徑抑制劑每4周以約3mg/kg至約7.5mg/kg的劑量施用。

在本文所述的方法的一些實(shí)施方案中，有絲分裂抑制劑以約25mg/m²至約200mg/m²的劑量向受試者施用。在本文所述方法的一些實(shí)施方案中，有絲分裂抑制劑以約50mg/m²至約150mg/m²的劑量施用。在本文所述的方法的一些實(shí)施方案中，所述有絲分裂抑制劑每周一次以約50mg/m²至約150mg/m²的劑量施用。

在一些實(shí)施方案中，該Wnt途徑抑制劑是與至少一種人FZD蛋白特異性結(jié)合的抗體。在一些實(shí)施方案中，該Wnt途徑抑制劑是與選自下列項(xiàng)中的至少一種FZD蛋白特異性結(jié)合的抗體：FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9及FZD10。在一些實(shí)施方案中，該Wnt途徑抑制劑是與選自下列項(xiàng)中的至少一種FZD蛋白特異性結(jié)合的抗體：FZD1、FZD2、FZD5、FZD7及FZD8。在一些實(shí)施方案中，該Wnt途徑抑制劑是特異性結(jié)合至少一種人FZD蛋白的抗體，其中所述抗體包含下列項(xiàng)的抗體：包含GFTFSHYTLS(SEQ ID NO:7)的重鏈CDR1、包含VISGDGSYTYYADSVKG(SEQ ID NO:8)的重鏈CDR2、以及包含NFIKYVFAN(SEQ ID NO:9)的重鏈CDR3，和/或包含SGDNIGSFYVH(SEQ ID NO:10)的輕鏈CDR1、包含DKSNRPSG(SEQ ID NO:11)的輕鏈CDR2、及包含QSYANTLSL(SEQ ID NO:12)的輕鏈CDR3。

在上述方面中的每一個(gè)的某些實(shí)施方案中，以及本文別處描述的其他方面和實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是特異性結(jié)合至少一種人FZD蛋白的抗體，其中所述抗體包含：(a)與SEQ ID NO:5具有至少約90％，至少約95％或100％的序列同一性的重鏈可變區(qū)；和/或(b)與SEQ ID NO:6具有至少約90％，至少約95％或100％的序列同一性的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是抗體OMP-18R5(也稱為凡地吐單抗(vantictumab))。

在上述方面中的每一個(gè)的某些實(shí)施方案中，以及本文其他地方描述的其他方面和實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是特異性結(jié)合至少一種人Wnt蛋白的抗體。

在上述方面中的每一個(gè)的某些實(shí)施方案中，以及本文其他地方描述的其他方面和實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是重組抗體。在一些實(shí)施方案中，抗體是單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。在一些實(shí)施方案中，抗體是包含抗原結(jié)合部位的抗體片段。在某些實(shí)施方案中，抗體或抗體片段是單價(jià)、單特異性、二價(jià)、雙特異性或多特異性的。在一些實(shí)施方案中，抗體是IgG1抗體、IgG2抗體或IgG4抗體。在某些實(shí)施方案中，分離抗體。在其他實(shí)施方案中，抗體基本上是純的。

在上述方面中的每一個(gè)的某些實(shí)施方案中，以及本文其他地方描述的其他方面和實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是可溶性受體。在一些實(shí)施方案中，可溶性受體包含人FZD蛋白的Fri結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)ri結(jié)構(gòu)域包含F(xiàn)ZD1的Fri結(jié)構(gòu)域、FZD2的Fri結(jié)構(gòu)域、FZD3的Fri結(jié)構(gòu)域、FZD4的Fri結(jié)構(gòu)域、FZD5的Fri結(jié)構(gòu)域、FZD6的Fri結(jié)構(gòu)域、FZD7的Fri結(jié)構(gòu)域、FZD8的Fri結(jié)構(gòu)域、FZD9的Fri結(jié)構(gòu)域、或FZD10的Fri結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)ri結(jié)構(gòu)域包含F(xiàn)ZD8的Fri結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，人FZD蛋白的Fri結(jié)構(gòu)域包含選自SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,和SEQ ID NO:23中的序列。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)ri結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21。

在本文所述的方法的一些實(shí)施方案中，可溶性受體包括非FZD多肽。在一些實(shí)施方案中，非FZD多肽直接連接到人FZD蛋白的Fri結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，非FZD多肽通過接頭連接到人FZD蛋白的Fri結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，非FZD多肽包含人Fc區(qū)。在一些實(shí)施方案中，非FZD多肽包含SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,或SEQ ID NO:28。在一些實(shí)施方案中，非FZD多肽包含SEQ ID NO:27。

在本文所述方法的一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑包含(a)包含SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,或SEQ ID NO:23的第一多肽；和(b)包含SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,或SEQ ID NO:28的第二多肽，其中所述第一多肽與所述第二多肽直接連接。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑包含(a)包含SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,或SEQ ID NO:23的第一多肽；和(b)包含SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,或SEQ ID NO:28的第二多肽，其中所述第一多肽通過接頭與第二多肽連接。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑包含：(a)包含SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21的第一多肽；和(b)包含SEQ ID NO:27的第二多肽，其中所述第一多肽與所述第二多肽直接連接。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑包含：(a)SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21的第一多肽；和(b)包含SEQ ID NO:27的第二多肽，其中所述第一多肽通過接頭連接到所述第二多肽。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑包含SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是FZD8-Fc可溶性受體OMP-54F28(也稱為艾非納西肽(ipafricept))。

在上述方面中的每一個(gè)的某些實(shí)施方案中，以及本文其他地方描述的其他方面和實(shí)施方案中，有絲分裂抑制劑選自紫杉烷(taxane)、長春花生物堿(vinca alkaloid)、埃坡霉素(epothilone)或艾日布林甲磺酸鹽(eribulinmesylate)。在一些實(shí)施方案中，有絲分裂抑制劑是紫杉烷。在一些實(shí)施方案中，紫杉烷選自：紫杉醇(TAXOL)、白蛋白結(jié)合型紫杉醇(ABRAXANE)或多西紫杉醇(TAXOTERE)。在一些實(shí)施方案中，有絲分裂抑制劑是長春花生物堿。在一些實(shí)施方案中，長春花生物堿選自長春花堿(VELBAN)、長春新堿(MARQIBO)或長春瑞濱(NAVELBINE)。在一些實(shí)施方案中，有絲分裂抑制劑是埃坡霉素。在一些實(shí)施方案中，埃坡霉素是伊沙匹隆(IXEMPRA)。在一些實(shí)施方案中，有絲分裂抑制劑是艾日布林甲磺酸鹽(HALAVEN)。

在上述方面中的每一個(gè)的某些實(shí)施方案中，以及本文中別處描述的其他方面和實(shí)施方案中，癌癥是選自結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、腎癌、前列腺癌、胃腸癌、黑素瘤、子宮頸癌，膀胱癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤和頭頸癌。在某些實(shí)施方案中，癌癥是乳腺癌。在一些實(shí)施方案中，癌癥是卵巢癌。在某些實(shí)施方案中，癌癥是肺癌。在某些實(shí)施方案中，癌癥是胰腺癌。

在一些實(shí)施方案中，治療癌癥的方法包括向受試者施用治療有效量的凡地吐單抗(OMP-18R5)和治療有效量的紫杉烷，所述紫杉烷選自紫杉醇、白蛋白結(jié)合型紫杉醇(nab-paclitaxel)和多西紫杉醇(docetaxel)，其中在施用凡地吐單抗后約1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天施用紫杉烷。在一些實(shí)施方案中，在施用凡地吐單抗約2天后施用紫杉烷。在一些實(shí)施方案中，約每3周施用一次凡地吐單抗。在一些實(shí)施方案中，約每4周施用一次凡地吐單抗。在一些實(shí)施方案中，紫杉烷每周施用一次。在一些實(shí)施方案中，在4周的周期內(nèi)的3周，每周施用一次紫杉烷。

在一些實(shí)施方案中，治療癌癥的方法包括向受試者施用治療有效量的艾非納西肽(OMP-54F28)和治療有效量的選自紫杉醇、白蛋白結(jié)合型紫杉醇和多西紫杉醇中的紫杉烷，其中所述紫杉烷在施用艾非納西肽(ipafricept)后約1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天施用。在一些實(shí)施方案中，紫杉烷在施用艾非納西肽后約2天施用。在一些實(shí)施方案中，艾非納西肽約每3周施用一次。在一些實(shí)施方案中，艾非納西肽(ipafricept)約每4周施用一次。在一些實(shí)施方案中，紫杉烷每周施用一次。在一些實(shí)施方案中，在4周的周期內(nèi)的3周，每周施用一次紫杉烷。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抑制受試者中腫瘤生長的方法，其包括使用交錯(cuò)給藥方案向受試者施用治療有效量的抗FZD抗體與有絲分裂抑制劑的組合。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抑制受試者中腫瘤生長的方法，其包括使用交錯(cuò)給藥方案向受試者施用治療有效量的凡地吐單抗與有絲分裂抑制劑的組合。在一些實(shí)施方案中，抑制受試者中腫瘤生長的方法包括向受試者施用治療有效量的凡地吐單抗與紫杉烷的組合。在一些實(shí)施方案中，抑制受試者中腫瘤生長的方法包括向受試者施用治療有效量的凡地吐單抗與紫杉醇的組合。在一些實(shí)施方案中，抑制受試者中腫瘤生長的方法包括向受試者施用治療有效量的凡地吐單抗與白蛋白結(jié)合型紫杉醇的組合。在一些實(shí)施方案中，抑制受試者中腫瘤生長的方法包括向所述受試者施用治療有效量的凡地吐單抗與多西紫杉醇的組合。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抑制受試者中腫瘤生長的方法，其包括使用交錯(cuò)給藥方案向受試者施用治療有效量的FZD可溶性受體與有絲分裂抑制劑的組合。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抑制受試者中腫瘤生長的方法，其包括使用交錯(cuò)給藥方案向受試者施用治療有效量的艾非納西肽與有絲分裂抑制劑的組合。在一些實(shí)施方案中，抑制受試者中腫瘤生長的方法包括向受試者施用治療有效量的艾非納西肽與紫杉烷的組合。在一些實(shí)施方案中，抑制受試者中腫瘤生長的方法包括向受試者施用治療有效量的艾非納西肽與紫杉醇的組合。在一些實(shí)施方案中，抑制受試者中腫瘤生長的方法包括向受試者施用治療有效量的艾非納西肽與白蛋白結(jié)合型紫杉醇的組合。在一些實(shí)施方案中，抑制受試者中腫瘤生長的方法包括向所述受試者施用治療有效量的艾非納西肽與多西紫杉醇的組合。

在上述方面中的每一個(gè)的某些實(shí)施方案中，以及本文別處描述的其他方面和實(shí)施方案中，所述方法還包括施用至少一種另外的治療劑。在一些實(shí)施方案中，另外的治療劑是化療劑。在一些實(shí)施方案中，另外的治療劑是抗體。

還提供了包含本文所述的Wnt途徑抑制劑和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物，其與包含本文所述的有絲分裂抑制劑和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物組合使用。

本發(fā)明的方面或?qū)嵤┓桨甘且择R庫什群組或其他群組化的替代方案描述，本發(fā)明不僅包含被標(biāo)示為整體的整個(gè)群組，而且包含該群組的個(gè)別成員及該主要群組中所有可能的亞群，且還包含不含其中一或多個(gè)群組成員的主要群組。本發(fā)明亦設(shè)想明確排除該申請(qǐng)專利的發(fā)明中任何群組成員中的一或多個(gè)。

附圖說明

圖1A至1D。通過Wnt途徑抑制劑組合化療劑抑制體內(nèi)卵巢腫瘤生長。OMP-OV19卵巢腫瘤細(xì)胞是經(jīng)皮下注射至NOD/SCID小鼠。圖1A。用對(duì)照抗體(-●-)、紫杉醇(-■-)、或FZD8-Fc可溶性受體OMP-54F28和紫杉醇的組合(▲-)治療小鼠。圖1B。用對(duì)照抗體(-●-)，白蛋白結(jié)合型紫杉醇(-■-)、或OMP-54F28和白蛋白結(jié)合型紫杉醇的組合(▲)治療小鼠。圖1C。用對(duì)照抗體(-●-)、卡鉑(-■-)、或OMP-54F28和卡鉑的組合(-▲-)治療小鼠。圖1D。用對(duì)照抗體(-●-)、卡鉑和紫杉醇(-■-)、或OMP-54F28、卡鉑和紫杉醇的組合(-▲-)治療小鼠。以45mg/kg的OMP-54F28、10mg/kg的紫杉醇、7.5mg/kg的白蛋白結(jié)合型紫杉醇、30mg/kg的卡鉑、以及15mg/kg卡鉑組合5mg/kg的紫杉醇給小鼠施用。所有試劑每三周施用并經(jīng)腹膜內(nèi)施用。數(shù)據(jù)顯示為治療后天數(shù)的腫瘤體積(mm³)?！爸委熀筇鞌?shù)”是指第一次治療后的天數(shù)。

圖2為使用交錯(cuò)給藥方案通過Wnt途徑抑制劑與紫杉烷組合來抑制活細(xì)胞內(nèi)乳腺腫瘤生長。將UM-PE13乳腺腫瘤細(xì)胞皮下注射到NOD/SCID小鼠中。用對(duì)照抗體(-●-)，紫杉醇(-■-)，在同一天施用的紫杉醇和抗FZD抗體OMP-18R5(-▲-)，其中紫杉醇在先于OMP-18R5三天施用的紫杉醇和OMP-18R5(-○-)，或其中OMP-18R5先于紫杉醇三天施用的紫杉醇和OMP-18R5(-□-)治療小鼠。以25mg/kg施用OMP-18R5，并且以20mg/kg施用紫杉醇。每三周施用劑并經(jīng)腹膜內(nèi)施用。數(shù)據(jù)顯示為針對(duì)治療后天數(shù)的腫瘤體積(mm³)。

圖3A-3C。使用交錯(cuò)給藥方案通過Wnt途徑抑制劑與紫杉烷組合抑制體內(nèi)卵巢腫瘤生長。圖3A。將OMP-OV38卵巢腫瘤細(xì)胞皮下注射到NOD/SCID小鼠中。將UM-PE13乳腺腫瘤細(xì)胞皮下注射到NOD/SCID小鼠中。用對(duì)照抗體(-●-)，紫杉醇(-■-)，在同一天施用的紫杉醇和FZD8-Fc可溶性受體OMP-54F28(-▲-)，其中紫杉醇先于OMP-54F28施用的紫杉醇和OMP-54F28(-○-)，其中OMP-54F28先于紫杉醇前兩天施用的紫杉醇和OMP-54F28(-□-)治療小鼠。OMP-54F28以25mg/kg施用，紫杉醇以20mg/kg施用。每三周施用劑并經(jīng)腹膜內(nèi)施用。數(shù)據(jù)顯示為針對(duì)治療后天數(shù)的腫瘤體積(mm³)。圖3B。將OMP-OV22卵巢腫瘤細(xì)胞皮下注射到NOD/SCID小鼠中。用對(duì)照抗體(-●-)，紫杉醇(-■-)，同一天施用的紫杉醇和OMP-54F28(-▲-)，其中紫杉醇先于OMP-54F28兩天施用的紫杉醇和OMP-54F28(-○-)，或其中OMP-54F28先于紫杉醇兩天施用的紫杉醇和OMP-54F28(-□-)治療小鼠。OMP-54F28以25mg/kg施用，而紫杉醇以20mg/kg施用。每三周經(jīng)腹膜內(nèi)施用劑。數(shù)據(jù)顯示為針對(duì)治療后天數(shù)的腫瘤體積(mm³)。圖3C。將OMP-OV38卵巢腫瘤細(xì)胞皮下注射到NOD/SCID小鼠中。通過對(duì)照抗體(-●-)，紫杉醇(-■-)，先施用OMP-54F28且一天后施用紫杉醇(-○-)，先施用OMP-54F28且兩天后施用紫杉醇(-▲-)，或先施用OMP-54F28且四天后施用紫杉醇(-□-)來治療小鼠。OMP-54F28以20mg/kg給藥，紫杉醇以20mg/kg給藥。每兩周施用劑并經(jīng)腹膜內(nèi)施用。數(shù)據(jù)顯示為針對(duì)治療后天數(shù)的腫瘤體積(mm³)。

圖4。使用交錯(cuò)給藥方案通過Wnt途徑抑制劑與紫杉烷組合抑制體內(nèi)肺腫瘤生長。將OMP-LU77肺腫瘤細(xì)胞皮下注射到NOD/SCID小鼠中。用對(duì)照抗體(-●-)，紫杉醇(-■-)，同一天施用的凡地吐單抗(OMP-18R5)和紫杉醇(-▲-)，或其中凡地吐單抗先于紫杉醇兩天施用的凡地吐單抗和紫杉醇(-□-)治療小鼠。凡地吐單抗以25mg/kg施用，紫杉醇以15mg/kg施用。每隔一周施用劑，并經(jīng)腹膜內(nèi)施用。數(shù)據(jù)顯示為針對(duì)治療后天數(shù)的腫瘤體積(mm³)。

圖5A-5B。癌干細(xì)胞頻率。圖5A。在用從已經(jīng)用對(duì)照抗體(對(duì)照mAb)、紫杉醇(Pac)或OMP-18R5和紫杉醇的組合(Van+Pac)治療的小鼠獲得的50、150或500個(gè)OMP-LU77腫瘤細(xì)胞植入后的小鼠的腫瘤生長。圖5B。通過有限稀釋分析測定的，用對(duì)照抗體(對(duì)照mAb)，紫杉醇或OMP-18R5抗體和紫杉醇的組合(Van+Pac)治療后，OMP-LU77肺腫瘤中的癌干細(xì)胞(CSC)頻率。

圖6。使用交錯(cuò)給藥方案通過Wnt途徑抑制劑與紫杉烷組合抑制體內(nèi)卵巢腫瘤生長。將OMP-OV38卵巢腫瘤細(xì)胞皮下注射到NOD/SCID小鼠中。用對(duì)照抗體(-▲-)，紫杉醇(-■-)，其中OMP-54F28與紫杉醇在同一天施用的OMP-54F28和紫杉醇的組合(-◆-)，或其中先于施用紫杉醇2天施用OMP-54F28的OMP-54F28和紫杉醇的組合(-●-)治療小鼠。OMP-54F28和紫杉醇以20mg/kg施用。每兩周施用劑并經(jīng)腹膜內(nèi)施用。數(shù)據(jù)顯示為針對(duì)治療后天數(shù)的腫瘤體積(mm³)。

圖7A-7B。使用交錯(cuò)給藥方案通過Wnt途徑抑制劑與紫杉烷組合抑制體內(nèi)乳腺腫瘤生長。圖7A。將OMP-B90乳腺腫瘤細(xì)胞皮下注射到NOD/SCID小鼠中。用對(duì)照抗體(-●-)，紫杉醇(▲-)，其中OMP-18R5與紫杉醇在同一天施用的OMP-18R5和紫杉醇的組合(-□-)，或其中先于施用紫杉醇2天施用OMP-18R5的OMP-18R5和紫杉醇的組合(-◇-)治療小鼠。圖7B。將OMP-B90乳腺腫瘤細(xì)胞皮下注射到NOD/SCID小鼠中。用對(duì)照抗體(-●-)，OMP-54F28(-■-)，紫杉醇(-▲-)，其中OMP-54F28與紫杉醇在同一天施用的OMP-54F28和紫杉醇的組合(-□-)，或其中在先于施用紫杉醇2天施用OMP-54F28的OMP-54F28和紫杉醇的組合(-◇-)治療小鼠。OMP-18R5、OMP-54F28和對(duì)照抗體以25mg/kg施用，紫杉醇以10mg/kg施用。OMP-18R5、OMP-54F28和對(duì)照抗體每兩周施用一次，紫杉醇每周施用一次，并且所有劑經(jīng)腹膜內(nèi)施用。數(shù)據(jù)顯示為針對(duì)治療后天數(shù)的腫瘤體積(mm³)。

圖8A-8B。使用交錯(cuò)給藥方案通過Wnt途徑抑制劑與紫杉烷組合抑制體內(nèi)結(jié)腸腫瘤生長。圖8A。將OMP-C28結(jié)腸腫瘤細(xì)胞皮下注射到NOD/SCID小鼠中。用對(duì)照抗體(-●-)，OMP-18R5(-▲-)，白蛋白結(jié)合型紫杉醇(-■-)或其中先于施用白蛋白結(jié)合型紫杉醇2天施用OMP-18R5的OMP-18R5和白蛋白結(jié)合型紫杉醇的組合(-◇-)治療小鼠。圖8B。將OMP-C28結(jié)腸腫瘤細(xì)胞皮下注射到NOD/SCID小鼠中。用對(duì)照抗體(-●-)，OMP-54F28(-▲-)，白蛋白結(jié)合型紫杉醇(-■-)或其中先于施用白蛋白結(jié)合型紫杉醇2天施用OMP-54F28的OMP-54F28和白蛋白結(jié)合型紫杉醇的組合(-◇-)治療小鼠。OMP-18R5、OMP-54F28和對(duì)照以25mg/kg施用，白蛋白結(jié)合型紫杉醇以15mg/kg施用。OMP-18R5、OMP-54F28和對(duì)照每兩周施用一次，紫杉醇每周施用一次，并且所有劑經(jīng)腹膜內(nèi)施用。數(shù)據(jù)顯示為針對(duì)治療后天數(shù)的腫瘤體積(mm³)。

圖9A-9B。使用交錯(cuò)給藥方案通過Wnt途徑抑制劑與紫杉烷組合抑制體內(nèi)卵巢腫瘤生長。圖9A。將OMP-OV40卵巢腫瘤細(xì)胞皮下注射到NOD/SCID小鼠中。用對(duì)照抗體(-●-)，OMP-18R5(-▲-)，紫杉醇(-■-)，或其中先于施用紫杉醇2天施用OMP-18R5的OMP-18R5和紫杉醇的組合(-◇-)治療小鼠。圖7B。將OMP-OV40卵巢腫瘤細(xì)胞皮下注射到NOD/SCID小鼠中。用對(duì)照抗體(-●-)，OMP-54F28(-▲-)，紫杉醇(■-)，或其中先于施用紫杉醇2天施用OMP-54F28的OMP-54F28和紫杉醇的組合(-◇-)治療小鼠。OMP-18R5、OMP-54F28和對(duì)照抗體以25mg/kg施用，紫杉醇以20mg/kg施用。試劑每兩周施用一次并經(jīng)腹膜內(nèi)施用。數(shù)據(jù)顯示為針對(duì)治療后天數(shù)的腫瘤體積(mm³)。

具體實(shí)施方案

本發(fā)明提供了抑制腫瘤生長的方法，減少腫瘤尺寸的方法和治療癌癥的方法。本文提供的方法包括使用交錯(cuò)給藥方案向受試者施用治療有效量的Wnt途徑抑制劑與治療有效量的有絲分裂抑制劑。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是抗體。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是特異性結(jié)合至少一種Wnt蛋白的抗體。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是特異性結(jié)合至少一種FZD蛋白的抗體。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是可溶性受體。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是包含F(xiàn)ZD蛋白Fri結(jié)構(gòu)域的可溶性受體。在一些實(shí)施方案中，有絲分裂抑制劑是紫杉烷、長春花生物堿、埃坡霉素或艾日布林甲磺酸鹽。

用Wnt途徑抑制劑抗-FZD抗體OMP-18R5與紫杉烷組合比與其他類化療劑組合具有更大的治療活性(即抑制腫瘤生長)(實(shí)施例1；圖1)。令人驚奇的是，施用Wnt途徑抑制劑，或抗FZD抗體OMP-18R5(也稱為凡地吐單抗)或FZD8-Fc可溶性受體OMP-54F28(也稱為艾非納西肽)，然后施用紫杉烷(交錯(cuò)或順序給藥方式)，這在抑制異種移植模型中的腫瘤生長中的作用比其他給藥方案有效(實(shí)施例2,3和6；圖2,3和4)。在交錯(cuò)給藥方案中Wnt途徑抑制劑和紫杉烷的施用抑制了多種腫瘤類型的腫瘤生長(實(shí)施例2,3和6-10；圖2-4和6-9)。此外，在一些研究中，以交錯(cuò)給藥方案施用Wnt途徑抑制劑和紫杉烷實(shí)際上導(dǎo)致已形成的腫瘤的尺寸減小(實(shí)施例3,6,8和9；圖3,4,6和6)7)。

I.定義

為了促進(jìn)對(duì)本發(fā)明的了解，以下定義一些用語及用詞。

本文所使用的用語“拮抗劑”及“拮抗性”，是指部分或完全阻斷、抑制、減少、或中和標(biāo)靶以及/或信號(hào)傳導(dǎo)途徑(例如Wnt途徑)的生物活性的任何分子。本文所使用的用語“拮抗劑”包括部分或完全阻斷、抑制、減少、或中和蛋白(例如FZD蛋白或Wnt蛋白)的活性的任何分子。適當(dāng)?shù)霓卓箘┓肿犹貏e包括但不限于拮抗劑抗體、抗體片段、可溶性受體、或小分子。

本文所使用的用語“抗體”是指免疫球蛋白分子，該免疫球蛋白分子通過其可變區(qū)內(nèi)的至少一個(gè)抗原結(jié)合部位，識(shí)別標(biāo)靶(例如蛋白、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂質(zhì)、或前述的組合)且與之特異性結(jié)合。如本文所使用，該用語包含完整多克隆抗體、完整單克隆抗體、包含抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段(諸如Fab、Fab’、F(ab’)2、及Fv片段)、單鏈Fv(scFv)抗體、多特異性抗體諸如雙特異性抗體、單特異性抗體、單價(jià)抗體、嵌合抗體、人化抗體、人抗體、包含抗體的抗原結(jié)合部位的融合蛋白，及任何其他包含抗原結(jié)合部位的經(jīng)修飾的免疫球蛋白分子，只要該等抗體展現(xiàn)所期望有的生物活性?？贵w可為下列五種主要免疫球蛋白類型中的任一者：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM或它們的亞型(同型)(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)，具體根據(jù)它們的分別被稱為α、δ、ε、γ、及μ的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域的命名。不同類型的免疫球蛋白具有不同且公知的次單位結(jié)構(gòu)及三維構(gòu)型?？贵w可為未經(jīng)修飾(naked)或與其他分子綴合(conjugated)，該等其他分子包括但不限于毒素及放射性同位素。

本文所使用的用語“抗體片段”是指完整抗體的部分且通常包括完整抗體的抗原性決定可變區(qū)或抗原結(jié)合部位?？乖蔚膶?shí)例包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2及Fv片段、線性抗體、單鏈抗體及自抗體片段形成的多特異性抗體。此處所使用的“抗體片段”包含至少一個(gè)抗原結(jié)合部位或表位結(jié)合部位。

本文所使用的抗體的“可變區(qū)”用語是指抗體輕鏈的可變區(qū)或抗體重鏈的可變區(qū)(或單獨(dú)或組合指稱)。重鏈或輕鏈的可變區(qū)通常由四個(gè)框架區(qū)組成，該四個(gè)框架區(qū)通過三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)連接，該三個(gè)CDR又名“超變異區(qū)”。各鏈中的CDR通過框架區(qū)并且利用來自其他鏈的CDR拉近，導(dǎo)致形成該抗體的抗原結(jié)合部位。至少有兩種技術(shù)用于測定CDR：(1)基于跨種序列變異性的方法(即Kabat et al.,1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5^th Edition,National Institutes of Health,Bethesda,MD)；及(2)基于抗原-抗體復(fù)合物的結(jié)晶學(xué)研究的方法(Al-Lazikani et al.,1997,J.Mol.Biol.,273:927-948)。此外，有時(shí)該技術(shù)領(lǐng)域組合使用這兩種技術(shù)以測定CDR。

如本文所使用的用語“單克隆抗體”是指同源性抗體群，其涉及高度特異性識(shí)別及結(jié)合單一抗原性決定簇或表位。這與多克隆抗體相反，多克隆抗體通常包括以不同抗原決定簇為目標(biāo)的不同抗體的混合。用語“單克隆抗體”包含完整及全長抗體，也包含抗體片段(例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、單鏈(scFv)抗體、包含抗體部分的融合蛋白質(zhì)、及任何其他包含至少一種抗原結(jié)合部位的經(jīng)修飾的免疫球蛋白分子。另外，“單克隆抗體”是指由許多技術(shù)制備的這樣的抗體，這些技術(shù)包括但不限于雜交瘤生產(chǎn)、噬菌體選擇、重組表達(dá)及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。

如本文所使用的用語“人化抗體”是指包含極少化非人序列的為特定免疫球蛋白鏈、嵌合性免疫球蛋白或其片段的抗體。通常，人源化抗體是其中CDR的氨基酸殘基經(jīng)非人物種(例如小鼠、大鼠、兔或倉鼠)的CDR的氨基酸殘基置換的人免疫球蛋白，其具有所欲的特異性、親和性以及/或結(jié)合能力。

如本文所使用的用語“人抗體”是指由人體產(chǎn)生的抗體或具有對(duì)應(yīng)由人體產(chǎn)生的抗體的氨基酸序列的抗體，人抗體利用任何該技術(shù)領(lǐng)域已知的技術(shù)制備。

如本文所使用的用語“嵌合抗體”是指其中該免疫球蛋白分子的氨基酸序列是源自二或更多個(gè)物種的抗體。通常，輕鏈及重鏈兩者的可變區(qū)皆對(duì)應(yīng)于源自一哺乳動(dòng)物物種(例如小鼠、大鼠、兔等)的具有所欲特異性、親和性以及/或結(jié)合能力的抗體的可變區(qū)，然而這些恒定區(qū)與源自另一物種(通常是人)的抗體中的序列是同源的。

如本文所使用的用語“親和性成熟抗體”是指在一或多個(gè)CDR中具有一或多個(gè)改變的抗體，該改變導(dǎo)致該抗體相較于不具有這種改變的親代抗體對(duì)抗原的親和性增加。優(yōu)選的親和性成熟抗體將具有納摩爾或甚至皮摩爾程度的對(duì)標(biāo)靶抗原的親和性。親和性成熟抗體通過該領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生，其包括重鏈和輕鏈可變區(qū)替換、CDR以及/或架構(gòu)殘基的隨機(jī)突變形成、或CDR以及/或架構(gòu)殘基的定點(diǎn)突變形成。

用語“表位”及“抗原決定簇”在本文可交換使用，是指可被特定抗體辨識(shí)且特異性結(jié)合的抗原部分。當(dāng)抗原是多肽時(shí)，表位可自連續(xù)氨基酸或通過蛋白質(zhì)的三級(jí)折疊并列的非連續(xù)氨基酸形成。自連續(xù)氨基酸形成的表位(又稱為線性表位)通常在蛋白質(zhì)變性時(shí)仍被保留，然而通過三級(jí)折疊形成的表位(又稱為構(gòu)象表位)通常在蛋白質(zhì)變性時(shí)喪失。表位通常包括至少3個(gè)及更通常地至少5，或8至10個(gè)呈獨(dú)特空間構(gòu)象的氨基酸。

如本文所使用的用語“選擇性結(jié)合”或“特異性結(jié)合”是指結(jié)合劑或抗體以更頻繁、更快速、更長時(shí)間、更高親和性或上述條件的某些組合與表位、蛋白質(zhì)或標(biāo)靶分子反應(yīng)或結(jié)合，相較于包括非相關(guān)或相關(guān)蛋白的可供選擇的物質(zhì)而言。在某些實(shí)施方案中，“特異性結(jié)合”是指例如抗體以大約0.1mM或更低，但通常低于大約1μM的K_D與標(biāo)靶結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，“特異性結(jié)合”是指抗體以至少約0.1μM或更低，至少約0.01μM或更低，或至少約1nM或更低的K_D與標(biāo)靶結(jié)合。由于不同物種的同源性蛋白質(zhì)之間具有序列一致性，因此特異性結(jié)合可包括辨識(shí)超過一個(gè)物種的蛋白質(zhì)(例如人FZD蛋白及小鼠FZD蛋白)的抗體。同樣地，由于不同蛋白的多肽序列的某些區(qū)域內(nèi)具有同源性，因此特異性結(jié)合可包括辨識(shí)超過一種蛋白(例如人FZD2及人FZD7)的抗體(或其他多肽或結(jié)合劑)。應(yīng)理解的是，在某些實(shí)施方案中，與第一標(biāo)靶特異性結(jié)合的抗體或結(jié)合劑可能或可能不與第二標(biāo)靶特異性結(jié)合。因此，“特異性結(jié)合”不一定需要(雖然可包括)排他性結(jié)合(即與單一標(biāo)靶結(jié)合)。因此，在某些實(shí)施方案中，抗體可與一種以上的標(biāo)靶特異性結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，多重標(biāo)靶可能由該抗體上的相同的抗原結(jié)合部位結(jié)合。舉例來說，在某些情況下，抗體可能包含二個(gè)完全相同的抗原結(jié)合部位，該二個(gè)抗原結(jié)合部位各自與二或多個(gè)蛋白(例如FZD2和FZD7)上的相同表位特異性結(jié)合。在某些可供選擇的實(shí)施方案中，抗體可能為雙特異性，且包含至少二個(gè)具有不同特異性的抗原結(jié)合部位。舉非限制性實(shí)例而言，雙特異性劑可包含辨識(shí)一個(gè)蛋白(例如人FZD)上的表位的一個(gè)抗原結(jié)合部位，且還包含辨識(shí)第二蛋白(例如Wnt蛋白)上的不同表位的第二個(gè)不同抗原結(jié)合部位。一般來說(但不必然)，所謂的結(jié)合是指特異性結(jié)合。

本文使用的用語“可溶性受體”是指受體蛋白在該受體的第一跨膜結(jié)構(gòu)域之前的胞外片段(或它的部分)，其可以可溶形式自細(xì)胞分泌。

本文使用的用語“FZD可溶性受體”是指FZD受體蛋白在該受體的第一跨膜結(jié)構(gòu)域之前的胞外片段，其可以可溶形式自細(xì)胞分泌。包含整個(gè)胞外域(ECD)的FZD可溶性受體以及ECD的較小片段由該用語涵蓋。因此，包含F(xiàn)ri結(jié)構(gòu)域的FZD可溶性受體亦包括于此用語中。

用語“多肽”和“肽”以及“蛋白”在本文可交換使用，這些用語是指任何長度的氨基酸的聚合物。該聚合物可為線性的或分支的，其可能包含經(jīng)修飾的氨基酸，且其可能被非氨基酸中斷。這些用語亦包含經(jīng)天然或干預(yù)修飾的氨基酸聚合物；例如雙硫鍵形成、糖基化、脂化、乙?；⒘姿峄蛉魏纹渌倏v或修飾，諸如與標(biāo)記成分綴合。該定義還包括例如包含一或多個(gè)氨基酸類似物(包括例如非天然氨基酸)的多肽，以及包含本領(lǐng)域公知的其他修飾的多肽。應(yīng)理解的是，由于本發(fā)明中描述的方法中使用的多肽可能以抗體為主，因此在某些實(shí)施方案中，這些多肽可能為單鏈或相關(guān)的鏈(例如二聚體)。

如本文所用的術(shù)語“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及與天然存在的氨基酸類似地起作用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是由遺傳密碼編碼的那些氨基酸，以及隨后被修飾的那些氨基酸，例如羥脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸絲氨酸。短語“氨基酸類似物”是指與天然存在的氨基酸具有相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，例如與氫、羧基、氨基和R基團(tuán)結(jié)合的α碳，例如，高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍。此類類似物可具有經(jīng)修飾的R基團(tuán)(例如正亮氨酸)或經(jīng)修飾的肽主鏈，但保留與天然存在的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。短語“氨基酸模擬物”是指具有不同于氨基酸的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)但與天然存在的氨基酸類似地起作用的結(jié)構(gòu)的化學(xué)化合物。

用語“多核苷酸”及“核酸”在本文可交換使用，是指任何長度的核苷酸的聚合物，包括DNA及RNA。該核苷酸可為脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經(jīng)修飾的核苷酸或堿基以及/或它們的類似物，或任何可通過DNA或RNA聚合酶被并入聚合物中的底物。

在提及二或多個(gè)核酸或多肽時(shí)，用語“一致”或百分比“一致性”是指當(dāng)二或多個(gè)序列或子序列經(jīng)比較及比對(duì)(需要時(shí)導(dǎo)入間格)以達(dá)最高對(duì)應(yīng)性且不把任何保守性氨基酸取代當(dāng)作序列一致性的部分時(shí)，該二或多個(gè)序列或子序列是相同或具有相同的特定百分比的核苷酸或氨基酸殘基。該百分比一致性可利用序列比較軟件或算法測量，或通過目視檢查測量。多種可被用于取得氨基酸或核苷酸序列比對(duì)的算法及軟件是該領(lǐng)域所公知的。這樣的算法及軟件包括但不限于BLAST和BLAST變體、ALIGN和ALIGN變體、Megalign、BestFit、GCG Wisconsin軟件包等。在一些實(shí)施方案中，二個(gè)核酸或多肽是實(shí)質(zhì)上一致的，表示當(dāng)它們經(jīng)比較或比對(duì)以達(dá)最高對(duì)應(yīng)性時(shí)，利用序列比較算法或目視檢查得知當(dāng)它們具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％且在一些實(shí)施方案中至少95％、96％、97％、98％、99％的核苷酸或氨基酸殘基一致性。在一些實(shí)施方案中，一致性存在于至少約10、至少約20、至少約40至60個(gè)核苷酸或殘基、至少約60至80個(gè)核苷酸或殘基長度或介于它們之間的任何整數(shù)長度的序列區(qū)域。在一些實(shí)施方案中，一致性存在于60至80個(gè)核苷酸或殘基以上的更長區(qū)域，諸如至少約80至100個(gè)核苷酸或殘基，且在一些實(shí)施方案中這些序列在經(jīng)比較的全長序列諸如核苷酸序列的編碼區(qū)域上是實(shí)質(zhì)上一致的。

本文所使用的用語“保守性氨基酸取代”是指其中一個(gè)氨基酸殘基被另一個(gè)具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基取代的取代。具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基的群系于該領(lǐng)域中定義，包括堿性側(cè)鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)及芳香族側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。舉例來說，以苯丙氨酸取代酪氨酸是保守性取代。優(yōu)選地，多肽及抗體的序列中的保守性取代不廢除含有該氨基酸序列的多肽或抗體與抗原的結(jié)合。識(shí)別不消除抗原結(jié)合性的核苷酸及氨基酸保守性取代的方法是本技術(shù)領(lǐng)域所公知的。

如本文所使用的用語“載體”是指構(gòu)建物，該構(gòu)建物能在宿主細(xì)胞中遞送及通常表達(dá)一或多種感興趣的基因或序列。載體的實(shí)例包括但不限于病毒性載體、裸DNA或RNA表達(dá)載體、質(zhì)粒載體、粘粒載體、或噬菌體載體、與陽離子縮合劑有關(guān)的DNA或RNA表達(dá)載體，及包封于脂質(zhì)粒中的DNA或RNA表達(dá)載體。

如本文所使用的，經(jīng)“分離”的多肽、抗體、多核苷酸、載體、細(xì)胞或組成物是呈現(xiàn)未見于自然界中的形式的多肽、抗體、多核苷酸、載體、細(xì)胞或組成物。經(jīng)分離的多肽、抗體、多核苷酸、載體、細(xì)胞或組成物包括那些經(jīng)純化至一定程度而使它們不再以見于自然界中的形式存在者。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)分離的多肽、抗體、多核苷酸、載體、細(xì)胞或組成物實(shí)質(zhì)上是純的。

如本文所使用的用語“實(shí)質(zhì)上純的”是指其為至少50％純的(即不含污染物)、至少90％純的、至少95％純的、至少98％純的或至少99％純的物質(zhì)。

如本文所使用的用語“癌”及“癌性”是指稱或描述哺乳動(dòng)物的生理狀況，其中細(xì)胞群具有未受調(diào)節(jié)的細(xì)胞生長的特征。癌的實(shí)例包括但不限于癌(carcinoma)、胚細(xì)胞瘤、肉瘤及血液性癌(諸如淋巴瘤及白血病)。

如本文所用的用語“增殖性病癥”和“增殖性疾病”是指與異常細(xì)胞增殖(例如癌癥)相關(guān)的病癥。

如本文所使用的用語“腫瘤”及“瘤(neoplasm)”是指任何由過度細(xì)胞生長或增生所導(dǎo)致的組織團(tuán)塊，不論是良性(非癌性)還是包括癌前性病灶的惡性(癌性)。

如本文所使用的用語“轉(zhuǎn)移”是指一種過程，癌通過該過程自原發(fā)部位擴(kuò)散或轉(zhuǎn)移至身體其他區(qū)域且在新位置發(fā)展類似癌性的病灶?！稗D(zhuǎn)移”或“轉(zhuǎn)移性”細(xì)胞通常是指與鄰近細(xì)胞喪失黏著接觸且(例如經(jīng)由血流或淋巴)自疾病的原發(fā)部位移動(dòng)以侵入鄰近的身體結(jié)構(gòu)。

用語“癌干細(xì)胞”、“CSC”、“腫瘤干細(xì)胞”及“腫瘤起始細(xì)胞”在本文可交換使用，是指源自癌或腫瘤且具有下列特性的細(xì)胞：(1)具有廣泛增生能力，(2)能進(jìn)行不對(duì)稱細(xì)胞分裂以產(chǎn)生一或多種類型的經(jīng)分化的細(xì)胞后代，其中該經(jīng)分化的細(xì)胞具有減少的增生或發(fā)育能力，及(3)能進(jìn)行對(duì)稱細(xì)胞分裂以自我更新或自我維持。這些特性授予癌干細(xì)胞在連續(xù)移植至免疫不全宿主(例如小鼠)時(shí)能形成或建立腫瘤或癌的能力，相比而言，大部分腫瘤細(xì)胞無法形成腫瘤。癌干細(xì)胞以混亂方式進(jìn)行自我更新及分化，以形成具有異常細(xì)胞類型的腫瘤，該異常細(xì)胞類型可隨時(shí)間的推移在突變發(fā)生時(shí)改變。

本文使用的用語“癌細(xì)胞”及“腫瘤細(xì)胞”是指源自癌或腫瘤或癌前病灶的整體細(xì)胞族群，包括非腫瘤發(fā)生性細(xì)胞(其包含大部分的腫瘤細(xì)胞族群)及腫瘤發(fā)生性細(xì)胞(癌干細(xì)胞)。此處使用的用語“癌細(xì)胞”或“腫瘤細(xì)胞”當(dāng)僅用于指稱該些缺乏更新及分化能力的細(xì)胞時(shí)，將由用語“非腫瘤發(fā)生性”修飾以區(qū)別這些腫瘤細(xì)胞與癌干細(xì)胞。

如本文所使用的用語“腫瘤發(fā)生性”是指癌干細(xì)胞的功能特性，包括自我更新(導(dǎo)致額外的腫瘤發(fā)生性癌干細(xì)胞)及增生以產(chǎn)生所有其他腫瘤細(xì)胞(導(dǎo)致經(jīng)分化及因此非腫瘤發(fā)生性腫瘤細(xì)胞)的特性。

如本文所使用的用語“腫瘤發(fā)生性”是指源自腫瘤的細(xì)胞樣本在連續(xù)移植至免疫不全宿主(例如小鼠)時(shí)形成明顯腫瘤的能力。

如本文所使用的用語“受試者”是指任何動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物)，包括但不限于人、非人靈長動(dòng)物、犬、貓、嚙齒動(dòng)物及類似動(dòng)物，該動(dòng)物將成為特定治療的接受者。通常，關(guān)于人受試者的用語“受試者”及“患者”在此處可交換使用。

用語“醫(yī)藥上可接受”是指經(jīng)美國聯(lián)邦政府的管理機(jī)關(guān)或州政府核準(zhǔn)或可核準(zhǔn)或經(jīng)明列于美國藥典或其他普遍公認(rèn)的藥典中以用于動(dòng)物(包括人)的試劑、化合物或者分子等。

用語“醫(yī)藥上可接受的賦形劑、載體或佐劑”和“可接受的醫(yī)藥載體”是指可與治療劑一起施用至受試者的賦形劑、載體或佐劑，且該賦形劑、載體或佐劑不破壞其藥理活性，并且當(dāng)以足以遞送治療效果的劑量施用時(shí)是無毒的。通常，本領(lǐng)域技術(shù)人員和FDA認(rèn)為藥學(xué)上可接受的賦形劑、載體或佐劑是任何制劑或藥物組合物的非活性成分。

本文使用的用語“有效量”和“治療有效量”以及“治療效應(yīng)”是指有效“治療”受試者或哺乳動(dòng)物的疾病或疾患的結(jié)合劑、抗體、多肽、多核苷酸、小型分子或其他治療劑的量。以癌為例，劑(例如抗體)的治療有效量具有治療效應(yīng)且因此可減少癌細(xì)胞的數(shù)量；降低腫瘤發(fā)生性、腫瘤發(fā)生頻率、或腫瘤發(fā)生能力；減少癌干細(xì)胞的數(shù)量或頻率；減小腫瘤尺寸；減少癌細(xì)胞群；抑制以及/或停止包括例如癌擴(kuò)散至軟組織及骨在內(nèi)的癌細(xì)胞浸潤至外圍器官；抑制以及/或停止腫瘤或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移；抑制以及/或停止腫瘤或癌細(xì)胞生長；緩解一或多種與癌相關(guān)的癥狀到某種程度；減少發(fā)病率及死亡率；改善生活質(zhì)量；或這些效應(yīng)的組合。以該劑預(yù)防現(xiàn)存癌細(xì)胞生長以及/或殺死現(xiàn)存癌細(xì)胞的方面而言，其可被稱為細(xì)胞靜止性以及/或細(xì)胞毒性。

用語“進(jìn)行治療”和“治療”和“以治療”以及“緩解”是指1)治療性措施，該措施治愈、減緩、減輕經(jīng)診斷的病理狀況或疾患的癥狀以及/或停止該經(jīng)診斷的病理狀況或疾患的進(jìn)展及2)預(yù)防性或防范性措施，該措施預(yù)防或減緩標(biāo)靶病理狀況或疾患的發(fā)展。因此這些需要治療者包括那些已經(jīng)診斷為罹患該疾患者、那些易于罹患該疾患者，以及那些欲預(yù)防疾患者。在一些實(shí)施方案中，受試者經(jīng)本發(fā)明的方法被成功“治療”，若該受試者顯示下列一或多項(xiàng)的話：癌細(xì)胞的數(shù)量減少以及/或完全消失；腫瘤尺寸減??；抑制以及/或缺乏包括癌細(xì)胞擴(kuò)散至軟組織及骨在內(nèi)的癌細(xì)胞浸潤至外圍器官；抑制以及/或缺乏腫瘤或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移；抑制以及/或缺乏癌生長；緩解一或多種與該特定癌相關(guān)的癥狀；減少發(fā)病率及死亡率；改善生活質(zhì)量；減少腫瘤發(fā)生性；減少癌干細(xì)胞的數(shù)量或頻率；或效應(yīng)的一些組合。

如本公開內(nèi)容及權(quán)利要求書中所使用的，單數(shù)形式的“一”(a,an)及“該”(the)包含復(fù)數(shù)形式，除非上下文另外清楚地說明。

應(yīng)理解的是，只要本文描述的實(shí)施方案是以用語“包含”描述，其亦提供其他以“由...組成”以及/或“實(shí)質(zhì)上由...組成”的用語所描述的類似實(shí)施方案。還應(yīng)理解的是，只要此處的實(shí)施方案是以用語“實(shí)質(zhì)上由...組成”描述，其亦提供其他以“由...組成”的用語所描述的類似實(shí)施方案。

當(dāng)使用于本文中的諸如“A以及/或B”之類的詞組中時(shí)，本文中的用語“以及/或”是意圖包括A及B兩者、A或B、A(單獨(dú))及B(單獨(dú))。同樣地，使用于詞組諸如“A、B以及/或C”中的用語“以及/或”是意圖包含下列實(shí)施方案中的每一種：A、B及C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A(單獨(dú))；B(單獨(dú))；及C(單獨(dú))。

II.使用藥物組合物的方法

本文所述的Wnt途徑抑制劑(例如Wnt結(jié)合劑和FDZ結(jié)合劑)與有絲分裂抑制劑的組合可用于多種應(yīng)用，包括但不限于用于治療性治療方法，例如治療癌癥，特別是當(dāng)以交錯(cuò)或順序給藥方案使用時(shí)。在某些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑和有絲分裂抑制劑的組合可用于抑制Wnt信號(hào)傳導(dǎo)(例如經(jīng)典Wnt信號(hào)傳導(dǎo)，自分泌Wnt信號(hào)傳導(dǎo)，有絲分裂Wnt信號(hào)傳導(dǎo))，抑制有絲分裂，抑制腫瘤生長，誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo)凋亡，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡，增加分化，增加細(xì)胞凋亡，增加腫瘤細(xì)胞死亡，減少腫瘤體積，減小腫瘤尺寸，降低腫瘤干細(xì)胞頻率和/或降低腫瘤的致瘤性，特別是當(dāng)以交錯(cuò)或順序給藥方案時(shí)。所使用的方法可以是體外，離體或體內(nèi)方法。

如本文所使用的，術(shù)語“交錯(cuò)或順序給藥方案”和相關(guān)術(shù)語或短語如“交錯(cuò)給藥方案”通常涉及Wnt途徑抑制劑與有絲分裂抑制劑的組合的用途，其中隨時(shí)間推移交錯(cuò)使用或施用每種劑。在一些實(shí)施方案中，在施用第二劑之前至少約12、24、36、48、60、72、84或96小時(shí)施用第一劑。在一些實(shí)施方案中，在施用第二劑之前至少約1天、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天或約7天施用第一劑。在一些實(shí)施方案中，在施用第二劑之前約2天施用第一劑。在一些實(shí)施方案中，兩種劑的交錯(cuò)施用包括劑量的變化。如本文所用，該定義不排除施用另外的治療劑。

在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑(例如Wnt結(jié)合劑或FDZ結(jié)合劑)與有絲分裂抑制劑的組合用于治療與Wnt途徑活化相關(guān)的疾病的方法中，特別是當(dāng)以交錯(cuò)或順序施用方案使用時(shí)。在一些實(shí)施方案中，所述疾病是依賴于Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的疾病。在具體實(shí)施方案中，Wnt信號(hào)傳導(dǎo)是規(guī)范的Wnt信號(hào)傳導(dǎo)。在一些實(shí)施方案中，Wnt信號(hào)傳導(dǎo)是自分泌Wnt信號(hào)傳導(dǎo)。在一些實(shí)施方案中，Wnt信號(hào)傳導(dǎo)是有絲分裂Wnt信號(hào)傳導(dǎo)。

在一些實(shí)施方案中，用Wnt途徑抑制劑(例如Wnt結(jié)合劑或FDZ結(jié)合劑)和有絲分裂抑制劑(其中使用交錯(cuò)施用方案施用治療劑)的組合治療的疾病是癌癥。在某些實(shí)施方案中，該癌癥的特征在于Wnt依賴性腫瘤。在某些實(shí)施方案中，該癌癥的特征在于表達(dá)或過表達(dá)一種或多種Wnt蛋白的腫瘤。在某些實(shí)施方案中，該癌癥的特征在于表達(dá)或過表達(dá)一種或多種FZD蛋白的腫瘤。在某些實(shí)施方案中，癌癥的特征在于表達(dá)或過表達(dá)β-鏈蛋白的腫瘤。

本發(fā)明提供了治療癌癥的方法，其包括向受試者施用治療有效量的Wnt途徑抑制劑和治療有效量的有絲分裂抑制劑，其中首先施用Wnt途徑抑制劑，并且其次才施用有絲分裂抑制劑。本發(fā)明提供了治療癌癥的方法，其包括向受試者施用治療有效量的Wnt途徑抑制劑和治療有效量的有絲分裂抑制劑，其中Wnt途徑抑制劑和有絲分裂抑制劑使用交錯(cuò)給藥方案施用，并且首先施用Wnt途徑抑制劑。在一些實(shí)施方案中，在施用Wnt途徑抑制劑后約1天、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天或約7天施用有絲分裂抑制劑。本發(fā)明還提供了提高有絲分裂抑制劑在治療受試者的癌癥中的功效的方法，其包括在施用有絲分裂抑制劑后約1天、約2天、約3天、約4天、約5天或約6天向受試者施用Wnt途徑抑制劑。在一些實(shí)施方案中，一種治療癌癥的方法包括向受試者施用治療有效量的Wnt途徑抑制劑和治療有效量的有絲分裂抑制劑，其中Wnt途徑抑制劑和有絲分裂抑制劑使用交錯(cuò)給藥方案施用，并且首先施用Wnt途徑抑制劑；且其中所述Wnt途徑抑制劑是特異性結(jié)合至少一種人卷曲(FZD)蛋白的抗體或包含人FZD蛋白的Fri結(jié)構(gòu)域的可溶性受體。在一些實(shí)施方案中，在施用Wnt途徑抑制劑后約1天、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天或約7天施用有絲分裂抑制劑。在一些實(shí)施方案中，在施用Wnt途徑抑制劑后約2天施用有絲分裂抑制劑。

在一些實(shí)施方案中，一種方法包括使用Wnt途徑抑制劑和有絲分裂抑制劑治療癌癥，其中Wnt途徑抑制劑和有絲分裂抑制劑以交錯(cuò)給藥方案使用，并且首先使用Wnt途徑抑制劑；且其中所述Wnt途徑抑制劑是(i)特異性結(jié)合至少一種人卷曲(FZD)蛋白的抗體，或(ii)包含人FZD蛋白的Fri結(jié)構(gòu)域的可溶性受體。

本發(fā)明還提供了提高有絲分裂抑制劑在治療受試者的癌癥中的功效的方法，其包括：(a)給受試者施用Wnt途徑抑制劑；以及(b)在施用Wnt途徑抑制劑后約1天、約2天、約3天、約4天、約5天或約6天向受試者施用有絲分裂抑制劑。在一些實(shí)施方案中，一種提高有絲分裂抑制劑在治療受試者的癌癥中的功效的方法包括在施用Wnt途徑抑制劑后約1天、約2天、約3天、約4天、約5天或約6天向受試者施用有絲分裂抑制劑，其中所述Wnt途徑抑制劑是(i)特異性結(jié)合至少一種人卷曲(FZD)蛋白的抗體，或(ii)包含人FZD蛋白的Fri結(jié)構(gòu)域的可溶性受體。在一些實(shí)施方案中，提高有絲分裂抑制劑在治療受試者的癌癥中的功效的方法包括：(a)向受試者施用Wnt途徑抑制劑，其中Wnt途徑抑制劑是：(i)至少一種人卷曲(FZD)蛋白，或(ii)包含人FZD蛋白的Fri結(jié)構(gòu)域的可溶性受體；以及(b)在施用Wnt途徑抑制劑后約1天、約2天、約3天、約4天、約5天或約6天給受試者施用有絲分裂抑制劑。在一些實(shí)施方案中，在施用Wnt途徑抑制劑后約2天施用有絲分裂抑制劑。在一些實(shí)施方案中，有絲分裂抑制劑在治療癌癥中的功效的提高是相對(duì)于當(dāng)有絲分裂抑制劑和Wnt途徑抑制劑基本上同時(shí)(例如在同一天)施用于患者時(shí)觀察到的功效而言的。

本發(fā)明還提供了一種提高在治療受試者的癌癥中的組合治療的功效的方法，其包括：(a)向受試者施用Wnt途徑抑制劑；以及(b)在施用Wnt途徑抑制劑后約1天、約2天、約3天、約4天、約5天或約6天給受試者施用有絲分裂抑制劑。在一些實(shí)施方案中，一種提高在治療受試者的癌癥中的組合治療的功效的方法包括在施用Wnt途徑抑制劑后約1天、約2天、約3天、約4天、約5天或約6天向受試者施用有絲分裂抑制劑，其中所述Wnt途徑抑制劑是(i)特異性結(jié)合至少一種人卷曲(FZD)蛋白的抗體，或(ii)包含人FZD蛋白的Fri結(jié)構(gòu)域的可溶性受體。在一些實(shí)施方案中，一種提高在治療受試者的癌癥中的組合治療的功效的方法包括：(a)向受試者施用Wnt途徑抑制劑，其中Wnt途徑抑制劑是：(i)至少一種人卷曲(FZD)蛋白，或(ii)包含人FZD蛋白的Fri結(jié)構(gòu)域的可溶性受體；以及(b)在施用Wnt途徑抑制劑后約1天、約2天、約3天、約4天、約5天或約6天給受試者施用有絲分裂抑制劑。在一些實(shí)施方案中，在施用Wnt途徑抑制劑后約2天施用有絲分裂抑制劑。在一些實(shí)施方案中，組合治療在治療癌癥中的功效的提高是相對(duì)于當(dāng)有絲分裂抑制劑和Wnt途徑抑制劑基本上同時(shí)(例如在同一天)施用于患者時(shí)觀察到的功效而言的。

在一些實(shí)施方案中，一種提高有絲分裂抑制劑治療癌癥的功效的方法包括在使用Wnt途徑抑制劑后約1天、約2天、約3天、約4天、約5天或約6天使用有絲分裂抑制劑，其中所述Wnt途徑抑制劑是(i)特異性結(jié)合至少一種人卷曲(FZD)蛋白的抗體，或(ii)包含人FZD蛋白的Fri結(jié)構(gòu)域的可溶性受體。在一些實(shí)施方案中，在使用Wnt途徑抑制劑后約2天使用有絲分裂抑制劑。在一些實(shí)施方案中，有絲分裂抑制劑在治療癌癥中的功效的提高是相對(duì)于當(dāng)有絲分裂抑制劑和Wnt途徑抑制劑基本上同時(shí)(例如在同一天)使用時(shí)所觀察到的功效而言的。

本發(fā)明還提供了一種提高包含Wnt途徑抑制劑和有絲分裂抑制劑的組合治療的功效的方法，其中所述方法包括在允許有足夠的時(shí)間使Wnt途徑抑制劑到達(dá)其標(biāo)靶后施用所述有絲分裂抑制劑。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種提高包含Wnt途徑抑制劑和有絲分裂抑制劑的組合治療的功效的方法，其中所述方法包括在允許有足夠的時(shí)間使Wnt途徑抑制劑在其標(biāo)靶處積聚之后施用有絲分裂抑制劑。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)靶是FZD蛋白。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)靶是Wnt蛋白。在一些實(shí)施方案中，發(fā)現(xiàn)標(biāo)靶與腫瘤相關(guān)。

在本文所述的方法的一些實(shí)施方案中，在施用Wnt途徑抑制劑后約1天施用有絲分裂抑制劑。在一些實(shí)施方案中，在施用Wnt途徑抑制劑后約2天施用有絲分裂抑制劑。在一些實(shí)施方案中，在施用Wnt途徑抑制劑后約3天施用有絲分裂抑制劑。

在本文所述方法的一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑和有絲分裂抑制劑協(xié)同作用。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑使癌細(xì)胞對(duì)有絲分裂抑制劑敏感。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑使癌癥干細(xì)胞對(duì)有絲分裂抑制劑敏感。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑在有絲分裂(M)期抑制或阻止細(xì)胞周期進(jìn)程。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑在G2/M檢查點(diǎn)抑制或阻止細(xì)胞周期進(jìn)程。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑在G2/M檢查點(diǎn)抑制或阻止細(xì)胞周期進(jìn)程，并提高有絲分裂抑制劑的功效。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑在M期抑制或阻止細(xì)胞周期進(jìn)程并提高有絲分裂抑制劑的功效。在一些實(shí)施方案中，交錯(cuò)給藥使得能持續(xù)抑制Wnt途徑活性和提高有絲分裂抑制劑的功效。

在本文所述方法的一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑與有絲分裂抑制劑組合的交錯(cuò)給藥方案增加腫瘤細(xì)胞的凋亡。在本文所述方法的一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑與有絲分裂抑制劑組合的交錯(cuò)給藥方案提高了腫瘤細(xì)胞的裂解。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑與有絲分裂抑制劑的組合的交錯(cuò)給藥方案使得Wnt途徑抑制劑能在腫瘤部位積聚。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑與有絲分裂抑制劑的組合的交錯(cuò)給藥方案使得Wnt途徑抑制劑和有絲分裂抑制劑的抗腫瘤活性能同步化。

在本文所述的方法的一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑每3周施用一次。在一些實(shí)施方案中，有絲分裂抑制劑約每周施用一次，約每2周施用一次，約每3周施用一次，約每4周施用一次，或在4周(即28天)周期內(nèi)的3周，約每周施用一次。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑約每3周施用一次，并且有絲分裂抑制劑每周施用一次，或在4周(即28天)周期內(nèi)的3周，約每周施用一次。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑每4周施用一次。在一些實(shí)施方案中，約每周施用一次，約每2周施用一次，有絲分裂抑制劑約每3周施用一次或約每4周施用一次。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑每4周施用一次，并且有絲分裂抑制劑每周施用一次，或在4周(即28天)周期內(nèi)的3周，約每周施用一次。

在一些實(shí)施方案中，治療或給藥方案可以限于特定的施用次數(shù)或“周期”?！爸芷凇笨梢允枪幕蛲ǔＳ杀绢I(lǐng)域技術(shù)人員用于標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理治療劑的給藥方案。例如，紫杉醇的周期可以在4周周期內(nèi)的3周，每周施用一次(即每4周有一周不施用)。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑施用2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)或更多個(gè)周期。在一些實(shí)施方案中，所述有絲分裂抑制劑施用2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)或更多個(gè)周期。在一些實(shí)施方案中，一種劑保持1個(gè)或多個(gè)周期不施用，而第二劑繼續(xù)施用。

在本文所述的方法的一些實(shí)施方案中，所述癌癥是選自結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、腎癌、前列腺癌、胃腸癌、黑素瘤、宮頸癌、膀胱癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤和頭頸癌。在某些實(shí)施方案中，癌癥是乳腺癌。在一些實(shí)施方案中，癌癥是卵巢癌。在某些實(shí)施方案中，癌癥是肺癌。如本文所使用的，“肺癌”包括但不限于小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)。在某些實(shí)施方案中，癌癥是胰腺癌。在一些實(shí)施方案中，癌癥是結(jié)腸癌。

在一些實(shí)施方案中，一種治療癌癥的方法包括向受試者施用治療有效量的凡地吐單抗(OMP-18R5)和治療有效量的選自紫杉醇，白蛋白結(jié)合型紫杉醇和多西紫杉醇的紫杉烷，其中在施用凡地吐單抗后約1天、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天或約7天施用紫杉烷。在一些實(shí)施方案中，在施用凡地吐單抗之后約2天施用紫杉烷。在一些實(shí)施方案中，約每2周施用一次凡地吐單抗。在一些實(shí)施方案中，約每3周施用一次凡地吐單抗。在一些實(shí)施方案中，約每4周施用一次凡地吐單抗。在一些實(shí)施方案中，紫杉烷每周施用一次。在一些實(shí)施方案中，紫杉烷每2周施用一次。在一些實(shí)施方案中，紫杉烷每三周施用一次。在一些實(shí)施方案中，紫杉烷在每4周周期的3周，每周施用一次。在一些實(shí)施方案中，一種治療癌癥的方法包括向受試者施用治療有效量的凡地吐單抗(OMP-18R5)和治療有效量的多西紫杉醇，其中多西紫杉醇在施用凡地吐單抗后約2或3天施用。在一些實(shí)施方案中，治療癌癥的方法包括向受試者施用治療有效量的凡地吐單抗(OMP-18R5)、治療有效量的白蛋白結(jié)合型紫杉醇和治療有效量的吉西他濱(gemcitabine)，其中所述白蛋白結(jié)合型紫杉醇和吉西他濱在施用凡地吐單抗之后約2或3天施用。在一些實(shí)施方案中，治療癌癥的方法包括向受試者施用治療有效量的凡地吐單抗(OMP-18R5)、治療有效量的白蛋白結(jié)合型紫杉醇和治療有效量的吉西他濱，其中在施用凡地吐單抗之后約2或3天施用所述白蛋白結(jié)合型紫杉醇。在一些實(shí)施方案中，治療癌癥的方法包括向受試者施用治療有效量的凡地吐單抗(OMP-18R5)和治療有效量的紫杉醇，其中紫杉醇在施用凡地吐單抗后約2或3天施用。

在一些實(shí)施方案中，治療癌癥的方法包括向受試者施用治療有效量的艾非納西肽(OMP-54F28)和治療有效量的選自紫杉醇、白蛋白結(jié)合型紫杉醇和多西紫杉醇中的紫杉烷，其中所述紫杉烷在施用艾非納西肽后約1天、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天或約7天施用。在一些實(shí)施方案中，紫杉烷在施用艾非納西肽后約2天施用。在一些實(shí)施方案中，艾非納西肽約每2周施用一次。在一些實(shí)施方案中，艾非納西肽約每3周施用一次。在一些實(shí)施方案中，艾非納西肽約每4周施用一次。在一些實(shí)施方案中，紫杉烷每周施用一次。在一些實(shí)施方案中，紫杉烷每2周施用一次。在一些實(shí)施方案中，紫杉烷每3周施用一次。在一些實(shí)施方案中，紫杉烷在每周4周周期的3周，每周施用一次。在一些實(shí)施方案中，治療癌癥的方法包括向受試者施用治療有效量的艾非納西肽(OMP-54F28)，治療有效量的紫杉醇和治療有效量的卡鉑，其中紫杉醇和卡鉑在施用艾非納西肽后約2或3天施用。在一些實(shí)施方案中，治療癌癥的方法包括向受試者施用治療有效量的艾非納西肽(OMP-54F28)、治療有效量的紫杉醇和治療有效量的卡鉑，其中紫杉醇在施用艾非納西肽后約2或3天施用。在一些實(shí)施方案中，治療癌癥的方法包括向受試者施用治療有效量的艾非納西肽(OMP-54F28)、治療有效量的白蛋白結(jié)合型紫杉醇和治療有效量的吉西他濱，其中所述白蛋白結(jié)合型紫杉醇和吉西他濱在艾非納西肽施用后約2或3天施用。在一些實(shí)施方案中，治療癌癥的方法包括向受試者施用治療有效量的艾非納西肽(OMP-54F28)、治療有效量的白蛋白結(jié)合型紫杉醇和治療有效量的吉西他濱，其中施用所述白蛋白結(jié)合型紫杉醇在艾非納西肽施用后約2或3天施用。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了抑制腫瘤生長的方法，其包括使腫瘤細(xì)胞接觸有效量的Wnt途徑抑制劑和有效量的有絲分裂抑制劑，其中Wnt途徑抑制劑首先施用于細(xì)胞，有絲分裂抑制劑然后施用于細(xì)胞。本發(fā)明提供了抑制腫瘤生長的方法，其包括使腫瘤細(xì)胞接觸有效量的Wnt途徑抑制劑和有效量的有絲分裂抑制劑，其中使用交錯(cuò)給藥方案將Wnt途徑抑制劑和有絲分裂抑制劑施用于細(xì)胞并且首先向細(xì)胞施用Wnt途徑抑制劑。在一些實(shí)施方案中，在施用Wnt途徑抑制劑后約12小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí)、48小時(shí)、60小時(shí)、72小時(shí)、84或96小時(shí)施用有絲分裂抑制劑。在一些實(shí)施方案中，在施用Wnt途徑抑制劑后約1天、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天或約7天施用有絲分裂抑制劑。本發(fā)明還提供了提高有絲分裂抑制劑在抑制腫瘤生長中的功效的方法，其包括：(a)使腫瘤細(xì)胞與Wnt途徑抑制劑接觸；以及(b)在施用Wnt途徑抑制劑后約1天、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天或約7天，使腫瘤細(xì)胞與有絲分裂抑制劑接觸。

在本文所述的方法的某些實(shí)施方案中，抑制腫瘤生長的方法包括在體外使腫瘤或腫瘤細(xì)胞接觸Wnt途徑抑制劑和有絲分裂途徑抑制劑。例如，在一些實(shí)施方案中，永生化細(xì)胞系或癌細(xì)胞系在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，首先向該培養(yǎng)基添加Wnt途徑抑制劑，然后加入有絲分裂抑制劑以抑制腫瘤細(xì)胞生長。在一些實(shí)施方案中，從患者樣品(例如組織活檢、胸腔積液或血液樣品)中分離腫瘤細(xì)胞，并在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，向該培養(yǎng)基添加Wnt途徑抑制劑和有絲分裂抑制劑的以抑制腫瘤細(xì)胞生長。

在一些實(shí)施方案中，抑制腫瘤生長的方法包括在體內(nèi)使腫瘤或腫瘤細(xì)胞與Wnt途徑抑制劑和有絲分裂抑制劑接觸。在某些實(shí)施方案中，使腫瘤或腫瘤細(xì)胞與Wnt途徑抑制劑和有絲分裂抑制劑接觸在動(dòng)物模型中進(jìn)行。例如，Wnt途徑抑制劑和有絲分裂抑制劑可以以交錯(cuò)給藥方式施用于攜帶異種移植腫瘤以抑制腫瘤生長的免疫受損小鼠(例如NOD/SCID小鼠)。在某些實(shí)施方案中，癌干細(xì)胞從患者樣品(例如組織活檢、胸腔積液或血液樣品)中分離，并被注射到免疫受損小鼠中，然后以交錯(cuò)給藥方式向免疫受損小鼠施用Wnt途徑抑制劑，接著施用有絲分裂抑制劑以抑制腫瘤細(xì)胞生長。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑和有絲分裂抑制劑以交錯(cuò)給藥方式同時(shí)或在將細(xì)胞引入動(dòng)物后不久施用以防止腫瘤生長(預(yù)防模型)。在一些實(shí)施方案中，在細(xì)胞生長至特定大小的腫瘤后，以交錯(cuò)給藥方式施用Wnt途徑抑制劑和有絲分裂抑制劑以抑制和/或減少腫瘤生長(治療模型)。

本發(fā)明還提供了抑制受試者中腫瘤生長的方法，其包括以交錯(cuò)給藥方式向受試者施用治療有效量的Wnt途徑抑制劑和治療有效量的有絲分裂抑制劑，其中Wnt途徑抑制劑在施用有絲分裂抑制劑之前施用。在某些實(shí)施方案中，受試者是人。在某些實(shí)施方案中，受試者具有腫瘤或其腫瘤已經(jīng)移除。在一些實(shí)施方案中，受試者具有已轉(zhuǎn)移的腫瘤。在一些實(shí)施方案中，受試者已經(jīng)進(jìn)行了之前的治療處理。

本發(fā)明還提供了減少受試者中腫瘤尺寸的方法，其包括以交錯(cuò)給藥方式向受試者施用治療有效量的Wnt途徑抑制劑和治療有效量的有絲分裂抑制劑，其中Wnt途徑抑制劑在施用有絲分裂抑制劑之前施用。在一些實(shí)施方案中，通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡來減小腫瘤尺寸。在一些實(shí)施方案中，通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的裂解來減小腫瘤尺寸。在某些實(shí)施方案中，受試者是人。在某些實(shí)施方案中，受試者具有腫瘤或其腫瘤已經(jīng)移除。在一些實(shí)施方案中，受試者具有已經(jīng)轉(zhuǎn)移的腫瘤。在一些實(shí)施方案中，受試者已經(jīng)進(jìn)行了之前的治療處理。

本發(fā)明還提供了誘導(dǎo)在受試者中的腫瘤消退的方法，其包括以交錯(cuò)給藥方式向受試者施用治療有效量的Wnt途徑抑制劑和治療有效量的有絲分裂抑制劑，其中Wnt途徑抑制劑在施用有絲分裂抑制劑之前施用。在某些實(shí)施方案中，受試者是人。在某些實(shí)施方案中，受試者具有腫瘤或其腫瘤已經(jīng)移除。在一些實(shí)施方案中，受試者具有已經(jīng)轉(zhuǎn)移的腫瘤。在一些實(shí)施方案中，受試者已經(jīng)進(jìn)行了之前的治療處理。

本發(fā)明還提供了抑制受試者中腫瘤侵襲性的方法，其包括以交錯(cuò)給藥方式向受試者施用治療有效量的Wnt途徑抑制劑和治療有效量的有絲分裂抑制劑，其中Wnt途徑抑制劑在施用有絲分裂抑制劑之前施用。在一些實(shí)施方案中，抑制侵襲性包括提高腫瘤細(xì)胞的E-鈣粘蛋白表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，受試者是人。在某些實(shí)施方案中，受試者具有腫瘤或其腫瘤已經(jīng)移除。

本發(fā)明還提供了減少或預(yù)防受試者內(nèi)的轉(zhuǎn)移(metastas)的方法，其包括以交錯(cuò)給藥方式向受試者施用治療有效量的Wnt途徑抑制劑和治療有效量的有絲分裂抑制劑，其中Wnt途徑抑制劑在施用有絲分裂抑制劑之前施用。在一些實(shí)施方案中，減少或預(yù)防轉(zhuǎn)移包括抑制腫瘤的侵襲性。在一些實(shí)施方案中，減少或預(yù)防轉(zhuǎn)移包括通過提高腫瘤細(xì)胞的E-鈣粘蛋白表達(dá)來抑制腫瘤的侵襲性。在某些實(shí)施方案中，受試者是人。在某些實(shí)施方案中，受試者具有腫瘤或其腫瘤已經(jīng)移除。

本發(fā)明還提供了抑制細(xì)胞中的Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的方法，其包括以交錯(cuò)給藥方式使細(xì)胞與有效量的Wnt途徑抑制劑以及有效量的有絲分裂抑制劑接觸，其中在施用有絲分裂抑制劑之前施用Wnt途徑抑制劑。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述方法是體內(nèi)方法，其中使細(xì)胞與抑制劑接觸的步驟包括向受試者施用治療有效量的抑制劑。在一些實(shí)施方案中，所述方法是體外或離體方法。在某些實(shí)施方案中，被抑制的Wnt信號(hào)傳導(dǎo)是規(guī)范的Wnt信號(hào)傳導(dǎo)。在某些實(shí)施方案中，被抑制的Wnt信號(hào)傳導(dǎo)是自分泌Wnt信號(hào)傳導(dǎo)。在某些實(shí)施方案中，被抑制的Wnt信號(hào)傳導(dǎo)是有絲分裂Wnt信號(hào)傳導(dǎo)。在某些實(shí)施方案中，Wnt信號(hào)傳導(dǎo)是通過Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt7b和/或Wnt10b進(jìn)行的信號(hào)傳導(dǎo)。在某些實(shí)施方案中，Wnt信號(hào)傳導(dǎo)是通過Wnt1、Wnt3a、Wnt7b和/或Wnt10b進(jìn)行的信號(hào)傳導(dǎo)。

另外，本發(fā)明提供了降低受試者中的腫瘤的致瘤性的方法，其包括以交錯(cuò)給藥方式向受試者施用治療有效量的Wnt途徑抑制劑和治療有效量的有絲分裂抑制劑，其中在施用有絲分裂抑制劑之前施用Wnt途徑抑制劑。在某些實(shí)施方案中，腫瘤包含癌癥干細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，通過降低腫瘤中癌干細(xì)胞的頻率來降低腫瘤的致瘤性。在某些實(shí)施方案中，腫瘤中癌癥干細(xì)胞的頻率通過施用Wnt途徑抑制劑而減少。在一些實(shí)施方案中，通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的分化來降低腫瘤的致瘤性。在一些實(shí)施方案中，通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡來降低腫瘤的致瘤性。在一些實(shí)施方案中，通過提高腫瘤細(xì)胞的凋亡來降低腫瘤的致瘤性。

本發(fā)明還提供了減少包含癌癥干細(xì)胞的腫瘤中的癌癥干細(xì)胞頻率的方法，所述方法包括以交錯(cuò)給藥的方式向受試者施用治療有效量的Wnt途徑抑制劑和治療有效量的有絲分裂抑制劑，其中在施用有絲分裂抑制劑之前施用Wnt途徑抑制劑。在某些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑與有絲分裂抑制劑的組合能夠降低動(dòng)物模型(例如小鼠異種移植模型)中包含癌癥干細(xì)胞的腫瘤的致瘤性。在某些實(shí)施方案中，與未經(jīng)治療的腫瘤中的癌癥干細(xì)胞的數(shù)量或頻率相比，經(jīng)治療的腫瘤中癌癥干細(xì)胞的數(shù)量或頻率降低至少約2倍、約3倍、約5倍、約10倍、約50倍、約100倍、或約1000倍。在某些實(shí)施方案中，通過使用動(dòng)物模型的有限稀釋測定來確定癌癥干細(xì)胞的數(shù)量或頻率的減少。

在某些實(shí)施方案中，腫瘤是其中Wnt信號(hào)傳導(dǎo)具有活性的腫瘤。在某些實(shí)施方案中，有活性的Wnt信號(hào)傳導(dǎo)是規(guī)范的Wnt信號(hào)傳導(dǎo)。在某些實(shí)施方案中，有活性的Wnt信號(hào)傳導(dǎo)是非規(guī)范Wnt信號(hào)傳導(dǎo)。在某些實(shí)施方案中，有活性的Wnt信號(hào)傳導(dǎo)是自分泌Wnt信號(hào)傳導(dǎo)。在某些實(shí)施方案中，有活性的Wnt信號(hào)是有絲分裂Wnt信號(hào)傳導(dǎo)。在某些實(shí)施方案中，腫瘤是Wnt依賴性腫瘤。

在本文所述方法的某些實(shí)施方案中，腫瘤表達(dá)與Wnt結(jié)合劑結(jié)合的一種或多種人Wnt蛋白。在某些實(shí)施方案中，腫瘤過表達(dá)一種或多種人Wnt蛋白。在某些實(shí)施方案中，與相同組織類型的正常組織中的Wnt蛋白表達(dá)相比，腫瘤過表達(dá)一種或多種人Wnt蛋白。在某些實(shí)施方案中，與至少一種其他腫瘤中的Wnt蛋白表達(dá)相比，腫瘤過表達(dá)一種或多種人Wnt蛋白。在一些實(shí)施方案中，腫瘤過表達(dá)Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11和Wnt16。在一些實(shí)施方案中，腫瘤過表達(dá)Wnt3或Wnt3a。

在某些實(shí)施方案中，腫瘤表達(dá)與FZD結(jié)合劑結(jié)合的一種或多種人FZD蛋白。在某些實(shí)施方案中，腫瘤過表達(dá)一種或多種人FZD蛋白。在某些實(shí)施方案中，腫瘤過表達(dá)人FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、ZFD6、FZD7、FZD8、FZD9和/或FZD10。在某些實(shí)施方案中，腫瘤過表達(dá)人FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、和/或FZD8。在某些實(shí)施方案中，腫瘤過表達(dá)人FZD8。應(yīng)當(dāng)理解，人FZD蛋白的“過表達(dá)”對(duì)于本文所述的FZD結(jié)合劑的使用不是必需的或不是必要的。

在本文所述的方法的一些實(shí)施方案中，所述腫瘤是選自結(jié)腸直腸腫瘤、胰腺腫瘤、肺腫瘤、卵巢腫瘤、肝腫瘤、乳腺腫瘤、腎腫瘤、前列腺腫瘤、胃腸腫瘤、黑素瘤、宮頸腫瘤、膀胱腫瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤和頭頸部腫瘤。在某些實(shí)施方案中，腫瘤是乳腺腫瘤。在一些實(shí)施方案中，所述腫瘤是卵巢腫瘤。在某些實(shí)施方案中，所述腫瘤是肺腫瘤。在某些實(shí)施方案中，所述腫瘤是胰腺腫瘤。

在本文所述的任何方法的一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是Wnt結(jié)合劑。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是FZD結(jié)合劑。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是抗體。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是抗Wnt抗體。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是抗FZD抗體。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是抗體OMP-18R5。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是可溶性受體。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是FZD-Fc可溶性受體。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是FZD8-Fc可溶性受體。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是FZD8-Fc可溶性受體OMP-54F28(艾非納西肽)。

在本文所述的任何方法的一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是特異性結(jié)合至少一種卷曲蛋白(FZD)或其片段的抗體。在一些實(shí)施方案中，抗體特異性結(jié)合選自FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9和FZD10中的至少一種人FZD蛋白。在一些實(shí)施方案中，抗體特異性結(jié)合選自FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8的至少一種人FZD蛋白。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是特異性結(jié)合至少一種人FZD蛋白的抗體，所述抗體包含：(a)包含GFTFSHYTLS(SEQ ID NO:7)的重鏈CDR1，包含VISGDGSYTYYADSVKG(SEQ ID NO:8)的重鏈CDR2，和包含NFIKYVFAN(SEQ ID NO:9)的重鏈CDR3，和(b)包含SGDNIGSFYVH(SEQ ID NO:10)的輕鏈CDR1，包含DKSNRPSG(SEQ ID NO:11)的輕鏈CDR2，和包含QSYANTLSL(SEQ ID NO:12)的輕鏈CDR3。

在本文所述的任何方法的某些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是包含(a)包含GFTFSHYTLS(SEQ ID NO:7)的重鏈CDR1，包含VISGDGSYTYYADSVKG(SEQ ID NO:8)的重鏈CDR2和包含NFIKYVFAN(SEQ ID NO:9)的重鏈CDR3，和(b)包含SGDNIGSFYVH(SEQ ID NO:10)的輕鏈CDR1，包含DKSNRPSG(SEQ ID NO:11)的輕鏈CDR2和包含QSYANTLSL(SEQ ID NO:12)的輕鏈CDR3，并以交錯(cuò)給藥方式與有絲分裂抑制劑組合施用。

在本文所述的任何方法的某些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是包含(a)包含GFTFSHYTLS(SEQ ID NO:7)的重鏈CDR1，包含VISGDGSYTYYADSVKG(SEQ ID NO:8)的重鏈CDR2和包含NFIKYVFAN(SEQ ID NO:9)的重鏈CDR3，和(b)包含SGDNIGSFYVH(SEQ ID NO:10)的輕鏈CDR1，包含DKSNRPSG(SEQ ID NO:11)的輕鏈CDR2和包含QSYANTLSL(SEQ ID NO:12)的輕鏈CDR3，并以交錯(cuò)給藥方式與紫杉烷組合施用。

在本文所述的任何方法的某些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是包含(a)包含GFTFSHYTLS(SEQ ID NO:7)的重鏈CDR1，包含VISGDGSYTYYADSVKG(SEQ ID NO:8)的重鏈CDR2和包含NFIKYVFAN(SEQ ID NO:9)的重鏈CDR3，和(b)包含SGDNIGSFYVH(SEQ ID NO:10)的輕鏈CDR1，包含DKSNRPSG(SEQ ID NO:11)的輕鏈CDR2和包含QSYANTLSL(SEQ ID NO:12)的輕鏈CDR3，并且以交錯(cuò)給藥方式與紫杉醇、白蛋白結(jié)合型紫杉醇或多西紫杉醇組合施用。

在本文所述的任何方法的某些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是包含含有SEQ ID NO:5的重鏈可變區(qū)和含有SEQ ID NO:6的輕鏈可變區(qū)的抗體，其以交錯(cuò)給藥方式與有絲分裂抑制劑組合施用。

在本文所述的任何方法的某些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是包含含有SEQ ID NO:5的重鏈可變區(qū)和含有SEQ ID NO:6的輕鏈可變區(qū)的抗體，其以交錯(cuò)給藥方式與紫杉烷組合施用。

在本文所述的任何方法的某些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是包含含有SEQ ID NO:5的重鏈可變區(qū)和含有SEQ ID NO:6的輕鏈可變區(qū)的抗體，其以交錯(cuò)給藥方式與紫杉醇、白蛋白結(jié)合型紫杉醇或多西紫杉醇組合施用。

在一些實(shí)施方案中，抗體是單克隆抗體、重組抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體或包含抗原結(jié)合部位的抗體片段。在一些實(shí)施方案中，抗體是單特異性抗體或雙特異性抗體。在一些實(shí)施方案中，抗體是IgG1抗體或IgG2抗體。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是抗體OMP-18R5(凡地吐單抗)。

在本文所述的任何方法的某些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是可溶性受體。在一些實(shí)施方案中，可溶性受體包含人FZD蛋白的Fri結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，人FZD蛋白的Fri結(jié)構(gòu)域包含F(xiàn)ZD1的Fri結(jié)構(gòu)域、FZD2的Fri結(jié)構(gòu)域、FZD3的Fri結(jié)構(gòu)域、FZD4的Fri結(jié)構(gòu)域、FZD5的Fri結(jié)構(gòu)域、FZD6的Fri結(jié)構(gòu)域、FZD7的Fri結(jié)構(gòu)域、FZD8的Fri結(jié)構(gòu)域、FZD9的Fri結(jié)構(gòu)域或FZD10的Fri結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，人FZD蛋白的Fri結(jié)構(gòu)域包含F(xiàn)ZD8的Fri結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，人FZD蛋白的Fri結(jié)構(gòu)域包含選自SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23中的序列。

在本文所述的任何方法的某些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是包含SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21的FZD-Fc可溶性受體，其以交錯(cuò)給藥方式與有絲分裂抑制劑組合施用。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是包含SEQ ID NO:20的FZD-Fc可溶性受體。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是包含SEQ ID NO:21的FZD-Fc可溶性受體。在一些實(shí)施方案中，有絲分裂抑制劑是紫杉烷。在一些實(shí)施方案中，紫杉烷是紫杉醇、白蛋白結(jié)合型紫杉醇或多西紫杉醇。

在本文所述的任何方法的某些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是包含SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30的FZD-Fc可溶性受體，其以交錯(cuò)給藥方式與有絲分裂抑制劑組合施用。在一些實(shí)施方案中，有絲分裂抑制劑是紫杉烷。在一些實(shí)施方案中，紫杉烷是紫杉醇、白蛋白結(jié)合型紫杉醇或多西紫杉醇。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是包含SEQ ID NO:29的FZD-Fc可溶性受體，其以交錯(cuò)給藥方式與紫杉烷組合施用。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是包含SEQ ID NO:29的FZD-Fc可溶性受體，其以交錯(cuò)給藥方式與紫杉醇、白蛋白結(jié)合型紫杉醇或多西紫杉醇組合施用。

本發(fā)明還提供了包含Wnt途徑抑制劑和/或有絲分裂抑制劑的組合物。在一些實(shí)施方案中，組合物包含本文所述的Wnt結(jié)合劑或多肽。在一些實(shí)施方案中，組合物包含本文所述的FZD結(jié)合劑或多肽。在一些實(shí)施方案中，組合物包含本文所述的有絲分裂抑制劑。在一些實(shí)施方案中，組合物是包含Wnt途徑抑制劑和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。在一些實(shí)施方案中，組合物是包含有絲分裂抑制劑和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。該藥物組合物可用于抑制腫瘤細(xì)胞生長、減小腫瘤尺寸、誘導(dǎo)腫瘤消退和治療人類患者的癌癥。在一些實(shí)施方案中，本文所述的FZD結(jié)合劑可與有絲分裂抑制劑組合用于制備用于治療癌癥的藥物。在一些實(shí)施方案中，本文所述的Wnt結(jié)合劑可與有絲分裂抑制劑組合用于制備用于治療癌癥的藥物。

通過將治療劑與藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑和/或穩(wěn)定劑作為無菌凍干粉末、水溶液等組合來制備用于儲(chǔ)存和使用的制劑(Remington:The Science and Practice of Pharmacy,22^ndEdition,2012,Pharmaceutical Press,London)。本領(lǐng)域技術(shù)人員通常認(rèn)為藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑和/或穩(wěn)定劑是制劑或藥物組合物的非活性成分。

合適的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑包括無毒緩沖劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機(jī)酸；鹽，例如氯化鈉；抗氧化劑，其包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基芐基氯化銨；六甲基氯化銨；苯扎氯銨；芐索氯銨；苯酚，丁醇或芐醇；烷基對(duì)羥基苯甲酸酯，例如甲基或丙基對(duì)羥基苯甲酸酯；兒茶酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間甲酚)；低分子量多肽(例如小于約10個(gè)氨基酸殘基)；蛋白質(zhì)，例如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，組氨酸，精氨酸或賴氨酸；碳水化合物，如單糖，二糖，葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合劑，如EDTA；糖，例如蔗糖，甘露醇，海藻糖，或山梨醇；成鹽抗衡離子，如鈉；金屬絡(luò)合物(例如Zn-蛋白質(zhì)絡(luò)合物)；和/或非離子表面活性劑，如聚山梨酯(TWEEN)或聚乙二醇(PEG)。

治療制劑可以是單位劑型。這樣的制劑包括片劑、丸劑、膠囊、粉劑、顆粒劑、在水或非水介質(zhì)中的溶液劑或混懸劑、或用于口服、腸胃外或直腸施用或通過吸入施用的栓劑。在諸如片劑之類的固體組合物中，主要活性成分與藥物載體混合。如本文所述，藥物載體被認(rèn)為是制劑或組合物的非活性成分。常規(guī)的壓片成分包括玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸鎂、磷酸二鈣或樹膠、以及其他稀釋劑(例如水)，以形成含有化合物的均勻混合物的固體預(yù)制劑組合物，或其無毒的藥學(xué)上可接受的鹽。然后將固體預(yù)制劑組合物再分成上述類型的單位劑型。新組合物的片劑、丸劑等可以被包衣或以其他方式復(fù)合以提供具有延長作用的優(yōu)點(diǎn)的劑型。例如，片劑或丸劑可以包含被外部組分覆蓋的內(nèi)部組合物。此外，兩種組分可以通過腸溶層分開，腸溶層用于抵抗崩解并且允許內(nèi)部組分完整地通過胃或延遲釋放。各種材料可用于這樣的腸溶層或包衣，這樣的腸溶層或包衣包括多種聚合酸和聚合酸與諸如紫膠、鯨蠟醇和乙酸纖維素之類的材料的混合物。

藥物制劑可包括與脂質(zhì)體復(fù)合的Wnt途徑抑制劑和/或有絲分裂抑制劑?？梢允褂冒字Ｄ憠A、膽固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂質(zhì)組合物通過反相蒸發(fā)來產(chǎn)生脂質(zhì)體。將脂質(zhì)體通過限定孔徑的過濾器擠出以產(chǎn)生具有所需直徑的脂質(zhì)體。

Wnt途徑抑制劑和/或有絲分裂抑制劑也可以包埋在微膠囊中。這樣的微膠囊例如通過凝膠技術(shù)或通過界面聚合制備，例如分別在膠體藥物遞送系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳劑、微乳劑、納米顆粒和納米膠囊)中或在如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,22^ndEdition,2012,Pharmaceutical Press,London中所述的宏乳液(macroemulsions)中的羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯))微膠囊。

此外，可以制備包含Wnt途徑抑制劑和/或有絲分裂抑制劑的持續(xù)釋放制劑。持續(xù)釋放制劑的合適實(shí)例包括含有該劑的固體疏水性聚合物的半透性基質(zhì)，所述基質(zhì)為成形制品(例如膜或微膠囊)的形式。持續(xù)釋放基質(zhì)的實(shí)例包括聚酯，水凝膠，如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇)，聚丙交酯，L-谷氨酸和7乙基-L-谷氨酸的共聚物，不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯，可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，例如LUPRON DEPOT^TM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林構(gòu)成的可注射微球體)，蔗糖乙酸異丁酸酯和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。

Wnt途徑抑制劑和有絲分裂抑制劑根據(jù)已知方法作為合適的藥物組合物施用于人類患者。藥物組合物可以以多種方式施用以用于局部或全身治療。合適的施用方法包括但不限于靜脈內(nèi)(作為丸劑或通過在一段時(shí)間內(nèi)連續(xù)輸注施用)，動(dòng)脈內(nèi)，肌內(nèi)(注射或輸注)，腫瘤內(nèi)，腹膜內(nèi)，腦脊髓內(nèi)，皮下，關(guān)節(jié)內(nèi)，滑膜內(nèi)，顱內(nèi)(例如鞘內(nèi)或心室內(nèi))或口服。另外，施用可以是局部性的(例如透皮貼劑，軟膏，洗劑，霜?jiǎng)?，凝膠劑，滴劑，栓劑，噴霧劑，液體和粉末)或經(jīng)肺進(jìn)行的(例如通過吸入或吹入粉末或氣霧劑，包括通過噴霧器；氣管內(nèi)，鼻內(nèi)，表皮和經(jīng)皮)。

為了治療疾病，Wnt途徑抑制劑與有絲分裂抑制劑的組合的合適劑量取決于待治療的疾病的類型，疾病的嚴(yán)重性和病程，疾病的反應(yīng)性，不管施用抑制劑是為了治療的目的還是為了預(yù)防目的，先前的治療，患者的臨床病史等等，所有這些都由治療醫(yī)師決定。Wnt途徑抑制劑可以一次施用或作為一系列治療在幾天至幾個(gè)月內(nèi)施用，或直到實(shí)現(xiàn)治愈或?qū)崿F(xiàn)疾病狀態(tài)的減輕(例如腫瘤尺寸減小)。有絲分裂抑制劑可以一次施用或作為一系列治療在幾天至幾個(gè)月內(nèi)施用，或直到實(shí)現(xiàn)治愈或?qū)崿F(xiàn)疾病狀態(tài)的減輕(例如腫瘤尺寸減小)。每種劑的最佳給藥方案可以根據(jù)患者體內(nèi)藥物積累的測量結(jié)果來計(jì)算，并且將根據(jù)單種劑的相對(duì)功效而變化。施用醫(yī)師可以確定最佳劑量、給藥方法和重復(fù)率。

在一些實(shí)施方案中，組合施用包括以單一藥物制劑共同施用。在一些實(shí)施方案中，組合施用包括使用單獨(dú)的制劑并以任何順序但通常在一段時(shí)間內(nèi)連續(xù)施用，使得所有活性劑可同時(shí)發(fā)揮其生物活性。在一些實(shí)施方案中，組合施用包括使用單獨(dú)的制劑和交錯(cuò)給藥方案。在一些實(shí)施方案中，組合施用包括使用單獨(dú)的制劑和以特定的順序施用。在一些實(shí)施方案中，組合施用包括使用單獨(dú)的制劑和以特定的順序和交錯(cuò)給藥方案施用劑。例如，在一些實(shí)施方案中，在施用Wnt途徑抑制劑后約1天、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天或約7天施用有絲分裂抑制劑。在一些實(shí)施方案中，在施用Wnt途徑抑制劑后約2天施用有絲分裂抑制劑。

在某些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑的劑量為約0.01μg至約100mg/kg體重，約0.1μg至約100mg/kg體重，約1μg至約100mg/kg體重，約1mg至約100mg/kg體重，約1mg至約80mg/kg體重，約10mg至約100mg/kg體重，約10mg至約75mg/kg體重，或約10mg至約50mg/kg體重。在某些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑的劑量為約0.1mg至約20mg/kg體重。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑以約2mg/kg至約10mg/kg的劑量施用于受試者。在某些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑每天、每周、每月或每年施用一次或多次。在某些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑每周施用一次，每兩周施用一次，每三周施用一次或每四周施用一次。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑以每3周約2mg/kg至約5mg/kg的劑量施用。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑以每4周約3mg/kg至約7.5mg/kg的劑量施用。

在某些實(shí)施方案中，有絲分裂抑制劑的劑量為約20mg/m²至約3000mg/m²，約20mg/m²至約2000mg/m²，約20mg/m²至約1000mg/m²，約20mg/m²至約500mg/m²，或約20mg/m²至約250mg/m²。在某些實(shí)施方案中，有絲分裂抑制劑的劑量為約20mg/m²至約150mg/m²。在某些實(shí)施方案中，有絲分裂抑制劑的劑量為約50mg/m²。在某些實(shí)施方案中，有絲分裂抑制劑的劑量為約75mg/m²。在某些實(shí)施方案中，有絲分裂抑制劑的劑量為約90mg/m²。在某些實(shí)施方案中，有絲分裂抑制劑的劑量為約125mg/m²。在某些實(shí)施方案中，有絲分裂抑制劑每天、每周、每月或每年施用一次或多次。在某些實(shí)施方案中，有絲分裂抑制劑每天施用兩次或多次、每天施用一次、每2天施用一次、每3天施用一次、每4天施用一次、每5天施用一次、每周施用一次、每兩周施用一次、每三周施用一次、或每四周施用一次。在一些實(shí)施方案中，按照為標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理治療劑建立的給藥方案施用有絲分裂抑制劑。

在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑和/或有絲分裂抑制劑可以最初施用較高的“負(fù)荷”劑量，然后施用一個(gè)或多個(gè)較低的劑量。在一些實(shí)施方案中，施用頻率也可改變。在一些實(shí)施方案中，給藥方案可以包括施用初始劑量，隨后是每周施用一次、每兩周施用一次、每三周施用一次或每月施用一次額外的劑量(或“維持”劑量)。例如，給藥方案可包括施用初始負(fù)荷劑量，然后施用為例如初始劑量的一半的每周維持劑量。或者給藥方案可包括施用初始負(fù)荷劑量，然后施用例如每隔一周施用為初始劑量的一半的維持劑量?；蛘呓o藥方案可以包括施用三個(gè)初始劑量持續(xù)3周，然后每隔一周施用例如相同量的維持劑量。

如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，施用任何治療劑可能導(dǎo)致副作用和/或毒性。在一些情況下，副作用和/或毒性如此嚴(yán)重，以至阻止以治療有效劑量施用特定劑。在一些情況下，藥物治療必須停止，并且可以嘗試其他劑。然而，相同治療類別中的許多劑經(jīng)常顯示類似的副作用和/或毒性，這意味著患者或者必須停止治療，或者如果可能的話，遭受與治療劑相關(guān)的令人不快的副作用。

本發(fā)明提供了治療受試者中的癌癥的方法，其包括使用用于施用兩種或更多種試劑的施用策略，其可以減少與施用Wnt途徑抑制劑和/或有絲分裂抑制劑相關(guān)的副作用和/或毒性。在一些實(shí)施方案中，用于治療人受試者中的癌癥的方法包括向受試者施用治療有效劑量的Wnt途徑抑制劑與治療有效劑量的有絲分裂抑制劑的組合，其中這些抑制劑中的一者或兩者都根據(jù)間歇給藥策略施用。在一些實(shí)施方案中，間歇給藥策略包括向受試者施用初始劑量的Wnt途徑抑制劑，并且約每2周施用一次后續(xù)劑量的Wnt途徑抑制劑。在一些實(shí)施方案中，間歇給藥策略包括向受試者施用初始劑量的Wnt途徑抑制劑，并且約每3周施用一次后續(xù)劑量的Wnt途徑抑制劑。在一些實(shí)施方案中，間歇給藥策略包括向受試者施用初始劑量的Wnt途徑抑制劑，并且約每4周施用一次后續(xù)劑量的Wnt途徑抑制劑。在一些實(shí)施方案中，使用間歇給藥策略施用Wnt途徑抑制劑，并且有絲分裂抑制劑每周施用或在4周周期的3周，每周施用。

使用兩種或更多種治療劑的組合治療通常使用通過不同作用機(jī)理起作用的劑，盡管這不是必需的。使用具有不同作用機(jī)理的劑的組合治療可導(dǎo)致加成或協(xié)同效應(yīng)。組合治療可允許每種劑的劑量低于在單一療法中使用的劑量，從而減小毒性副作用和/或提高劑的治療指數(shù)。組合治療可以降低抗性癌細(xì)胞形成的可能性。在一些實(shí)施方案中，組合治療包括影響(例如，抑制或殺死)非致瘤性細(xì)胞的治療劑和影響(例如，抑制或殺死)致瘤性CSCs的治療劑。

在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑和有絲分裂抑制劑的組合產(chǎn)生加和或協(xié)同結(jié)果。在一些實(shí)施方案中，組合治療導(dǎo)致Wnt途徑抑制劑的治療指數(shù)的提高。在一些實(shí)施方案中，組合治療導(dǎo)致有絲分裂抑制劑的治療指數(shù)的提高。在一些實(shí)施方案中，組合治療導(dǎo)致Wnt途徑抑制劑的毒性和/或副作用的降低。在一些實(shí)施方案中，組合治療導(dǎo)致有絲分裂抑制劑的毒性和/或副作用的降低。

治療醫(yī)師可以基于測得的停留時(shí)間和藥物在體液或組織中的濃度來估計(jì)給藥的重復(fù)率。治療的進(jìn)展可以通過常規(guī)技術(shù)和測定來監(jiān)測。

在某些實(shí)施方案中，除了施用Wnt途徑抑制劑與有絲分裂抑制劑的組合外，治療方法還可以包括在施用Wnt途徑抑制劑之前、同時(shí)和/或之后施用至少一種另外的治療劑和/或有絲分裂抑制劑。

在一些實(shí)施方案中，另外的治療劑將與Wnt途徑抑制劑或有絲分裂抑制劑基本上同時(shí)或同時(shí)施用。例如，受試者可以服用Wnt途徑抑制劑和有絲分裂抑制劑，同時(shí)經(jīng)歷用另外的治療劑(例如，另外的化療劑)進(jìn)行的治療過程。在某些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑和有絲分裂抑制劑將在用另外的治療劑治療1年內(nèi)施用。在某些替代性實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑和有絲分裂抑制劑將在使用另外的治療劑的任何治療的10個(gè)月、8個(gè)月、6個(gè)月、4個(gè)月或2個(gè)月內(nèi)施用。在某些其他實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑和有絲分裂抑制劑將在使用另外的治療劑進(jìn)行的任何治療的4周、3周、2周或1周內(nèi)施用。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑和有絲分裂抑制劑將在使用另外的治療劑進(jìn)行的任何治療的5天、4天、3天、2天、或1天內(nèi)施用。還應(yīng)理解，所述劑或治療可以在利用Wnt途徑抑制劑或有絲分裂抑制劑的幾小時(shí)或幾分鐘(即，基本上同時(shí))的時(shí)間內(nèi)向受試者施用。

有用的另外的治療(例如抗癌)劑類別包括例如耳抑素(auristatins)、DNA次要凹槽結(jié)合劑、DNA復(fù)制抑制劑、烷化劑(例如鉑復(fù)合物，諸如順鉑(cis-platin)、單(鉑)、二(鉑)及三核鉑復(fù)合物及卡鉑(carboplatin))、蒽環(huán)類(anthracycline)、抗生素、抗葉酸劑、抗代謝物、化學(xué)療法致敏劑、雙聯(lián)霉素(duocarmycin)、依托泊苷(etoposide)、氟化嘧啶、離子載體、萊克西托素(lexitropsin)、亞硝基尿素、普拉汀諾(platinol)、嘌呤抗代謝物、嘌呤霉素(puromycin)、放射線致敏劑、類固醇、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、或類似物。在某些實(shí)施方案中，另外的治療劑是抗代謝物、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑或血管生成抑制劑。

可與Wnt途徑抑制劑和有絲分裂抑制劑組合施用的治療劑包括化療劑。因此，在一些實(shí)施方案中，該方法或治療涉及施用Wnt途徑抑制劑和有絲分裂抑制劑與化療劑或多種不同化療劑的雞尾酒(cocktail)的組合。利用Wnt途徑抑制劑和有絲分裂抑制劑進(jìn)行的治療可發(fā)生于施用化療劑之前、同時(shí)或之后。本發(fā)明考慮的化療劑包括本領(lǐng)域已知的并且可商購的化學(xué)物質(zhì)或藥物，例如吉西他濱(gemcitabine)，伊立替康(irinotecan)，多柔比星(doxorubicin)，5-氟尿嘧啶，阿糖胞苷(“Ara-C”)，環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)，噻替派(thiotepa)，白消安(busulfan)，細(xì)胞毒素，甲氨蝶呤，順鉑，霉法蘭(melphalan)和卡鉑。組合施用可包括于單一醫(yī)藥制劑中共同施用或利用分開的制劑共同施用，或以任何順序連續(xù)施用但通常在一段期間內(nèi)以使所有活性劑可同步發(fā)揮它們的生物活性。這樣的化療劑的準(zhǔn)備及給藥計(jì)劃可根據(jù)制造商的說明使用或由經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)生憑經(jīng)驗(yàn)決定。這樣的化學(xué)治療的準(zhǔn)備及給藥計(jì)劃亦描述于Chemotherapy Service,1992,M.C.Perry,Editor,Williams&Wilkins,Baltimore,MD中。

可用于本發(fā)明所述的方法中的化療劑包括但不限于：烷化劑，諸如噻替派(thiotepa)及環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)；烷基磺酸鹽，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，諸如苯多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、甲基優(yōu)瑞多巴(meturedopa)及優(yōu)瑞多巴(uredopa)；乙烯亞胺(ethylenimines)及甲基三聚氰胺(methylamelamines)，包括阿草特胺(altretamine)、三亞乙基三聚氰胺(triethylenemelamine)、三乙烯磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙烯硫磷酰胺(triethylenethiophosphaoramide)及三羥甲基三聚氰胺(trimethylolomelamime)；氮芥子氣，諸如氯芥苯丁酸(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌二醇氮芥(estramustine)、異環(huán)磷酸胺(ifosfamide)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、霉法蘭(melphalan)、新氮芥(novembichin)、膽甾醇苯乙酸氮芥(phenesterine)、松龍苯芥(prednimustine)、氯乙環(huán)磷酰胺(trofosfamide)、尿嘧啶芥(uracil mustard)；亞硝基脲(nitrosourea)，諸如卡氮芥(carmustine)、吡葡亞硝脲(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、羅氮芥(lomustine)、尼氮芥(nimustine)、雷諾氮芥(ranimustine)；抗生素，諸如阿克拉霉素(aclacinomycin)、放線菌素(actinomycin)、安曲霉素(anthramycin)、氮絲氨酸(azaserine)、博來霉素(bleomycin)、放線菌素C(cactinomycin)、卡利奇霉素(calicheamicin)、卡拉比辛(carabicin)、洋紅霉素(carminomycin)、嗜癌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、達(dá)克霉素(dactinomycin)、正定霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)、表阿霉素(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達(dá)比星(idarubicin)、麻西羅霉素(marcellomycin)、絲裂霉素(mitomycins)、霉酚酸、諾加霉素(nogalamycin)、橄欖霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、波弗霉素(porfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三鐵阿霉素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈霉黑素(streptonigrin)、鏈脲佐菌素(streptozocin)、殺結(jié)核菌素(tubercidin)、鳥苯美司(ubenimex)、新制癌菌素(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝劑，諸如甲胺喋呤(methotrexate)及5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如二甲葉酸(denopterin)、甲胺喋呤、蝶羅呤(pteropterin)、三甲蝶呤(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達(dá)拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-硫唑脲嘧啶(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脫氧尿苷、脫氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、5-FU；雄性素，諸如卡魯睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、硫雄甾醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪內(nèi)酮(testolactone)；抗腎上腺劑，諸如胺魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補(bǔ)充劑，諸如亞葉酸；醋葡醛內(nèi)酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；貝斯特氮芥(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依達(dá)曲沙(edatrexate)；地弗胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾弗米素(elformithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；依托格魯(etoglucid)；硝酸鎵(gallium nitrate)；羥基脲；香菇糖(lentinan)；氯尼達(dá)明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達(dá)醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；噴司他丁(pentostatin)；蛋胺氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK；雷佐生(razoxane)；西佐喃(sizofuran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細(xì)交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2’,2”-三氯三乙胺(2,2’,2”-trichlorotriethylamine)；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)；達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛(wèi)矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加塞拖素(gacytosine)；阿拉伯糖苷(Ara-C)；環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)；噻替派(thiotepa)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他濱(gemcitabine)；6-硫鳥嘌呤；巰嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；鉑類似物，諸如順鉑(cisplatin)及卡鉑(carboplatin)；鉑(platinum)；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)；絲裂霉素C；米托蒽醌(mitoxantrone)；米托蒽醌(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；道諾霉素(daunomycin)；胺喋呤(aminopterin)；希羅達(dá)(xeloda)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；CPT11；拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；視黃酸；埃斯培拉霉素(esperamicin)；卡培他濱(capecitabine)及上述任一劑的醫(yī)藥上可接受的鹽、酸或衍生物?；焺┻€包括用來調(diào)節(jié)或抑制荷爾蒙對(duì)腫瘤的作用的抗荷爾蒙劑，諸如抗雌激素劑，包括例如它莫西芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、芳香酶抑制劑4(5)-咪唑、4-羥基它莫西芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)及托瑞米芬(toremifene)；及抗雄性素劑諸如氟他胺(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、柳普林(leuprolide)及戈舍瑞林(goserelin)；及上述任一劑的醫(yī)藥上可接受的鹽、酸或衍生物。

在某些實(shí)施方案中，該化療劑是拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑。拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑是干擾拓?fù)洚悩?gòu)酶(例如拓?fù)洚悩?gòu)酶I或II)的活性的化療劑。拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑包括但不限于鹽酸多柔比星(doxorubicin HCl)、檸檬酸正定霉素(daunorubicin citrate)、鹽酸米托蒽醌(mitoxantrone HCl)、放線菌素D、依托泊苷(etoposide)、鹽酸拓?fù)涮婵?topotecan HCl)、替尼泊苷(teniposide)(VM-26)及伊立替康(irinotecan)。

在某些實(shí)施方案中，該化療劑是抗代謝劑?？勾x劑是化學(xué)物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)類似正常生化反應(yīng)所需的代謝物，但仍有足夠的不同處以干擾一或多種細(xì)胞正常功能，諸如細(xì)胞分裂。抗代謝劑包括但不限于吉西他濱(gemcitabine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、卡培他濱(capecitabine)、甲胺喋呤鈉、雷替曲塞(ralitrexed)、培美曲塞(pemetrexed)、替加氟(tegafur)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosine arabinoside)、硫鳥嘌呤、5-氮雜胞苷、6-巰基嘌呤、硫唑嘌呤、6-硫鳥嘌呤、噴司他丁(pentostatin)、磷酸氟達(dá)拉濱(fludarabine phosphate)及克拉屈濱(cladribine)，以及這些劑中的任一劑的醫(yī)藥上可接受的鹽、酸或衍生物。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑和有絲分裂抑制劑組合吉西他濱使用。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑和有絲分裂抑制劑組合吉西他濱使用以用于治療胰腺癌，其中Wnt途徑抑制劑是OMP-18R5，有絲分裂抑制劑是紫杉醇或白蛋白結(jié)合型紫杉醇(ABRAXANE)。

在一些實(shí)施方案中，治療可以包括施用一種或多種細(xì)胞因子(例如，淋巴因子、白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子和/或生長因子)，或者可以伴隨手術(shù)切除腫瘤或癌細(xì)胞或治療醫(yī)師認(rèn)為必要的任何其他治療。

在某些實(shí)施方案中，治療包括施用Wnt途徑抑制劑和有絲分裂抑制劑與放射治療的組合。用Wnt途徑抑制劑和有絲分裂抑制劑的治療可以在施用放射治療之前、同時(shí)或之后進(jìn)行。這種放射治療的給藥方案可以由技術(shù)人員確定。

III Wnt途徑抑制劑

本發(fā)明提供了包含本文所述的Wnt途徑抑制劑的方法，該Wnt途徑抑制劑用于抑制腫瘤生長，減小腫瘤尺寸或治療癌癥，特別是與有絲分裂抑制劑組合進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑與有絲分裂抑制劑組合按有序的或交錯(cuò)的給藥方案使用，其中Wnt途徑抑制劑在施用有絲分裂抑制劑之前施用。

在某些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是結(jié)合Wnt途徑的一種或多種可溶性胞外組分的藥劑。在某些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是結(jié)合Wnt途徑的膜結(jié)合組分的一個(gè)或多個(gè)胞外區(qū)的試劑。在某些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是直接調(diào)節(jié)Wnt途徑的一種或多種可溶性胞外組分的試劑。在某些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是直接調(diào)節(jié)Wnt途徑的膜結(jié)合組分的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞外區(qū)的試劑。

在某些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是結(jié)合一種或多種人卷曲(FZD)蛋白的藥劑。這些試劑在本文中稱為“FZD結(jié)合劑”。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)ZD結(jié)合劑特異性結(jié)合一種、兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、或十種FZD蛋白。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)ZD結(jié)合劑結(jié)合選自FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9和FZD10中的一種或多種FZD蛋白。在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)ZD結(jié)合劑結(jié)合一種、兩種、三種、四種、五種或更多種FZD蛋白。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)ZD結(jié)合劑特異性結(jié)合選自FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8中的一種、兩種、三種、四種或五種FZD蛋白。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)ZD結(jié)合劑與一或多種FZD蛋白結(jié)合，該一或多種FZD蛋白包含F(xiàn)ZD1、FZD2、FZD5、FZD7、以及/或FZD8。在某些實(shí)施方案中，該FZD結(jié)合劑與FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、及FZD8特異性結(jié)合。FZD結(jié)合劑的非限制性實(shí)例可見于美國專利第7,982,013號(hào)。

在某些實(shí)施方案中，該FZD結(jié)合劑是FZD拮抗劑。在某些實(shí)施方案中，該FZD結(jié)合劑是Wnt途徑拮抗劑。在某些實(shí)施方案中，該FZD結(jié)合劑抑制Wnt信號(hào)傳導(dǎo)。在一些實(shí)施方案中，該FZD結(jié)合劑抑制典型Wnt信號(hào)傳導(dǎo)。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)ZD結(jié)合劑抑制自分泌Wnt信號(hào)傳導(dǎo)。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)ZD結(jié)合劑抑制有絲分裂Wnt信號(hào)傳導(dǎo)。

在一些實(shí)施方案中，該FZD結(jié)合劑是抗體。在一些實(shí)施方案中，該FZD結(jié)合劑是多肽。在某些實(shí)施方案中，該FZD結(jié)合劑是包含抗原結(jié)合部位的抗體或多肽。在某些實(shí)施方案中，本文所述的FZD結(jié)合抗體或多肽的抗原結(jié)合部位能與一、二、三、四、五、或更多種人FZD蛋白結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，該FZD結(jié)合抗體或多肽的抗原結(jié)合部位能與選自FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9及FZD10中的一、二、三、四、或五種人FZD蛋白特異性結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)該FZD結(jié)合劑是與超過一種FZD蛋白特異性結(jié)合的抗體時(shí)，其可能被稱為“泛FZD抗體”。

在某些實(shí)施方案中，該FZD結(jié)合劑(例如抗體)與其所結(jié)合的一或多種人FZD蛋白的胞外域(ECD)特異性結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，該FZD結(jié)合劑在其所結(jié)合的人FZD蛋白的Fri結(jié)構(gòu)域(亦稱為多半胱氨酸區(qū)(CRD))特異性結(jié)合。各種人FZD蛋白的Fri結(jié)構(gòu)域的序列是該領(lǐng)域已知的，且提供為SEQ ID NO:13(FZD1)、SEQ ID NO:14(FZD2)、SEQ ID NO:15(FZD3)、SEQ ID NO:16(FZD4)、SEQ ID NO:17(FZD5)、SEQ ID NO:18(FZD6)、SEQ ID NO:19(FZD7)、SEQ ID NO:20(FZD8)、SEQ ID NO:21(FZD8)、SEQ ID NO:22(FZD9)、及SEQ ID NO:23(FZD10)。

在一些實(shí)施方案中，該FZD結(jié)合劑以大約1μM或更低、大約100nM或更低、大約40nM或更低、大約20nM或更低、大約10nM或更低、大約1nM或更低、或大約0.1nM或更低的解離常數(shù)(K_D)與至少一種人FZD蛋白結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)ZD結(jié)合劑以大約1nM或更低的K_D與至少一種FZD蛋白結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)ZD結(jié)合劑以大約0.1nM或更低的K_D與至少一種FZD蛋白結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)ZD結(jié)合劑以約40nM或更低的K_D與FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、及FZD8中的一或多種(例如1、2、3、4、或5種)中的每種結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，該FZD結(jié)合劑以約10nM或更低的K_D與FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、及FZD8中的一或多種中的每種結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，該FZD結(jié)合劑以約10nM的K_D與FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、及FZD8中的每種結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，該結(jié)合劑(例如抗體)與FZD蛋白的K_D是利用固定于Biacore芯片上的FZD-Fc融合蛋白測得的K_D，該FZD-Fc融合蛋白包含至少部分的FZD胞外域或FZD-Fri結(jié)構(gòu)域。

在某些實(shí)施方案中，該FZD結(jié)合劑以約1μM或更低、約100nM或更低、約40nM或更低、約20nM或更低、約10nM或更低、或約1nM或更低的EC₅₀與一或多種(例如二或更多種、三或更多種、或四或更多種)人FZD蛋白結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)ZD結(jié)合劑以約40nM或更低、約20nM或更低、或約10nM或更低的EC₅₀與超過一種FZD蛋白結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，該FZD結(jié)合劑對(duì)下列FZD蛋白中的一或多種(例如1、2、3、4、或5種)具有約20nM或更低的EC₅₀：FZD1、FZD2、FZD5、FZD7及FZD8。在某些實(shí)施方案中，該FZD結(jié)合劑對(duì)下列FZD蛋白中的一或多種(例如1、2、3、4、或5種)具有約10nM或更低的EC₅₀：FZD1、FZD2、FZD5、FZD7及FZD8。在某些實(shí)施方案中，該FZD結(jié)合劑在與FZD5以及/或FZD8結(jié)合方面具有約40nM或更低或20nM或更低的EC₅₀。

在某些實(shí)施方案中，該Wnt途徑抑制劑是FZD結(jié)合劑，該FZD結(jié)合劑是抗體。在一些實(shí)施方案中，該抗體是重組抗體。在一些實(shí)施方案中，該抗體是單克隆抗體。在一些實(shí)施方案中，該抗體是嵌合抗體。在一些實(shí)施方案中，該抗體是人化抗體。在一些實(shí)施方案中，該抗體是人抗體。在某些實(shí)施方案中，該抗體是IgG1抗體。在某些實(shí)施方案中，該抗體是IgG2抗體。在某些實(shí)施方案中，該抗體是包含抗原結(jié)合部位的抗體片段。在一些實(shí)施方案中，該抗體是單價(jià)、單特異性、雙價(jià)、雙特異性、或多特異性的。在一些實(shí)施方案中，該抗體是與細(xì)胞毒性部分綴合的。在一些實(shí)施方案中，該抗體是經(jīng)分離的。在一些實(shí)施方案中，該抗體實(shí)質(zhì)上是純的。

FZD結(jié)合劑(例如抗體)的特異性結(jié)合可使用該領(lǐng)域已知的任何方法檢測?？墒褂玫拿庖邫z測包括但不限于競爭性及非競爭性檢測系統(tǒng)，這樣的系統(tǒng)利用諸如Biacore分析、FACS分析、免疫熒光、免疫細(xì)胞化學(xué)、西方墨點(diǎn)分析(Western blot analysis)、放射性免疫測定、ELISA、“三明治式”免疫測定、免疫沉淀分析、沉淀反應(yīng)、膠體擴(kuò)散沉淀反應(yīng)、免疫擴(kuò)散分析、凝集測定、補(bǔ)體固定測定、免疫放射分析、熒光免疫分析及蛋白質(zhì)A免疫分析之類的技術(shù)。這樣的檢測是例行性檢測且為該領(lǐng)域中所公知(參見例如Ausubel et al.,Editors,1994-present,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,New York,NY)。

例如，劑與人FZD蛋白的特異性結(jié)合可利用ELISA測定。ELISA測定包含準(zhǔn)備抗原(例如FZD蛋白或其片段)，以抗原包覆96孔微量滴定板的孔槽，添加與可檢測的化合物諸如酶底物(例如辣根過氧化酶或堿性磷酸酶)綴合的FZD結(jié)合劑(例如抗體)至孔槽，培養(yǎng)一段時(shí)間后，檢測與該抗原結(jié)合的FZD結(jié)合劑的存在。在一些實(shí)施方式中，該FZD結(jié)合劑不與可檢測的化合物綴合，而是將綴合到識(shí)別該FZD結(jié)合劑或抗體的第二抗體加入孔槽中。在一些實(shí)施方式中，不以抗原包覆孔槽，反而是以FZD結(jié)合劑包覆孔槽，并于添加抗原至該經(jīng)包覆的孔槽后加入與可檢測的化合物綴合的第二抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道可經(jīng)修改以增加所檢測的信號(hào)的參數(shù)以及可使用的ELISA的其他變量。

在另一實(shí)例中，劑與人FZD蛋白的特異性結(jié)合可利用FACS測定。FACS篩選測定可包含產(chǎn)生cDNA構(gòu)建物以表達(dá)抗原為融合蛋白(例如FZD-CD4TM融合蛋白)，將該構(gòu)建物轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，使該抗原表達(dá)在細(xì)胞表面，使該FZD結(jié)合劑與該經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞混合，并培養(yǎng)一段時(shí)間。被FZD結(jié)合劑結(jié)合的細(xì)胞，可利用與可檢測的化合物綴合的二級(jí)抗體(例如PE綴合抗Fc抗體)及流式細(xì)胞分析識(shí)別。本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道可經(jīng)修改以優(yōu)化經(jīng)檢測的信號(hào)的參數(shù)以及其他可增進(jìn)篩選(例如篩選阻斷抗體)的FACS變數(shù)。

FZD結(jié)合劑與抗原(例如FZD蛋白)的結(jié)合親和性，及結(jié)合劑-抗原交互反應(yīng)的解離速率，可通過競爭性結(jié)合測定決定。競爭性結(jié)合測定的一實(shí)例，即放射性免疫測定，其包含在漸增量的未經(jīng)標(biāo)記的抗原存在下，培養(yǎng)經(jīng)標(biāo)記的抗原(例如用³H或¹²⁵I標(biāo)記的FZD蛋白)或其片段或變異體與感興趣的結(jié)合劑，之后檢測與該經(jīng)標(biāo)記的抗原結(jié)合的劑。該劑對(duì)抗原的親和性及結(jié)合解離速率可由斯卡查德(Scatchard)圖分析的數(shù)據(jù)決定。在一些實(shí)施方式中，Biacore動(dòng)力學(xué)分析用于測定FZD結(jié)合劑的結(jié)合及解離速率。Biacore動(dòng)力學(xué)分析包含分析抗體與芯片表面上經(jīng)固定的FZD結(jié)合劑的結(jié)合及解離。

在某些實(shí)施方案中，本文所述的方法包含Wnt途徑抑制劑，其是特異性結(jié)合至少一種人FZD蛋白的抗體。在一些實(shí)施方案中，該抗體特異性結(jié)合選自FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9和FZD10中的至少一種人FZD蛋白。在一些實(shí)施方案中，該抗體特異性結(jié)合選自FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8中的至少一種人FZD蛋白。在一些實(shí)施方案中，抗體包含重鏈CDR1、重鏈CDR2、及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含GFTFSHYTLS(SEQ ID NO:7)，該重鏈CDR2包含VISGDGSYTYYADSVKG(SEQ ID NO:8)，且該重鏈CDR3包含NFIKYVFAN(SEQ ID NO:9)。在一些實(shí)施方案中，該抗體還包含輕鏈CDR1、輕鏈CDR2、及輕鏈CDR3，該輕鏈CDR1包含SGDNIGSFYVH(SEQ ID NO:10)，該輕鏈CDR2包含DKSNRPSG(SEQ ID NO:11)，且該輕鏈CDR3包含QSYANTLSL(SEQ ID NO:12)。在一些實(shí)施方案中，該抗體包含：包含SGDNIGSFYVH(SEQ ID NO:10)的輕鏈CDR1、包含DKSNRPSG(SEQ ID NO:11)的輕鏈CDR2、及包含QSYANTLSL(SEQ ID NO:12)的輕鏈CDR3。在某些實(shí)施方案中，該抗體包含：(a)包含GFTFSHYTLS(SEQ ID NO:7)的重鏈CDR1、包含VISGDGSYTYYADSVKG(SEQ ID NO:8)的重鏈CDR2、及包含NFIKYVFAN(SEQ ID NO:9)的重鏈CDR3，及(b)包含SGDNIGSFYVH(SEQ ID NO:10)的輕鏈CDR1、包含DKSNRPSG(SEQ ID NO:11)的輕鏈CDR2、及包含QSYANTLSL(SEQ ID NO:12)的輕鏈CDR3。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明所描述的方法包含屬于抗體的FZD結(jié)合劑，其包含：(a)包含GFTFSHYTLS(SEQ ID NO:7)的重鏈CDR1，或其包含1、2、3、或4個(gè)氨基酸取代的變異體；(b)包含VISGDGSYTYYADSVKG(SEQ ID NO:8)的重鏈CDR2，或其包含1、2、3、或4個(gè)氨基酸取代的變異體；(c)包含NFIKYVFAN(SEQ ID NO:9)的重鏈CDR3，或其包含1、2、3、或4個(gè)氨基酸取代的變異體；(d)包含SGDNIGSFYVH(SEQ ID NO:10)的輕鏈CDR1，或其包含1、2、3、或4個(gè)氨基酸取代的變異體；(e)包含DKSNRPSG(SEQ ID NO:11)的輕鏈CDR2，或其包含1、2、3、或4個(gè)氨基酸取代的變異體；及(f)包含QSYANTLSL(SEQ ID NO:12)的輕鏈CDR3，或其包含1、2、3、或4個(gè)氨基酸取代的變異體。在某些實(shí)施方案中，該氨基酸取代是保守性取代。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明所描述的方法包含屬于抗體的FZD結(jié)合劑，其包含重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)與SEQ ID NO:5具有至少約80％序列一致性，該輕鏈可變區(qū)與SEQ ID NO:6具有至少80％序列一致性。在某些實(shí)施方案中，該抗體包含與SEQ ID NO:5具有至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約97％、或至少約99％序列一致性的重鏈可變區(qū)。在某些實(shí)施方案中，該抗體包含與SEQ ID NO:6具有至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約97％、或至少約99％序列一致性的輕鏈可變區(qū)。在某些實(shí)施方案中，該抗體包含與SEQ ID NO:5具有至少約95％序列一致性的重鏈可變區(qū)，和/或與SEQ ID NO:6具有至少約95％序列一致性的輕鏈可變區(qū)。在某些實(shí)施方案中，該抗體包含：包含SEQ ID NO:5的重鏈可變區(qū)，和/或包含SEQ ID NO:6的輕鏈可變區(qū)。在某些實(shí)施方案中，該抗體包含：實(shí)質(zhì)上由SEQ ID NO:5組成的重鏈可變區(qū)及實(shí)質(zhì)上由SEQ ID NO:6組成的輕鏈可變區(qū)。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的方法包含屬于抗體的FZD結(jié)合劑，該抗體包含：(a)與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3具有至少90％序列一致性的重鏈；以及/或(b)與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4具有至少90％序列一致性的輕鏈。在一些實(shí)施方案中，該抗體包含：(a)與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3具有至少95％序列一致性的重鏈；以及/或(b)與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4具有至少95％序列一致性的輕鏈。在一些實(shí)施方案中，該抗體包含：包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的重鏈，和/或包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的輕鏈。在一些實(shí)施方案中，該抗體包含：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列20-463的重鏈及包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列20-232的輕鏈。在一些實(shí)施方案中，該抗體包含：包含SEQ ID NO:3的重鏈和包含SEQ ID NO:4的輕鏈。在一些實(shí)施方案中，該抗體包含：實(shí)質(zhì)上由SEQ ID NO:1的氨基酸20至463所組成的重鏈及實(shí)質(zhì)上由SEQ ID NO:2的氨基酸20至232所組成的輕鏈。在一些實(shí)施方案中，該抗體包含：實(shí)質(zhì)上由SEQ ID NO:3組成的重鏈及實(shí)質(zhì)上由SEQ ID NO:4組成的輕鏈。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的方法包含Wnt途徑抑制劑，其是與FZD1、FZD2、FZD5、FZD7以及/或FZD8中的至少一者特異性結(jié)合的FZD結(jié)合劑(例如抗體)，其中該FZD結(jié)合劑(例如抗體)包含抗體OMP-18R5的一、二、三、四、五、以及/或六個(gè)CDR。抗體OMP-18R5(亦稱為凡地吐單抗(vantictumab))，以及其他FZD結(jié)合劑，已于美國專利第7,982,013號(hào)中先行描述。編碼該18R5IgG2抗體的重鏈及輕鏈的DNA，依照布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，于2008年9月29日以ATCC編號(hào)PTA-9541保藏于美國菌種保藏中心。在一些實(shí)施方案中，該FZD結(jié)合劑包含OMP-18R5的1或多個(gè)CDR、OMP-18R5的2或更多個(gè)CDR、OMP-18R5的3或更多個(gè)CDR、OMP-18R5的4或更多個(gè)CDR、OMP-18R5的5或更多個(gè)CDR、或OMP-18R5的所有6個(gè)CDR。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的方法包含屬于Wnt途徑抑制劑的多肽。這樣的多肽包括但不限于與人FZD蛋白或其片段特異性結(jié)合的抗體。在一些實(shí)施方案中，多肽與選自下列項(xiàng)中的一或多種FZD蛋白或其片段結(jié)合：FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、及FZD10。在一些實(shí)施方案中，多肽與FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、以及/或FZD8結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，多肽與FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、及FZD8結(jié)合。

在某些實(shí)施方案中，多肽包含抗體OMP-18R5的一、二、三、四、五、以及/或六個(gè)CDR。在一些實(shí)施方案中，多肽包含其中每個(gè)CDR有最多達(dá)四個(gè)(即0、1、2、3、或4個(gè))氨基酸取代的CDR。在某些實(shí)施方案中，該重鏈CDR被包含于重鏈可變區(qū)之內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，該輕鏈CDR被包含于輕鏈可變區(qū)之內(nèi)。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的方法包含與一或多種人FZD蛋白特異性結(jié)合的多肽，其中該多肽包含與SEQ ID NO:5具有至少約80％序列一致性的氨基酸序列，和/或與SEQ ID NO:6具有至少約80％序列一致性的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，該多肽包含與SEQ ID NO:5具有至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約97％、或至少約99％序列一致性的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，該多肽包含與SEQ ID NO:6具有至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約97％、或至少約99％序列一致性的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，該多肽包含與SEQ ID NO:5具有至少約95％序列一致性的氨基酸序列，和/或與SEQ ID NO:6具有至少約95％序列一致性的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，該多肽包含：包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，和/或包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。

在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)ZD結(jié)合劑包含多肽，該多肽包含選自下列項(xiàng)中的序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、及SEQ ID NO:6。

在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)ZD結(jié)合劑包含OMP-18R5抗體的重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)。在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)ZD結(jié)合劑包含(有或無前導(dǎo)序列的)OMP-18R5抗體的重鏈及輕鏈。

在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)ZD結(jié)合劑包含抗體OMP-18R5(凡地吐單抗)、實(shí)質(zhì)上由抗體OMP-18R5(凡地吐單抗)組成、或由抗體OMP-18R5(凡地吐單抗)組成。

在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)ZD結(jié)合劑(例如抗體)與包含下列項(xiàng)的抗體競爭與一或多種人FZD蛋白的特異性結(jié)合：包含SEQ ID NO:5的重鏈可變區(qū)及包含SEQ ID NO:6的輕鏈可變區(qū)。在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)ZD結(jié)合劑(例如抗體)與包含下列項(xiàng)的抗體競爭與一或多種人FZD蛋白的特異性結(jié)合：包含SEQ ID NO:1(有或無信號(hào)序列)的重鏈及包含SEQ ID NO:2(有或無信號(hào)序列)的輕鏈可變區(qū)。在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)ZD結(jié)合劑(例如抗體)與包含下列項(xiàng)的抗體競爭與一或多種人FZD蛋白的特異性結(jié)合：包含SEQ ID NO:3的重鏈及包含SEQ ID NO:4的輕鏈可變區(qū)。在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)ZD結(jié)合劑與抗體OMP-18R5競爭與一或多種人FZD蛋白的特異性結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)ZD結(jié)合劑或抗體與抗體OMP-18R5于試管內(nèi)競爭性結(jié)合測定中競爭與一或多種人FZD蛋白的特異性結(jié)合。

在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)ZD結(jié)合劑(例如抗體)與一或多種人FZD蛋白上由本發(fā)明的抗體所結(jié)合的表位相同的表位或?qū)嵸|(zhì)上相同的表位結(jié)合。在另一實(shí)施方案中，F(xiàn)ZD結(jié)合劑是與一或多種人FZD蛋白上的表位結(jié)合的抗體，該表位與由本發(fā)明的抗體所結(jié)合的FZD蛋白上的表位重疊。在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)ZD結(jié)合劑(例如抗體)與一或多種FZD蛋白上由抗體OMP-18R5所結(jié)合的表位相同的表位或?qū)嵸|(zhì)上相同的表位結(jié)合。在另一實(shí)施方案中，該FZD結(jié)合劑是與一或多種人FZD蛋白上的表位結(jié)合的抗體，該表位與由抗體OMP-18R5所結(jié)合的FZD蛋白上的表位重疊。

在某些實(shí)施方案中，該Wnt途徑抑制劑是與一或多種人Wnt蛋白結(jié)合的劑。這些劑在這里稱作“Wnt結(jié)合劑”。在某些實(shí)施方案中，這樣的劑與一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、或更多種Wnt蛋白特異性結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，該Wnt結(jié)合劑與一或多種選自下列項(xiàng)中的人Wnt蛋白結(jié)合：Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、及Wnt16。在某些實(shí)施方案中，Wnt結(jié)合劑與一或多種(或二或更多種、三或更多種、四或更多種、五或更多種、等)選自下列項(xiàng)中的Wnt蛋白結(jié)合：Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10a、及Wnt10b。在某些實(shí)施方案中，該一或多種(或二或更多種、三或更多種、四或更多種、五或更多種、等)Wnt蛋白是選自：Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10a、及Wnt10b。

在某些實(shí)施方案中，該Wnt結(jié)合劑是Wnt拮抗劑。在某些實(shí)施方案中，該Wnt結(jié)合劑是Wnt途徑拮抗劑。在某些實(shí)施方案中，該Wnt結(jié)合劑抑制Wnt信號(hào)傳導(dǎo)。在一些實(shí)施方案中，該Wnt結(jié)合劑抑制典型Wnt信號(hào)傳導(dǎo)。在一些實(shí)施方案中，Wnt結(jié)合劑抑制自分泌Wnt信號(hào)傳導(dǎo)。在一些實(shí)施方案中，Wnt結(jié)合劑抑制有絲分裂Wnt信號(hào)傳導(dǎo)。

在某些實(shí)施方案中，該Wnt結(jié)合劑以約1μM或更低、約100nM或更低、約40nM或更低、約20nM或更低、或約10nM或更低的K_D與一或多種(例如二或多種、三或多種、或四或多種)Wnt蛋白結(jié)合。舉例來說，在某些實(shí)施方案中，本文所述的與超過一種Wnt蛋白結(jié)合的Wnt結(jié)合劑，以約100nM或更低、約20nM或更低、或約10nM或更低的K_D與該些Wnt蛋白結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，該Wnt結(jié)合劑以約40nM或更低的K_D與一或多種(例如1、2、3、4、或5種)Wnt蛋白中的每一種結(jié)合，其中這樣的Wnt蛋白是選自：Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10a及Wnt10b。在一些實(shí)施方案中，該結(jié)合劑(例如抗體)與Wnt蛋白的K_D是利用固定于Biacore芯片上的包含至少部分的Wnt C端多半胱氨酸區(qū)的Wnt融合蛋白測得的K_D。

在某些實(shí)施方案中，該Wnt結(jié)合劑以約1μM或更低、約100nM或更低、約40nM或更低、約20nM或更低、約10nM或更低、或約1nM或更低的EC₅₀與一或多種(例如二或多種、三或多種、或四或多種)人Wnt蛋白結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，Wnt結(jié)合劑以約40nM或更低、約20nM或更低、或約10nM或更低的EC₅₀與超過一種Wnt結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，該Wnt結(jié)合劑相對(duì)于Wnt蛋白Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、以及/或Wnt16中的一或多種(例如1、2、3、4、或5種)具有約20nM或更低的EC₅₀。在某些實(shí)施方案中，該Wnt結(jié)合劑相對(duì)于下列Wnt蛋白中的一或多種(例如1、2、3、4、或5種)具有約10nM或更低的EC₅₀：Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10a、以及/或Wnt10b。

在本發(fā)明的方法中使用的Wnt結(jié)合劑(例如抗體或可溶性受體)的特異性結(jié)合可使用該領(lǐng)域已知的任何方法檢測?？墒褂玫拿庖邫z測包括但不限于競爭性及非競爭性檢測系統(tǒng)，這樣的系統(tǒng)利用諸如Biacore分析、FACS分析、免疫熒光、免疫細(xì)胞化學(xué)、西方墨點(diǎn)分析(Western blot analysis)、放射性免疫測定、ELISA、“三明治式”免疫測定、免疫沉淀分析、沉淀反應(yīng)、膠體擴(kuò)散沉淀反應(yīng)、免疫擴(kuò)散分析、凝集測定、補(bǔ)體固定測定、免疫放射分析、熒光免疫分析及蛋白質(zhì)A免疫分析之類的技術(shù)。這樣的檢測是例行性檢測且為該領(lǐng)域中所公知(參見例如Ausubel et al.,Editors,1994-present,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,New York,NY)。

例如，Wnt結(jié)合劑與人Wnt蛋白的特異性結(jié)合可利用ELISA測定。ELISA測定包含準(zhǔn)備抗原(例如Wnt蛋白或其片段)，以抗原包覆96孔微量滴定板的孔槽，添加與可檢測的化合物諸如酶底物(例如辣根過氧化酶或堿性磷酸酶)綴合的Wnt結(jié)合劑(例如抗體)至孔槽，培養(yǎng)一段時(shí)間后，檢測與該抗原結(jié)合的Wnt結(jié)合劑的存在。在一些實(shí)施方式中，該Wnt結(jié)合劑不與可檢測的化合物綴合，而是將綴合到識(shí)別該Wnt結(jié)合劑的第二抗體加入孔槽中。在一些實(shí)施方式中，不以抗原包覆孔槽，反而是以Wnt結(jié)合劑包覆孔槽，并于添加抗原至該經(jīng)包覆的孔槽后加入與可檢測的化合物綴合的第二抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道可經(jīng)修改以增加所檢測的信號(hào)的參數(shù)以及可使用的ELISA的其他變量。

在另一實(shí)例中，Wnt結(jié)合劑與人Wnt蛋白的特異性結(jié)合可利用FACS測定。FACS篩選測定可包含產(chǎn)生cDNA構(gòu)建物以表達(dá)抗原為融合蛋白，將該構(gòu)建物轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，使該抗原表達(dá)在細(xì)胞表面，使該Wnt結(jié)合劑與該經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞混合，并培養(yǎng)一段時(shí)間。被Wnt結(jié)合劑結(jié)合的細(xì)胞，可通過利用與可檢測的化合物綴合的二級(jí)抗體(例如PE綴合抗Fc抗體)及流式細(xì)胞分析識(shí)別。本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道可經(jīng)修改以優(yōu)化經(jīng)檢測的信號(hào)的參數(shù)以及其他可增進(jìn)篩選的FACS變數(shù)。

Wnt結(jié)合劑與抗原(例如Wnt蛋白)的結(jié)合親和性，及結(jié)合劑-抗原交互反應(yīng)的解離速率，可通過例如上文針對(duì)FZD結(jié)合劑所描述的那些競爭性結(jié)合測定決定。

在某些實(shí)施方案中，該Wnt結(jié)合劑是可溶性受體。在某些實(shí)施方案中，該Wnt途徑抑制劑是可溶性受體。在某些實(shí)施方案中，該可溶性受體包含F(xiàn)ZD受體蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，該可溶性受體包含F(xiàn)ZD蛋白的Fri結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，包含F(xiàn)ZD Fri結(jié)構(gòu)域的可溶性受體相較于包含該完整FZD胞外結(jié)構(gòu)域的可溶性受體可顯示改變的生物活性(例如增加蛋白半衰期)。蛋白半衰期可進(jìn)一步通過聚乙二醇(PEG)或聚氧乙烯(PEO)的共價(jià)修飾延長。在某些實(shí)施方案中，該FZD蛋白是人FZD蛋白。在某些實(shí)施方案中，該人FZD蛋白是FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9或FZD10?？扇苄訤ZD受體的非限制性實(shí)例可見于美國專利No.7,723,477及7,947,277及國際公布WO 2011/088123中。

人FZD 1至10蛋白中的每一種的預(yù)測Fri結(jié)構(gòu)域被提供為SEQ ID NO:13至23。本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)于對(duì)應(yīng)各種Fri結(jié)構(gòu)域的確切氨基酸的了解可能互異。因此，上述及本文所述的結(jié)構(gòu)域的N端和/或C端可延長或縮短1、2、3、4、5、6、7、8、9、或甚至10個(gè)氨基酸。

在某些實(shí)施方案中，該可溶性受體包含與一或多種人Wnt蛋白結(jié)合的人FZD蛋白的Fri結(jié)構(gòu)域，或該Fri結(jié)構(gòu)域的片段或變異體。在某些實(shí)施方案中，該人FZD蛋白是FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、或FZD10。在某些實(shí)施方案中，該人FZD蛋白是FZD8。在某些實(shí)施方案中，該FZD蛋白是FZD8且該Wnt結(jié)合劑包含SEQ ID NO:20。在某些實(shí)施方案中，該FZD蛋白是FZD8且該Wnt結(jié)合劑包含SEQ ID NO:21。

在一些實(shí)施方案中，該可溶性受體包含F(xiàn)ri結(jié)構(gòu)域，該Fri結(jié)構(gòu)域?qū)嵸|(zhì)上由FZD1的Fri結(jié)構(gòu)域、FZD2的Fri結(jié)構(gòu)域、FZD3的Fri結(jié)構(gòu)域、FZD4的Fri結(jié)構(gòu)域、FZD5的Fri結(jié)構(gòu)域、FZD6的Fri結(jié)構(gòu)域、FZD7的Fri結(jié)構(gòu)域、FZD8的Fri結(jié)構(gòu)域、FZD9的Fri結(jié)構(gòu)域、或FZD10的Fri結(jié)構(gòu)域組成。在一些實(shí)施方案中，該可溶性受體包含實(shí)質(zhì)上由FZD8的Fri結(jié)構(gòu)域組成的Fri結(jié)構(gòu)域。

在一些實(shí)施方案中，該可溶性受體包含選自下列項(xiàng)中的序列：SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22,和SEQ ID NO:23。在一些實(shí)施方案中，該可溶性受體包含包含SEQ ID NO:20的Fri結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，該可溶性受體包含包含SEQ ID NO:21的Fri結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，該可溶性受體包含實(shí)質(zhì)上由SEQ ID NO:20組成的Fri結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，該可溶性受體包含實(shí)質(zhì)上由SEQ ID NO:21組成的Fri結(jié)構(gòu)域。

在某些實(shí)施方案中，該可溶性受體包含前述FZD Fri結(jié)構(gòu)域序列中的任一者的變異體，其包含一或多個(gè)(例如一、二、三、四、五、六、七、八、九、十個(gè)、等)保守性取代且能與Wnt蛋白結(jié)合。

在某些實(shí)施方案中，該可溶性受體(例如包含人FZD受體的Fri結(jié)構(gòu)域的劑)還包含非FZD(例如，異源)多肽。在一些實(shí)施方案中，可溶性受體可包括與其他非FZD功能性及結(jié)構(gòu)性多肽連接的FZD ECD或Fri結(jié)構(gòu)域，這樣的非FZD功能性及結(jié)構(gòu)性多肽包括但不限于人Fc區(qū)、至少一個(gè)蛋白標(biāo)簽(例如myc、FLAG、GST、GFP)、其他內(nèi)源性蛋白或蛋白片段，或包含在FZD ECD或Fri結(jié)構(gòu)域與第二多肽之間的任何接頭區(qū)的任何其他可用的蛋白序列。在某些實(shí)施方案中，該非FZD多肽包含人Fc區(qū)。該Fc區(qū)可自任一類型的免疫球蛋白如IgG、IgA、IgM、IgD及IgE獲得。在一些實(shí)施方案中，該Fc區(qū)是人IgG1Fc區(qū)。在一些實(shí)施方案中，該Fc區(qū)是人IgG2Fc區(qū)。在一些實(shí)施方案中，該Fc區(qū)是野生型Fc區(qū)。在一些實(shí)施方案中，該Fc區(qū)是突變Fc區(qū)。在一些實(shí)施方案中，該Fc區(qū)的N端是經(jīng)截短1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)氨基酸的(例如在鉸鏈結(jié)構(gòu)域)。在一些實(shí)施方案中，在鉸鏈結(jié)構(gòu)域的氨基酸被改變以阻止非所期望的雙硫鍵形成。在一些實(shí)施方案中，半胱氨酸是經(jīng)絲氨酸取代以阻礙非所期望的雙硫鍵形成。在一些實(shí)施方案中，該Fc區(qū)的C端被截短1、2、3、或更多個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施方案中，該Fc區(qū)的C端被截短1個(gè)氨基酸。在某些實(shí)施方案中，該非FZD多肽包含SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28。在某些實(shí)施方案中，該非FZD多肽包含SEQ ID NO:27。在某些實(shí)施方案中，該非FZD多肽實(shí)質(zhì)上由SEQ ID NO:27組成。

在某些實(shí)施方案中，可溶性受體是包含F(xiàn)ZD受體的至少一最小Fri結(jié)構(gòu)域與Fc區(qū)的融合蛋白。此處所使用的“融合蛋白”是由包含至少二種基因的核苷酸序列的核酸分子表達(dá)的雜合蛋白。在一些實(shí)施方案中，該第一多肽的C端與該免疫球蛋白Fc區(qū)的N端連接。在一些實(shí)施方案中，該第一多肽(例如FZD Fri結(jié)構(gòu)域)與該Fc區(qū)直接相連(即不含中介肽接頭)。在一些實(shí)施方案中，該第一多肽與該Fc區(qū)經(jīng)由接頭相連。

此處使用的用語“接頭”是指插入第一多肽(例如FZD成分)與第二多肽(例如Fc區(qū))之間的接頭。在一些實(shí)施方案中，該接頭是肽接頭。接頭不應(yīng)不良影響該多肽的表達(dá)、分泌或生物活性。接頭應(yīng)不具抗原性且不應(yīng)誘發(fā)免疫反應(yīng)。適當(dāng)?shù)慕宇^是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，且通常包括甘氨酸及絲氨酸殘基的混合物，且通常包括無空間位阻的氨基酸。其他可被納入于可用接頭的氨基酸包括蘇氨酸及丙氨酸殘基。接頭的長度范圍可以是，例如1至50個(gè)氨基酸長度、1至22個(gè)氨基酸長度、1至10個(gè)氨基酸長度、1至5個(gè)氨基酸長度或1至3個(gè)氨基酸長度。本文所使用的接頭是不包括來自該第一多肽(例如FZD Fri結(jié)構(gòu)域)的C端或該第二多肽(例如Fc區(qū))的N端的氨基酸殘基的中介肽序列。

在一些實(shí)施方案中，該可溶性受體包含第一多肽和第二多肽，該第一多肽包含SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、或SEQ ID NO:23，該第二多肽包含SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、或SEQ ID NO:28，其中該第一多肽是與該第二多肽直接連接。在一些實(shí)施方案中，該可溶性受體包含：包含SEQ ID NO:20的第一多肽及包含SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、或SEQ ID NO:28的第二多肽。在一些實(shí)施方案中，該可溶性受體包含：包含SEQ ID NO:20的第一多肽及包含SEQ ID NO:27的第二多肽。在一些實(shí)施方案中，該可溶性受體包含：實(shí)質(zhì)上由SEQ ID NO:20組成的第一多肽及實(shí)質(zhì)上由SEQ ID NO:27組成的第二多肽。在一些實(shí)施方案中，該可溶性受體包含：包含SEQ ID NO:21的第一多肽及包含SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、或SEQ ID NO:28的第二多肽。在一些實(shí)施方案中，該可溶性受體包含：包含SEQ ID NO:21的第一多肽及包含SEQ ID NO:27的第二多肽。在一些實(shí)施方案中，該可溶性受體包含：包含SEQ ID NO:21的第一多肽及實(shí)質(zhì)上由SEQ ID NO:27組成的第二多肽。

在一些實(shí)施方案中，該可溶性受體包含第一多肽及第二多肽，該第一多肽包含SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22,、或SEQ ID NO:23，該第二多肽包含SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、或SEQ ID NO:28，其中該第一多肽通過接頭與該第二多肽連接。在一些實(shí)施方案中，該可溶性受體包含：包含SEQ ID NO:20的第一多肽及包含SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、或SEQ ID NO:28的第二多肽，其中該第一多肽通過接頭與該第二多肽連接。在一些實(shí)施方案中，該可溶性受體包含：包含SEQ ID NO:20的第一多肽及包含SEQ ID NO:27的第二多肽，其中該第一多肽通過接頭與該第二多肽連接。在一些實(shí)施方案中，該可溶性受體包含：實(shí)質(zhì)上由SEQ ID NO:20組成的第一多肽及實(shí)質(zhì)上由SEQ ID NO:27組成的第二多肽，其中該第一多肽通過接頭與該第二多肽連接。在一些實(shí)施方案中，該可溶性受體包含：包含SEQ ID NO:21的第一多肽及包含SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、或SEQ ID NO:28的第二多肽，其中該第一多肽通過接頭與該第二多肽連接。在一些實(shí)施方案中，該可溶性受體包含：包含SEQ ID NO:21的第一多肽及包含SEQ ID NO:27的第二多肽，其中該第一多肽通過接頭與該第二多肽連接。在一些實(shí)施方案中，該可溶性受體包含：實(shí)質(zhì)上由SEQ ID NO:21組成的第一多肽及實(shí)質(zhì)上由SEQ ID NO:27組成的第二多肽，其中該第一多肽通過接頭與該第二多肽連接。

在一些實(shí)施方案中，該可溶性受體包含：與SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、或SEQ ID NO:23具有至少95％一致性的第一多肽及包含SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、或SEQ ID NO:28的第二多肽，其中該第一多肽通過接頭與該第二多肽連接。在一些實(shí)施方案中，該可溶性受體包含：與SEQ ID NO:20具有至少95％一致性的第一多肽及包含SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、或SEQ ID NO:28的第二多肽。在一些實(shí)施方案中，該可溶性受體包含：與SEQ ID NO:21具有至少95％一致性的第一多肽及包含SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、或SEQ ID NO:28的第二多肽。

在一些實(shí)施方案中，該可溶性受體包含：與SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、或SEQ ID NO:23具有至少95％一致性的第一多肽及包含SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、或SEQ ID NO:28的第二多肽，其中該第一多肽通過接頭與該第二多肽連接。在一些實(shí)施方案中，該可溶性受體包含：與SEQ ID NO:20具有至少95％一致性的第一多肽及包含SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、或SEQ ID NO:28的第二多肽，其中該第一多肽通過接頭與該第二多肽連接。在一些實(shí)施方案中，該可溶性受體包含：與SEQ ID NO:21具有至少95％一致性的第一多肽及包含SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、或SEQ ID NO:28的第二多肽，其中該第一多肽通過接頭與該第二多肽連接。

FZD蛋白包含引導(dǎo)該蛋白運(yùn)輸?shù)男盘?hào)序列。信號(hào)序列(又稱信號(hào)肽或前導(dǎo)序列)通常位于新生多肽的N端。它們引導(dǎo)該多肽至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)且這樣的蛋白被分類至彼等應(yīng)該去的地方，例如胞器的內(nèi)部空間、細(xì)胞內(nèi)部的膜、細(xì)胞的外膜或經(jīng)分泌至細(xì)胞外部。大部分信號(hào)序列在蛋白被運(yùn)送至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后，通過信號(hào)肽酶從該蛋白切割。自該多肽切割該信號(hào)序列通常發(fā)生于氨基酸序列的特定位點(diǎn)，且取決于該信號(hào)序列內(nèi)的氨基酸殘基。雖然通常有一個(gè)特定的切割位點(diǎn)，但信號(hào)肽酶可能識(shí)別和/或使用一個(gè)以上的切割位點(diǎn)，導(dǎo)致該多肽不相同的N端。舉例來說，使用信號(hào)序列內(nèi)的不同的切割位點(diǎn)可導(dǎo)致具有不同N端氨基酸的多肽的表達(dá)。因此，在一些實(shí)施方案中，本文所述的多肽可能包含具有不同N端的多肽的混合物。在一些實(shí)施方案中，該N端的長度相差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施方案中，該N端的長度相差1、2、3、4或5個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施方案中，該多肽為實(shí)質(zhì)上相同，即該多肽具有相同的N端。在一些實(shí)施方案中，該多肽的信號(hào)序列包含一或多個(gè)(例如一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、等等)氨基酸取代和/或刪除。在一些實(shí)施方案中，該多肽的信號(hào)序列包含讓一個(gè)切割位點(diǎn)變成主要切割位點(diǎn)的氨基酸取代和/或刪除，由此導(dǎo)致具有一種N端的實(shí)質(zhì)上相同的多肽。

在一些實(shí)施方案中，該可溶性受體包含選自下列項(xiàng)中的氨基酸序列：SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30。

在某些實(shí)施方案中，該可溶性受體包含SEQ ID NO:29的序列。在某些實(shí)施方案中，該可溶性受體包含SEQ ID NO:29的序列，該序列包含一或多個(gè)(例如一、二、三、四、五、六、七、八、九、十個(gè)、等等)保守性取代。在某些實(shí)施方案中，該可溶性受體包含與SEQ ID NO:29具有至少約90％、約95％、或約98％序列一致性的序列。在某些實(shí)施方案中，SEQ ID NO:29的變異體維持其與一或多種人Wnt蛋白結(jié)合的能力。

在某些實(shí)施方案中，Wnt結(jié)合劑是包含SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30的序列。在一些實(shí)施方案中，多肽實(shí)質(zhì)上由SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30組成。在某些實(shí)施方案中，多肽包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列。

在一些實(shí)施方案中，該多肽是實(shí)質(zhì)上經(jīng)純化的包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的多肽。在某些實(shí)施方案中，該實(shí)質(zhì)上經(jīng)純化的多肽是由至少90％的具有丙氨酸-絲氨酸-丙氨酸(ASA)的N端氨基酸序列的多肽所組成。在一些實(shí)施方案中，該新生多肽包含導(dǎo)致具有一N端序列的實(shí)質(zhì)上均質(zhì)多肽產(chǎn)物的信號(hào)序列。

在某些實(shí)施方案中，Wnt結(jié)合劑包含免疫球蛋白的Fc區(qū)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，本發(fā)明的某些結(jié)合劑將包含融合蛋白，相比于具有大約相同免疫原性的包含天然或未經(jīng)改變的恒定區(qū)的融合蛋白，其中至少部分的Fc區(qū)是經(jīng)刪除或以其他方式改變，以提供所期望的生化特征，例如增加癌細(xì)胞定位、增加腫瘤穿透、減少血清半衰期、或增加血清半衰期。對(duì)Fc區(qū)的修飾可能包括添加、刪除或取代一或多個(gè)結(jié)構(gòu)域中的一或多個(gè)氨基酸。此處所公開的經(jīng)修飾的融合蛋白可能包含對(duì)二個(gè)重鏈恒定結(jié)構(gòu)域的一或多種(CH2或CH3)或?qū)︺q鏈區(qū)的改變或修飾。在其他實(shí)施方案中，整個(gè)CH2結(jié)構(gòu)域可被移除(ΔCH2構(gòu)建體)。在一些實(shí)施方案中，該遺漏的恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域是由短氨基酸間隔子(例如10個(gè)殘基)取代，以提供通常由該遺漏恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域所授予的一些分子柔韌性。

在一些實(shí)施方案中，該經(jīng)修飾的融合蛋白是經(jīng)建構(gòu)以直接連接CH3結(jié)構(gòu)域與該鉸鏈區(qū)。在其他實(shí)施方案中，肽間隔子被插入鉸鏈區(qū)與經(jīng)修飾的CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域之間。舉例來說，其中CH2結(jié)構(gòu)域被刪除且剩余的CH3結(jié)構(gòu)域(經(jīng)修飾或未經(jīng)修飾)是以5至20個(gè)氨基酸間隔子與鉸鏈區(qū)連接的構(gòu)建體可被表達(dá)。該間隔子可被添加以確保恒定區(qū)的調(diào)節(jié)組件維持自由及可接近，或該鉸鏈區(qū)維持柔性。然而，應(yīng)注意氨基酸間隔子在一些情況中可能證實(shí)具有免疫原性，且誘發(fā)拮抗該構(gòu)建體的非所期望的免疫反應(yīng)。因此，在某些實(shí)施方案中，任何添加至構(gòu)建體的間隔子將為相對(duì)非免疫原性，以維持該融合蛋白的所期望的生物性質(zhì)。

在一些實(shí)施方案中，該經(jīng)修飾的融合蛋白可能僅具有恒定結(jié)構(gòu)域的部分刪除或取代少數(shù)或甚至單一氨基酸。舉例來說，在CH2結(jié)構(gòu)域的選擇區(qū)域中的單一氨基酸突變可能足以實(shí)質(zhì)上減少Fc結(jié)合，因此增加癌細(xì)胞定位和/或腫瘤穿透。類似地，可能所期望的是單純刪除該一或多個(gè)恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域中控制特定效應(yīng)功能(例如補(bǔ)體C1q結(jié)合)的部分。該恒定區(qū)的部分刪除可增進(jìn)該結(jié)合劑的選擇特性(例如血清半衰期)，同時(shí)保留其他與該主題恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域完整有關(guān)的所期望的功能。另外，如上所述，該公開的融合蛋白的恒定區(qū)可經(jīng)由一或多個(gè)氨基酸的突變或取代改性以增進(jìn)該形成構(gòu)建物的特性。在這方面可能擾亂由保守性結(jié)合位點(diǎn)所提供的活性(例如Fc結(jié)合)，同時(shí)實(shí)質(zhì)上維持該經(jīng)修飾的融合蛋白的構(gòu)造及免疫原性特性。在某些實(shí)施方案中，該經(jīng)修飾的融合蛋白包含添加一或多個(gè)氨基酸至恒定區(qū)以增進(jìn)所期望的特征，諸如減少或增加效應(yīng)功能，或提供更多細(xì)胞毒素或碳水化合物連接位點(diǎn)。

該領(lǐng)域已知的是恒定區(qū)介導(dǎo)數(shù)種效應(yīng)功能。舉例來說，補(bǔ)體的C1成分與(結(jié)合至抗原的)IgG或IgM抗體的Fc區(qū)的結(jié)合活化該補(bǔ)體系統(tǒng)。補(bǔ)體的活化于細(xì)胞病原體的調(diào)理作用及溶解中是重要的。補(bǔ)體的活化亦刺激發(fā)炎反應(yīng)，且還能與自體免疫超敏性有關(guān)。此外，免疫球蛋白的Fc區(qū)可與表達(dá)Fc受體(FcR)的細(xì)胞結(jié)合。有一些對(duì)不同類型的抗體具有特異性的Fc受體，其包括IgG(γ受體)、IgE(ε受體)、IgA(α受體)及IgM(μ受體)?？贵w與細(xì)胞表面上的Fc受體的結(jié)合引發(fā)多種重要且多變的生物反應(yīng)，包括吞噬及破壞抗體包覆顆粒、清空免疫復(fù)合物、通過殺手細(xì)胞溶解經(jīng)抗體包覆的標(biāo)靶細(xì)胞、釋放發(fā)炎介質(zhì)、胚胎轉(zhuǎn)移及控制免疫球蛋白的產(chǎn)生。

在一些實(shí)施方案中，該經(jīng)修飾的融合蛋白提供經(jīng)改變的效應(yīng)功能，進(jìn)而影響該施用劑的生物特性。舉例來說，在一些實(shí)施方案中，刪除或不活化(經(jīng)由點(diǎn)突變或其他方法)恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域可能減少循環(huán)中經(jīng)修飾的劑與Fc受體結(jié)合，因此增加癌細(xì)胞定位和/或腫瘤穿透。在其他實(shí)施方案中，恒定區(qū)修飾增加或減少劑的血清半衰期。在一些實(shí)施方案中，恒定區(qū)是經(jīng)修飾以消除雙硫鍵或寡糖基團(tuán)。

在某些實(shí)施方案中，經(jīng)修飾的融合蛋白不具有一或多種通常與Fc區(qū)有關(guān)的效應(yīng)功能。在一些實(shí)施方案中，該劑不具抗體依賴性細(xì)胞媒介性細(xì)胞毒性(ADCC)活性和/或不具補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)活性。在某些實(shí)施方案中，該劑不與該Fc受體和/或補(bǔ)體因子結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，該劑不具效應(yīng)功能。

在一些實(shí)施方案中，本文所述的Wnt結(jié)合劑(例如可溶性受體)被修飾以減少免疫原性。通常，當(dāng)這些蛋白用來作為治療劑時(shí)，拮抗完全正常人蛋白的免疫反應(yīng)很少發(fā)生。然而，雖然許多融合蛋白包含與自然界中發(fā)現(xiàn)的序列相同的多肽序列，但若干種治療性融合蛋白已顯示在哺乳動(dòng)物中具有免疫原性。在一些試驗(yàn)中，包含接頭的融合蛋白已被發(fā)現(xiàn)比不包含接頭的融合蛋白更具免疫原性。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽是通過運(yùn)算方法分析以預(yù)測免疫原性。在一些實(shí)施方案中，分析這樣的多肽中T細(xì)胞和/或B細(xì)胞表位的存在。如果任何T細(xì)胞或B細(xì)胞表位是經(jīng)辨識(shí)和/或預(yù)測，則可對(duì)這些區(qū)域進(jìn)行修飾(例如氨基酸取代)以擾亂或破壞這樣的表位。各種可用于預(yù)測T細(xì)胞和/或B細(xì)胞表位的算法及軟件是該領(lǐng)域所公知的。例如，軟件程序SYFPEITHI、HLA Bind、PEPVAC、RANKPEP、DiscoTope、ElliPro、及抗體表位預(yù)測(Antibody Epitope Prediction)都是公眾可獲得的。

在一些實(shí)施方案中，提供包含如本文中所述的可溶性受體或多肽中的任何一種的組合物。在一些實(shí)施方案中，該組合物包含多肽，其中該多肽中的至少80％、90％、95％、97％、98％、或99％具有丙氨酸-絲氨酸-丙氨酸(ASA)的N端氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，該組合物包含多肽，其中該多肽中的100％具有ASA的N端氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，該組合物包含多肽，其中該多肽中的至少80％具有ASA的N端氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，該組合物包含多肽，其中該多肽中的至少90％具有ASA的N端氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，該組合物包含多肽，其中該多肽中的至少95％具有ASA的N端氨基酸序列。

本文中所述的多肽可為重組多肽、自然界多肽、或合成多肽。在本技術(shù)領(lǐng)域中應(yīng)認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明的一些氨基酸序列可變化而不會(huì)對(duì)該蛋白的結(jié)構(gòu)或功能造成顯著影響。若考慮這樣的序列上的差異，應(yīng)記住在蛋白質(zhì)上將有決定活性的重要區(qū)域。因此，本發(fā)明另包括多肽的變異體，該變異體顯示實(shí)質(zhì)活性或包括FZD蛋白的區(qū)域，例如如本文所討論的蛋白部分。這樣的突變包括刪除、插入、倒位、重復(fù)、及類型取代。

當(dāng)然，技術(shù)人員會(huì)采用的氨基酸取代的數(shù)量取決于許多因素，包括上文所描述的那些。在某些實(shí)施方案中，用于任何給定的可溶性受體多肽中的取代的數(shù)量不會(huì)超過50、40、30、25、20、15、10、5或3個(gè)。

多肽的片段或部分可被采用來通過肽合成用于產(chǎn)生該對(duì)應(yīng)的全長多肽；因此，這樣的片段可被采用來用于產(chǎn)生全長多肽的中間物。這樣的多肽的片段或部分也可被稱為“蛋白片段”或“多肽片段”。

蛋白片段是能與一或多種人Wnt蛋白或一或多種人FZD蛋白結(jié)合的蛋白的一部分或整體。在一些實(shí)施方案中，該片段對(duì)一或多種人Wnt蛋白具有高親和性。在一些實(shí)施方案中，該片段對(duì)一或多種人FZD蛋白具有高親和性。此處所描述的Wnt結(jié)合劑的一些片段是包含與免疫球蛋白的恒定區(qū)(例如Fc區(qū))的至少部分連接的FZD蛋白的胞外部分的至少部分的蛋白片段。該蛋白片段的結(jié)合親和性可以在約10^-11至10^-12M的范圍，雖然親和性可因片段的不同大小而具有從10^-7至10^-13M的大幅差異。在一些實(shí)施方案中，該片段是約100至約200個(gè)氨基酸長度，且包含與免疫球蛋白的恒定區(qū)的至少部分連接的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是Wnt結(jié)合劑，該Wnt結(jié)合劑是抗體。在一些實(shí)施方案中，該Wnt結(jié)合劑是多肽。在某些實(shí)施方案中，該Wnt結(jié)合劑是包含抗原結(jié)合部位的抗體或多肽。在某些實(shí)施方案中，本文所述的Wnt結(jié)合抗體或多肽的抗原結(jié)合部位能與一、二、三、四、五、或更多種人Wnt蛋白結(jié)合(或鍵合)。在某些實(shí)施方案中，該Wnt結(jié)合抗體或多肽的抗原結(jié)合部位能與選自Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10a及Wnt10b中的一、二、三、四或五種人Wnt蛋白特異性結(jié)合。Wnt結(jié)合劑的非限制性實(shí)例可見于美國專利No.7,723,477,國際專利公布No.WO 2011/088123,以及國際專利公布No.WO 2011/088127。

在某些實(shí)施方案中，Wnt結(jié)合劑結(jié)合一種或多種人Wnt蛋白的C-端富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，Wnt結(jié)合劑結(jié)合與劑或抗體結(jié)合的一種或多種Wnt蛋白內(nèi)的結(jié)構(gòu)域，所述劑或抗體選自：SEQ ID NO:31(Wnt1)、SEQ ID NO:32(Wnt2)、SEQ ID NO:33(Wnt2b)、SEQ ID NO:34(Wnt3)、SEQ ID NO:35(Wnt3a)、SEQ ID NO:36(Wnt7a)、SEQ ID NO:37(Wnt7b)、SEQ ID NO:38(Wnt8a)、SEQ ID NO:39(Wnt8b)、SEQ ID NO:40(Wnt10a)和SEQ ID NO:41(Wnt10b)。

在某些實(shí)施方式中，該Wnt途徑抑制劑是Wnt結(jié)合劑，且該Wnt結(jié)合劑是抗體。在一些實(shí)施方式中，該抗體是重組抗體。在一些實(shí)施方式中，該抗體是單克隆抗體。在一些實(shí)施方式中，該抗體是嵌合抗體。在一些實(shí)施方式中，該抗體是人化抗體。在一些實(shí)施方式中，該抗體是人抗體。在某些實(shí)施方式中，該抗體是IgG1抗體。在某些實(shí)施方式中，該抗體是IgG2抗體。在某些實(shí)施方式中，該抗體是包含抗原結(jié)合部位的抗體片段。在一些實(shí)施方式中，該抗體是單價(jià)、單特異性、雙價(jià)、雙特異性或多特異性的。在一些實(shí)施方式中，該抗體是與細(xì)胞毒性部分綴合。在一些實(shí)施方式中，該抗體是被分離的。在一些實(shí)施方式中，該抗體是實(shí)質(zhì)上純的。

在一些實(shí)施方案中，該Wnt途徑抑制劑是多克隆抗體。多克隆抗體可利用任何已知的方法制備。在一些實(shí)施方案中，多克隆抗體是通過以相關(guān)的抗原(例如經(jīng)純化的肽片段、全長重組蛋白或融合蛋白)利用多重皮下或腹腔內(nèi)注射的方式使動(dòng)物(例如兔、大鼠、小鼠、山羊、驢)免疫而產(chǎn)生。該抗原可任意選擇地與載體綴合，該載體諸如鑰孔狀帽貝血藍(lán)素(KLH)或血清白蛋白。該抗原(不論有無載體蛋白質(zhì))被無菌鹽水稀釋，且通常與佐劑(例如完全或不完全弗氏(Freund’s)佐劑)組合以形成穩(wěn)定乳液。在經(jīng)過足夠時(shí)間后，從該經(jīng)免疫處理的動(dòng)物的血液和/或腹水回收多克隆抗體。該多克隆抗體可根據(jù)該領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法自血清或腹水純化，這樣的方法包括但不限于親和性層析、離子交換層析、膠體電泳及透析。

在一些實(shí)施方案中，該Wnt途徑抑制劑是單克隆抗體。單克隆抗體可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的雜交瘤方法制備。在一些實(shí)施方案中，使用雜交瘤方法，將小鼠、倉鼠或其他適當(dāng)?shù)乃拗鲃?dòng)物經(jīng)上述方法免疫，以誘發(fā)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生將與該免疫抗原特異性結(jié)合的抗體。在一些實(shí)施方案中，淋巴細(xì)胞可于體外進(jìn)行免疫處理。在一些實(shí)施方案中，該免疫抗原可為人蛋白質(zhì)或其一部分。在一些實(shí)施方案中，該免疫抗原可為小鼠蛋白或其一部分。

在免疫后，淋巴細(xì)胞是經(jīng)分離并利用例如聚乙二醇與適當(dāng)?shù)墓撬枇黾?xì)胞系融合，以形成接著可與未融合的淋巴細(xì)胞及骨髓瘤細(xì)胞分離的雜交瘤細(xì)胞。產(chǎn)生特異性拮抗選定抗原的單克隆抗體的雜交瘤可利用多種方法識(shí)別，這樣的方法包括但不限于免疫沉淀、免疫轉(zhuǎn)漬及試管內(nèi)結(jié)合試驗(yàn)(例如流式細(xì)胞分析、FACS、ELISA及放射性免疫測定)。該雜交瘤可利用標(biāo)準(zhǔn)方法于試管內(nèi)增殖，或于動(dòng)物活體內(nèi)(in vivo)以腹水腫瘤方式增殖。該單克隆抗體可根據(jù)該領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法從培養(yǎng)基或腹水液體純化，這樣的方法包括但不限于親和性層析、離子交換層析、膠體電泳及透析。

在某些實(shí)施方案中，單克隆抗體可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的重組DNA技術(shù)制備。編碼單克隆抗體的多核苷酸與成熟B細(xì)胞或雜交瘤細(xì)胞分離，例如通過使用寡核苷酸引物的RT-PCR，從而特異性擴(kuò)增編碼該抗體的重鏈及輕鏈的基因，并且其序列是利用公知技術(shù)測定。該經(jīng)分離的編碼重鏈及輕鏈的多核苷酸接著被克隆至適當(dāng)表達(dá)載體內(nèi)，該載體在轉(zhuǎn)染至原本不產(chǎn)生免疫球蛋白的宿主細(xì)胞諸如大腸桿菌(E.coli)、類人猿COS細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞后產(chǎn)生單克隆抗體。在其他實(shí)施方案中，重組單克隆抗體或其片段可自噬菌體展示庫分離。

編碼單克隆抗體的多核苷酸可進(jìn)一步以多種不同方式使用重組DNA技術(shù)修飾，以產(chǎn)生可供選擇的抗體。在一些實(shí)施方案中，例如小鼠單克隆抗體的輕鏈及重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域可被例如人抗體的該些區(qū)域取代以產(chǎn)生嵌合抗體，或以非免疫球蛋白多肽取代以產(chǎn)生融合抗體。在一些實(shí)施方案中，這樣的恒定區(qū)被截短或移除以產(chǎn)生所期望的單克隆抗體的抗體片段。在一些實(shí)施方案中，可變區(qū)的定點(diǎn)或高密度突變形成可被用于優(yōu)化單克隆抗體的特異性、親和性等。

在一些實(shí)施方案中，該Wnt途徑抑制劑是人化抗體。通常，人化抗體是其中CDR的殘基經(jīng)源自具有所期望特異性、親和性和/或結(jié)合能力的非人物種(例如小鼠、大鼠、兔、倉鼠等)的CDR的氨基酸殘基取代的人免疫球蛋白，該取代是利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行的。在一些實(shí)施方案中，人免疫球蛋白的框架區(qū)殘基由非人物種的抗體的對(duì)應(yīng)殘基取代。在一些實(shí)施方案中，該人化抗體可進(jìn)一步通過取代框架區(qū)和/或該經(jīng)取代的非人殘基內(nèi)的額外殘基加以修飾，以精煉和優(yōu)化抗體特異性、親和性和/或能力。通常，該人化抗體將包含實(shí)可變結(jié)構(gòu)域區(qū)，該可變結(jié)構(gòu)域區(qū)包含所有或?qū)嵸|(zhì)上所有的對(duì)應(yīng)該非人免疫球蛋白的CDR，然而所有或?qū)嵸|(zhì)上所有的框架區(qū)是具有人免疫球蛋白序列的框架區(qū)。在一些實(shí)施方案中，該人化抗體亦可包含至少部分的免疫球蛋白恒定區(qū)或恒定結(jié)構(gòu)域(Fc)，通常為人免疫球蛋白的該部分。在某些實(shí)施方案中，這樣的人化抗體是用于治療用途，因?yàn)楫?dāng)施用至人受試者時(shí)它們可能減少抗原性及HAMA(人抗小鼠抗體)反應(yīng)。

在某些實(shí)施方案中，該Wnt途徑抑制劑是人抗體。人抗體可利用該領(lǐng)域已知的多種技術(shù)直接制備。在一些實(shí)施方案中，可制備在試管內(nèi)經(jīng)免疫處理的或從經(jīng)免疫處理的個(gè)體分離的永生化人B淋巴細(xì)胞，該永生化人B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生以標(biāo)靶抗原為目標(biāo)的抗體。在一些實(shí)施方案中，該人抗體可選自噬菌體庫，其中該噬菌體庫表達(dá)人抗體?；蛘?，噬菌體展示技術(shù)可被用來從未經(jīng)免疫處理的捐贈(zèng)者的免疫球蛋白可變區(qū)結(jié)構(gòu)域基因貯庫在試管內(nèi)產(chǎn)生人抗體及抗體片段。用于產(chǎn)生及使用抗體噬菌體庫的技術(shù)是本技術(shù)領(lǐng)域所公知的，并且抗體噬菌體庫是可商購的。包括但不限于鏈改組(chain shuffling)及定點(diǎn)突變形成的親和性成熟策略在本技術(shù)領(lǐng)域是已知的，并可被用于產(chǎn)生高親和性人抗體。

在一些實(shí)施方案中，人抗體可于包含人免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因小鼠中制備。經(jīng)免疫后，這些小鼠可產(chǎn)生整套人抗體而不產(chǎn)生內(nèi)源性免疫球蛋白。

本發(fā)明還包含特異性識(shí)別至少一種人FZD蛋白或至少一種Wnt蛋白的雙特異性抗體。雙特異性抗體可特異性辨識(shí)及結(jié)合至少二種不同表位。這樣的不同的表位可位于相同分子內(nèi)(例如二個(gè)不同的表位位于人FZD5上)或位于不同分子上(例如一表位位于FZD5上，不同的表位位于第二蛋白上)。在一些實(shí)施方案中，該雙特異性抗體是單克隆人或人化抗體。在一些實(shí)施方案中，雙特異性抗體是完整抗體。在一些實(shí)施方案中，雙特異性抗體是抗體片段。在某些實(shí)施方案中，抗體是多特異性的。在一些實(shí)施方案中，該抗體可特異性識(shí)別及結(jié)合第一抗原標(biāo)靶(例如FZD蛋白)及第二抗原標(biāo)靶，例如在淋巴細(xì)胞上的效應(yīng)分子(例如CD2、CD3、CD28、CD80、或CD86)或Fc受體(例如CD64、CD32或CD16)，以使細(xì)胞性防御機(jī)制集中于表達(dá)該第一抗原標(biāo)靶的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，這樣的抗體可被用于引導(dǎo)細(xì)胞毒性劑至表達(dá)特定標(biāo)靶抗原的細(xì)胞。這些抗體具有抗原結(jié)合臂及與細(xì)胞毒性劑或放射性核素螯合劑(諸如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA結(jié)合)的臂。用于制造雙特異性或者多特異性抗體的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。

在某些實(shí)施方案中，此處描述的抗體(或其他多肽)可為單特異性的。例如，在某些實(shí)施方案中，抗體所包含的一或多個(gè)抗原結(jié)合部位中的每一種是能結(jié)合不同蛋白質(zhì)上的同源性表位。

在某些實(shí)施方案中，該Wnt途徑抑制劑是包含抗原結(jié)合部位的抗體片段?？贵w片段可具有與完整抗體不同的功能或能力，例如抗體片段可具有增加的腫瘤穿透。已知用于產(chǎn)生抗體片段的各種技術(shù)包括但不限于完整抗體的蛋白水解消化。在一些實(shí)施方案中，抗體片段包括由胃蛋白酶消化抗體分子所產(chǎn)生的F(ab’)2片段。在一些實(shí)施方案中，抗體片段包括通過減少F(ab’)2片段的雙硫鍵所產(chǎn)生的Fab片段。在其他實(shí)施方案中，抗體片段包括通過以木瓜酶及還原劑處理抗體分子所產(chǎn)生的Fab片段。在某些實(shí)施方案中，抗體片段是經(jīng)重組產(chǎn)生的。在一些實(shí)施方案中，抗體片段包括Fv或單鏈Fv(scFv)片段。Fab、Fv及scFv抗體片段可在大腸桿菌或其他宿主細(xì)胞中表達(dá)及分泌，從而使得能大量產(chǎn)生這些片段。在一些實(shí)施方案中，抗體片段與如此處所討論的抗體噬菌體分子庫分離。舉例來說，可利用方法建構(gòu)Fab表達(dá)庫以允許快速有效地識(shí)別對(duì)FZD或Wnt蛋白或其衍生物、片段、類似物或同源物具有所期望特異性的單克隆Fab片段。在一些實(shí)施方案中，抗體片段是線性抗體片段。在某些實(shí)施方案中，抗體片段是單特異性或雙特異性的。在某些實(shí)施方案中，該Wnt途徑抑制劑是scFv。各種技術(shù)可被用于產(chǎn)生對(duì)一或多種人FZD蛋白或一或多種人Wnt蛋白具有特異性的單鏈抗體。

另外尤其就抗體片段而言所期望的是，修飾抗體以增加其血清半衰期。這可通過例如使抗體片段中的適當(dāng)區(qū)域發(fā)生突變以將救援受體結(jié)合表位并入抗體片段中實(shí)現(xiàn)，或通過將該表位并入肽標(biāo)簽中然后使該肽標(biāo)簽與抗體片段的末端或中間融合(例如通過DNA或肽合成)來實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，抗體被修飾以減小其血清半衰期。

異源綴合抗體的用途也屬于本發(fā)明的方法的范圍內(nèi)。異源綴合抗體是由二個(gè)共價(jià)連接的抗體組成。這樣的抗體被計(jì)劃用于例如使免疫細(xì)胞以非所期望的細(xì)胞為標(biāo)靶。還考慮到這樣的異源綴合抗體可利用已知的合成蛋白質(zhì)化學(xué)方法于試管內(nèi)制備，包括涉及交聯(lián)劑的那些方法。舉例來說，免疫毒素可利用雙硫交換反應(yīng)或通過形成硫醚鍵加以建構(gòu)。為達(dá)此目的的適當(dāng)試劑實(shí)例包括亞氨基硫醇鹽及甲基-4-巰基丁亞氨酸酯。

就本發(fā)明的方法而言，應(yīng)理解的是經(jīng)修飾的抗體可包含任何類型的使得該抗體與標(biāo)靶(即人FZD蛋白或人Wnt蛋白)連接的可變區(qū)。在這方面，該可變區(qū)可包含或衍生自任何種類的可被誘導(dǎo)以啟動(dòng)體液性反應(yīng)及產(chǎn)生拮抗該所期望的腫瘤相關(guān)抗原的免疫球蛋白的哺乳動(dòng)物。因此，該經(jīng)修飾的抗體的可變區(qū)可為來源于例如人、小鼠、非人靈長動(dòng)物(例如長尾獼猴(cynomolgus monkey)、獼猴等)或兔。在一些實(shí)施方案中，該經(jīng)修飾的免疫球蛋白的可變區(qū)及恒定區(qū)都是來源于人的。在其他實(shí)施方案中，兼容性抗體的可變區(qū)(通常源自非人來源)可經(jīng)工程化或特別修改以促進(jìn)該分子的結(jié)合特性或降低該分子的免疫原性。在這方面，可變區(qū)可經(jīng)人化或另行通過包括輸入氨基酸序列而改變。

在某些實(shí)施方案中，重鏈及輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域是通過至少部分取代一或多個(gè)CDR及(若需要的話)通過部分取代框架區(qū)及序列修飾和/或改變而加以改變。雖然CDR可能源自與作為框架區(qū)來源的抗體相同類型或甚至相同亞型的抗體，設(shè)想CDR將優(yōu)選地源自不同物種的抗體。要轉(zhuǎn)移一可變結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合能力至另一可變結(jié)構(gòu)域，不一定需要將所有CDR取代成捐贈(zèng)者可變區(qū)的所有CDR。相反地，可能只需要轉(zhuǎn)移那些維持抗原結(jié)合部位的活性所需的殘基即可。

盡管對(duì)可變區(qū)進(jìn)行改變，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，經(jīng)修飾的抗體將包含其中至少部分的一或多個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域已被刪除或以其他方式改變的抗體(例如全長抗體或其免疫反應(yīng)性片段)以提供所期望的生化特征，例如相比于包含原始或未經(jīng)改變的恒定區(qū)的大約相同的免疫原性的抗體，具有增加的腫瘤定位和/或增加的血清半衰期。在一些實(shí)施方案中，該經(jīng)修飾的抗體的恒定區(qū)將包含人恒定區(qū)。與本發(fā)明兼容的恒定區(qū)的修飾包含添加、刪除或取代一或多個(gè)結(jié)構(gòu)域中的一或多個(gè)氨基酸。此處所公開的經(jīng)修飾的抗體可能包含對(duì)三個(gè)重鏈恒定結(jié)構(gòu)域中的一或多種(CH1、CH2或CH3)和/或?qū)p鏈恒定結(jié)構(gòu)域(CL)的改變或修飾。在一些實(shí)施方案中，一或多個(gè)結(jié)構(gòu)域從該經(jīng)修飾的抗體的恒定區(qū)部分或全部刪除。在一些實(shí)施方案中，該經(jīng)修飾的抗體將包含其中整個(gè)CH2結(jié)構(gòu)域已被移除的結(jié)構(gòu)域刪除構(gòu)建體或變異體(ΔCH2構(gòu)建體)。在一些實(shí)施方案中，該缺少的恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域由短氨基酸間隔子(例如10個(gè)氨基酸殘基)取代，以提供通常由該缺少恒定區(qū)授予的一些分子柔韌性。

在一些實(shí)施方案中，該經(jīng)修飾的抗體是經(jīng)工程化以直接融合CH3結(jié)構(gòu)域與該抗體的鉸鏈區(qū)。在其他實(shí)施方案中，肽間隔子被插入鉸鏈區(qū)與經(jīng)修飾的CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域之間。例如，其中CH2結(jié)構(gòu)域被刪除且剩余的CH3結(jié)構(gòu)域(經(jīng)修飾或未經(jīng)修飾)是用5至20個(gè)氨基酸間隔子與鉸鏈區(qū)連接的構(gòu)建體可被表達(dá)。該間隔子可被添加以確保恒定結(jié)構(gòu)域的調(diào)節(jié)組件維持自由及可接近，或該鉸鏈區(qū)維持柔性。然而，應(yīng)注意氨基酸間隔子在一些情況中可能證實(shí)具有免疫原性，且誘發(fā)拮抗該構(gòu)建體的非所期望的免疫反應(yīng)。因此，在某些實(shí)施方案中，任何添加至構(gòu)建體的間隔子將是相對(duì)非免疫原性的，以維持該經(jīng)修飾的抗體的所期望的生物性質(zhì)。

在一些實(shí)施方案中，該經(jīng)修飾的抗體可能僅具有恒定結(jié)構(gòu)域的部分刪除或取代少數(shù)或甚至單一氨基酸。舉例來說，在CH2結(jié)構(gòu)域的選擇區(qū)域中的單一氨基酸突變可能足以實(shí)質(zhì)上減少Fc結(jié)合，因此增加癌細(xì)胞定位和/或腫瘤穿透。類似地，可能所期望的是單純刪除該一或多個(gè)恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域中控制特定效應(yīng)功能(例如補(bǔ)體C1q結(jié)合)的部分。該恒定區(qū)的部分刪除可增進(jìn)該抗體的選擇特性(血清半衰期)，同時(shí)保留其他與該主題恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域完整有關(guān)的所期望功能。另外，如上所述，該公開的抗體的恒定區(qū)可經(jīng)由一或多個(gè)氨基酸的突變或取代來修飾以增進(jìn)該形成構(gòu)建物的特性。在這方面，擾亂由保守性結(jié)合位點(diǎn)所提供的活性(例如Fc結(jié)合)，同時(shí)實(shí)質(zhì)上維持該經(jīng)修飾的抗體的構(gòu)造及免疫原性特性，這是可能的。在某些實(shí)施方案中，該經(jīng)修飾的抗體包含添加一或多個(gè)氨基酸至恒定區(qū)以增進(jìn)所期望的特征，諸如減少或增加效應(yīng)功能或提供更多細(xì)胞毒素或碳水化合物連接位點(diǎn)。

該技術(shù)領(lǐng)域已知的是，恒定區(qū)媒介數(shù)種效應(yīng)功能。例如，補(bǔ)體的C1成分與(結(jié)合至抗原的)IgG或IgM抗體的Fc區(qū)的結(jié)合活化該補(bǔ)體系統(tǒng)。補(bǔ)體的活化在細(xì)胞病原體的調(diào)理作用及溶解中是重要的。補(bǔ)體的活化還刺激發(fā)炎反應(yīng)，且還可與自體免疫超敏性有關(guān)。此外，抗體的Fc區(qū)可與表達(dá)Fc受體(FcR)的細(xì)胞結(jié)合。有一些Fc受體對(duì)不同類型的抗體具有特異性，包括IgG(γ受體)、IgE(ε受體)、IgA(α受體)及IgM(μ受體)?？贵w與細(xì)胞表面上的Fc受體的結(jié)合引發(fā)多種重要且多變的生物反應(yīng)，包括吞噬及破壞抗體包覆顆粒、清空免疫復(fù)合物、通過殺手細(xì)胞溶解經(jīng)抗體包覆的標(biāo)靶細(xì)胞、釋放發(fā)炎介質(zhì)、胚胎轉(zhuǎn)移及控制免疫球蛋白的產(chǎn)生。

在某些實(shí)施方案中，該Wnt途徑抑制劑是提供經(jīng)改變的效應(yīng)功能的抗體。這些經(jīng)改變的效應(yīng)功能可能影響該經(jīng)施用的抗體的生物特性。例如，在一些實(shí)施方案中，刪除恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域或(經(jīng)由點(diǎn)突變或其他方法)使恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域失活可能減少循環(huán)中經(jīng)修飾的抗體(例如抗FZD抗體)與Fc受體結(jié)合，從而增加癌細(xì)胞定位和/或腫瘤穿透。在其他實(shí)施方案中，恒定區(qū)修飾增加或減少抗體的血清半衰期。在一些實(shí)施方案中，恒定區(qū)被修飾以消除雙硫鍵或寡糖部分。根據(jù)本發(fā)明對(duì)恒定區(qū)的修飾可輕易利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的生化或分子工程技術(shù)進(jìn)行。

在某些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是不具有一或多種效應(yīng)功能的抗體。例如，在一些實(shí)施方案中，該抗體不具有ADCC活性和/或CDC活性。在某些實(shí)施方案中，該抗體不與Fc受體和/或補(bǔ)體因子結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，該抗體不具有效應(yīng)功能。

本發(fā)明的發(fā)明還包含實(shí)質(zhì)上與本文中所述的嵌合抗體、人化抗體、人抗體或其抗體片段同源的變異體及相等物。這些可包含例如保守性取代突變。

在某些實(shí)施方案中，此處所述的抗體是被分離的。在某些實(shí)施方案中，此處所述的抗體是實(shí)質(zhì)上純的。

在本文所描述的方法的一些實(shí)施方案中，該Wnt途徑抑制劑是多肽。該多肽可為包含與至少一種人FZD蛋白或至少一種Wnt蛋白結(jié)合的抗體或其片段的重組多肽、自然界多肽或合成多肽。在本領(lǐng)域中應(yīng)認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明的一些氨基酸序列可變化而不會(huì)對(duì)該蛋白的結(jié)構(gòu)或功能造成顯著影響。因此，本發(fā)明還包括多肽的變異體，該變異體顯示實(shí)質(zhì)的活性或包括拮抗人FZD蛋白或Wnt蛋白的抗體的區(qū)域或其片段。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)ZD結(jié)合多肽或Wnt結(jié)合多肽的氨基酸序列變異體包括刪除、插入、倒位、重復(fù)和/或其他類型的取代。

該多肽、類似物及其變異體可進(jìn)一步經(jīng)修飾以包含非該多肽的正常部分的額外化學(xué)基團(tuán)。這樣的衍生化基團(tuán)可增進(jìn)該多肽的溶解性、延長生物半衰期和/或吸收。這樣的基團(tuán)還可減少或消除該多肽及變異體的任何非所期望的不良反應(yīng)。有關(guān)化學(xué)基團(tuán)的介紹可見Remington:The Science and Practice of Pharmacy,22^nd Edition,2012,Pharmaceutical Press,London。

本文所述的經(jīng)分離的多肽可通過該領(lǐng)域已知的任何適當(dāng)方法生產(chǎn)。這樣的方法范圍從直接蛋白質(zhì)合成方法至建構(gòu)編碼多肽序列的DNA序列及在適當(dāng)宿主中表達(dá)這樣的序列皆可。在一些實(shí)施方案中，DNA序列是利用重組技術(shù)通過分離或合成編碼感興趣的野生型蛋白質(zhì)的DNA序列來建構(gòu)。任選地，該序列可通過定點(diǎn)突變形成來突變以提供其功能性類似物。

在一些實(shí)施方案中，編碼感興趣的多肽的DNA序列可利用寡核苷酸合成器通過化學(xué)合成建構(gòu)。寡核苷酸可根據(jù)該所期望的多肽的氨基酸序列設(shè)計(jì)，并選擇這些將產(chǎn)生感興趣的重組多肽的宿主細(xì)胞所偏好的密碼子。標(biāo)準(zhǔn)方法可被用于合成編碼經(jīng)分離的感興趣的多肽的多核苷酸序列。例如，完全氨基酸序列可被用于建構(gòu)反翻譯基因。另外，可合成包含編碼經(jīng)分離的特定多肽的核苷酸序列的DNA寡聚體。例如，多個(gè)編碼該所期望的多肽的部分的小型寡核苷酸可被合成然后連接。個(gè)別寡核苷酸通常包含5’或3’懸端以用于互補(bǔ)組裝。

一經(jīng)組裝(通過合成、定點(diǎn)突變形成或其他方法)，該編碼感興趣的特定多肽的多核苷酸序列可被插入表達(dá)載體并可操作性連接適合該蛋白質(zhì)于所期望宿主內(nèi)表達(dá)的表達(dá)控制序列。適當(dāng)組裝可通過核苷酸測序、限制酶定位和/或于適當(dāng)宿主內(nèi)表達(dá)生物活性多肽證實(shí)。如該領(lǐng)域所公知的，為了在宿主內(nèi)獲得高表達(dá)量的經(jīng)轉(zhuǎn)染的基因，該基因必須與在選定的表達(dá)宿主內(nèi)具有功能性的轉(zhuǎn)錄及翻譯表達(dá)控制序列可操作性連接。

在某些實(shí)施方案中，重組表達(dá)載體被用于擴(kuò)增及表達(dá)結(jié)合人FZD蛋白或Wnt蛋白的DNA編碼劑(例如抗體或可溶性受體)或其片段。例如，重組表達(dá)載體可為可復(fù)制的DNA構(gòu)建體，其具有與適當(dāng)轉(zhuǎn)錄和/或翻譯調(diào)節(jié)組件可操作性連接的編碼FZD結(jié)合劑、Wnt結(jié)合劑、抗FZD抗體或其片段、抗Wnt抗體或其片段、或FZD-Fc可溶性受體的多肽鏈的合成性或cDNA衍生性DNA片段，該調(diào)節(jié)組件是源自哺乳動(dòng)物、微生物、病毒或昆蟲基因。轉(zhuǎn)錄單位通常包含下列的組合：(1)于基因表達(dá)中具有調(diào)節(jié)作用的一個(gè)或多個(gè)基因組件，例如轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子或增強(qiáng)子，(2)被轉(zhuǎn)錄成mRNA并被翻譯成蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或編碼序列，以及(3)適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄及翻譯啟動(dòng)及終止序列。調(diào)節(jié)組件可包括操作子序列以控制轉(zhuǎn)錄。通常由復(fù)制起點(diǎn)授予的于宿主內(nèi)復(fù)制的能力及有利轉(zhuǎn)化物辨識(shí)的選擇基因可被額外并入。DNA區(qū)在它們彼此之間是功能性相關(guān)時(shí)是“可操作性連接的”。例如，如果信號(hào)肽的DNA(分泌前導(dǎo)序列)被表達(dá)為參與多肽分泌的前體，則該信號(hào)肽的DNA(分泌前導(dǎo)序列)是可操作性連接用于該多肽的DNA的；如果啟動(dòng)子控制編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則該啟動(dòng)子是可操作性連接該序列的；或如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被定位成能夠進(jìn)行翻譯，則核糖體結(jié)合位點(diǎn)是可操作性連接編碼序列的。在一些實(shí)施方案中，適用于酵母菌表達(dá)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)組件包括使宿主酵母菌細(xì)胞能胞外分泌經(jīng)翻譯的蛋白質(zhì)的前導(dǎo)序列。在其他實(shí)施方案中，如果重組蛋白質(zhì)是在無前導(dǎo)或轉(zhuǎn)運(yùn)序列存在時(shí)被表達(dá)，則其可包括N端甲硫氨酸殘基。此殘基之后可任選地與該經(jīng)表達(dá)的重組蛋白質(zhì)切開以提供最終產(chǎn)物。

表達(dá)控制序列及表達(dá)載體的選擇取決于宿主的選擇。多樣化的表達(dá)宿主/載體組合可被采用?？捎糜谡婧怂拗鞯谋磉_(dá)載體包括例如包含源自SV40、牛乳頭狀瘤病毒、腺病毒及巨細(xì)胞病毒的表達(dá)控制序列的載體?？捎糜诩?xì)菌宿主的表達(dá)載體包括已知的細(xì)菌質(zhì)粒，像是源自大腸桿菌的質(zhì)粒(包括pCR1、pBR322、pMB9及其衍生物)，及廣泛宿主范圍的質(zhì)粒，例如M13及其他絲狀單股DNA噬菌體。

用于表達(dá)FZD結(jié)合劑或Wnt結(jié)合劑(或用來作為抗原的蛋白)的適當(dāng)宿主細(xì)胞包括原核生物、酵母菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或高級(jí)真核細(xì)胞。原核生物包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性有機(jī)體，例如大腸桿菌(E.coli)或桿菌(Bacillus)。高級(jí)真核細(xì)胞包括如下所述的哺乳動(dòng)物來源的株化細(xì)胞系。不含細(xì)胞的翻譯系統(tǒng)也可被采用。用于細(xì)菌性、真菌性、酵母菌性及哺乳動(dòng)物細(xì)胞性宿主的適當(dāng)克隆及表達(dá)載體是本技術(shù)領(lǐng)域所公知的。

多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)被用于表達(dá)重組多肽。于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)重組蛋白可為優(yōu)選的，因?yàn)檫@些蛋白通常經(jīng)過正確折疊、適當(dāng)修飾且具有生物功能性。適當(dāng)哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的實(shí)例包括COS-7(猴腎來源)、L-929(小鼠纖維母細(xì)胞來源)、C127(小鼠乳房腫瘤來源)、3T3(小鼠纖維母細(xì)胞來源)、CHO(中國倉鼠卵巢來源)、HeLa(人子宮頸癌來源)、BHK(倉鼠腎纖維母細(xì)胞來源)、HEK-293(人胚胎腎來源)細(xì)胞系及其變異株。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體可包含非轉(zhuǎn)錄組件(諸如復(fù)制起點(diǎn)、與擬表達(dá)的基因相連的適當(dāng)啟動(dòng)子及增強(qiáng)子，及其他5’或3’側(cè)翼非轉(zhuǎn)錄序列)及5’或3’非翻譯序列(諸如必要的核糖體結(jié)合位點(diǎn)、聚腺苷酸化位點(diǎn)、剪接供體點(diǎn)及受體點(diǎn)，及轉(zhuǎn)錄終止序列)。

在昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(例如桿狀病毒)中表達(dá)重組蛋白質(zhì)還提供產(chǎn)生正確折疊及具有生物功能的蛋白質(zhì)的穩(wěn)健方法。用于在昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生異源性蛋白質(zhì)的桿狀病毒系統(tǒng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。

因此，本發(fā)明提供包含此處所述的FZD結(jié)合劑或Wnt結(jié)合劑的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，這樣的細(xì)胞產(chǎn)生此處所述的結(jié)合劑(例如抗體或可溶性受體)。在某些實(shí)施方案中，這樣的細(xì)胞產(chǎn)生抗體。在某些實(shí)施方案中，這樣的細(xì)胞產(chǎn)生抗體OMP-18R5。在一些實(shí)施方案中，這樣的細(xì)胞產(chǎn)生可溶性受體。在一些實(shí)施方案中，這樣的細(xì)胞產(chǎn)生FZD-Fc可溶性受體。在一些實(shí)施方案中，這樣的細(xì)胞產(chǎn)生FZD8-Fc可溶性受體。在一些實(shí)施方案中，這樣的細(xì)胞產(chǎn)生FZD8-Fc可溶性受體OMP-54F28。

由經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可根據(jù)任何適當(dāng)方法純化。標(biāo)準(zhǔn)方法包括層析(例如離子交換、親和性及施膠柱層析)、離心、差別溶解或通過任何其他用于蛋白質(zhì)純化的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。親和性標(biāo)簽諸如六組氨酸、麥芽糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域、流感外套序列及麩胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶可被連接至該蛋白質(zhì)以使得能經(jīng)由通過適當(dāng)親和性管柱輕易純化。被分離的蛋白也可使用例如蛋白水解、質(zhì)譜分析(MS)、核磁共振(NMR)、高效液相層析(HPLC)及x光結(jié)晶之類的技術(shù)通過物理方式特征化。

在一些實(shí)施方案中，源自分泌重組蛋白質(zhì)至培養(yǎng)基的表達(dá)系統(tǒng)的上清液可利用商用蛋白質(zhì)濃縮過濾器先行濃縮，例如使用阿密康(Amicon)或密里博(Millipore)Pellicon超過濾單位濃縮。在濃縮步驟之后，該濃縮液可被加至適當(dāng)純化基材。在一些實(shí)施方案中，可采用陰離子交換樹脂，例如具有二乙基氨基乙基(DEAE)懸掛基團(tuán)的基材或基質(zhì)。該基材可為丙烯酰胺、洋菜糖、葡聚糖、纖維素或其他常用于蛋白質(zhì)純化的基材。在一些實(shí)施方案中，可采用陽離子交換步驟。適當(dāng)?shù)年栯x子交換基材包括包含磺丙基或羧甲基的各種不可溶基材。在一些實(shí)施方案中，可采用羥磷灰石基質(zhì)，包括但不限于陶瓷羥磷灰石(CHT)。在某些實(shí)施方案中，一或多種應(yīng)用疏水性反相HPLC基質(zhì)(例如具有懸掛甲基或其他脂肪族基團(tuán)的硅膠)的反相HPLC步驟可被采用以進(jìn)一步純化結(jié)合劑。上述的一些或所有純化步驟的各種組合也可被應(yīng)用以提供均質(zhì)性重組蛋白。

在一些實(shí)施方案中，于細(xì)菌培養(yǎng)中生產(chǎn)的重組蛋白質(zhì)可被分離，例如通過自細(xì)胞團(tuán)塊初步萃取，接著進(jìn)行一或多次濃縮、鹽析、水性離子交換或膠排除層析步驟進(jìn)行。HPLC可被使用于最終純化步驟。用于表達(dá)重組蛋白的微生物細(xì)胞可通過任何方便方法破碎，該任何方便方法包括冷凍解凍循環(huán)、超聲波震蕩、機(jī)械破碎或使用細(xì)胞溶解劑。

在某些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是小分子。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是抑制β-鏈蛋白和CREB結(jié)合蛋白(CBP)之間的相互作用的小分子。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是ICG-001。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是抑制β-鏈蛋白和T細(xì)胞因子(TCF)之間的相互作用的小分子。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是iCRT-3、iCRT-5或iCRT-14。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是CPG049090。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是NC043。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是第二代版本PRI-724。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是抑制稱為豪豬(porcupine)的酰基轉(zhuǎn)移酶的小分子。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是LGK974。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是IWP-1、IWP-2、IWP-3或IWP-4。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是抑制端錨聚合酶(例如，端錨聚合酶1或端錨聚合酶2)的小分子。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是XAV939。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是JW55。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是IWR或IWR-1-endo。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是撲蟯靈(pyrvinium)。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是CCT031374。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是SM04755。在一些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑是選自以下項(xiàng)中的小分子：XAV939、IWR1、IWP-1、IWP-2、JW74、JW55、大田酸(okadaic acid)、泰托霉素(tautomycin)、SB239063、SB203580、ADP-HPD、2-[4-(4-氟-苯基)哌嗪-1-基]-6-甲基嘧啶-4(3H)-酮、PJ34、氯硝柳胺(niclosamide)、康丙羅(cambinol)、舒林酸(sulindac)、3289-8625、J01-017a、NSC668036、非律平(filipin)、IC261、PF670462、博舒替尼(bosutinib)、PHA665752、伊馬替尼(imatinib)、ICG-001、依他尼酸(ethacrynic acid)及其衍生物、PKF115-584、PNU-74654、PKF118-744、CGP049090、PKF118-310、ZTM000990、BC21、GDC-0941和Rp-8-Br-cAMP。

在某些實(shí)施方案中，該結(jié)合劑可以以數(shù)種綴合(即免疫綴合物或放射綴合物)或非綴合形式中的任一者被使用。在某些實(shí)施方案中，抗體可以非綴合形式被使用以駕馭受試者的自然界防御機(jī)制，包括補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性及抗體依賴性細(xì)胞毒性，以消滅該惡性或癌細(xì)胞。

在一些實(shí)施方案中，該結(jié)合劑與細(xì)胞毒性劑綴合。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞毒性劑是化療劑，包括但不限于甲胺喋呤(methotrexate)、甲烯土霉素(adriamicin)、多柔比星(doxorubicin)、霉法蘭(melphalan)、絲裂霉素C(mitomycin C)、氯芥苯丁酸(chlorambucil)、正定霉素(daunorubicin)或其他插入劑。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞毒性劑是細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物來源的酶活性毒素及其片段，包括但不限于白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒素(abrin)A鏈、莫迪素(modeccin)A鏈、α-次黃嘌呤(sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素(dianthin)蛋白、美洲商陸(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、瀉果素(curcin)、巴豆素(crotin)、肥皂草(saponaria officinalis)抑制劑、白樹毒素(gelonin)、絲裂膠素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、伊諾霉素(enomycin)及新月毒素(trichothecene)。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞毒性劑是放射性同位素以產(chǎn)生放射綴合物或經(jīng)放射綴合的抗體。多種放射性核素可用于產(chǎn)生經(jīng)放射綴合的抗體，包括但不限于⁹⁰Y、¹²⁵I、¹³¹I、¹²³I、¹¹¹In、¹³¹In、¹⁰⁵Rh、¹⁵³Sm、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、¹⁶⁶Ho、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re及²¹²Bi。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明可產(chǎn)生抗體與一或多種小分子毒素的綴合物，這樣的毒素諸如卡利奇霉素(calicheamicin)、類美坦素(maytansinoids)、新月毒素(trichothene)、CC1065及具有毒素活性的這些毒素的衍生物。在某些實(shí)施方案中，抗體與細(xì)胞毒性劑的綴合物可利用各種雙官能性蛋白偶合劑制備，該雙官能性蛋白偶合劑如N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)、二亞氨環(huán)硫丁烷(IT)、亞氨酸酯的雙官能基衍生物(諸如己二亞胺二甲酯HCL)、活性酯的雙官能基衍生物(諸如辛二酸二琥珀酰亞胺)、醛的雙官能基衍生物(諸如戊二醛)、雙迭氮化合物(諸如雙(對(duì)-迭氮苯甲?；?己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙-(對(duì)-重氮苯甲?；?-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如2,6-二異氰酸甲苯酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝苯)。

在某些實(shí)施方案中，該Wnt途徑抑制劑(例如抗體或可溶性受體)是至少一種Wnt蛋白(即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10種Wnt蛋白)的拮抗劑。在某些實(shí)施方案中，該Wnt途徑抑制劑抑制其所結(jié)合的Wnt蛋白的活性。在某些實(shí)施方案中，該Wnt途徑抑制劑抑制至少約10％、至少約20％、至少約30％、至少約50％、至少約75％、至少約90％或約100％的其所結(jié)合的人Wnt蛋白的活性。

在某些實(shí)施方案中，該Wnt途徑抑制劑(例如抗體或可溶性受體)抑制至少一種人Wnt與適當(dāng)受體的結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，該Wnt途徑抑制劑抑制至少一種人Wnt蛋白與一或多種人FZD蛋白的結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，該至少一種Wnt蛋白是選自：Wnt1、Wnt2、Wnt2b/13、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、及Wnt16。在一些實(shí)施方案中，該一或多種人FZD蛋白是選自：FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9及FZD10。在某些實(shí)施方案中，該Wnt途徑抑制劑抑制一或多種Wnt蛋白與FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、和/或FZD8的結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，由該Wnt途徑抑制劑對(duì)特定Wnt與FZD蛋白的結(jié)合的抑制是至少約10％、至少約25％、至少約50％、至少約75％、至少約90％或至少約95％。在某些實(shí)施方案中，抑制Wnt與FZD蛋白結(jié)合的Wnt途徑抑制劑還抑制Wnt途徑信號(hào)傳導(dǎo)。在某些實(shí)施方案中，抑制人Wnt途徑信號(hào)傳導(dǎo)的Wnt途徑抑制劑是抗體。在某些實(shí)施方案中，抑制人Wnt途徑信號(hào)傳導(dǎo)的Wnt途徑抑制劑是抗Wnt抗體。在某些實(shí)施方案中，抑制人Wnt途徑信號(hào)傳導(dǎo)的Wnt途徑抑制劑是抗FZD抗體。在某些實(shí)施方案中，抑制人Wnt途徑信號(hào)傳導(dǎo)的Wnt途徑抑制劑是抗體OMP-18R5。在某些實(shí)施方案中，抑制人Wnt途徑信號(hào)傳導(dǎo)的Wnt途徑抑制劑是FZD-Fc可溶性受體。在某些實(shí)施方案中，抑制人Wnt途徑信號(hào)傳導(dǎo)的Wnt途徑抑制劑是FZD8-Fc可溶性受體。在某些實(shí)施方案中，抑制人Wnt途徑信號(hào)傳導(dǎo)的Wnt途徑抑制劑是可溶性受體OMP-54F28。

在某些實(shí)施方案中，本文中所述的該Wnt途徑抑制劑(例如抗體或可溶性受體)是至少一種人Wnt蛋白的拮抗劑且抑制Wnt活性。在某些實(shí)施方案中，該Wnt途徑抑制劑抑制至少約10％、至少約20％、至少約30％、至少約50％、至少約75％、至少約90％或約100％的Wnt活性。在一些實(shí)施方案中，該Wnt途徑抑制劑抑制一、二、三、四、五或更多種Wnt蛋白的活性。在一些實(shí)施方案中，該Wnt途徑抑制劑抑制選自下列項(xiàng)中的至少一種人Wnt蛋白的活性：Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、及Wnt16。在一些實(shí)施方案中，該Wnt結(jié)合劑與至少一種選自Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10a、及Wnt10b中的Wnt蛋白結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，該至少一種Wnt蛋白是選自Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10a、及Wnt10b。在某些實(shí)施方案中，抑制人Wnt活性的Wnt途徑抑制劑是抗體。在某些實(shí)施方案中，抑制人Wnt活性的Wnt途徑抑制劑是抗Wnt抗體。在某些實(shí)施方案中，抑制人Wnt活性的Wnt途徑抑制劑是FZD-Fc可溶性受體。在某些實(shí)施方案中，抑制人Wnt活性的Wnt途徑抑制劑是FZD8-Fc可溶性受體。在某些實(shí)施方案中，抑制人Wnt活性的Wnt途徑抑制劑是可溶性受體OMP-54F28。

在某些實(shí)施方案中，本文所述的Wnt途徑抑制劑是至少一種人FZD蛋白的拮抗劑且抑制FZD活性。在某些實(shí)施方案中，該Wnt途徑抑制劑抑制至少約10％、至少約20％、至少約30％、至少約50％、至少約75％、至少約90％或約100％的FZD活性。在一些實(shí)施方案中，該Wnt途徑抑制劑抑制一、二、三、四、五或更多種FZD蛋白的活性。在一些實(shí)施方案中，該Wnt途徑抑制劑抑制選自下列項(xiàng)中的至少一種人FZD蛋白的活性：FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9及FZD10。在某些實(shí)施方案中，該Wnt途徑抑制劑抑制FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、和/或FZD8的活性。在一些實(shí)施方案中，該Wnt途徑抑制劑是抗FZD抗體。在某些實(shí)施方案中，該Wnt途徑抑制劑是抗FZD抗體OMP-18R5。

在某些實(shí)施方案中，本文所述的Wnt途徑抑制劑是至少一種人Wnt蛋白的拮抗劑且抑制Wnt信號(hào)傳導(dǎo)。在某些實(shí)施方案中，該Wnt途徑抑制劑抑制至少約10％、至少約20％、至少約30％、至少約50％、至少約75％、至少約90％或約100％的Wnt信號(hào)傳導(dǎo)。在一些實(shí)施方案中，該Wnt途徑抑制劑抑制一、二、三、四、五或更多種Wnt蛋白的信號(hào)傳導(dǎo)。在一些實(shí)施方案中，該Wnt途徑抑制劑抑制至少一種選自Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10a、及Wnt10b中的Wnt蛋白的信號(hào)傳導(dǎo)。在某些實(shí)施方案中，抑制Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的Wnt途徑抑制劑是抗體。在某些實(shí)施方案中，抑制Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的Wnt途徑抑制劑是抗Wnt抗體。在某些實(shí)施方案中，抑制Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的Wnt途徑抑制劑是可溶性受體。在某些實(shí)施方案中，抑制Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的Wnt途徑抑制劑是FZD-Fc可溶性受體。在某些實(shí)施方案中，抑制Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的Wnt途徑抑制劑是FZD8-Fc可溶性受體。在某些實(shí)施方案中，抑制Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的Wnt途徑抑制劑是可溶性受體OMP-54F28。

在某些實(shí)施方案中，本文中所述的Wnt途徑抑制劑是β-鏈蛋白信號(hào)傳導(dǎo)的拮抗劑。在某些實(shí)施方案中，該Wnt途徑抑制劑抑制至少約10％、至少約20％、至少約30％、至少約50％、至少約75％、至少約90％或約100％的β-鏈蛋白信號(hào)傳導(dǎo)。在某些實(shí)施方案中，抑制β-鏈蛋白信號(hào)傳導(dǎo)的Wnt途徑抑制劑是抗體。在某些實(shí)施方案中，抑制β-鏈蛋白信號(hào)傳導(dǎo)的Wnt途徑抑制劑是抗Wnt抗體。在某些實(shí)施方案中，抑制β-鏈蛋白信號(hào)傳導(dǎo)的Wnt途徑抑制劑是抗FZD抗體。在某些實(shí)施方案中，抑制β-鏈蛋白信號(hào)傳導(dǎo)的Wnt途徑抑制劑是抗體OMP-18R5。在某些實(shí)施方案中，抑制β-鏈蛋白信號(hào)傳導(dǎo)的Wnt途徑抑制劑是可溶性受體。在某些實(shí)施方案中，抑制β-鏈蛋白信號(hào)傳導(dǎo)的Wnt途徑抑制劑是FZD-Fc可溶性受體。在某些實(shí)施方案中，抑制β-鏈蛋白信號(hào)傳導(dǎo)的Wnt途徑抑制劑是FZD8-Fc可溶性受體。在某些實(shí)施方案中，抑制β-鏈蛋白信號(hào)傳導(dǎo)的Wnt途徑抑制劑是可溶性受體OMP-54F28。

在某些實(shí)施方案中，本文中所述的Wnt途徑抑制劑抑制至少一種Wnt蛋白與受體的結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，該Wnt途徑抑制劑抑制至少一種人Wnt蛋白與一或多種其受體的結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，該Wnt途徑抑制劑抑制至少一種Wnt蛋白與至少一種FZD蛋白的結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，該Wnt結(jié)合劑抑制至少一種Wnt蛋白與FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FDZ5、FDZ6、FDZ7、FDZ8、FDZ9、和/或FZD10的結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，抑制至少一種Wnt與至少一種FZD蛋白的結(jié)合是抑制至少約10％、至少約25％、至少約50％、至少約75％、至少約90％或至少約95％。在某些實(shí)施方案中，抑制至少一種Wnt與至少一種FZD蛋白結(jié)合的Wnt途徑抑制劑還抑制Wnt途徑信號(hào)傳導(dǎo)和/或β-鏈蛋白信號(hào)傳導(dǎo)。在某些實(shí)施方案中，抑制至少一種人Wnt與至少一種FZD蛋白結(jié)合的Wnt途徑抑制劑是抗體。在某些實(shí)施方案中，抑制至少一種人Wnt與至少一種FZD蛋白結(jié)合的Wnt途徑抑制劑是抗FZD抗體。在某些實(shí)施方案中，抑制至少一種人Wnt與至少一種FZD蛋白結(jié)合的Wnt途徑抑制劑是抗體OMP-18R5。在某些實(shí)施方案中，抑制至少一種人Wnt與至少一種FZD蛋白結(jié)合的Wnt途徑抑制劑是可溶性受體。在某些實(shí)施方案中，抑制至少一種人Wnt與至少一種FZD蛋白結(jié)合的Wnt途徑抑制劑是FZD-Fc可溶性受體。在某些實(shí)施方案中，抑制至少一種人Wnt與至少一種FZD蛋白結(jié)合的Wnt途徑抑制劑是FZD8-Fc可溶性受體。在某些實(shí)施方案中，抑制至少一種人Wnt與至少一種FZD蛋白結(jié)合的Wnt途徑抑制劑是FZD8-Fc可溶性受體OMP-54F28。

在某些實(shí)施方案中，本文中所述的Wnt途徑抑制劑阻斷至少一種Wnt與受體的結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，該Wnt途徑抑制劑阻斷至少一種人Wnt蛋白與一或多種其受體的結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，該Wnt途徑抑制劑阻斷至少一種Wnt與至少一種FZD蛋白的結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，該Wnt途徑抑制劑阻斷至少一種Wnt蛋白與FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FDZ5、FDZ6、FDZ7、FDZ8、FDZ9、和/或FZD10的結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，至少一種Wnt與至少一種FZD蛋白的結(jié)合是阻斷至少約10％、至少約25％、至少約50％、至少約75％、至少約90％或至少約95％。在某些實(shí)施方案中，阻斷至少一種Wnt蛋白與至少一種FZD蛋白結(jié)合的Wnt途徑抑制劑還抑制Wnt途徑信號(hào)傳導(dǎo)和/或β-鏈蛋白信號(hào)傳導(dǎo)。在某些實(shí)施方案中，阻斷至少一種人Wnt與至少一種FZD蛋白結(jié)合的Wnt途徑抑制劑是抗體。在某些實(shí)施方案中，阻斷至少一種人Wnt與至少一種FZD蛋白結(jié)合的Wnt途徑抑制劑是抗FZD抗體。在某些實(shí)施方案中，阻斷至少一種人Wnt與至少一種FZD蛋白結(jié)合的Wnt途徑抑制劑是抗體OMP-18R5。在某些實(shí)施方案中，阻斷至少一種人Wnt與至少一種FZD蛋白結(jié)合的Wnt途徑抑制劑是可溶性受體。在某些實(shí)施方案中，阻斷至少一種人Wnt與至少一種FZD蛋白結(jié)合的Wnt途徑抑制劑是FZD-Fc可溶性受體。在某些實(shí)施方案中，阻斷至少一種人Wnt與至少一種FZD蛋白結(jié)合的Wnt途徑抑制劑是FZD8-Fc可溶性受體。在某些實(shí)施方案中，阻斷至少一種人Wnt與至少一種FZD蛋白結(jié)合的Wnt途徑抑制劑是可溶性受體OMP-54F28。

在某些實(shí)施方案中，本文所述的Wnt途徑抑制劑抑制Wnt途徑信號(hào)傳導(dǎo)。應(yīng)理解的是，抑制Wnt途徑信號(hào)傳導(dǎo)的Wnt途徑抑制劑在某些實(shí)施方案中可能抑制Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑中通過一或多種受體進(jìn)行的信號(hào)傳導(dǎo)，但不一定抑制通過所有受體進(jìn)行的信號(hào)傳導(dǎo)。在某些選擇性實(shí)施方案中，通過所有人受體進(jìn)行的Wnt途徑信號(hào)傳導(dǎo)可能被抑制。在某些實(shí)施方案中，通過選自FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FDZ5、FDZ6、FDZ7、FDZ8、FDZ9、及FZD10中的一或多種受體進(jìn)行的Wnt途徑信號(hào)傳導(dǎo)被抑制。在某些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑對(duì)Wnt途徑信號(hào)傳導(dǎo)的抑制是指Wnt途徑信號(hào)傳導(dǎo)的量減少至少約10％、至少約25％、至少約50％、至少約75％、至少約90％或至少約95％。在一些實(shí)施方案中，抑制Wnt途徑信號(hào)傳導(dǎo)的Wnt途徑抑制劑是抗體。在一些實(shí)施方案中，抑制Wnt途徑信號(hào)傳導(dǎo)的Wnt途徑抑制劑是抗FZD抗體。在一些實(shí)施方案中，抑制Wnt途徑信號(hào)傳導(dǎo)的Wnt途徑抑制劑是抗體OMP-18R5。在一些實(shí)施方案中，抑制Wnt途徑信號(hào)傳導(dǎo)的Wnt途徑抑制劑是可溶性受體。在一些實(shí)施方案中，抑制Wnt途徑信號(hào)傳導(dǎo)的Wnt途徑抑制劑是FZD-Fc可溶性受體。在一些實(shí)施方案中，抑制Wnt途徑信號(hào)傳導(dǎo)的Wnt途徑抑制劑是FZD8-Fc可溶性受體。在一些實(shí)施方案中，抑制Wnt途徑信號(hào)傳導(dǎo)的Wnt途徑抑制劑是可溶性受體OMP-54F28。

在某些實(shí)施方案中，本文所述的Wnt途徑抑制劑抑制β-鏈蛋白的活化。應(yīng)理解的是，抑制β-鏈蛋白的活化的Wnt途徑抑制劑在某些實(shí)施方案中可能抑制通過一或多種受體進(jìn)行的β-鏈蛋白的活化，但不一定抑制通過所有受體進(jìn)行的β-鏈蛋白的活化。在某些選擇性實(shí)施方案中，通過所有人受體進(jìn)行的β-鏈蛋白活化可能被抑制。在某些實(shí)施方案中，通過選自FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FDZ5、FDZ6、FDZ7、FDZ8、FDZ9、及FZD10中的一或多種受體進(jìn)行的β-鏈蛋白的活化被抑制。在某些實(shí)施方案中，該Wnt結(jié)合劑對(duì)β-鏈蛋白活化的抑制是指減少β-鏈蛋白活化量至少約10％、至少約25％、至少約50％、至少約75％、至少約90％或至少約95％。在一些實(shí)施方案中，抑制β-鏈蛋白的活化的Wnt途徑抑制劑是抗體。在一些實(shí)施方案中，抑制β-鏈蛋白的活化的Wnt途徑抑制劑是抗FZD抗體。在一些實(shí)施方案中，抑制β-鏈蛋白的活化的Wnt途徑抑制劑是抗體OMP-18R5。在一些實(shí)施方案中，抑制β-鏈蛋白的活化的Wnt途徑抑制劑是可溶性受體。在一些實(shí)施方案中，抑制β-鏈蛋白的活化的Wnt途徑抑制劑是FZD-Fc可溶性受體。在一些實(shí)施方案中，抑制β-鏈蛋白的活化的Wnt途徑抑制劑是FZD8-Fc可溶性受體。在一些實(shí)施方案中，抑制β-鏈蛋白的活化的Wnt途徑抑制劑是可溶性受體OMP-54F28。

用于測定Wnt途徑抑制劑是否抑制Wnt途徑信號(hào)傳導(dǎo)的活體內(nèi)及試管內(nèi)測定是該技術(shù)領(lǐng)域所公知的。例如，可使用以細(xì)胞為基底的熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)測量試管內(nèi)的β-鏈蛋白信號(hào)傳導(dǎo)量，該試驗(yàn)利用含有多份TCF結(jié)合結(jié)構(gòu)域與下游螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因的TCF/Luc報(bào)告載體(Gazit et al.,1999,Oncogene,18；5959-66；TOPflash,Millipore,Billerica MA)。在一或多種Wnt蛋白(例如由轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)或由Wnt條件培養(yǎng)基提供的Wnt)存在下，結(jié)合劑存在時(shí)的β-鏈蛋白信號(hào)傳導(dǎo)量是與無結(jié)合劑存在時(shí)的信號(hào)傳導(dǎo)量比較。除了TCF/Luc報(bào)告子測定之外，結(jié)合劑(或候選劑)對(duì)β-鏈蛋白信號(hào)傳導(dǎo)的影響可于試管內(nèi)或活體內(nèi)通過測量該劑對(duì)β-鏈蛋白調(diào)節(jié)基因表達(dá)量的影響加以測定，如c-myc(He et al.,1998、Science,281:1509-12)、細(xì)胞周期素D1(Tetsu et al.,1999,Nature,398:422-6)和/或纖維粘連蛋白(Gradl et al.1999,Mol.Cell Biol.,19:5576-87)。在某些實(shí)施方案中，結(jié)合劑對(duì)β-鏈蛋白信號(hào)傳導(dǎo)的影響亦可能通過測量該劑對(duì)Dishevelled-1、Dishevelled-2、Dishevelled-3、LRP5、LRP6和/或β-鏈蛋白的磷酸化狀態(tài)的影響檢測。

在某些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑具有一或多種下列影響：抑制腫瘤細(xì)胞增生、抑制腫瘤生長、減小腫瘤尺寸、誘導(dǎo)腫瘤消退、減少癌干細(xì)胞于腫瘤中的頻率、減少腫瘤的腫瘤發(fā)生性、通過減少癌干細(xì)胞于腫瘤中的頻率以減少腫瘤的腫瘤發(fā)生性、刺激腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞死亡、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞裂解、誘導(dǎo)腫瘤中的細(xì)胞分化、使致癌細(xì)胞分化成非致癌狀態(tài)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化標(biāo)志的表達(dá)、防止腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、或減少腫瘤細(xì)胞的存活。

在某些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑可抑制腫瘤生長。在某些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑可抑制活體內(nèi)(例如異種移植小鼠模型和/或于罹患癌的人內(nèi))的腫瘤生長。在一些實(shí)施方案中，該腫瘤是選自結(jié)直腸腫瘤、結(jié)腸腫瘤、胰腫瘤、肺腫瘤、卵巢腫瘤、肝腫瘤、乳房腫瘤、腎腫瘤、前列腺腫瘤、胃腸道腫瘤、黑色素瘤、子宮頸腫瘤、膀胱腫瘤、神經(jīng)膠母細(xì)胞瘤或頭頸腫瘤中的腫瘤。在某些實(shí)施方案中，該腫瘤是乳房腫瘤。在某些實(shí)施方案中，該腫瘤是卵巢腫瘤。在某些實(shí)施方案中，該腫瘤是肺腫瘤。在某些實(shí)施方案中，該腫瘤是胰腫瘤。在某些實(shí)施方案中，該腫瘤是Wnt依賴性腫瘤。

在某些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑可減少腫瘤的腫瘤發(fā)生性。在某些實(shí)施方案中，Wnt途徑抑制劑可于動(dòng)物模型諸如小鼠異種移植模型中減少包含癌干細(xì)胞的腫瘤的腫瘤發(fā)生性。在某些實(shí)施方案中，腫瘤中癌干細(xì)胞的數(shù)量或頻率是減少至少約1/2、約2/3、約3/4、約9/10、約49/50、約99/100、或約999/1000。在某些實(shí)施方案中，癌干細(xì)胞的數(shù)量或頻率減少是通過使用動(dòng)物模型的限制稀釋試驗(yàn)測定。有關(guān)使用限制稀釋試驗(yàn)以測定腫瘤中癌干細(xì)胞的數(shù)量或頻率的減少的其他實(shí)例及指南可見例如國際公開號(hào)WO 2008/042236、及美國專利公開No.2008/0064049及No.2008/0178305。

在某些實(shí)施方案中，本文描述的Wnt途徑抑制劑于活體內(nèi)具有至少1小時(shí)、至少約2小時(shí)、至少約5小時(shí)、至少約10小時(shí)、至少約24小時(shí)、至少約2天、至少約3天、至少約1周、或至少約2周的活性。在某些實(shí)施方案中，該Wnt途徑抑制劑是IgG(例如IgG1或IgG2)抗體，其于活體內(nèi)具有至少1小時(shí)、至少約2小時(shí)、至少約5小時(shí)、至少約10小時(shí)、至少約24小時(shí)、至少約2天、至少約3天、至少約1周、或至少約2周的活性。在某些實(shí)施方案中，該Wnt途徑抑制劑是融合蛋白，其于活體內(nèi)具有至少1小時(shí)、至少約2小時(shí)、至少約5小時(shí)、至少約10小時(shí)、至少約24小時(shí)、至少約2天、至少約3天、至少約1周、或至少約2周的活性。

在某些實(shí)施方案中，本文描述的Wnt途徑抑制劑于小鼠、長尾獼猴(cynomolgus monkey)或人體內(nèi)具有至少約5小時(shí)、至少約10小時(shí)、至少約24小時(shí)、至少約2天、至少約3天、至少約1周、或至少約2周的循環(huán)半衰期。在某些實(shí)施方案中，該Wnt途徑抑制劑是于小鼠、長尾獼猴或人體內(nèi)具有至少約5小時(shí)、至少約10小時(shí)、至少約24小時(shí)、至少約2天、至少約3天、至少約1周、或至少約2周的循環(huán)半衰期的IgG(例如IgG1或IgG2)抗體。在某些實(shí)施方案中，該Wnt途徑抑制劑是融合蛋白，其于小鼠、長尾獼猴(cynomolgus monkey)或人體內(nèi)具有至少約5小時(shí)、至少約10小時(shí)、至少約24小時(shí)、至少約2天、至少約3天、至少約1周、或至少約2周的循環(huán)半衰期。增加(或減少)劑諸如多肽及抗體的半衰期的方法是該領(lǐng)域所公知的。例如，增加IgG抗體循環(huán)半衰期的已知方法包括導(dǎo)入突變至Fc區(qū)，從而增加抗體對(duì)新生兒Fc受體(FcRn)的pH依賴性結(jié)合。增加缺乏Fc區(qū)的抗體片段的循環(huán)半衰期的已知方法包括例如PEG化之類的技術(shù)。

IV.有絲分裂抑制劑

本文所述的方法包含Wnt途徑抑制劑與有絲分裂抑制劑一起用于組合治療來抑制腫瘤生長、減小腫瘤尺寸和/或用于治療癌癥。有絲分裂抑制劑或抗有絲分裂劑包括但不限于微管結(jié)合劑、微管酶抑制劑、有絲分裂檢查點(diǎn)激酶(CHK)抑制劑和有絲分裂酶抑制劑。微管結(jié)合劑包括但不限于紫杉烷(taxanes)、紫杉烷類(taxoids)、長春花生物堿(vinca alkaloids)、生物堿，埃坡霉素(epothilones)和軟海綿素(halichondrins)。

在一些實(shí)施方案中，有絲分裂抑制劑選自紫杉烷，長春花生物堿，埃坡霉素或軟海綿素。在一些實(shí)施方案中，有絲分裂抑制劑是紫杉烷。紫杉烷通過抑制微管解聚(即穩(wěn)定微管聚合物)來誘導(dǎo)有絲分裂細(xì)胞周期阻斷。有絲分裂細(xì)胞周期阻斷導(dǎo)致有絲分裂停滯和細(xì)胞凋亡。在一些實(shí)施方案中，紫杉烷選自：紫杉醇(TAXOL)、白蛋白結(jié)合型紫杉醇(ABRAXANE)、多西紫杉醇(TAXOTERE)、卡巴他賽(JEVTANA)、替司他賽(tesetaxel)、拉羅他賽(larotaxel)、或奧他賽(ortataxel)、DHA-紫杉醇、PG-紫杉醇、其藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。在一些實(shí)施方案中，有絲分裂抑制劑是長春花生物堿。在一些實(shí)施方案中，長春花生物堿選自長春堿(VELBAN)、長春新堿(MARQIBO)、長春瑞濱(NAVELBINE)、長春蔓佛明(vincadifformine)、長春地辛(vindesine)、長春氟寧(vinflunine)、小長春蔓辛(minovincine)、及其藥學(xué)上可接受的鹽、酸或衍生物。在一些實(shí)施方案中，有絲分裂抑制劑是生物堿，例如新膠質(zhì)(neoxaline)。在一些實(shí)施方案中，有絲分裂抑制劑是埃坡霉素。在一些實(shí)施方案中，埃坡霉素是伊沙匹隆(IXEMPRA)。在一些實(shí)施方案中，有絲分裂抑制劑是軟骨素B。在一些實(shí)施方案中，軟海綿素是類似物艾日布林甲磺酸鹽(HALAVEN)。在一些實(shí)施方案中，有絲分裂抑制劑是微管酶抑制劑。在一些實(shí)施方案中，微管酶抑制劑選自ARQ 621、EMD534085和LY2523355。在一些實(shí)施方案中，有絲分裂抑制劑是有絲分裂檢查點(diǎn)激酶抑制劑。在一些實(shí)施方案中，有絲分裂檢查點(diǎn)激酶抑制劑是LY2603618。在一些實(shí)施方案中，有絲分裂抑制劑是有絲分裂酶抑制劑。在一些實(shí)施方案中，有絲分裂酶抑制劑是Aurora A或PLK1的抑制劑。在一些實(shí)施方案中，有絲分裂酶抑制劑選自MLN8237、ENMD-0276、AZD1152、GSK1070916A、PHA-739358、SNS-314、CYC116、PF-03814735、AT9238、AS703569和BI 6727。

實(shí)施例

實(shí)施例1

FZD8-Fc可溶性受體OMP-54F28與化療劑在體內(nèi)的組合的活性

本文所述的OncoMed異種移植物模型在OncoMed Pharmaceuticals由最低限度傳代的患者衍生的腫瘤標(biāo)本建立。腫瘤樣本由病理學(xué)家檢查并分類為特定腫瘤類型。OncoMed依賴這些分類，除非對(duì)任何特定腫瘤進(jìn)行進(jìn)一步分析，并且認(rèn)為需要重新分類。

將異種移植OMP-OV19卵巢腫瘤細(xì)胞(1×10⁵個(gè)細(xì)胞)的單細(xì)胞懸浮液皮下注射到6-8周齡的NOD/SCID小鼠中。使腫瘤生長28天，直到它們達(dá)到120mm³的平均體積。將小鼠隨機(jī)分組(每組n＝9)，并用紫杉醇、白蛋白結(jié)合型紫杉醇、卡鉑、卡鉑和紫杉醇的組合、OMP-54F28和紫杉醇的組合、OMP-54F28和白蛋白結(jié)合型紫杉醇的組合、OMP-54F28和卡鉑的組合、OMP-54F28與卡鉑以及紫杉醇的組合或?qū)φ湛贵w治療小鼠。每三周用對(duì)照抗體或劑量為45mg/kg的OMP-54F28，劑量為10mg/kg的紫杉醇，劑量為7.5mg/kg的劑量的白蛋白結(jié)合型紫杉醇，劑量為30mg/kg的卡鉑，或劑量為15mg/kg的卡鉑與劑量為5mg/kg的白蛋白結(jié)合型紫杉醇的組合治療小鼠一次。所有藥物經(jīng)腹膜內(nèi)施用。監(jiān)測腫瘤生長，并在指定的時(shí)間點(diǎn)用電子測徑器測量腫瘤體積。數(shù)據(jù)表示為平均值±S.E.M。

如圖1所示，相比于單獨(dú)的化療劑，OMP-54F28與每種化療劑的組合在更大程度上降低卵巢腫瘤OMP-OV19的生長。令人驚奇的是，與OMP-54F28和卡鉑的組合或單獨(dú)的卡鉑(圖1D)相比，OMP-54F28和紫杉烷化學(xué)治療劑(紫杉醇(圖1A)、白蛋白結(jié)合型紫杉醇(圖1B)或紫杉醇和卡鉑(圖1C))的組合顯示出較大的抑制性。在其他腫瘤類型中已獲得了類似的結(jié)果。

這些結(jié)果支持以下假說：Wnt途徑抑制劑(例如OMP-54F28和OMP-18R5)與紫杉烷的組合相比于其與其他類化療劑的組合具有更大活性和/或更有效。

這些結(jié)果的可能解釋集中在Wnt和各種類型的化療劑對(duì)細(xì)胞周期抑制的不同機(jī)理上。已經(jīng)顯示W(wǎng)nt信號(hào)傳導(dǎo)在細(xì)胞周期的G2/M期達(dá)到峰值，并在調(diào)節(jié)有絲分裂細(xì)胞分裂中發(fā)揮重要作用(Niehrs and Acebron,2012,EMBO J,31:2705-2713)。已經(jīng)確定的是，用紫杉烷治療通過對(duì)微管穩(wěn)定的影響而在有絲分裂時(shí)阻斷細(xì)胞分裂。相比之下，其他化療劑(例如鉑化合物，如卡鉑，或核苷類似物，如吉西他濱)在G1/S期抑制DNA合成并阻斷細(xì)胞周期。因此，紫杉烷和Wnt途徑抑制劑可以一同起作用以在細(xì)胞周期的有絲分裂期期間協(xié)同地抑制或阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程，從而導(dǎo)致有絲分裂的破壞和腫瘤細(xì)胞死亡。

實(shí)施例2

交錯(cuò)給藥方案對(duì)于抗FZD抗體OMP-18R5與紫杉醇的組合的活性的影響

將異種移植UM-PE13乳腺腫瘤細(xì)胞(20,000個(gè)細(xì)胞)的單細(xì)胞懸浮液皮下注射到6-8周齡的NOD/SCID小鼠中。UM-PE13是一種三陰性乳腺癌。使腫瘤生長34天，直到它們達(dá)到平均80mm³的體積。將小鼠隨機(jī)分組(每組n＝8)，并用紫杉醇，在同一天施用的OMP-18R5和紫杉醇的組合，OMP-18R5和紫杉醇的組合(其中紫杉醇在施用OMP-18R5之前3天施用)，OMP-18R5和紫杉醇的組合(其中OMP-18R5在施用紫杉醇之前3天施用)，或?qū)φ湛贵w治療小鼠。用劑量為25mg/kg的OMP-18R5和劑量為20mg/kg的紫杉醇每三周治療小鼠一次。經(jīng)腹膜內(nèi)施用OMP-18R5和紫杉醇。監(jiān)測腫瘤生長，并在指定的時(shí)間點(diǎn)用電子測徑器測量腫瘤體積。數(shù)據(jù)表示為平均值±S.E.M。

如圖2所示，OMP-18R5和紫杉醇的交錯(cuò)施用(其中在施用紫杉醇之前施用OMP-18R5)在抑制UM-PE13乳腺腫瘤細(xì)胞的腫瘤生長方面顯著優(yōu)于任何其他施用方案。重要的是，當(dāng)在施用紫杉烷之前2天施用Wnt途徑抑制劑時(shí)，若干個(gè)體小鼠中的腫瘤消退到不可檢測的水平。

這些研究表明，給藥的順序和時(shí)間對(duì)腫瘤生長抑制和/或消退的程度具有顯著影響，特別是在Wnt途徑抑制劑和紫杉烷兩者都間歇地給藥的情況下。

實(shí)施例3

交錯(cuò)給藥方案對(duì)于FZD8-Fc可溶性受體OMP-54F28與紫杉醇的組合的活性的影響

將異種移植OMP-OV38卵巢腫瘤細(xì)胞(1×10⁵個(gè)細(xì)胞)的單細(xì)胞懸浮液皮下注射到6-8周齡的NOD/SCID小鼠中。使腫瘤生長38天，直到它們達(dá)到140mm³的平均體積。將小鼠隨機(jī)分組(每組n＝9)，并用紫杉醇、同一天施用的OMP-54F28和紫杉醇的組合、OMP-54F28和紫杉醇的組合(其中紫杉醇在施用OMP-54F28之前2天施用)、OMP-54F28和紫杉醇的組合(其中在施用紫杉醇之前2天施用OMP-54F28)或?qū)φ湛贵w治療小鼠。用劑量為25mg/kg的OMP-54F28和劑量為20mg/kg的紫杉醇每兩周治療小鼠一次。經(jīng)腹膜內(nèi)施用OMP-54F28和紫杉醇。監(jiān)測腫瘤生長，并在指定的時(shí)間點(diǎn)用電子測徑器測量腫瘤體積。數(shù)據(jù)表示為平均值±S.E.M。

如圖3A所示，OMP-54F28和紫杉醇的交錯(cuò)施用(其中在施用紫杉醇之前施用OMP-54F28)在抑制OMP-OV38卵巢腫瘤細(xì)胞的腫瘤生長方面比任何其他給藥方案顯著更好。如圖3B所示，在使用OMP-OV22卵巢腫瘤細(xì)胞的第二異種移植模型中觀察到類似的結(jié)果。

進(jìn)行另外的研究以確定最佳交錯(cuò)給藥方案。在施用紫杉醇之前1天，在施用紫杉醇之前2天或在施用紫杉醇之前4天，向患OV38腫瘤小鼠施用OMP-54F28。如圖3C所示，在施用紫杉醇前一天或兩天施用OMP-54F28導(dǎo)致最大量的腫瘤生長抑制，其中在施用紫杉醇前兩天施用OMP-54F28是這些研究中的最佳施用方案。

通過組織學(xué)分析經(jīng)治療的OMP-OV38腫瘤。分析顯示，在紫杉醇之前使用Wnt途徑抑制劑的交錯(cuò)給藥計(jì)劃對(duì)腫瘤的組織學(xué)產(chǎn)生顯著的影響。用這種方案治療的腫瘤包含許多細(xì)胞，具有有絲分裂破壞的證據(jù)，包括多核細(xì)胞、具有巨核的擴(kuò)大細(xì)胞、固縮和表觀細(xì)胞死亡。相比之下，單獨(dú)用紫杉醇，用Wnt途徑抑制劑和紫杉醇(當(dāng)Wnt途徑抑制劑和紫杉醇同時(shí)施用時(shí))，或用Wnt途徑抑制劑和紫杉醇(當(dāng)在施用Wnt途徑抑制劑之前施用紫杉醇時(shí))治療的腫瘤細(xì)胞沒有顯示這些影響(數(shù)據(jù)未示出)。這些結(jié)果支持以下假設(shè)：Wnt途徑抑制劑(例如OMP-18R5或OMP-54F28)的在先給藥導(dǎo)致在有絲分裂的G2/M期阻斷有絲分裂Wnt信號(hào)傳導(dǎo)，并且該活性與由紫杉烷治療引起的有絲分裂抑制協(xié)同作用，從而促進(jìn)腫瘤中的細(xì)胞死亡。

這些異種移植結(jié)果表明，臨床上的最佳組合活性可以通過在施用含紫杉烷的化療方案之前(例如2天前)施用Wnt途徑抑制劑來實(shí)現(xiàn)。這種安排對(duì)于其中紫杉烷以三周計(jì)劃給藥的方案可能是特別重要的。

實(shí)施例4

凡地吐單抗(OMP-18R5)與多西紫杉醇的組合用于非小細(xì)胞肺癌患者中1b期研究

該研究是在患有先前經(jīng)治療的復(fù)發(fā)性或晚期非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的患者中凡地吐單抗與多西紫杉醇的組合的公開標(biāo)簽1b期劑量遞增研究。該研究的主要目的是確定凡地吐單抗與多西紫杉醇的組合的安全性和最大耐受劑量。確定凡地吐單抗與多西紫杉醇組合的推薦的2期劑量。次要目的是表征凡地吐單抗在與多西紫杉醇組合施用時(shí)的藥代動(dòng)力學(xué)(PK)，以表征凡地吐單抗的免疫原性，并且對(duì)凡地吐單抗在與多西紫杉醇組合施用時(shí)的功效進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。

在每個(gè)21天的周期的第1天施用凡地吐單抗。群組1和群組2的凡地吐單抗的劑量水平分別為5mg/kg和10mg/kg。對(duì)于群組1和群組2，在每個(gè)周期的第1天靜脈內(nèi)施用多西紫杉醇(75mg/m²)。由于在1期程序中觀察到脆性骨折，因而對(duì)于群組1和2中的所有患者停止用凡地吐單抗。群組3和4的患者將分別以2mg/kg和4mg/kg每3周施用凡地吐單抗一次。在劑量群組中不允許凡地吐單抗的劑量增加。交錯(cuò)給藥方案將在群組3和群組4中評(píng)價(jià)。在每個(gè)周期的第3天靜脈內(nèi)施用多西紫杉醇(75mg/m²)。

實(shí)施例5

艾非納西肽(OMP-54F28)與紫杉醇以及卡鉑的組合用于卵巢癌患者的1b期研究

該研究是艾非納西肽與紫杉醇以及卡鉑的組合用于復(fù)發(fā)性鉑敏感性卵巢癌患者中的公開標(biāo)簽1b期劑量遞增研究。該研究的主要目的是確定艾非納西肽與紫杉醇以及卡鉑的組合的安全性和最大耐受劑量。確定艾非納西肽與紫杉醇以及卡鉑的組合的推薦的2期劑量。次要目的是表征艾非納西肽在與紫杉醇以及卡鉑組合施用時(shí)的藥代動(dòng)力學(xué)(PK)，以表征艾非納西肽在與紫杉醇以及卡鉑組合施用時(shí)的免疫原性，以及對(duì)艾非納西肽在與紫杉醇以及卡鉑組合施用時(shí)的功效進(jìn)行初步評(píng)估。

在每個(gè)21天的周期的第1天施用艾非納西肽。群組1和2的艾非納西肽的劑量水平分別為5mg/kg和10mg/kg。對(duì)于群組1和群組2，在每個(gè)周期的第1天靜脈內(nèi)施用紫杉醇(175mg/m²)和卡鉑(AUC＝5mg/ml·min)。由于在1期程序中觀察到脆性骨折，因此對(duì)群組1和2中的所有患者停用艾非納西肽。群組3和群組4的患者將分別以2mg/kg和4mg/kg每3周施用一次。在劑量群組中將不允許艾非納西肽的劑量增加。交錯(cuò)給藥方案將在群組3和群組4中評(píng)估。將在每個(gè)周期的第3天靜脈內(nèi)施用紫杉醇(175mg/m²)和卡鉑(AUC＝5mg/ml·min)。

實(shí)施例6

交錯(cuò)給藥方案對(duì)于抗FZD抗體OMP-18R5與紫杉醇的組合在肺腫瘤異種移植模型中的活性的影響

OMP-LU77是患者衍生的非小細(xì)胞肺(NSCLC)腫瘤。將異種移植OMP-LU77肺腫瘤細(xì)胞(50,000個(gè)細(xì)胞)的單細(xì)胞懸浮液皮下注射到NOD/SCID小鼠中。使腫瘤生長37天，直到它們達(dá)到平均約200mm³的體積。將攜帶腫瘤的小鼠隨機(jī)分成4組(每組n＝8-9)。攜帶腫瘤的小鼠用單獨(dú)的紫杉醇、在同一天施用的凡地吐單抗(OMP-18R5)和紫杉醇的組合，凡地吐單抗和紫杉醇的組合(其中該抗體在施用紫杉醇之前兩天施用)或?qū)φ湛贵w治療?？贵w以25mg/kg給藥，每隔一周施用一次。紫杉醇以15mg/kg給藥，也是每隔一周施用一次。監(jiān)測腫瘤生長并在治療后指定的天數(shù)測量腫瘤體積。數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。

如圖4所示，交錯(cuò)施用凡地吐單抗和紫杉醇(在施用紫杉醇之前施用凡地吐單抗)在抑制OMP-LU77肺腫瘤細(xì)胞的腫瘤生長方面顯著優(yōu)于任何其他的給藥方案。

實(shí)施例7

OMP-18R5和紫杉醇的組合治療對(duì)OMP-LU77肺腫瘤中的癌干細(xì)胞的影響

限制性稀釋測定(LDAs)可用于評(píng)估Wnt途徑抑制劑對(duì)實(shí)體腫瘤癌癥干細(xì)胞的影響和/或?qū)δ[瘤的致瘤性的影響。所述測定可用于確定來自用Wnt途徑抑制劑治療過的動(dòng)物的腫瘤中的癌干細(xì)胞的頻率，并將該頻率與來自對(duì)照動(dòng)物的腫瘤中的癌干細(xì)胞的頻率進(jìn)行比較。

在研究結(jié)束時(shí)收獲來自上述OMP-LU77異種移植物模型的對(duì)照和處理的腫瘤(實(shí)施例6)。將腫瘤加工并解離成單個(gè)細(xì)胞。將腫瘤細(xì)胞用生物素化的小鼠抗體(抗小鼠CD45-生物素和大鼠抗小鼠H2Kd-生物素，BioLegend，San Diego，CA)在冰上孵育30分鐘，隨后加入鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠(Invitrogen，Carlsbad，CA)以在磁體的幫助下除去小鼠細(xì)胞。

對(duì)于LDA，收獲懸浮液中的腫瘤細(xì)胞，計(jì)數(shù)，并將合適的細(xì)胞劑量(50、150和500個(gè)細(xì)胞)皮下注射到NOD/SCID小鼠中(每個(gè)治療組每個(gè)細(xì)胞劑量10只小鼠)。允許腫瘤生長79天，如圖5A所示。圖5A中的每個(gè)符號(hào)表示單個(gè)小鼠的腫瘤體積。在所有治療組中測定具有可檢測腫瘤的小鼠的百分比，并與對(duì)照中具有可檢測腫瘤的小鼠的百分比進(jìn)行比較。使用L-CalcTM軟件，利用腫瘤生長頻率計(jì)算癌癥干細(xì)胞頻率。每個(gè)治療組的計(jì)算得到的癌癥干細(xì)胞頻率顯示在圖5B中。凡地吐單抗(OMP-18R5)和紫杉醇的交錯(cuò)施用(其中在施用紫杉醇之前施用凡地吐單抗)顯著降低癌癥干細(xì)胞頻率。

實(shí)施例8

交錯(cuò)給藥方案對(duì)于OMP-54F28與紫杉醇的組合的活性的影響

將異種移植OMP-OV19卵巢腫瘤細(xì)胞的單細(xì)胞懸浮液皮下注射到6-8周齡的NOD/SCID小鼠中。使腫瘤生長直到它們達(dá)到平均120mm³的體積。將小鼠隨機(jī)分布(每組n＝8-10)，并用紫杉醇，同一天施用的OMP-54F28和紫杉醇的組合，OMP-54F28和紫杉醇的組合(其中在施用紫杉醇之前2天施用OMP-54F28)，或?qū)φ湛贵w治療。小鼠每兩周用20mg/kg的劑量的OMP-54F28和20mg/kg的劑量的紫杉醇治療一次。OMP-54F28和紫杉醇經(jīng)腹膜內(nèi)施用。監(jiān)測腫瘤生長，并在指定的時(shí)間點(diǎn)用電子測徑器測量腫瘤體積。數(shù)據(jù)表示為平均值±S.E.M。

如圖6所示，交錯(cuò)施用OMP-54F28和紫杉醇的組合(其中在施用紫杉醇之前2天施用OMP-54F28)在抑制OMP-OV19卵巢腫瘤細(xì)胞的腫瘤生長方面顯著優(yōu)于任何其他給藥方案。如圖6所示，不僅腫瘤生長受到抑制，而且OMP-54F28和紫杉醇的交錯(cuò)治療誘導(dǎo)已形成的卵巢腫瘤消退。令人驚訝的是，這種腫瘤生長抑制/消退維持超過170天。

實(shí)施例9

在乳腺癌異種移植模型中Wnt抑制劑與紫杉醇的組合的交錯(cuò)給藥方案

將異種移植OMP-B90乳房腫瘤細(xì)胞的單細(xì)胞懸浮液皮下注射到6-8周齡的NOD/SCID小鼠中。使腫瘤生長直到它們達(dá)到平均約137mm³的體積。將小鼠隨機(jī)分組(每組n＝9)，并用紫杉醇，同一天施用的OMP-18R5和紫杉醇的組合，OMP-18R5和紫杉醇的組合(其中在施用紫杉醇之前2天施用OMP-18R5)，OMP-54F28，同一天施用的OMP-54F28和紫杉醇的組合，OMP-54F28和紫杉醇的組合(其中在施用紫杉醇之前2天施用OMP-54F28)，或?qū)φ湛贵w治療。小鼠用OMP-18R5、OMP-54F28或?qū)φ湛贵w以25mg/kg的劑量每兩周治療一次，并用紫杉醇以10mg/kg的劑量每周治療一次。經(jīng)腹膜內(nèi)施用抗體和紫杉醇。監(jiān)測腫瘤生長，并在指定的時(shí)間點(diǎn)用電子測徑器測量腫瘤體積。數(shù)據(jù)表示為平均值±S.E.M。

如圖7所示，Wnt途徑抑制劑OMP-18R5和OMP-54F28與紫杉醇的交錯(cuò)施用(其中Wnt途徑抑制劑在施用紫杉醇之前2天施用)在抑制OMP-B90乳腺腫瘤細(xì)胞的腫瘤生長方面顯著好于任何其他給藥方案。不僅腫瘤生長受到抑制，而且Wnt途徑抑制劑和紫杉醇的交錯(cuò)治療誘導(dǎo)已形成的乳腺腫瘤消退。

實(shí)施例10

在結(jié)腸癌異種移植模型中使用Wnt抑制劑與紫杉醇的組合的交錯(cuò)給藥方案

將異種移植OMP-C28結(jié)腸腫瘤細(xì)胞的單細(xì)胞懸浮液皮下注射到6-8周齡的NOD/SCID小鼠中。使腫瘤生長直到它們達(dá)到平均約89mm³的體積。將小鼠隨機(jī)分組(每組n＝9)，并用白蛋白結(jié)合型紫杉醇、OMP-18R5、OMP-54F28、OMP-18R5和白蛋白結(jié)合型紫杉醇的組合(其中在施用白蛋白結(jié)合型紫杉醇之前2天施用OMP-18R5)、OMP-54F28和白蛋白結(jié)合型紫杉醇的組合(其中在施用白蛋白結(jié)合型紫杉醇之前2天施用OMP-54F28)、或?qū)φ者M(jìn)行治療。小鼠每2周用OMP-18R5、OMP-54F28或?qū)φ找?5mg/kg的劑量治療一次，并用白蛋白結(jié)合型紫杉醇以15mg/kg的劑量每周治療一次?？贵w和白蛋白結(jié)合型紫杉醇經(jīng)腹膜內(nèi)施用。監(jiān)測腫瘤生長，并在指定的時(shí)間點(diǎn)用電子測徑器測量腫瘤體積。數(shù)據(jù)表示為平均值±S.E.M。

如圖8所示，Wnt途徑抑制劑OMP-18R5(圖8A)和OMP-54F28(圖8B)以及白蛋白結(jié)合型紫杉醇的交錯(cuò)施用(其中Wnt途徑抑制劑在施用紫杉醇前2天施用)相比于單獨(dú)用Wnt途徑抑制劑或單獨(dú)用白蛋白結(jié)合型紫杉醇在更大程度上抑制OMP-C28結(jié)腸腫瘤細(xì)胞的腫瘤生長。

實(shí)施例11

在結(jié)腸癌異種移植模型中使用Wnt抑制劑與紫杉醇的組合的交錯(cuò)給藥方案

將異種移植OMP-OV40卵巢腫瘤細(xì)胞的單細(xì)胞懸浮液皮下注射到6-8周齡的NOD/SCID小鼠中。使腫瘤生長直到它們達(dá)到平均約128mm³的體積。將小鼠隨機(jī)分組(每組n＝8)，并用紫杉醇、OMP-18R5、OMP-54F28、OMP-18R5和白蛋白結(jié)合型紫杉醇的組合(其中在施用白蛋白結(jié)合型紫杉醇之前2天施用OMP-18R5)、OMP-54F28和白蛋白結(jié)合型紫杉醇的組合(其中在施用白蛋白結(jié)合型紫杉醇之前2天施用OMP-54F28)、或?qū)φ湛贵w治療。小鼠每2周用OMP-18R5、OMP-54F28或?qū)φ找?5mg/kg的劑量治療一次，并用紫杉醇以20mg/kg的劑量每兩周治療一次。經(jīng)腹膜內(nèi)施用抗體和紫杉醇。監(jiān)測腫瘤生長，并在指定的時(shí)間點(diǎn)用電子測徑器測量腫瘤體積。數(shù)據(jù)表示為平均值±S.E.M。

如圖9所示，Wnt途徑抑制劑OMP-18R5(圖9A)和OMP-54F28(圖9B)以及紫杉醇的交錯(cuò)施用(其中Wnt途徑抑制劑在施用紫杉醇之前2天施用)相比于單獨(dú)施用Wnt途徑抑制劑或單獨(dú)施用紫杉醇在更大程度上抑制OMP-OV40卵巢腫瘤細(xì)胞的腫瘤生長。

這些結(jié)果表明，抗FZD抗體OMP-18R5與紫杉醇的組合以及可溶性受體OMP-54F28與紫杉醇的組合抑制卵巢腫瘤的腫瘤生長。

應(yīng)理解此處所描述的實(shí)施例及實(shí)施方案僅用于說明的目的，各種對(duì)其進(jìn)行的修飾或改變將被呈現(xiàn)給本領(lǐng)域技術(shù)人員且將被納入本申請(qǐng)的精神與范圍內(nèi)。

本文所引述的所有公開文獻(xiàn)、專利、專利申請(qǐng)、互聯(lián)網(wǎng)網(wǎng)站、和登錄號(hào)/包括多核苷酸和多肽序列的數(shù)據(jù)庫序列通過引用基于所有目的完整并入本文，如同每個(gè)公開文獻(xiàn)、專利、專利申請(qǐng)、互聯(lián)網(wǎng)網(wǎng)站、和登錄號(hào)/數(shù)據(jù)庫序列是特別且單獨(dú)地被表明這樣通過引用并入。

本申請(qǐng)中公開的的序列如下：

SEQ ID NO:1含加下劃線的預(yù)測信號(hào)序列的18R5重鏈氨基酸序列

MKHLWFFLLLVAAPRWVLSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYTLSWVRQAPGKGLEWVSVISGDGSYTYYADSVKGRFTISSDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNFIKYVFANWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:2含加下劃線的預(yù)測信號(hào)序列的18R5輕鏈氨基酸序列

MAWALLLLTLLTQGTGSWADIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDNIGSFYVHWYQQKPGQAPVLVIYDKSNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQSYANTLSLVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS

SEQ ID NO:3不含預(yù)測信號(hào)序列的18R5重鏈氨基酸序列

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYTLSWVRQAPGKGLEWVSVISGDGSYTYYADSVKGRFTISSDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNFIKYVFANWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:4不含預(yù)測信號(hào)序列的18R5輕鏈氨基酸序列

DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDNIGSFYVHWYQQKPGQAPVLVIYDKSNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQSYANTLSLVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS

SEQ ID NO:5 18R5重鏈可變區(qū)氨基酸序列

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYTLSWVRQAPGKGLEWVSVISGDGSYTYYADSVKGRFTISSDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNFIKYVFANWGQGTLVTVSSSEQ ID NO:6 18R5輕鏈可變區(qū)氨基酸序列

DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDNIGSFYVHWYQQKPGQAPVLVIYDKSNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQSYANTLSLVFGGGTKLTVLG

SEQ ID NO:7 18R5重鏈CDR1

GFTFSHYTLS

SEQ ID NO:8 18R5重鏈CDR2

VISGDGSYTYYADSVKG

SEQ ID NO:9 18R5重鏈CDR3

NFIKYVFAN

SEQ ID NO:10 18R5輕鏈CDR1

SGDNIGSFYVH

SEQ ID NO:11 18R5輕鏈CDR2

DKSNRPSG

SEQ ID NO:12 18R5輕鏈CDR3

QSYANTLSL

SEQ ID NO:13不含預(yù)測信號(hào)序列的人FZD1Fri結(jié)構(gòu)域氨基酸序列

QQPPPPPQQQQSGQQYNGERGISVPDHGYCQPISIPLCTDIAYNQTIMPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSAELKFFLCSMYAPVCTVLEQALPPCRSLCERARQGCEALMNKFGFQWPDTLKCEKFPVHGAGELCVGQNTSDKGT

SEQ ID NO:14不含預(yù)測信號(hào)序列的人FZD2Fri結(jié)構(gòu)域氨基酸序列

QFHGEKGISIPDHGFCQPISIPLCTDIAYNQTIMPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLEQAIPPCRSICERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCEHFPRHGAEQICVGQNHSEDG

SEQ ID NO:15不含預(yù)測信號(hào)序列的人FZD3Fri結(jié)構(gòu)域氨基酸序列

HSLFSCEPITLRMCQDLPYNTTFMPNLLNHYDQQTAALAMEPFHPMVNLDCSRDF

RPFLCALYAPICMEYGRVTLPCRRLCQRAYSECSKLMEMFGVPWPEDMECSRFPDCDEPYPRLVDL

SEQ ID NO:16不含預(yù)測信號(hào)序列的人FZD4Fri結(jié)構(gòu)域氨基酸序列

FGDEEERRCDPIRISMCQNLGYNVTKMPNLVGHELQTDAELQLTTFTPLIQYGCSSQLQFFLCSVYVPMCTEKINIPIGPCGGMCLSVKRRCEPVLKEFGFAWPESLNCSKFPPQNDHNHMCMEGPGDEEV

SEQ ID NO:17不含預(yù)測信號(hào)序列的人FZD5Fri結(jié)構(gòu)域氨基酸序列

ASKAPVCQEITVPMCRGIGYNLTHMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLRFFLCSMYTPICLPDYHKPLPPCRSVCERAKAGCSPLMRQYGFAWPERMSCDRLPVLGRDAEVLCMDYNRSEATT

SEQ ID NO:18不含預(yù)測信號(hào)序列的人FZD6Fri結(jié)構(gòu)域氨基酸序列

HSLFTCEPITVPRCMKMAYNMTFFPNLMGHYDQSIAAVEMEHFLPLANLECSPNIETFLCKAFVPTCIEQIHVVPPCRKLCEKVYSDCKKLIDTFGIRWPEELECDRLQYCDETVPVTFDPHTEFLG

SEQ ID NO:19不含預(yù)測信號(hào)序列的人FZD7Fri結(jié)構(gòu)域氨基酸序列

QPYHGEKGISVPDHGFCQPISIPLCTDIAYNQTILPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLDQAIPPCRSLCERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCENFPVHGAGEICVGQNTSDGSG

SEQ ID NO:20不含預(yù)測信號(hào)序列的人FZD8Fri結(jié)構(gòu)域氨基酸序列

ASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFFLCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTLCMDYNRTDLTT

SEQ ID NO:21不含預(yù)測信號(hào)序列的人FZD8Fri結(jié)構(gòu)域氨基酸序列

ASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFFLCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTLCMDYNRTDL

SEQ ID NO:22不含預(yù)測信號(hào)序列的人FZD9Fri結(jié)構(gòu)域氨基酸序列

LEIGRFDPERGRGAAPCQAVEIPMCRGIGYNLTRMPNLLGHTSQGEAAAELAEFAPLVQYGCHSHLRFFLCSLYAPMCTDQVSTPIPACRPMCEQARLRCAPIMEQFNFGWPDSLDCARLPTRNDPHALCMEAPENA

SEQ ID NO:23不含預(yù)測信號(hào)序列的人FZD10Fri結(jié)構(gòu)域氨基酸序列

ISSMDMERPGDGKCQPIEIPMCKDIGYNMTRMPNLMGHENQREAAIQLHEFAPLVEYGCHGHLRFFLCSLYAPMCTEQVSTPIPACRVMCEQARLKCSPIMEQFNFKWPDSLDCRKLPNKNDPNYLCMEAPNNG

SEQ ID NO:24人IgG₁ Fc區(qū)

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:25人IgG₁ Fc區(qū)

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:26人IgG₁ Fc區(qū)

KSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:27人IgG₁ Fc區(qū)

EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:28人IgG₂ Fc區(qū)

CVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:29FZD8-Fc 54F28氨基酸序列(不含預(yù)測信號(hào)序列)

ASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFFLCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTLCMDYNRTDLTTEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:30含具有下劃線的預(yù)測信號(hào)序列的FZD8-Fc 54F28

MEWGYLLEVTSLLAALLLLQRSPFVHAASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFFLCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTLCMDYNRTDLTTEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:31人Wnt1 C-端富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域(aa 288-370)

DLVYFEKSPNFCTYSGRLGTAGTAGRACNSSSPALDGCELLCCGRGHRTRTQRVTERCNCTFHWCCHVSCRNCTHTRVLHECL

SEQ ID NO:32人Wnt2 C-端富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域(aa 267-360)

DLVYFENSPDYCIRDREAGSLGTAGRVCNLTSRGMDSCEVMCCGRGYDTSHVTRMTKCGCKFHWCCAVRCQDCLEALDVHTCKAPKNADWTTAT

SEQ ID NO:33人Wnt2b C-端富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域(aa 298-391)

DLVYFDNSPDYCVLDKAAGSLGTAGRVCSKTSKGTDGCEIMCCGRGYDTTRVTRVTQCECKFHWCCAVRCKECRNTVDVHTCKAPKKAEWLDQT

SEQ ID NO:34人Wnt3 C-端富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域(aa 273-355)

DLVYYENSPNFCEPNPETGSFGTRDRTCNVTSHGIDGCDLLCCGRGHNTRTEKRKEKCHCIFHWCCYVSCQECIRIYDVHTCK

SEQ ID NO:35人Wnt3a C-端富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域(aa 270-352)

DLVYYEASPNFCEPNPETGSFGTRDRTCNVSSHGIDGCDLLCCGRGHNARAERRREKCRCVFHWCCYVSCQECTRVYDVHTCK

SEQ ID NO:36人Wnt7a C-端富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域(aa 267-359)

DLVYIEKSPNYCEEDPVTGSVGTQGRACNKTAPQASGCDLMCCGRGYNTHQYARVWQCNCKFHWCCYVKCNTCSERTEMYTCK

SEQ ID NO:37人Wnt7b C-端富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域(aa 267-349)

DLVYIEKSPNYCEEDAATGSVGTQGRLCNRTSPGADGCDTMCCGRGYNTHQYTKVWQCNCKFHWCCFVKCNTCSERTEVFTCK

SEQ ID NO:38人Wnt8a C-端富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域(aa 248-355)

ELIFLEESPDYCTCNSSLGIYGTEGRECLQNSHNTSRWERRSCGRLCTECGLQVEERKTEVISSCNCKFQWCCTVKCDQCRHVVSKYYCARSPGSAQSLGRVWFGVYI

SEQ ID NO:39人Wnt8b C-端富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域(aa 245-351)

ELVHLEDSPDYCLENKTLGLLGTEGRECLRRGRALGRWELRSCRRLCGDCGLAVEERRAETVSSCNCKFHWCCAVRCEQCRRRVTKYFCSRAERPRGGAAHKPGRKP

SEQ ID NO:40人Wnt10a C-端富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域(aa 335-417)

DLVYFEKSPDFCEREPRLDSAGTVGRLCNKSSAGSDGCGSMCCGRGHNILRQTRSERCHCRFHWCCFVVCEECRITEWVSVCK

SEQ ID NO:41人Wnt10b C-端富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域(aa 307-389)

ELVYFEKSPDFCERDPTMGSPGTRGRACNKTSRLLDGCGSLCCGRGHNVLRQTRVERCHCRFHWCCYVLCDECKVTEWVNVCK

權(quán)利要求書(按照條約第19條的修改)

1.一種治療癌癥和/或抑制腫瘤生長的方法，其包括：

向受試者施用治療有效量的Wnt途徑抑制劑和治療有效量的有絲分裂抑制劑，其中所述Wnt途徑抑制劑和所述有絲分裂抑制劑使用交錯(cuò)給藥方案施用，并且所述Wnt途徑抑制劑首先施用；且其中所述Wnt途徑抑制劑是：

(a)特異性結(jié)合至少一種人卷曲(FZD)蛋白的抗體，或

(b)包含人FZD蛋白的Fri結(jié)構(gòu)域的可溶性受體。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述有絲分裂抑制劑在施用所述Wnt途徑抑制劑后約1天、2天、3天、4天、5天或6天施用。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述Wnt途徑抑制劑每3周施用一次。

4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述Wnt途徑抑制劑約每4周施用一次。

5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述有絲分裂抑制劑約每周施用一次、約每2周施用一次、約每3周施用一次、或在4周(28天)的周期內(nèi)的3周，每周施用一次。

6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述Wnt途徑抑制劑是抗體，所述抗體特異性結(jié)合選自FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8中的至少一種人FZD蛋白。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述抗體包含：

(a)包含GFTFSHYTLS(SEQ ID NO:7)的重鏈CDR1，包含VISGDGSYTYYADSVKG(SEQ ID NO:8)的重鏈CDR2和包含NFIKYVFAN(SEQ ID NO:9)的重鏈CDR3，以及

(b)包含SGDNIGSFYVH(SEQ ID NO:10)的輕鏈CDR1，包含DKSNRPSG(SEQ ID NO:11)的輕鏈CDR2和包含QSYANTLSL(SEQ ID NO:12)的輕鏈CDR3。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述抗體包含包含SEQ ID NO:5的重鏈可變區(qū)和包含SEQ ID NO:6的輕鏈可變區(qū)。

9.根據(jù)權(quán)利要求6-8中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述抗體是單克隆抗體、重組抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、包含抗原結(jié)合部位的抗體片段、單特異性抗體、雙特異性抗體、IgG1抗體、或IgG2抗體。

10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述Wnt途徑抑制劑是凡地吐單抗。

11.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述Wnt途徑抑制劑是包含人FZD蛋白的Fri結(jié)構(gòu)域的可溶性受體。

12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述人FZD蛋白的Fri結(jié)構(gòu)域包含F(xiàn)ZD8的Fri結(jié)構(gòu)域。

13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述人FZD蛋白的Fri結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21。

14.根據(jù)權(quán)利要求11-13中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述可溶性受體包含非FZD多肽。

15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述非FZD多肽包含人Fc區(qū)。

16.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述可溶性受體包括：

(a)SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21；和

(b)SEQ ID NO:27。

17.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述可溶性受體包含SEQ ID NO:29。

18.根據(jù)權(quán)利要求1-5或11-17中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述Wnt途徑抑制劑是艾非納西肽。

19.根據(jù)權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述有絲分裂抑制劑是紫杉烷、長春花生物堿、埃坡霉素或艾日布林甲磺酸鹽。

20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述有絲分裂抑制劑是選自紫杉醇、白蛋白結(jié)合型紫杉醇、多西紫杉醇及其衍生物中的紫杉烷。

21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述有絲分裂抑制劑是長春花生物堿，其選自長春花堿、長春新堿、長春瑞濱及其衍生物。

22.根據(jù)權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述癌癥或腫瘤是乳腺癌/腫瘤、卵巢癌/腫瘤、肺癌/腫瘤或胰腺癌/腫瘤。

23.根據(jù)權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)所述的方法，其還包括施用至少一種另外的治療劑。

24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述另外的治療劑是化療劑。