本發(fā)明涉及神經(jīng)前體細(xì)胞或包含其分泌蛋白質(zhì)組(Secretome)作為有效成分的治療缺血性疾病或神經(jīng)炎癥性疾病的組合物。

背景技術(shù)：

干細(xì)胞因其多分化能而被視為多種疾病的有希望的治療候選物質(zhì)。例如，間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有可容易地獲得及分離、促進(jìn)血管生成、抑制炎癥的許多營(yíng)養(yǎng)因子等特性(Caplan，A.I.，&Dennis，J.E.(2006).Journal of Cellular Biochemistry，98，1076-1084)。間充質(zhì)干細(xì)胞的這些特性被適用于治療人類(lèi)疾病的研究中。根據(jù)最近的研究，間充質(zhì)干細(xì)胞在許多動(dòng)物模型及人體臨床治療(Chen，J.，Li，Y.，Katakowski，M.，et al.(2003).Journal of Neuroscience Research，73，778-786；Kopen，G.C.，Prockop，D.J.，&Phinney，D.G.(1999).Proceedings of the National Academy of Sciences，96，10711-10716)中起到組織恢復(fù)的作用。在一些報(bào)道中提及了間充質(zhì)干細(xì)胞在體外分化為包括神經(jīng)細(xì)胞(Bae，K.S.，Park，J.B.，Kim，H.S.，Kim，D.S.，Park，D.J.，&Kang，S.J.(2011).Yonsei Medical Journal，52，401-412)及星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte)(Kopen，G.C.，Prockop，D.J.，&Phinney，D.G.(1999).Proceedings of the National Academy of Sciences，96，10711-10716)的神經(jīng)系列的分化能力，但未提及這些被分化的細(xì)胞在體內(nèi)起到哪些功能的明確證據(jù)。間充質(zhì)干細(xì)胞的有益的效果為上述間充質(zhì)干細(xì)胞被旁分泌(paracrine)機(jī)制誘導(dǎo)，而不是細(xì)胞替代，由此，間充質(zhì)干細(xì)胞的移植(transplantation)可具有臨時(shí)且有限的效果，而不是長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)的改善(Cho，S.R.，Kim，Y.R.，Kang，H.S.，et al.(2009).Cell Transplantion，18，1359-1368)。

相反地，胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)可分化為來(lái)源于3個(gè)胚芽層(embryonic germ layer)的所有特定細(xì)胞形態(tài)，并且具有強(qiáng)大的自我再生能力。值得注意的是，來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的神經(jīng)前體細(xì)胞(neural precursor cells，NPCs)優(yōu)選分化為包括神經(jīng)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞(oligodendrocyte)的神經(jīng)系列的特定形態(tài)的細(xì)胞，因此可視為用于腦組織恢復(fù)的細(xì)胞源(cells ource)。這些細(xì)胞還分泌促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)前體細(xì)胞的生存及增殖的一些因子(Capone，C.，F(xiàn)rigerio，S.，F(xiàn)umagalli，S.，et al.(2007).PLoSOne，7，e373)。但是，仍然未提及分化于胚胎干細(xì)胞的神經(jīng)前體細(xì)胞或者神經(jīng)前體細(xì)胞的培養(yǎng)液在完成疾病模型移植后如何起到改善功能的作用的內(nèi)容。

在本說(shuō)明書(shū)全文中，參照了多篇論文及專(zhuān)利文獻(xiàn)，并表示了其引用。所引用的論文及專(zhuān)利文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容全部引入本說(shuō)明書(shū)作為參照，從而更加明確說(shuō)明本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的水平及本發(fā)明的內(nèi)容。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

技術(shù)問(wèn)題

本發(fā)明者為了開(kāi)發(fā)缺血性疾病或神經(jīng)炎癥性疾病的根本的治療方法而進(jìn)行了深入研究。其結(jié)果，當(dāng)向病變部位注射在表面表達(dá)作為神經(jīng)粘附分子的多聚唾液酸神經(jīng)細(xì)胞粘附分子(PSA-NCAM，poly-sialylated neural cell adhesion molecule)的神經(jīng)前體細(xì)胞時(shí)，促進(jìn)血管的新生以及抑制炎癥反應(yīng)，從而可有效地治療因血管損傷而產(chǎn)生的缺血性疾病及因炎癥而產(chǎn)生的神經(jīng)組織的損傷，由此完成了本發(fā)明。因此，作為不同于干細(xì)胞移植的實(shí)施方式，通過(guò)給藥至神經(jīng)前體細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)組的病變部位來(lái)減少缺血性損傷部位并恢復(fù)神經(jīng)功能，從而可有效地治療缺血性疾病和因炎癥而產(chǎn)生的神經(jīng)損傷疾病等的退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，由此完成了本發(fā)明。

并且，本發(fā)明的目的在于，提供治療缺血性疾病或神經(jīng)炎癥性疾病的組合物。

本發(fā)明的再一目的在于，提供缺血性疾病或神經(jīng)炎癥性疾病的治療方法。

根據(jù)如下的發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明、權(quán)利要求及附圖可進(jìn)一步明確本發(fā)明的還有一目的及優(yōu)點(diǎn)。

解決問(wèn)題的方案

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施方式，本發(fā)明提供包含多聚唾液酸神經(jīng)細(xì)胞粘附分子-陽(yáng)性神經(jīng)前體細(xì)胞作為有效成分的治療缺血性疾病或神經(jīng)炎癥性疾病的組合物。

根據(jù)本發(fā)明的再一實(shí)施方式，本發(fā)明提供包括向所需的個(gè)體給藥包含多聚唾液酸神經(jīng)細(xì)胞粘附分子-陽(yáng)性神經(jīng)前體細(xì)胞作為有效成分的組合物的步驟的缺血性疾病或神經(jīng)炎癥性疾病的治療方法。

根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的組合物在患有缺血性疾病或神經(jīng)炎癥性疾病的個(gè)體恢復(fù)缺血性組織的血管或者抑制炎癥反應(yīng)，從而起到抑制上述癥狀的發(fā)展或者去除或減輕上述癥狀的作用。并且，本發(fā)明的組合物因其本身的特性還可作為缺血性疾病或神經(jīng)炎癥性疾病的治療組合物，并且還可以與其它抗缺血/抗炎癥組合物同時(shí)給藥而作為針對(duì)這些疾病的治療輔助劑。在此，在本說(shuō)明書(shū)使用的術(shù)語(yǔ)“治療”或“治療劑”包括“治療輔助”或“治療輔助劑”的意識(shí)。

根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的組合物顯著增加作為血管生成誘發(fā)因子的促血管生成素-1(angiopoietin-1)的表達(dá)，并且大大提高給藥(或移植)部位的血管數(shù)量及微血管濃度。并且，本發(fā)明的組合物因血管組織的消失、血管生成的缺乏或不正常血管的形成等而產(chǎn)生的血流量減少的個(gè)體中恢復(fù)血管組織或者增加血管的數(shù)量，從而可用作恢復(fù)血流量的有效的缺血性疾病治療組合物。

根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的組合物抑制所給藥(或移植)的神經(jīng)組織中的反應(yīng)性小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞地活性化。小膠質(zhì)細(xì)胞(microglia)作為在中樞神經(jīng)系統(tǒng)執(zhí)行第一性免疫功能的細(xì)胞，與正常狀態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞不同地，被活性化的小膠質(zhì)細(xì)胞積極地進(jìn)行吞噬作用，并且實(shí)現(xiàn)細(xì)胞增殖，而且通過(guò)表達(dá)TNF-α、IL-1β及IL-6等的細(xì)胞因子、趨化因子、誘生型一氧化氮合酶(iNOS，inducible nitric oxide synthase)、環(huán)氧合酶-2(COX-2，cyclooxygenase-2)等的遺傳基因來(lái)生成炎癥介質(zhì)物質(zhì)。被活性化的星形膠質(zhì)細(xì)胞也分泌作為炎癥性細(xì)胞因子的IL-6、TGF-β、LIF及IL-1，所分泌的這些細(xì)胞因子重新使小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞活性化，從而惡化組織內(nèi)環(huán)境。并且，用于抑制小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性化的本發(fā)明的組合物可有效地防止因炎癥反應(yīng)而引起的神經(jīng)組織的損傷。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，本發(fā)明的治療缺血性疾病或神經(jīng)炎癥性疾病的組合物用于增加促血管生成素-1的表達(dá)。

在本說(shuō)明書(shū)所使用的術(shù)語(yǔ)“表達(dá)的增加”是指不同于正常狀態(tài)以能夠檢測(cè)出的程度顯著增加遺傳基因或蛋白質(zhì)的表達(dá)，更具體地，不同于對(duì)照組，表達(dá)量稱(chēng)為130％以上。

根據(jù)本發(fā)明發(fā)熱一實(shí)例，本發(fā)明的治療缺血性疾病或神經(jīng)炎癥性疾病的組合物用于抑制膠質(zhì)細(xì)胞(glial cell)或星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性化。

在本說(shuō)明書(shū)所使用的術(shù)語(yǔ)“活性化的抑制”是指抑制引起膠質(zhì)細(xì)胞或星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量、功能及活性化降低的體內(nèi)變形，例如是指抑制顯著降低這些細(xì)胞的特異性標(biāo)記(例如，CD68或GFAP)的表達(dá)或者無(wú)法檢測(cè)或者以無(wú)意識(shí)的水準(zhǔn)存在的現(xiàn)象。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，在本發(fā)明所使用的多聚唾液酸神經(jīng)細(xì)胞粘附分子-陽(yáng)性神經(jīng)前體細(xì)胞從神經(jīng)叢分離，上述神經(jīng)叢從全能干細(xì)胞分化。

根據(jù)本發(fā)明，在本發(fā)明所使用的多聚唾液酸神經(jīng)細(xì)胞粘附分子-陽(yáng)性神經(jīng)前體細(xì)胞可利用抗多聚唾液酸神經(jīng)細(xì)胞粘附分子-抗體從神經(jīng)叢分離，上述神經(jīng)叢通過(guò)神經(jīng)分化刺激從全能干細(xì)胞分化。

根據(jù)本發(fā)明的還有一實(shí)施方式，本發(fā)明提供包含神經(jīng)前體細(xì)胞的分泌蛋白質(zhì)組作為有效成分的治療缺血性疾病或神經(jīng)炎癥性疾病的組合物。

本發(fā)明的另一實(shí)施方式，本發(fā)明提供包括向所需的個(gè)體給藥包含神經(jīng)前體細(xì)胞的分泌蛋白質(zhì)組作為有效成分的組合物的步驟的缺血性疾病或神經(jīng)炎癥性疾病的治療方法。

在本說(shuō)明書(shū)所使用的術(shù)語(yǔ)“神經(jīng)前體細(xì)胞的分泌蛋白質(zhì)組”(Secretome)是指在培養(yǎng)神經(jīng)前體細(xì)胞的過(guò)程中從神經(jīng)前體細(xì)胞分泌至外部(培養(yǎng)基)的蛋白質(zhì)的集合體。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，適用于本發(fā)明的分泌蛋白質(zhì)組的制備的神經(jīng)前體細(xì)胞分化至全能干細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，上述神經(jīng)前體細(xì)胞為通過(guò)使全能干細(xì)胞(例如，胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)全能干細(xì)胞)分化為神經(jīng)系列細(xì)胞而形成的神經(jīng)叢(neural rosette)步驟中的神經(jīng)前體細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，上述神經(jīng)前體細(xì)胞為多聚唾液酸神經(jīng)細(xì)胞粘附分子-陽(yáng)性神經(jīng)前體細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)例，上述神經(jīng)前體細(xì)胞為多聚唾液酸神經(jīng)細(xì)胞粘附分子-陰性神經(jīng)前體細(xì)胞。

上述多聚唾液酸神經(jīng)細(xì)胞粘附分子-陽(yáng)性或陰性神經(jīng)前體細(xì)胞可利用抗多聚唾液酸神經(jīng)細(xì)胞粘附分子-抗體從神經(jīng)叢分離，上述神經(jīng)叢通過(guò)神經(jīng)分化刺激從全能干細(xì)胞分化。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)神經(jīng)前體細(xì)胞來(lái)獲得的細(xì)胞培養(yǎng)液中含有上述分泌蛋白質(zhì)組。即，在本發(fā)明的組合物可包含含有神經(jīng)前體細(xì)胞的分泌蛋白質(zhì)組的神經(jīng)前體細(xì)胞的培養(yǎng)液。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，在包含ITS(胰島素/轉(zhuǎn)鐵蛋白/硒)及堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF，basic fibroblast growth factor)的無(wú)血清動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)神經(jīng)前體細(xì)胞后，可通過(guò)去除細(xì)胞來(lái)獲得上述神經(jīng)前體細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液。在上述培養(yǎng)的過(guò)程中可利用傳代培養(yǎng)的神經(jīng)前體細(xì)胞，例如，通過(guò)在添加有N2、B-27和/或Gem21的含堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)(例如，4傳代以上)而獲得的神經(jīng)前體細(xì)胞。

上述培養(yǎng)基中的細(xì)胞的去除可使用離心分離、過(guò)濾等的普通的細(xì)胞分離方法實(shí)施。

只要是在培養(yǎng)神經(jīng)前體細(xì)胞的過(guò)程中使用的普通培養(yǎng)基，則不對(duì)上述動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行限制，例如可使用DMEM/F12。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，上述神經(jīng)前體細(xì)胞從人類(lèi)誘導(dǎo)全能干細(xì)胞分化，上述神經(jīng)前體細(xì)胞的分泌蛋白質(zhì)組包括如下的蛋白質(zhì)：聚集蛋白(Agrin)、膜聯(lián)蛋白A5(AnnexinA5)、基礎(chǔ)免疫球蛋白(BSG，Basigin)、二聚糖(Biglycan)、鈣調(diào)蛋白-3(Calponin-3)、類(lèi)共激活蛋白(Coactosin-like protein)、絲切蛋白-1(Cofilin-1)、膠原蛋白α-2、滯蛋白-3(Cullin-3)、消去蛋白(Destrin)、營(yíng)養(yǎng)不良蛋白聚糖(Dystroglycan)、肝配蛋白-B2(Ephrin-B2)、輸出蛋白-2(Exportin-2)、埃茲蛋白(Ezrin)、纖維連接蛋白、纖蛋白-1(Fibulin-1)、卷曲相關(guān)(Frizzled-related)蛋白質(zhì)、半乳糖凝集素-3結(jié)合蛋白(Galectin-3 binding protein)、顆粒體蛋白(Granulins)、生長(zhǎng)/分化因子11(Growh/differentiationfactor11)、觸珠蛋白(Haptoglobin)、血液結(jié)合素(Hemopexin)、高速泳動(dòng)族蛋白(High mobility group protein)B2、角蛋白(Hornerin)、輸入蛋白-9(Importin-9)、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2(Insulin-like grwoth factor-binding protein2)、狼瘡La蛋白(Lupus La protein)、巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor)、中期因子(Midkine)、膜突蛋白(Moesin)、神經(jīng)氈蛋白2(Neuropilin2)、多效蛋白(Pleiotrophin)、抑制蛋白-1(Profilin-1)、DJ-1蛋白(Protein DJ-1)、根蛋白(Radixin)、分泌型卷曲相關(guān)蛋白-2(Secreted frizzled-related protein-2)、胞裂蛋白-11(Septin-11)、踝蛋白-1(Talin-1)、睪丸蛋白聚糖(Testican)、促胸腺生成素(Thymopoietin)、轉(zhuǎn)膠蛋白-3(Transgelin-3)及波形蛋白(Vimentin)。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，上述神經(jīng)前體細(xì)胞從人類(lèi)胚胎干細(xì)胞分化，上述神經(jīng)前體細(xì)胞的分泌蛋白質(zhì)組包括如下的蛋白質(zhì)：聚集蛋白(Agrin)、膜聯(lián)蛋白A2(Annexin A2)、吸引素(Attractin)、二聚糖(Biglycan)、血漿銅藍(lán)蛋白(Ceruloplasmin)、絲切蛋白-1(Cofilin-1)、膠原蛋白α-1、冠蛋白-1X(Coronin-1X)、皮西丁蛋白(Dermicidin)、DERP12、肝配蛋白-B3、外生骨疣樣蛋白-2(Exostosin-2)、埃茲蛋白(Ezrin)、明膠-3結(jié)合蛋白、顆粒體蛋白(Granulins)、生長(zhǎng)分化因子11(Growh/differentiation factor 11)、觸珠蛋白(Haptoglobin)、血液結(jié)合素(Hemopexin)、高速泳動(dòng)族蛋白B2、角蛋白(Hornerin)、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2(Insulin-like grwoth factor-binding protein 2)、狼瘡La蛋白、中期因子(Midkine)、膜突蛋白(Moesin)、多表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域蛋白8(Multiple epidermal growth factor-like domains protein 8)、巢蛋白-1(Nidogen-1)、胸腺旁腺素(Parathymosin)、抑制蛋白-2(Profilin-2)、DJ-1蛋白(ProteinDJ-1)、分泌型卷曲相關(guān)蛋白-2、分泌粒蛋白(Secretogranin)、踝蛋白-1(Talin-1)、胸腺素β-4(Thymosin beta-4)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子Β誘導(dǎo)蛋白IG-H3(TGFBI，Transforming grwowth factor-beta-induced protein ig-h3)、轉(zhuǎn)膠蛋白(Transgelin)及波形蛋白(Vimentin)。

以下，對(duì)共同適用于如上所述的本發(fā)明的組合物及治療方法的內(nèi)容進(jìn)行說(shuō)明。

在本說(shuō)明書(shū)所使用的術(shù)語(yǔ)“干細(xì)胞”是在分化(differentiation)為形成組織的各細(xì)胞之前的步驟的未分化細(xì)胞的總稱(chēng)，具有根據(jù)特定分化刺激(環(huán)境)而能夠分化為特定細(xì)胞的能力。不同于停止細(xì)胞分裂的已完成分化的細(xì)胞，干細(xì)胞的特征在于，可通過(guò)細(xì)胞分裂而生成(self-renewal)與自身相同的細(xì)胞，并具有如下的分化可塑性(plasticity)，即，若施加分化刺激，則分化為特定細(xì)胞，并且這種分化還可根據(jù)其它環(huán)境或其它分化刺激而分化為多種細(xì)胞。

在本發(fā)明所使用的干細(xì)胞為如下的全能干細(xì)胞(pluripotent stem cell)，即，可在體外無(wú)限增殖，并且可分化為來(lái)源于3種種類(lèi)的所有胚層(外胚層、中胚層和內(nèi)胚層)的多種細(xì)胞。更具體地，上述全能干細(xì)胞為胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells)、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs，induced pluripotent stem cells)、胚胎生殖細(xì)胞(embryonic germ cells)或胚胎癌細(xì)胞(embryonic carcinoma cells)。

胚胎干細(xì)胞來(lái)源于胚盤(pán)胞的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)，胚胎生殖細(xì)胞來(lái)源于5～10周齡的生殖嵴(gonadal ridge)的原始生殖細(xì)胞。

誘導(dǎo)全能干細(xì)胞為通過(guò)插入從非全分化能細(xì)胞(例如，體細(xì)胞)賦予全能性的特定遺傳基因來(lái)人工制備的全分化能干細(xì)胞中的一種。誘導(dǎo)全能干細(xì)胞在干細(xì)胞遺傳基因及蛋白質(zhì)表達(dá)、染色體甲基化、倍增時(shí)間(doubling time)、胚體形成、畸胎瘤形成、生存性嵌合體形成、雜交性及分化性等方面與全分化能干細(xì)胞(例如，胚胎干細(xì)胞)相同。

上述術(shù)語(yǔ)“神經(jīng)叢(neural rosette)”是指人類(lèi)胚胎干細(xì)胞的神經(jīng)分化過(guò)程的初始步驟的神經(jīng)干細(xì)胞，神經(jīng)叢具有圓柱形的放射形態(tài)。上述神經(jīng)叢由表達(dá)Pax6及Sox1等的初始神經(jīng)外胚層(neuroectodermal)標(biāo)記的細(xì)胞形成，并且可分化為神經(jīng)細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。上述神經(jīng)分化刺激可通過(guò)本技術(shù)領(lǐng)域的常規(guī)實(shí)施方法實(shí)現(xiàn)分化，例如，可通過(guò)無(wú)血清培養(yǎng)基(Tropepe V et al.，Neuron.30:6578(2001))，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGFs，fibroblast growth factors)、細(xì)胞外因子(Wnt)及視黃酸(RA，retinoic acid)等的成形素(morphogens)的處理(Ying QL et al.Nat Biotechnol.21:183186(2003))實(shí)現(xiàn)分化，但并不限定于此。

上述抗體可使用多克隆抗體或單克隆抗體。針對(duì)多聚唾液酸神經(jīng)細(xì)胞粘附分子的抗體可通過(guò)本技術(shù)領(lǐng)域的常規(guī)實(shí)施方式制備，例如，可通過(guò)融合方法(Kohler and Milstein，European Journal of Immunology，6:511-519(1976))、重組DNA方法(美國(guó)專(zhuān)利第4，816，56號(hào))或噬菌體抗體庫(kù)方法(Clackson et al，Nature，352:624-628(1991)及Marks et al，J.Mol.Biol.，222:58，1-597(1991))制備。針對(duì)抗體制備的普通過(guò)程已詳細(xì)記載于Harlow，E.and Lane，D.，Using Antibodies:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，New York，1999；Zola，H.，Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques，CRC Press，Inc.，Boca Raton，F(xiàn)lorida，1984；及Coligan，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY，Wiley/Greene，NY，1991，上述文獻(xiàn)作為參考引用在本說(shuō)明書(shū)。例如，用于生成單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞的制備可通過(guò)融合非凋亡化細(xì)胞株和抗體生成淋巴細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)，在此過(guò)程中所需要的技術(shù)已被本發(fā)明所述技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所公知，并且可容易實(shí)現(xiàn)。多克隆抗體可通過(guò)如下的方法實(shí)現(xiàn)，即，向適合的動(dòng)物注射多聚唾液酸神經(jīng)細(xì)胞粘附分子抗原，并從上述動(dòng)物收集抗血清后，利用公知的親和性(affinity)技術(shù)從抗血清分離抗體而獲得。

在本說(shuō)明書(shū)中，提及多聚唾液酸神經(jīng)細(xì)胞粘附分子時(shí)所使用的術(shù)語(yǔ)“抗體”為針對(duì)多聚唾液酸神經(jīng)細(xì)胞粘附分子的特異抗體，并與多聚唾液酸神經(jīng)細(xì)胞粘附分子蛋白質(zhì)特異性結(jié)合，不僅包括完整的抗體形態(tài)，還包括抗體分子的抗原結(jié)合片段。完成的抗體為具有2個(gè)整體長(zhǎng)度的輕鏈及2個(gè)整體長(zhǎng)度的重鏈的結(jié)構(gòu)，各個(gè)輕鏈以二硫鍵的方式與重鏈相連接，抗體分子的抗原結(jié)合片段作為具有抗原結(jié)合功能的片段，包括Fab、F(ab')、F(ab')2及Fv。

為了分離利用抗體的多聚唾液酸神經(jīng)細(xì)胞粘附分子-陽(yáng)性神經(jīng)前體細(xì)胞，可利用熒光激活細(xì)胞分選機(jī)(fluorescence-activating cell sorters，F(xiàn)ACS)、磁性激活細(xì)胞分選機(jī)(magnetic activated cell sorter，MACS)及補(bǔ)體介導(dǎo)溶解(complement-mediatedlysis)方法。

在本說(shuō)明書(shū)所使用的術(shù)語(yǔ)“治療”是指：(a)抑制疾病、病癥或癥狀的發(fā)展；(b)減輕疾病、病癥或癥狀；或者(c)去除疾病、病癥或癥狀。本發(fā)明的組合物起到抑制、去除或減輕缺血性疾病或神經(jīng)炎癥性疾病的癥狀的發(fā)展的作用。并且，本發(fā)明的組合物因其本身的特性還可作為缺血性疾病或神經(jīng)炎癥性疾病的治療用組合物，并且還可以與其它抗缺血/抗炎癥組合物同時(shí)給藥而作為針對(duì)這些疾病的治療輔助劑。在此，在本說(shuō)明書(shū)使用的術(shù)語(yǔ)“治療”或“治療劑”包括“治療輔助”或“治療輔助劑”的意識(shí)。

在本說(shuō)明書(shū)所使用的術(shù)語(yǔ)“缺血性疾病”是指如下的疾病，即，因伴隨血管損傷的血液滲漏(blood leakage)、栓塞(embolism)或梗塞(infarction)等而減少血流量，因而使血液供給被切斷的組織壞死。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，可通過(guò)本發(fā)明的組合物治療的缺血性疾病選自由缺血性心臟疾病、心肌梗死、心絞痛、下肢動(dòng)脈缺血性疾病、四肢遠(yuǎn)端缺血性疾病及缺血性腦血管疾病組成的組中。

在本說(shuō)明書(shū)所使用的術(shù)語(yǔ)“缺血性心臟疾病”是指因向心臟供給血液的冠狀動(dòng)脈損傷、冠狀動(dòng)脈狹窄或被阻塞而減少流向心臟肌肉的血流并由此產(chǎn)生的疾病。更具體地，可通過(guò)本發(fā)明的組合物治療的缺血性心臟疾病選自由心絞痛、心肌梗死癥及心臟衰竭組成的組中。

在本說(shuō)明書(shū)所使用的術(shù)語(yǔ)“缺血性腦血管疾病”是指因腦血管損傷、腦血管狹窄或被阻塞而使無(wú)法接受血流的腦組織損傷的疾病。更具體地，上述缺血性腦血管疾病為缺血性腦卒中。

在本說(shuō)明書(shū)所使用的術(shù)語(yǔ)“神經(jīng)炎癥性疾病”是指因炎癥反應(yīng)而產(chǎn)生的神經(jīng)組織的損傷所導(dǎo)致的疾病。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，可通過(guò)本發(fā)明的組合物治療的神經(jīng)炎癥性疾病選自由阿耳茨海默氏病、帕金森病、亨丁頓舞蹈癥、肌肉萎縮癥、克雅氏病、多發(fā)性硬化癥、肌萎縮側(cè)索硬化癥、彌漫性路易體病、白質(zhì)腦炎、顳葉癲癇及炎癥性脊髓損傷組成的組中。

在本說(shuō)明書(shū)所使用的術(shù)語(yǔ)“給藥”或“進(jìn)行給藥”是指，通過(guò)向?qū)ο篌w直接給藥本發(fā)明的組合物的治療有效量而在對(duì)象體的體內(nèi)形成相同的量。并且，術(shù)語(yǔ)“進(jìn)行給藥”包括向病變部位注射本發(fā)明的有效成分(多聚唾液酸神經(jīng)細(xì)胞粘附分子-陽(yáng)性神經(jīng)前體細(xì)胞或神經(jīng)前體細(xì)胞的分泌蛋白質(zhì)組)，因此術(shù)語(yǔ)“進(jìn)行給藥”和“進(jìn)行注射”為相同的意識(shí)。

組合物的“治療有效量”是指為了向待給藥組合物的個(gè)體提供治療效果或預(yù)防效果而所需的充分的提取物的含量，并且上述“治療有效量”包括“預(yù)防有效量”。在本說(shuō)明書(shū)所使用的術(shù)語(yǔ)“個(gè)體”無(wú)限制地包括人類(lèi)、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、貓、馬、牛、豬、猴、黑猩猩、狒狒或獼猴。具體地，本發(fā)明的個(gè)體為人類(lèi)。

本發(fā)明的組合物被制備為藥物組合物的情況下，本發(fā)明的藥物組合物包括藥學(xué)上可接受的載體。包含在本發(fā)明的藥物組合物的藥學(xué)上可接受的載體作為制劑時(shí)通常利用的，包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、藻酸鹽、半乳糖凝集素、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、糖漿、甲基纖維素、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂、礦物油、食鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，phosphate buffered saline)或培養(yǎng)基等，但并不限定于此。

除了上述成分以外，本發(fā)明的藥物組合物還可包括潤(rùn)滑劑、潤(rùn)濕劑、甜味劑、調(diào)味劑、乳化劑、懸浮劑、保鮮劑。適合的藥學(xué)上可接受的載體及制劑詳細(xì)地記載于Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed.，1995)。

本發(fā)明的藥物組合物可實(shí)施口服或非口服給藥，具體地，可以是非口服給藥，更具體地，可以是肌肉內(nèi)(intramuscular)給藥、腦室內(nèi)(intracerebroventricular)給藥、脊髓腔(Intrathecal)給藥或血管內(nèi)(intravascular)給藥。

本發(fā)明的藥物組合物的適合的給藥量可根據(jù)制劑化方法、給藥方式、患者的年齡、體重、性別、病態(tài)、飲食、給藥時(shí)間、給藥途徑、排泄速度及反應(yīng)靈敏性等的因素開(kāi)多種處方。以成人為基準(zhǔn)，本發(fā)明的藥物組合物的普通給藥量為每天10²-10¹⁰細(xì)胞。

本發(fā)明的藥物組合物根據(jù)本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可容易實(shí)施的方法并利用藥學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑來(lái)進(jìn)行制劑化，從而可制備成單位容量形態(tài)或者以填充于大型容器內(nèi)的方式制備。此時(shí)，劑型可以為油介質(zhì)或水介質(zhì)中的溶液、懸浮液、糖漿劑或乳液形態(tài)，并且還可以為浸膏劑、粉劑、粉末劑、顆粒劑、片劑或膠囊劑形態(tài)，而且還包括分散劑或穩(wěn)定劑。

發(fā)明的效果

如下的概括說(shuō)明本發(fā)明的特征及優(yōu)點(diǎn)。

(a)本發(fā)明提供治療缺血性疾病或神經(jīng)炎癥性疾病的組合物。

(b)在本發(fā)明所使用的多聚唾液酸神經(jīng)細(xì)胞粘附分子-陽(yáng)性神經(jīng)前體細(xì)胞用于促進(jìn)被注射的組織中的血管生成以及抑制炎癥反應(yīng)。上述多聚唾液酸神經(jīng)細(xì)胞粘附分子-陽(yáng)性神經(jīng)前體細(xì)胞可利用抗多聚唾液酸神經(jīng)細(xì)胞粘附分子-抗體簡(jiǎn)單地分離，相對(duì)于間充質(zhì)干細(xì)胞，呈現(xiàn)優(yōu)秀的血管生成及驗(yàn)證抑制活性，從而可有用地用作針對(duì)因血管損傷而引起的缺血性疾病及因炎癥而引起的神經(jīng)損傷疾病的有效的治療組合物。

(c)本發(fā)明的神經(jīng)前體細(xì)胞的分泌蛋白質(zhì)組不僅減少缺血性損傷部位，還恢復(fù)神經(jīng)功能，因而還可用作針對(duì)因缺血性疾病和炎癥而引起的神經(jīng)損傷疾病等的退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療劑。

附圖說(shuō)明

圖1為示出移植NPC^PSA-NCAM+及間充質(zhì)干細(xì)胞的大鼠腦缺血中的梗塞部位縮小的圖。圖1a為示出實(shí)驗(yàn)計(jì)劃圖的示意圖。在大腦中動(dòng)脈閉塞(pMCAo)1日后，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)給藥NPC^PSA-NCAM+、間充質(zhì)干細(xì)胞或磷酸鹽緩沖鹽水(分別n＝10)。在移植26日后犧牲實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，并對(duì)腦組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析。圖1b為示出大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞模型中的間充質(zhì)干細(xì)胞移植及NPC^PSA-NCAM+移植在移植26日后對(duì)梗塞大小產(chǎn)生的效果的圖。與磷酸鹽緩沖鹽水組相比，分別為*P<0.05及**P<0.01。圖1c為示出給藥磷酸鹽緩沖鹽水、NPC^PSA-NCAM+或間充質(zhì)干細(xì)胞的大鼠中的移植26日后的代表圖像的圖。

圖2為示出在移植NPC^PSA-NCAM+的大鼠腦卒中模型中提高行動(dòng)能力的圖。分別示出體重變化(圖2a)、前肢踩空試驗(yàn)(圖2b)、非對(duì)稱(chēng)試驗(yàn)(圖2c)、平衡木試驗(yàn)(圖2d)、抓握牽引試驗(yàn)(圖2e)及改良神經(jīng)功能評(píng)分(圖2f)的結(jié)果。檢測(cè)值用±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。與磷酸鹽緩沖鹽水組相比，分別為*P<0.05、**P<0.01及***P<0.001。

圖3為示出生存的NPC^PSA-NCAM+的編入大鼠腦組織以及分化為大鼠腦組織的圖。圖3a示出梗塞部位。在移植26日后對(duì)NPC^PSA-NCAM+的生存及增殖進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在大鼠腦缺血中檢測(cè)出Ki67(綠色)或DCX(紅色)陽(yáng)性細(xì)胞。比例尺：500μm。圖3b為圖3a的高倍率體。比例尺：200μm。圖3為示出同時(shí)表達(dá)hNu(綠色)及DCX(紅色)的NPC^PSA-NCAM+細(xì)胞的一列的圖，許多被移植的NPC^PSA-NCAM+細(xì)胞呈現(xiàn)hNu陽(yáng)性，由此可知，NPC^PSA-NCAM+細(xì)胞具有優(yōu)秀的生存率和在被損傷的腦組織中的存活率。比例尺：20μm。圖3d為示出在大部分的間充質(zhì)干細(xì)胞移植組的針道(needle tract)周?chē)鷻z測(cè)出一些增殖的Ki67⁺hNu^-細(xì)胞的圖。比例尺：200μm。

在圖3b從左側(cè)開(kāi)始是有關(guān)DCX/DAPI、Ki67/DAPI、DCX/Ki67/DAPI、Tuj1/DAPI、Nestin/Ki67/DAPI的圖。在圖3c從左側(cè)開(kāi)始向順時(shí)針?lè)较蚴怯嘘P(guān)DAPI、hNu、hNU/DCX、DCX的圖。在圖3d從左側(cè)開(kāi)始是有關(guān)hNU/DAPI、Ki37/DAPI、hNU/Ki67的圖。

圖4為示出在大鼠腦組織NPC^PSA-NCAM+對(duì)神經(jīng)組織的貢獻(xiàn)以及對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞活性化的減少效果的圖。圖4a為示出在移植NPC^PSA-NCAM+的大鼠腦檢測(cè)出hMito⁺(紅色)及MAP2⁺(綠色)細(xì)胞的圖。比例尺：20μm。圖4b為被移植的細(xì)胞的移植26日后的共聚焦圖像。供體來(lái)源細(xì)胞(綠色，hNu⁺)與MAP2⁺(紅色)共同位于NPC^PSA-NCAM+移植部位。DAPI為藍(lán)色。圖4c示出在對(duì)側(cè)紋狀體的宿主神經(jīng)細(xì)胞沒(méi)有與MAP2同時(shí)存在的hMi的圖?？芍?，在紋狀體明顯地存在MAP2⁺細(xì)胞。比例尺：20μm。圖4d為示出在移植NPC^PSA-NCAM+的大鼠腦未檢測(cè)出hMito⁺GFAP⁺細(xì)胞的圖。比例尺：20μm。圖4e為示出在NPC^PSA-NCAM+移植組同側(cè)紋狀體的ED-1陽(yáng)性被顯著減少以及在間充質(zhì)干細(xì)胞移植組減少程度小于上述NPC^PSA-NCAM+移植組的圖。NPC^PSA-NCAM+移植組及間充質(zhì)干細(xì)胞移植組均與磷酸鹽緩沖鹽水組呈現(xiàn)顯著的差異。相對(duì)于間充質(zhì)干細(xì)胞組或磷酸鹽緩沖鹽水組，在NPC^PSA-NCAM+移植組GFAP的表達(dá)被顯著減少。比例尺：200μm。在至少5個(gè)單獨(dú)的顯微鏡區(qū)域?qū)D1或GFAP陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)值用±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。進(jìn)行各組之間的多重比較的結(jié)果，分別為*P<0.05及***P<0.001。

圖5為示出在移植NPC^PSA-NCAM+的大鼠腦缺血促進(jìn)血管生成的圖。圖5a為分別示出磷酸鹽緩沖鹽水組、NPC^PSA-NCAM+或間充質(zhì)干細(xì)胞移植組的缺血性腦的免疫染色結(jié)果的圖。比例尺：200μm。圖5b為示出NPC^PSA-NCAM+移植部位的宿主起源α-SMA-陽(yáng)性血管上皮細(xì)胞(紅色)的代表圖像的圖。比例尺：20μm。圖5c為示出移植NPC^PSA-NCAM+或間充質(zhì)干細(xì)胞的大鼠中的α-SMA-陽(yáng)性微血管地定量分析結(jié)果的圖。檢測(cè)值用±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。對(duì)*NPC^PSA-NCAM+組和間充質(zhì)干細(xì)胞或*NPC^PSA-NCAM+組和磷酸鹽緩沖鹽水組進(jìn)行比較的結(jié)果，分別為P<0.05及P<0.01。圖5d為示出通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)在抑制NPC^PSA-NCAM+(NPC)或間充質(zhì)干細(xì)胞后的7日及26日對(duì)缺血性腦中的大鼠-促血管生成素-1表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果的圖。并且，示出對(duì)促血管生成素-1的逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增(上部分)及空白對(duì)照組(基準(zhǔn)值)進(jìn)行磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)標(biāo)準(zhǔn)化的信使核糖核酸(mRNA)水準(zhǔn)(下部分)的定量化結(jié)果。檢測(cè)值用±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。與*磷酸鹽緩沖鹽水組相比，P<0.05。

圖6為示出利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)對(duì)移植NPC^PSA-NCAM+、間充質(zhì)干細(xì)胞或磷酸鹽緩沖鹽水的腦缺血中的大鼠及人類(lèi)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)水準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果的圖。并且，示出對(duì)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增及空白對(duì)照組(基準(zhǔn)值)(每組n＝3)進(jìn)行磷酸甘油醛脫氫酶標(biāo)準(zhǔn)化的信使核糖核酸水準(zhǔn)的定量化結(jié)果。檢測(cè)值用±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。與*磷酸鹽緩沖鹽水組相比，P<0.05。

圖7為示出磷酸鹽緩沖鹽水對(duì)照組、培養(yǎng)基對(duì)照組及分泌蛋白質(zhì)組處理組的缺血性病變部位的大小的圖。

圖8為示出磷酸鹽緩沖鹽水對(duì)照組、培養(yǎng)基對(duì)照組及分泌蛋白質(zhì)組處理組的體重變化的圖。

圖9為示出磷酸鹽緩沖鹽水對(duì)照組、培養(yǎng)基對(duì)照組及分泌蛋白質(zhì)組處理組的行為分析結(jié)果的圖。圖9a示出平衡木試驗(yàn)結(jié)果，圖9b示出抓握牽引試驗(yàn)結(jié)果，圖9c示出前肢踩空試驗(yàn)結(jié)果，圖9d示出各單位時(shí)間的行為活躍度的線(xiàn)截面(line cross)結(jié)果。

圖10為示出磷酸鹽緩沖鹽水對(duì)照組、培養(yǎng)基對(duì)照組及分泌蛋白質(zhì)組處理組的綜合行動(dòng)神經(jīng)改善效果(改良神經(jīng)功能評(píng)分)分析結(jié)果的圖。

在圖7至圖10中，*P值(value)<0.05，**P值<0.01。

具體實(shí)施方式

以下，通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說(shuō)明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，這些實(shí)施例僅用于更具體地說(shuō)明本發(fā)明，并且根據(jù)本發(fā)明的主旨，本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限定于這些實(shí)施例。

實(shí)施例

實(shí)施例1.多聚唾液酸神經(jīng)細(xì)胞粘附分子-陽(yáng)性神經(jīng)前體細(xì)胞對(duì)缺血性疾病和神經(jīng)炎癥性疾病的治療效果

實(shí)驗(yàn)方法

來(lái)源于人類(lèi)間充質(zhì)干細(xì)胞及人類(lèi)胚胎干細(xì)胞的NPC^PSA-NCAM+細(xì)胞的培養(yǎng)及分化

人類(lèi)細(xì)胞的使用已結(jié)構(gòu)醫(yī)學(xué)研究倫理審查委員會(huì)(Institutional Review Board，IRB No.4-2008-0643)的批準(zhǔn)。人類(lèi)骨髓從提出知情同意書(shū)的健康的成人志愿者的后部髂嵴獲取。如下的簡(jiǎn)要說(shuō)明獲取方法，即，利用密度梯度離心分離(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)分離骨髓單核細(xì)胞，在投入10％的空腹血糖(FBS)(Gibco，GrandIsland，NY)的DMEM放置上述骨髓單核細(xì)胞后，在37℃的溫度下，在包含5％的CO₂的加濕空氣中進(jìn)行培養(yǎng)。在24小時(shí)后，清洗并去除非吸附細(xì)胞。每3日更換培養(yǎng)液，在細(xì)胞匯合度達(dá)到90％的情況下，利用0.05％的胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(Invitrogen，Carlsbad，CA)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

在本實(shí)驗(yàn)使用完成3～5傳代的吸附間充質(zhì)干細(xì)胞。為了誘導(dǎo)神經(jīng)，在無(wú)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人類(lèi)胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基(Invitrogen)上，在包含5μM的游離堿(DM，dorsomorphin)(Sigma，St。Louis，MO)及5～10μM的SB431542(Calbiochem，San Diego，CA)的懸浮液培養(yǎng)4日來(lái)源于人類(lèi)胚胎干細(xì)胞的類(lèi)胚體(embryoid bodies，EBs)，然后在投入20ng/ml的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的1XN2(Invitrogen)培養(yǎng)基中5日左右吸附于包被基質(zhì)膠的培養(yǎng)皿(BD Biosciences，Bedford，MA)((Kim，D.S.，Lee，D.R.，Kim，H.S.，et al.(2012).PLoSOne，7，e39715)。利用pulled玻璃吸管從周邊的扁平細(xì)胞小心地分離出現(xiàn)在所吸附的EB菌落的中心的神經(jīng)叢。在涂敷有基質(zhì)膠的培養(yǎng)皿使小叢塊進(jìn)行煮沸，并在投入1XN2、1XB27(Invitrogen)的DMEM/F12進(jìn)行培養(yǎng)(Kim，D.S.，Lee，J.S.，Leem，J.W.，et al.(2010).Stem Cell Reviews and Reports，6，270-281)。

借助磁性激活細(xì)胞分選機(jī)的多聚唾液酸神經(jīng)細(xì)胞粘附分子-陽(yáng)性神經(jīng)前體細(xì)胞的分離

在10μM的Y27632(Sigma)暴露1小時(shí)左右完成80～90％合流的被擴(kuò)增的神經(jīng)叢，以防止在進(jìn)行磁性激活細(xì)胞分選機(jī)步驟之前發(fā)生細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象。在利用Accutase(Invitrogen)完成分離后，在包含1％的牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽緩沖鹽水使細(xì)胞(～1×10⁸cells)成塊，并與結(jié)合有微珠(Miltenyi Biotec)的抗多聚唾液酸神經(jīng)細(xì)胞粘附分子抗體共同在4℃的溫度下培養(yǎng)15分鐘。在徹底清洗完畢后，將細(xì)胞懸浮液放入磁性細(xì)胞分選機(jī)(MASC，magnetic activated cell sorting)，并用管洗脫殘留在色譜柱的標(biāo)記陽(yáng)性的細(xì)胞。將所分離的NPC^PSA-NCAM+以4～5×10⁵cells/cm²的濃度重新放置于添加有N2B27培養(yǎng)基或20ng/ml的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的NBG培養(yǎng)基(投入1XN2、0.5XB27及0.5×G21)(GeminiBio-Products，WestSacramento，CA)。培養(yǎng)培養(yǎng)基每天進(jìn)行更換，細(xì)胞按2～3日進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

腦卒中模型的確立及NPC^PSA-NCAM+的定位注射(stereotaxic injection)

在N₂O與O₂之比為70％～30％的條件下，使用3％的異氟烷(HanaPharm，Seoul，Korea)對(duì)2周齡的雄性斯普拉-道來(lái)(Sprague-Dawley)大鼠(體重為約250～300g)進(jìn)行麻醉。分離左側(cè)頸總動(dòng)脈及外頸動(dòng)脈，并用4-0手術(shù)用縫合線(xiàn)連接。向左側(cè)內(nèi)頸動(dòng)脈插入尼龍線(xiàn)，并移動(dòng)至韋利斯氏環(huán)(永久性大腦中動(dòng)脈阻塞：permanent middle cerebral artery occlusion，大腦中動(dòng)脈閉塞)，遺留線(xiàn)，直到犧牲大鼠。

在大腦中動(dòng)脈閉塞2日后，進(jìn)行NPC^PSA-NCAM+、間充質(zhì)干細(xì)胞或磷酸鹽緩沖鹽水的定位注射。使用舒泰(VirbacS。A。，F(xiàn)rance，25mg/kg)麻醉大鼠，并放置于正位外科手術(shù)工具(David Kopf Instruments，Tujunga，CA)。向左側(cè)紋狀體(striatum)(從前囟的坐標(biāo)：前后側(cè)(anteroposterior)+0.7mm，內(nèi)外側(cè)(mediolateral)-2mm及背腹側(cè)(dorsoventral)-5.5mm，從腦膜(meninges)-2.5mm)插入A26號(hào)針頭(Hamilton syringe，Hamilton，Reno，NV)；向5.5mm及-2.5mm部位注射5μl的NPC^PSA-NCAM+、間充質(zhì)干細(xì)胞(分別1×10⁵cells/μl)或磷酸鹽緩沖鹽水。通過(guò)持續(xù)的攪拌來(lái)防止細(xì)胞凝集，并向左側(cè)紋狀體以1μl/min的速度注射所有細(xì)胞。9只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在大腦中動(dòng)脈閉塞手術(shù)及細(xì)胞移植過(guò)程中死亡。

在12小時(shí)明/暗循環(huán)的條件下，在實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物護(hù)理評(píng)估和鑒定協(xié)會(huì)(AAALAC，Association for Assessment and Accreditation of Laboratry Animal Care)批準(zhǔn)的設(shè)施中飼養(yǎng)所有動(dòng)物。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)接受了醫(yī)學(xué)研究倫理審查委員會(huì)(Institutional Review Board，IRBNo。4-2011-0087)的批準(zhǔn)。

行為試驗(yàn)

前肢踩空試驗(yàn)(Foot fault test)：前肢踩空試驗(yàn)用于檢測(cè)在2分鐘的試驗(yàn)過(guò)程中準(zhǔn)確地將前爪放置于等距離柵板(equi-distant grid，60×60cm，6cm長(zhǎng)度)的程度。上述試驗(yàn)基于現(xiàn)有的研究并根據(jù)變更的步驟執(zhí)行[12，13]。

不對(duì)稱(chēng)行為試驗(yàn)(Asymmetric behavior test)：利用已報(bào)告的變更的抬高身體搖擺試驗(yàn)(EBST，elevated body swing test)。將大鼠的尾巴抬高至實(shí)驗(yàn)區(qū)域表面的10cm后檢測(cè)側(cè)面運(yùn)動(dòng)。檢測(cè)1分鐘向右側(cè)或左側(cè)的搖擺(swing)頻度。如下的計(jì)算了不對(duì)稱(chēng)分?jǐn)?shù)值：0分-扭轉(zhuǎn)軀干，向左側(cè)或右側(cè)搖擺，1分-<30°的不對(duì)稱(chēng)扭轉(zhuǎn)，2分->30°的不對(duì)稱(chēng)扭轉(zhuǎn)。根據(jù)扭轉(zhuǎn)軀干的方向，分?jǐn)?shù)按同側(cè)扭轉(zhuǎn)(同側(cè)twist，與梗塞部位相同的方向)或相反側(cè)扭轉(zhuǎn)(contralateral twist，與梗塞部位相反的方向)計(jì)算。

平衡木試驗(yàn)(Beam balance test)：橫梁步行機(jī)構(gòu)由橫梁(100×5×2cm)形成。運(yùn)動(dòng)能力按現(xiàn)有研究中使用的6分單位進(jìn)行評(píng)價(jià)：1分-在橫梁上實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的姿勢(shì)以及用爪子實(shí)現(xiàn)平衡，2分-抓住橫梁的側(cè)面并進(jìn)行搖擺動(dòng)作，3分-一只以上的爪子掉落，4分-試圖保持平衡而掉落，5分-搭載橫梁而掉落，6分-沒(méi)有試圖保持平衡而掉落。

抓握牽引試驗(yàn)(Prehensile traction test)：試驗(yàn)中的能否抓握是通過(guò)大鼠用前爪吊在水平方向的繩索的能力進(jìn)行檢測(cè)。抓握牽引試驗(yàn)是為了評(píng)價(jià)大鼠的肌肉強(qiáng)度而進(jìn)行。該試驗(yàn)是通過(guò)現(xiàn)有的方法進(jìn)行。將鐵棒(直徑2cm，長(zhǎng)度100cm)水平放置于海綿橡膠墊(厚度7.5cm)的70cm的上方。使大鼠的前爪位于鐵棒后放開(kāi)大鼠。使大鼠掛在鐵棒5秒鐘。通過(guò)計(jì)算掉下來(lái)所花費(fèi)的時(shí)間和是否將后爪放在鐵棒來(lái)如下的計(jì)算分?jǐn)?shù)：0分-大鼠懸掛5秒鐘且后爪沒(méi)有掉下來(lái)，1分–大鼠懸掛5秒鐘且后爪掉下來(lái)；2分-大鼠懸掛3～4秒鐘，3分-大鼠懸掛0～2秒鐘。

改良神經(jīng)功能評(píng)分(mNSS，Modified neurological severity score)：神經(jīng)障礙分?jǐn)?shù)通過(guò)結(jié)合運(yùn)動(dòng)、知覺(jué)及反射神經(jīng)檢查來(lái)導(dǎo)出，并使用現(xiàn)有的方法進(jìn)行?？陀^定量化基于不對(duì)稱(chēng)行為試驗(yàn)、平衡木試驗(yàn)、抓握牽引試驗(yàn)、曠場(chǎng)試驗(yàn)(旋轉(zhuǎn)頻度)及前肢踩空試驗(yàn)實(shí)現(xiàn)，并如下地計(jì)算分?jǐn)?shù)：0分-無(wú)缺陷，2分-很難完全伸展相反側(cè)前腿(3≤front foot fault<10)，4分-無(wú)法伸展相反側(cè)前腿(front foot fault≥10)，6分-向相反側(cè)些許旋轉(zhuǎn)(1≤旋轉(zhuǎn)或不對(duì)稱(chēng)扭轉(zhuǎn)<5)，8分-旋轉(zhuǎn)得厲害(旋轉(zhuǎn)或不對(duì)稱(chēng)扭轉(zhuǎn)≥5)，10分-向相反側(cè)掉落(抓握牽引≤2)。

免疫組織化學(xué)分析及定量化

用4％的甲醛固定腦組織24小時(shí)左右，并用磷酸鹽緩沖鹽水清洗。為了制備石蠟截面，在遞增乙醇對(duì)組織進(jìn)行脫水，并包埋在石蠟。在顯微鏡用薄片切片機(jī)上以5mm厚度層切割包埋在石蠟的腦，在二甲苯進(jìn)行10分鐘脫石蠟化后，在遞增酒精進(jìn)行再水化。向截面處理1小時(shí)左右的10mM的檸檬酸后，添加含有磷酸鹽緩沖鹽水及0.5％的氚核X-100的5％的牛血清白蛋白溶液。然后，在4℃的溫度下與針對(duì)DCX(Abcam)、Tuj1(Covance)、hNu(Millipore，clone235-1)、GFAP(Millipore)、Ki67(Leica Microsystems)、hMito(Millipore)、MAP2(Millipore)、人類(lèi)Nestin(Millipore，clone10C2)或ED-1(Abcam)(1：100)的第一抗體共同培養(yǎng)腦切片10～12小時(shí)。與第一抗體共同培養(yǎng)過(guò)夜后，用磷酸鹽緩沖鹽水清洗切片，將切片與被熒光標(biāo)記的作為第二抗體的抗兔IgG培養(yǎng)31小時(shí)左右。重新用磷酸鹽緩沖鹽水清洗一次切片，并利用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，4’，6’-diamidino-2-phenylindole)進(jìn)行裝片。利用熒光顯微鏡(OlympusIX71)來(lái)獲取切片的熒光圖像。為了準(zhǔn)確地檢測(cè)在腦組織內(nèi)與特定抗體反應(yīng)的神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量，而利用盲試。使預(yù)先不知道實(shí)驗(yàn)的三名實(shí)驗(yàn)者檢查幻燈片內(nèi)的5個(gè)50mm²四角形內(nèi)的ED-1⁺細(xì)胞及α-SMA⁺血管(直徑為50mm以下)的數(shù)量。然后，調(diào)查者通過(guò)綜合三名實(shí)驗(yàn)者的結(jié)果來(lái)準(zhǔn)確地決定所檢測(cè)的神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量。

在移植26日后，利用舒泰(VirbacS。A。，F(xiàn)rance，25mg/kg)對(duì)大鼠(每組10只)進(jìn)行麻醉，并利用包含在磷酸鹽緩沖鹽水及磷酸鹽緩沖鹽水的4％的多聚甲醛(pH7.5)進(jìn)行灌注。

為了檢測(cè)梗塞部位，以蘇木精對(duì)腦切片進(jìn)行染色，并利用顯微鏡(Zeiss，Oberkochen，Germany)進(jìn)行拍攝。計(jì)算從相反側(cè)半球的梗塞面積減去同側(cè)半球的梗塞面積的間接損傷部位。通過(guò)NIHImageJ程序(1.47版本)對(duì)相對(duì)梗塞面積進(jìn)行分析。顯示與相反側(cè)半球進(jìn)行比較的間接損傷的平均百分比。

逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)

利用Trizol試劑(Invitrogen)來(lái)分離總核糖核酸(RNA)。首選，利用轉(zhuǎn)錄酶(Transcriptase)Ⅱ(Invitrogen)來(lái)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)逆轉(zhuǎn)錄(RT)后，利用如下的引物集進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)：促血管生成素1正向引物：TGTGTCCATCAGCTCCAGTTGC(序列列表第一序列)，反向引物：CGGCTACCATGCTCGAGATAGG(序列列表第二序列)(Bioneer，Daejeon，Korea)。將聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)接在1.2％的瓊脂糖凝膠旋后，利用溴化乙錠進(jìn)行染色，并從紫外光檢測(cè)出條帶(約400bp)。最后，利用NIHImageJ程序(版本1.47)對(duì)所檢測(cè)出的條帶進(jìn)行定量化。

統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)以平均±標(biāo)準(zhǔn)誤差顯示。利用社會(huì)科學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件(SPSS，Statistical Package for Social Sciences，版本20.0)并使用方差分析法(ANOVA)及獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)行為試驗(yàn)及梗塞面積的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。當(dāng)P-values<0.05時(shí)，視為具有統(tǒng)計(jì)顯著性。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

NPC^PSA-NCAM+的移植減少宿主腦的梗塞部位。

圖1a示出本發(fā)明的整體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。神經(jīng)組織的損傷程度通過(guò)在移植26日后利用蘇木精無(wú)法正常染色的腦部位(area)進(jìn)行評(píng)價(jià)。梗塞部位主要顯示在大腦皮質(zhì)及紋狀體。相對(duì)于移植間充質(zhì)干細(xì)胞或NPC^PSA-NCAM+的情況，梗塞部位在處理磷酸鹽緩沖鹽水的缺血性腦中明確地更寬(圖1b)。相對(duì)于磷酸鹽緩沖鹽水組(25.1±2.4％)，針對(duì)相反側(cè)的梗塞面積的百分比在移植NPC^PSA-NCAM+(7.1±2.5％)或間充質(zhì)干細(xì)胞(14.9±1.9％)的組中被顯著地減少(F＝13.64，P<0.01)。雖然NPC^PSA-NCAM+移植組及間充質(zhì)干細(xì)胞移植組之間的梗塞沒(méi)有明顯地差異，但NPC^PSA-NCAM+移植組的梗塞面積明顯地更窄于間充質(zhì)干細(xì)胞移植組(圖1c)。

NPC^PSA-NCAM+的移植在大鼠腦卒中模型中提升行動(dòng)能力。

相對(duì)于在大腦中動(dòng)脈閉塞1日后檢測(cè)的基準(zhǔn)值，大鼠的體重被減少40g。體重減少在磷酸鹽緩沖鹽水處理大鼠的7日后達(dá)到頂點(diǎn)。在間充質(zhì)干細(xì)胞移植組中，體重在移植17日后恢復(fù)到基礎(chǔ)階段。但是，與磷酸鹽緩沖鹽水組相比，在NPC^PSA-NCAM+移植組中，從移植3日后開(kāi)始檢測(cè)出顯著的體重恢復(fù)(P<0.05)(圖2a)。從大腦中動(dòng)脈閉塞后的3日(P<0.05)至13日(P<0.01)，與磷酸鹽緩沖鹽水組相比，踩空/線(xiàn)截面頻度在NPC^PSA-NCAM+移植組及間充質(zhì)干細(xì)胞移植組被顯著地減少(圖2b)。而且，與間充質(zhì)干細(xì)胞移植組相比，NPC^PSA-NCAM+移植組在13日也顯著減少踩空/線(xiàn)截面。但是，這種差異隨著此后的(移植后的17日及24日)體重增加而引起的活動(dòng)性減少變得不明顯。

在大腦中動(dòng)脈閉塞之前，所有大鼠在電子血液跟蹤系統(tǒng)(EBTS)呈現(xiàn)相對(duì)低的不對(duì)稱(chēng)性，相反地，在大腦中動(dòng)脈閉塞后，明確觀察到所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的不對(duì)稱(chēng)性。在移植3日后，在NPC^PSA-NCAM+移植組及間充質(zhì)干細(xì)胞移植組開(kāi)始出現(xiàn)同側(cè)扭轉(zhuǎn)行為。間充質(zhì)干細(xì)胞移植組直到移植13日呈現(xiàn)緩慢的上升趨勢(shì)(P<0.05)，相反地，NPC^PSA-NCAM+移植組的不對(duì)稱(chēng)行為分?jǐn)?shù)從移植7日后開(kāi)始顯著地減少，并持續(xù)到24日(P<0.01)(圖2c)。

與間充質(zhì)干細(xì)胞移植組及磷酸鹽緩沖鹽水組相比，NPC^PSA-NCAM+移植還改善了從3日到24日之間的平衡木試驗(yàn)中的功能恢復(fù)(P<0.01)(圖2d)。NPC^PSA-NCAM+移植顯著地增加了用于反應(yīng)運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)能力的在橫梁上維持的小時(shí)，但在間充質(zhì)干細(xì)胞處理組及磷酸鹽緩沖鹽水處理組未呈現(xiàn)統(tǒng)計(jì)上的差異。

與前爪的肌肉強(qiáng)度具有陰性相互關(guān)系的抓握牽引分?jǐn)?shù)在NPC^PSA-NCAM+移植組中的3～24日之間逐漸減少(P<0.01)(圖2e)。間充質(zhì)干細(xì)胞移植組也在移植7～24日后呈現(xiàn)了類(lèi)似的改善模式。

為了使神經(jīng)恢復(fù)效果的定量化標(biāo)準(zhǔn)化，本發(fā)明者最后基于不對(duì)稱(chēng)行為分?jǐn)?shù)、平衡木試驗(yàn)、抓握牽引試驗(yàn)、曠場(chǎng)試驗(yàn)(旋轉(zhuǎn)頻度，未公開(kāi)數(shù)據(jù))及前肢踩空試驗(yàn)對(duì)改良神經(jīng)功能評(píng)分基準(zhǔn)進(jìn)行了評(píng)價(jià)。改良神經(jīng)功能評(píng)分示出了如下的內(nèi)容，即，與磷酸鹽緩沖鹽水處理組相比，在NPC^PSA-NCAM+移植組及間充質(zhì)干細(xì)胞移植組中，逐漸的神經(jīng)功能恢復(fù)從3日逐漸開(kāi)始呈現(xiàn)(P<0.05)(圖2f)。不僅如此，與間充質(zhì)干細(xì)胞移植組相比，NPC^PSA-NCAM+移植組從7日至24日還呈現(xiàn)出實(shí)質(zhì)性的改善(P<0.01)。NPC^PSA-NCAM+移植組的效果尤其在3日至7之間明確地呈現(xiàn)，由此可知，在移植初始具有強(qiáng)有力的旁分泌(paracrine)。

被移植的NPC^PSA-NCAM+在宿主腦中生存，并分化為神經(jīng)系統(tǒng)。

為了追蹤被移植的細(xì)胞的密度，本發(fā)明者在26日利用針對(duì)hNu(人類(lèi)-特異性核)、Ki67(增殖細(xì)胞標(biāo)記)、DCX(神經(jīng)母細(xì)胞標(biāo)記)、巢蛋白(神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記)及Tuj1(神經(jīng)標(biāo)記)的抗體進(jìn)行組織化學(xué)分析。在移植NPC^PSA-NCAM+后，大部分的細(xì)胞在初始移植部位(例如，紋狀體)被發(fā)現(xiàn)。被移植的NPC^PSA-NCAM+的生存、增殖及分化通過(guò)已損傷的腦中的Ki67⁺、DCX⁺、Tuj1⁺及巢蛋白⁺的存在來(lái)確認(rèn)(圖3a及圖3b)。被移植的大部分NPC^PSA-NCAM+細(xì)胞表達(dá)DCX或Tuj1，而一部分針對(duì)巢蛋白具有陽(yáng)性。被移植的細(xì)胞的有絲分裂步驟通過(guò)Ki67-免疫反應(yīng)性進(jìn)行調(diào)差。hNu⁺細(xì)胞(9184個(gè))的一部分在移植后的26日也對(duì)Ki67具有陽(yáng)性(432個(gè)，4.7％)。NPC^PSA-NCAM+細(xì)胞中的Tuj-1免疫反應(yīng)性與DCX免疫反應(yīng)性廣泛地重疊(圖3b)。這些DCX免疫反應(yīng)性細(xì)胞并不是來(lái)源于大鼠的細(xì)胞，而是來(lái)源于人類(lèi)的細(xì)胞(圖3c)，由此可知，腦梗塞部位的減少部分起源于被移植的細(xì)胞的融合。

許多被移植的NPC^PSA-NCAM+細(xì)胞呈現(xiàn)優(yōu)秀的生存率，并且被編入至已損傷的組織，但是用于表達(dá)hNu的間充質(zhì)干細(xì)胞在移植26日后僅檢測(cè)出少許細(xì)胞(圖3d)。大部分的被移植的NPC^PSA-NCAM+細(xì)胞為未成熟神經(jīng)細(xì)胞(例如，DCX陽(yáng)性，部分為Ki67陽(yáng)性細(xì)胞)(圖3b)。相反地，被移植的間充質(zhì)干細(xì)胞(hNu⁺細(xì)胞)在損傷部位并未呈現(xiàn)DCX陽(yáng)性，在大部分的間充質(zhì)干細(xì)胞移植組中，少數(shù)的增殖中的hNu^-Ki67⁺細(xì)胞存在于針道內(nèi)部及周?chē)?圖3d)。

在移植NPC^PSA-NCAM+的大鼠檢測(cè)出hMito⁺MAP2⁺及hNu⁺MAP2⁺雙重標(biāo)記細(xì)胞(圖4a及4b)，但幾乎未檢測(cè)出hMito⁺GFAP⁺(圖4d)或hMito⁺GalC⁺(未公開(kāi)數(shù)據(jù))共-染色細(xì)胞，由此可知，NPC^PSA-NCAM+細(xì)胞為主要參與神經(jīng)系統(tǒng)的前體細(xì)胞。在對(duì)側(cè)紋狀體中幾乎未檢測(cè)到hMito⁺細(xì)胞(圖4c)。

NPC^PSA-NCAM+的移植在宿主腦中抑制反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞的活性。

少許GFAP(星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記)-陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn)在針道內(nèi)部及周?chē)?，但GFAP的表達(dá)在NPC^PSA-NCAM+移植組中明顯地較少(圖4e)。事實(shí)上，GFAP-陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量在NPC^PSA-NCAM+移植組被大大地減少(P<0.001)，在間充質(zhì)干細(xì)胞移植組其減少程度較低(圖4e及圖4f)。由此可知，NPC^PSA-NCAM+移植強(qiáng)有力地抑制反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性化，并由此形成對(duì)組織重生有利的環(huán)境(Gonzalez，F(xiàn).F.，McQuillen，P.，Mu，D.，et al.(2007).Developmental Neuroscience，29，321-330)。

缺血性腦卒中誘導(dǎo)因組織損傷而產(chǎn)生的小膠質(zhì)細(xì)胞的相反的反應(yīng)。對(duì)此，本發(fā)明者在移植后的26日利用用于識(shí)別CD68(活性小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記)的ED1抗體來(lái)對(duì)缺血腦組織中的小膠質(zhì)細(xì)胞地活性化進(jìn)行了調(diào)查(圖4e)。值得注意的是，ED1-陽(yáng)性細(xì)胞在NPC^PSA-NCAM+組被顯著地減少(P<0.001)，而間充質(zhì)干細(xì)胞移植組的減少程度小于上述NPC^PSA-NCAM+組(P<0.05)(圖4f)。雖然，紋狀體內(nèi)的Nu+細(xì)胞在6月后被檢測(cè)出，但在移植NPC^PSA-NCAM+的腦的移植部位或其它部位完全沒(méi)有畸胎瘤的痕跡。

NPC^PSA-NCAM+移植促進(jìn)宿主腦中的血管生成。

利用作為平滑肌肌動(dòng)蛋白標(biāo)記的α-SMA的抗體對(duì)缺血性腦中的內(nèi)源性血管生成進(jìn)行調(diào)查。其結(jié)果可知，與間充質(zhì)干細(xì)胞處理組及磷酸鹽緩沖鹽水處理組相比，NPC^PSA-NCAM+移植大鼠中α-SMA反應(yīng)性血管的數(shù)量在移植部位周?chē)黾?圖5a，圖5b)。通過(guò)微血管的定量分析，明確確認(rèn)到與間充質(zhì)干細(xì)胞處理組及磷酸鹽緩沖鹽水處理組相比，NPC^PSA-NCAM+移植大鼠的α-SMA+血管在梗塞部位增加(圖5c)。

在移植7日及26日后，利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)對(duì)腦組織中的作為血管生成誘發(fā)因子的促血管生成素-1的表達(dá)水準(zhǔn)進(jìn)行調(diào)查的結(jié)果，在第26日，NPC^PSA-NCAM+移植大鼠中的表達(dá)水準(zhǔn)顯著地高于其它組(P<0.05)(圖5d)，由此可知，由長(zhǎng)時(shí)間生存的NPC^PSA-NCAM+誘導(dǎo)血管新生。在移植后的26日與移植后的7日的相比，NPC^PSA-NCAM+移植的大鼠呈現(xiàn)出促血管生成素-1增加的模式，相反地，間充質(zhì)干細(xì)胞處理大鼠的促血管生成素-1與其7日的相比，沒(méi)發(fā)生變化或者略有減少。但是，與磷酸鹽緩沖鹽水處理組相比，間充質(zhì)干細(xì)胞處理大鼠在7日呈現(xiàn)增加的模式(P<0.05)。

實(shí)施例2.針對(duì)神經(jīng)前體細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)組的缺血性疾病和神經(jīng)炎癥性疾病的治療效果

實(shí)驗(yàn)材料及實(shí)驗(yàn)方法

來(lái)源于人類(lèi)胚胎干細(xì)胞的NPC^PSA-NCAM+細(xì)胞的獲得

人類(lèi)細(xì)胞的使用受到醫(yī)學(xué)研究倫理審查委員會(huì)(Institutional Review Board，IRBNo.4-2008-0643)的批準(zhǔn)。為了神經(jīng)誘導(dǎo)，在沒(méi)有堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的人類(lèi)胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基(Invitrogen)上，在包含5μM的游離堿(Sigma，St。Louis，MO)及5～10μM的SB431542(Calbiochem，SanDiego，CA)的懸浮液培養(yǎng)來(lái)源于人類(lèi)胚胎干細(xì)胞和iPSC的各類(lèi)胚體(embryoid bodies，EBs)4日后，在投入的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的1XN2(Invitrogen)培養(yǎng)基中5日左右吸附于包被基質(zhì)膠的培養(yǎng)皿(BD Biosciences，Bedford，MA)(Kim，D.S.，Lee，D.R.，Kim，H.S.，et al.(2012).Highly pure and expandable PSA-NCAM-positive neural precursors from human ESC and iPSC-derived neural rosettes.PLoSOne，7，e39715)。利用玻璃吸管從周邊的扁平細(xì)胞小心地分離出現(xiàn)在所吸附的EB菌落的中心的神經(jīng)叢。在涂敷有基質(zhì)膠的培養(yǎng)皿使小叢塊進(jìn)行煮沸，并在投入1XN2、1XB27(Invitrogen)的DMEM/F12進(jìn)行培養(yǎng)(Kim，D.S.，Lee，J.S.，Leem，J.W.，et al.(2010).Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity.Stem Cell Reviews and Reports，6，270-281)。

在10μM的Y27632(Sigma)暴露1小時(shí)左右完成80～90％合流的被擴(kuò)增的神經(jīng)叢，以防止在進(jìn)行磁性激活細(xì)胞分選機(jī)步驟之前發(fā)生細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象。在利用Accutase(Invitrogen)完成分離后，在包含1％的牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖鹽水使細(xì)胞(～1×10⁸cells)成塊，并與結(jié)合有微珠(MiltenyiBiotec)的抗多聚唾液酸神經(jīng)細(xì)胞粘附分子抗體共同在4℃的溫度下培養(yǎng)15分鐘。在徹底清洗完畢后，將細(xì)胞懸浮液放入磁性細(xì)胞分選機(jī)，并用管洗脫殘留在色譜柱的標(biāo)記陽(yáng)性的細(xì)胞。將所分離的NPC^PSA-NCAM+以4～5×10⁵cells/cm²的濃度重新放置于添加有N2B27培養(yǎng)基或的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的NBG培養(yǎng)基(投入1XN2、0.5XB27及0.5×G21)(GeminiBio-Products，WestSacramento，CA)。培養(yǎng)培養(yǎng)基每天進(jìn)行更換，細(xì)胞按2～3日進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

在來(lái)源于人類(lèi)全分化能干細(xì)胞的神經(jīng)前體細(xì)胞(神經(jīng)前體細(xì)胞)中分泌蛋白質(zhì)組的分離

將從上述過(guò)程中獲得的來(lái)源于人類(lèi)全程干細(xì)胞的神經(jīng)前體細(xì)胞(多聚唾液酸神經(jīng)細(xì)胞粘附分子-陽(yáng)性神經(jīng)前體細(xì)胞)放入基本培養(yǎng)液(DMEM/F-12)，并投入N2(100×-最終濃度1X)、B-27(50×-最終濃度0.5X)及Gem21(50×-最終濃度0.5X)的血清清除補(bǔ)充劑，添加堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子并在涂敷有基質(zhì)膠(Matrigel)的60mm培養(yǎng)皿反復(fù)培養(yǎng)4傳代以上，在完成擴(kuò)增后，在8～10個(gè)培養(yǎng)皿培養(yǎng)至填滿(mǎn)約90％的細(xì)胞。在去除培養(yǎng)液后，以磷酸緩沖溶液清洗3次，向無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)液(DMEM/F12)僅添加ITS(100×-最終濃度1X)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子并培養(yǎng)24小時(shí)。在對(duì)照組中，在無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)皿投入相同量的相同構(gòu)成的培養(yǎng)液(向基礎(chǔ)培養(yǎng)液添加相同量的ITS和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)，在培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)左右后，將回收的作為對(duì)照組使用。收集所有培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離(在800g進(jìn)行30分)，在去除細(xì)胞的碎渣等后，立即冷凍于-70℃的冷凍箱，需要時(shí)通過(guò)解凍來(lái)使用。

腦卒中模型的制備

為了檢測(cè)對(duì)因局部腦缺血而產(chǎn)生的神經(jīng)細(xì)胞損傷的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)效果，而使用所應(yīng)用的血管內(nèi)縫合法(intraluminal suture method)。作為ZiaLonga(ZeaLonga，etal，Stroke。，1989，20，84-91)開(kāi)發(fā)的方法的局部腦缺血模型與其他模型不同地具有臨床上類(lèi)似的優(yōu)點(diǎn)。由于這些理由成為適合于針對(duì)缺血-再灌注(ischemia-reperfusion)的機(jī)理研究或者篩選多種藥物的效果的模型。

在循環(huán)一周后，使用呼吸麻醉機(jī)來(lái)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(雄性斯普拉-道來(lái)rat，體重250～300g)進(jìn)行麻醉，作為麻醉劑使用異氟醚(isoflurane)。首先，在混合80％的N₂O和20％的O₂混合氣中以5％的異氟醚對(duì)大白鼠誘導(dǎo)全身麻醉后，并以2～2.5％維持麻醉。為了制備腦卒中模型，在切開(kāi)大白鼠的左側(cè)頸部皮膚后，向內(nèi)側(cè)剝離頸及導(dǎo)出總動(dòng)脈(common carotid artery)、外頸動(dòng)脈(external carotid artery)及內(nèi)頸動(dòng)脈(internal carotid artery)后，利用黑絲輕輕地扎住各個(gè)血管，并切斷血流。切割一半程度的頸總動(dòng)脈，通過(guò)切面對(duì)尼龍縫合線(xiàn)的末端進(jìn)行燒烙，從而插入通過(guò)圓角處理來(lái)制備成0.40mm的25mm的4-0尼龍?zhí)结?probe)。將通過(guò)外頸動(dòng)脈插入的尼龍?zhí)结樈?jīng)過(guò)內(nèi)頸動(dòng)脈插入并固定于大腦中動(dòng)脈部位，在頸總動(dòng)脈分枝插入約18～20mm程度后，堵住大腦中動(dòng)脈的起始部，并用線(xiàn)固定，從而在永久關(guān)閉大腦中動(dòng)脈后，重新縫合皮膚切開(kāi)部位，并從麻醉中自然恢復(fù)。

在腦卒中模型通過(guò)腦動(dòng)脈的分泌蛋白質(zhì)組注射及行為實(shí)驗(yàn)

在誘發(fā)腦卒中1日后，對(duì)行為實(shí)驗(yàn)確立基線(xiàn)(baseline)，然后以與制備腦卒中模型相同的方式通過(guò)右側(cè)外頸動(dòng)脈向內(nèi)頸動(dòng)脈部位插入胰島素針頭，然后通過(guò)上述針頭對(duì)分泌蛋白質(zhì)組動(dòng)脈注射0.2mg/kg(體積)左右，對(duì)對(duì)照組給藥相同體積的培養(yǎng)液或磷酸緩沖溶液(磷酸鹽緩沖鹽水)。在注射分泌蛋白質(zhì)組液體后，觀察動(dòng)物的狀態(tài)14日左右，在注射前檢測(cè)1次體重，在注射后檢測(cè)4次體重，并進(jìn)行行為分析。

①上體姿態(tài)(torso twisting)檢測(cè)：為了試驗(yàn)被視為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的大腦皮質(zhì)和紋狀體知覺(jué)的上體姿態(tài)，而檢測(cè)不對(duì)稱(chēng)運(yùn)動(dòng)行為。

②平衡木(beam balance)試驗(yàn)：通過(guò)使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在窄橫梁上保持穩(wěn)定的平衡姿態(tài)來(lái)評(píng)價(jià)總前庭運(yùn)動(dòng)功能(gross vestibulomotor function)。

③前肢踩空試驗(yàn)(foot-fault test)：作為在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中檢測(cè)運(yùn)動(dòng)行為(motor movement)的調(diào)節(jié)(協(xié)同)和組合(綜合)時(shí)使用的實(shí)驗(yàn)方法，踩空(Foot-fault)是指動(dòng)物的前爪或后爪未放錯(cuò)位置(misplace)或者爪子從柵板(grid bar)之間掉落的情況，踩空在撐場(chǎng)動(dòng)物中不同尋常的對(duì)稱(chēng)。

④抓握牽引試驗(yàn)(Prehensile Traction test)：檢測(cè)中的抓握牽引與否是通過(guò)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可利用前爪掛在水平方向的繩索的能力來(lái)檢測(cè)。抓握牽引試驗(yàn)是為了評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肌肉強(qiáng)度而進(jìn)行的。通過(guò)現(xiàn)有的方法進(jìn)行上述試驗(yàn)。將鐵棒(直徑2cm，長(zhǎng)度100cm)水平放置于海綿橡膠墊(厚度7.5cm)上方的70cm處。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的前爪放置于鐵棒后，松開(kāi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物掛在鐵棒5秒鐘。通過(guò)計(jì)算掉下來(lái)所花費(fèi)的時(shí)間和是否將后爪放在鐵棒來(lái)如下的計(jì)算分?jǐn)?shù)：0分-大鼠懸掛5秒鐘且后爪沒(méi)有掉下來(lái)，1分–大鼠懸掛5秒鐘且后爪掉下來(lái)；2分-大鼠懸掛3～4秒鐘，3分-大鼠懸掛0～2秒鐘。

⑤曠場(chǎng)試驗(yàn)(open-field test)：作為確認(rèn)不同步行或多水準(zhǔn)的試驗(yàn)，通過(guò)直接觀察動(dòng)物的行為模式和特性，來(lái)檢測(cè)動(dòng)物的活動(dòng)性、情緒性及行為模式等。

⑥改良神經(jīng)功能評(píng)分(modified Neural Sibiarity Score)：作為通過(guò)上述的多種試驗(yàn)獲得的運(yùn)動(dòng)、知覺(jué)、平衡、反應(yīng)及情緒實(shí)驗(yàn)值的中和成績(jī)，根據(jù)如下的基準(zhǔn)計(jì)算分?jǐn)?shù)(按每個(gè)個(gè)體合算分?jǐn)?shù)來(lái)檢測(cè)改良神經(jīng)功能評(píng)分)。

-曠場(chǎng)試驗(yàn)(檢測(cè)動(dòng)物的情緒性、活動(dòng)性、行為模式等)

無(wú)動(dòng)作：3

1～20次：2

21～30次：1

30次以上：0

-抓握牽引試驗(yàn)(體力檢測(cè))

0～5秒：3

6～10秒：2

11～20秒：1

21秒以上：0

-平衡木試驗(yàn)(平衡知覺(jué)檢測(cè))

0分：1＝穩(wěn)定的姿勢(shì)

2＝抓住橫梁的側(cè)面略有晃動(dòng)的程度

1分：3＝1只以上的爪子從橫梁掉落的情況

4＝試圖保持平衡而掉落的情況

2分：5＝未保持平衡，倒掛在橫梁而掉落的情況

6＝在橫梁上完全無(wú)法保持平衡而掉落的情況

-前肢踩空試驗(yàn)(運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力)

0～5次：0

6～10次：1

11～20次：2

21次以上：3

-上體姿態(tài)試驗(yàn)(不對(duì)稱(chēng)運(yùn)動(dòng)行為)

0次：2

1～4次：1

5次以上：0

在誘發(fā)腦缺血14日后，以舒泰對(duì)大白鼠進(jìn)行麻醉，并進(jìn)行剖胸，然后，切開(kāi)右心耳，并向左心室注入針頭后，以利用泵向心臟灌注磷酸緩沖溶液的方式去除血液，并取出腦組織。以前囟(bregma)為基準(zhǔn)將用于制備樣品的組織切片包埋于石蠟，為了確認(rèn)損傷的腦組織，而將腦組織切片染色于蘇木精，在完成脫水后進(jìn)行固定，利用數(shù)碼相機(jī)拍攝幻燈片后，存儲(chǔ)在電腦。使用圖像分析程序(image J)以如下的數(shù)學(xué)式1計(jì)算腦梗塞比率(％)。

數(shù)學(xué)式1

腦梗塞比率(％)＝(正常左半球的面積-腦梗塞部位的正常組織的面積)/正常左半球的面積×100

分泌蛋白質(zhì)組分析(Secretomics)

在來(lái)源于人類(lèi)胚胎干細(xì)胞的神經(jīng)前體細(xì)胞的分泌蛋白質(zhì)組和來(lái)源于人類(lèi)iPSC的神經(jīng)前體細(xì)胞的分泌蛋白質(zhì)組中，分別以4～12％的梯度Novex Bis-Tris凝膠(Invitrogen)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)而完成分離后，以Gel Cord Blue染色試劑(Pierce)以無(wú)法看到蛋白質(zhì)條帶的方式對(duì)凝膠進(jìn)行染色。按相同大小的10條帶切割完成染色的凝膠，并以現(xiàn)有的方法膠內(nèi)胰蛋白酶降解。

使用與納米超高效(Nano Ultra Performance)液相色譜法(Eksigent Technologies)結(jié)合的LinearTrap Quadrupole(LTQ)質(zhì)譜儀(Thermo Finnigan)對(duì)通過(guò)膠內(nèi)降解而制備的肽進(jìn)行分析。具體地，將胰蛋白酶處理的肽適用于填有C18普通5微米大小的樹(shù)脂的分析色譜柱(75微米×11cm)。在97％的溶液A(在蒸餾水添加0.1％的甲酸)使用60％的溶液B(向乙腈添加0.1％的甲酸)以流速為0.3微升/小時(shí)的條件進(jìn)行分線(xiàn)性45分梯度。對(duì)所降解的肽離子以納米電噴射離子(Electrospray Ionization，ESI)源進(jìn)行電動(dòng)噴霧。在MS/MS譜中，按片段選擇整個(gè)MS掃描，并以結(jié)果-依存掃描獲得最多的5種譜。將針對(duì)動(dòng)態(tài)排除的重復(fù)計(jì)數(shù)設(shè)定為1，將重復(fù)期間設(shè)定為30秒，將動(dòng)態(tài)排除期間設(shè)定為180秒，將排除質(zhì)量寬度設(shè)定為1.5Da，將動(dòng)作排除列表設(shè)定為50。

在ipi.HUMANv3.76數(shù)據(jù)庫(kù)(89378項(xiàng)目)使用Thermo-SEQUEST算法(Thermo Finnigan)來(lái)檢索肽及蛋白質(zhì)的確認(rèn)。在檢索數(shù)據(jù)庫(kù)后，利用scarffold2(Proteome Software)確認(rèn)完成確認(rèn)的肽及蛋白質(zhì)。在借助SEQUEST檢索出的肽中，選擇具有0.95以上的肽預(yù)測(cè)(Peptide Prophet)的一組肽。并且，獲得具有0.99以上的蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)(Protein Prophet)蓋然性及2個(gè)以上的固有肽的蛋白質(zhì)列表。

統(tǒng)計(jì)分析

組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著水平利用適用Tukey'scorrection的單向方差分析法(one-watanalysis of variance，ANOVA)來(lái)獲得，將p值<0.05判定為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為了在腦卒中模型檢測(cè)根據(jù)神經(jīng)前體細(xì)胞的分泌蛋白質(zhì)組的疾病改善，而按如下的3個(gè)組進(jìn)行了2周的實(shí)驗(yàn)。在誘發(fā)腦卒中24小時(shí)后，通過(guò)行為實(shí)驗(yàn)將確認(rèn)完成疾病誘導(dǎo)的大白鼠隨機(jī)分配成3個(gè)組后，向右側(cè)外頸動(dòng)脈注射相同量的分泌蛋白質(zhì)組(0.2mg/kg，體積)、培養(yǎng)基或磷酸鹽緩沖鹽水。在注射各物質(zhì)后，在3日、7日、10日及14日確認(rèn)動(dòng)物的狀態(tài)和體重，并進(jìn)行行為分析。

表1

缺血病變部位分析結(jié)果

在大白鼠中通過(guò)永久MCAO的腦卒中的誘導(dǎo)引發(fā)了廣泛的腦病變的損傷。在進(jìn)過(guò)腦卒中誘導(dǎo)14日后，取出腦，并通過(guò)氯化三苯基四氮唑(TTC(2，3，5-triphenyltetrazolium chloride))染色確認(rèn)腦的損傷與否和損傷部位。TTC染色以與細(xì)胞內(nèi)的正常線(xiàn)粒體氧化酶系統(tǒng)(mitochondrial oxidative enzyme system)發(fā)生反應(yīng)的方式進(jìn)行染色，若發(fā)生腦缺血損傷而損傷線(xiàn)粒體，則干擾氧化系統(tǒng)，從而未完成染色而顯示白色，因此可區(qū)分腦的損傷部位。

如圖7所示，因大腦中動(dòng)脈閉塞而引發(fā)的損傷主要發(fā)生在右側(cè)腦的皮質(zhì)部位和紋狀體部位(圖7)。并且，神經(jīng)前體細(xì)胞的分泌蛋白質(zhì)組注射減少缺血性病變部位(infarct size)。在磷酸鹽緩沖鹽水對(duì)照組損傷了將近又腦的60％，在培養(yǎng)基對(duì)照組損傷了46％左右，但分泌蛋白質(zhì)組處理組的損傷部位為29％程度，與對(duì)照組相比，損傷部位明顯減少了。

體重分析結(jié)果

由于腦卒中的誘發(fā)減少大白鼠的運(yùn)動(dòng)能力，而立即減少體重并持續(xù)到第7日，多種治療劑通過(guò)運(yùn)動(dòng)能力的恢復(fù)誘導(dǎo)體重的增加。分泌蛋白質(zhì)組的注射也與細(xì)胞移植相同地誘導(dǎo)體重增加(圖8)。在神經(jīng)損傷的恢復(fù)過(guò)程中最顯著的現(xiàn)象為體重的恢復(fù)。與磷酸鹽緩沖鹽水對(duì)照組相比，分泌蛋白質(zhì)組處理組出現(xiàn)明顯的改善。

行為分析結(jié)果

與兩個(gè)對(duì)照組相比，分泌蛋白質(zhì)組處理組在平衡木試驗(yàn)中呈現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的行為改善效果，這種效果呈現(xiàn)從治療3日開(kāi)始發(fā)生改善等的即時(shí)性效果(圖9a)。

并且，與兩個(gè)對(duì)照組相比，在抓握牽引試驗(yàn)(prehensile traction)中也從治療(注射)7日開(kāi)始呈現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的效果(圖9b)。

而且，分泌蛋白質(zhì)組注射呈現(xiàn)減少網(wǎng)兜中的失足(foot fault)頻度的效果(圖9c)。在檢測(cè)每單位時(shí)間的行為的活躍度的線(xiàn)截面(line cross)也呈現(xiàn)出改善趨勢(shì)(圖9d)。

綜合行動(dòng)神經(jīng)改善效果(改良神經(jīng)功能評(píng)分)分析結(jié)果

改良神經(jīng)功能評(píng)分(Modified Neurological Severity Score test)為用于檢測(cè)神經(jīng)學(xué)功能的結(jié)構(gòu)表。按運(yùn)動(dòng)(肌肉狀態(tài))和知覺(jué)(mensory)(視覺(jué)、嗅覺(jué)及本體感覺(jué)(proprioceptive))項(xiàng)目進(jìn)行評(píng)價(jià)。正常為0分，分?jǐn)?shù)越高被判斷為功能異常程度越嚴(yán)重。如圖10所示，在改良神經(jīng)功能評(píng)分的分析中，分泌蛋白質(zhì)組處理組從治療開(kāi)始階段呈現(xiàn)出明顯高于磷酸鹽緩沖鹽水對(duì)照組和培養(yǎng)基對(duì)照組的治療效果(行為改善)(圖10)。

在改良神經(jīng)功能評(píng)分試驗(yàn)中，在誘發(fā)腦缺血1日后，磷酸鹽緩沖鹽水對(duì)照組從平均5.4分變?yōu)?4后的平均5.5分，由此可知，維持因腦卒中而產(chǎn)生的神經(jīng)行為學(xué)障礙。在培養(yǎng)基對(duì)照組的情況下，臨時(shí)性行為改善效果呈現(xiàn)在治療后的第3日，但未發(fā)揮額外的改善效果。相反地，在分泌蛋白質(zhì)組處理組的情況下，從治療3日(改良神經(jīng)功能評(píng)分4.5分)至10日(改良神經(jīng)功能評(píng)分3分)呈現(xiàn)了持續(xù)的行為改善效果。

分泌蛋白質(zhì)組分析結(jié)果

從來(lái)源于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的神經(jīng)前體細(xì)胞獲得的分泌蛋白質(zhì)組包括聚集蛋白(Agrin)、膜聯(lián)蛋白A5(AnnexinA5)、基礎(chǔ)免疫球蛋白(BSG，Basigin)、二聚糖(Biglycan)、鈣調(diào)蛋白-3(Calponin-3)、類(lèi)共激活蛋白(Coactosin-like protein)、絲切蛋白-1(Cofilin-1)、膠原蛋白α-2、滯蛋白-3(Cullin-3)、消去蛋白(Destrin)、營(yíng)養(yǎng)不良蛋白聚糖(Dystroglycan)、肝配蛋白-B2(Ephrin-B2)、輸出蛋白-2(Exportin-2)、埃茲蛋白(Ezrin)、纖維連接蛋白、纖蛋白-1(Fibulin-1)、卷曲相關(guān)(Frizzled-related)蛋白質(zhì)、半乳糖凝集素-3結(jié)合蛋白(Galectin-3binding protein)、顆粒體蛋白(Granulins)、生長(zhǎng)分化因子11(Growh/differentiationfactor11)、觸珠蛋白(Haptoglobin)、血液結(jié)合素(Hemopexin)、高速泳動(dòng)族蛋白(High mobility group protein)B2、角蛋白(Hornerin)、輸入蛋白-9(Importin-9)、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2(Insulin-like grwoth factor-binding protein2)、狼瘡La蛋白(Lupus La protein)、巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor)、中期因子(Midkine)、膜突蛋白(Moesin)、神經(jīng)氈蛋白2(Neuropilin2)、多效蛋白(Pleiotrophin)、抑制蛋白-1(Profilin-1)、DJ-1蛋白(Protein DJ-1)、根蛋白(Radixin)、分泌型卷曲相關(guān)蛋白-2(Secreted frizzled-related protein-2)、胞裂蛋白-11(Septin-11)、踝蛋白-1(Talin-1)、睪丸蛋白聚糖(Testican)、促胸腺生成素(Thymopoietin)、轉(zhuǎn)膠蛋白-3(Transgelin-3)及波形蛋白(Vimentin)等的蛋白質(zhì)。

從人類(lèi)胚胎干細(xì)胞的神經(jīng)前體細(xì)胞獲得的分泌蛋白質(zhì)組包括聚集蛋白(Agrin)、膜聯(lián)蛋白A2(Annexin A2)、吸引素(Attractin)、二聚糖(Biglycan)、血漿銅藍(lán)蛋白(Ceruloplasmin)、絲切蛋白-1(Cofilin-1)、膠原蛋白α-1、冠蛋白-1X(Coronin-1X)、皮西丁蛋白(Dermicidin)、DERP12、肝配蛋白-B3、外生骨疣樣蛋白-2(Exostosin-2)、埃茲蛋白(Ezrin)、明膠-3結(jié)合蛋白、顆粒體蛋白(Granulins)、生長(zhǎng)分化因子11(Growh/differentiation factor 11)、觸珠蛋白(Haptoglobin)、血液結(jié)合素(Hemopexin)、高速泳動(dòng)族蛋白B2、角蛋白(Hornerin)、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2(Insulin-like grwoth factor-binding protein 2)、狼瘡La蛋白、中期因子(Midkine)、膜突蛋白(Moesin)、多表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域蛋白8(Multiple epidermal growth factor-like domains protein 8)、巢蛋白-1(Nidogen-1)、胸腺旁腺素(Parathymosin)、抑制蛋白-2(Profilin-2)、DJ-1蛋白(ProteinDJ-1)、分泌型卷曲相關(guān)蛋白-2、分泌粒蛋白(Secretogranin)、踝蛋白-1(Talin-1)、胸腺素β-4(Thymosin beta-4)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子Β誘導(dǎo)蛋白IG-H3(TGFBI，Transforming grwowth factor-beta-induced protein ig-h3)、轉(zhuǎn)膠蛋白(Transgelin)及波形蛋白(Vimentin)等的蛋白質(zhì)。

如上所述地詳細(xì)說(shuō)明了本發(fā)明的特定部分，對(duì)于本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，這些具體技術(shù)僅是優(yōu)選實(shí)例，本發(fā)明的范圍并不限定于上述實(shí)例。因此，由所附的權(quán)利要求書(shū)和其等同替代物定義本發(fā)明的實(shí)際范圍。

? 序列表

<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION, Yonsei University

<120> 包含神經(jīng)前體細(xì)胞或其分泌蛋白質(zhì)組作為有效成分的治療缺血性疾病或神經(jīng)炎癥性疾病的組合物

<130> PP150076

<150> KR 10-2014-0080009

<151> 2014-06-27

<160> 2

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 促血管生成素-1的正向引物

<400> 1

tgtgtccatc agctccagtt gc 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 促血管生成素-1的反向引物

<400> 2

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