本發(fā)明總體涉及用于抑制膀胱平滑肌的方法和組合物，特別是用于降低排尿頻率的方法和組合物。

背景技術：

逼尿肌(detrusor muscle)是一層由排列成螺旋束、縱向束和環(huán)形束的平滑肌纖維組成的膀胱壁。當膀胱牽張時，這指示副交感神經(jīng)系統(tǒng)使逼尿肌收縮。這促使膀胱經(jīng)由尿道排出尿液。

為使尿液離開膀胱，自動控制的內(nèi)括約肌和自主控制的外括約肌均必須打開。這些肌肉出現(xiàn)問題可導致失禁。若尿液量達到膀胱絕對容量的100％，則自主括約肌將變得不自主且尿液將即刻排出。

成人膀胱通常容納約300至350毫升尿液(工作容積)，但充盈的成人膀胱可容納高達約1000毫升(絕對容積)的尿液，個體間存在差異。尿液積聚時，由膀胱壁折疊產(chǎn)生的褶皺(rugae)變平且膀胱壁隨其牽張而變薄，使得膀胱可儲存較大量的尿液，而不會使內(nèi)部壓力顯著上升。

在大多數(shù)個體中，通常在膀胱中的尿液體積達到約200毫升時開始產(chǎn)生尿意。在此階段，如果需要，個體易于抗拒排尿沖動。隨著膀胱繼續(xù)填充，尿意變強且變得更難忽略。最終，膀胱將填充至排尿沖動無法抗拒的點，此時個體將無法再置之不理。

在一些個體中，當膀胱中的尿液達到小于其工作容積的100％時即開始產(chǎn)生此尿意。這種增強的尿意可干擾正?；顒?，包括充分不間斷的休息期間的睡眠能力。在一些情形下，這種增強的尿意可能與醫(yī)學疾病相關，如男性的良性前列腺增生或前列腺癌或女性的妊娠。然而，在未受其他醫(yī)學疾病影響的男性和女性個體中亦會發(fā)生尿意增強現(xiàn)象。

在一些個體中，如兒童，可能由于對膀胱肌缺乏控制而發(fā)生非自主排尿(例如，尿床)。在其他個體中，可能由于潛在醫(yī)學疾病而發(fā)生非自主排尿(例如，尿失禁)。

因此，存在對用于治療罹患非期望排尿頻率的男性和女性個體的組合物和方法的需求。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一方面涉及一種降低個體的排尿頻率的方法。此方法包括對患有導致非期望排尿頻率的疾病的個體施用有效量的藥學組合物，該藥學組合物包含一種或多種前列腺素途徑(prostaglandin pathway)抑制劑。

本發(fā)明的另一方面涉及一種用于治療導致非期望排尿頻率的疾病的藥學組合物。該藥學組合物包含一種或多種前列腺素途徑抑制劑和藥學上可接受的載體。

附圖說明

圖1A和圖1B是顯示了在脂多糖(LPS)不存在(圖1A)或存在(圖1B)的情況下止痛劑調(diào)節(jié)Raw 264巨噬細胞對協(xié)同刺激分子的表達的圖表。在止痛劑單獨存在或與鼠傷寒沙門氏菌(Salmonela typhimurium)LPS(0.05微克/毫升(μg/ml))一起存在的情況下，將細胞培養(yǎng)24小時(hr)。結(jié)果為CD40+CD80+細胞的平均相對％。

具體實施方式

呈現(xiàn)以下詳細說明以使得本領域技術人員可實施和利用本發(fā)明。為解釋目的，陳述特定術語以提供對本發(fā)明的完全理解。然而，本領域技術人員將顯而易見的是，實踐本發(fā)明并不需要這些特定細節(jié)。關于特定應用的描述僅提供作為代表性實施例。本發(fā)明旨不在受限于所示的實施例，而在具有與本文公開的原理和特征一致的可能最寬泛的范疇。

本文所用的術語“前列腺素(prostaglandin，PG)”指經(jīng)酶促作用(enzymatically)由脂肪酸衍生出的在動物體內(nèi)具有各種生理學作用(如調(diào)節(jié)平滑肌組織的收縮和舒張)的一組脂質(zhì)化合物。每個前列腺素含有20個碳原子，包括一個5-碳環(huán)。前列腺素的實例包括前列腺素E1(PGE1)、前列腺素E₂(PGE₂)、前列腺素D₂、前列腺素I₂(PGI₂，前列腺環(huán)素)和前列腺素F_2α(PGF_2α)。

本文所用的術語“前列腺素(PG)途徑抑制劑”指與在PG的合成或PG對靶組織的作用中所涉及的一種或多種組分直接或間接相互作用、且干擾前列腺素的水平或其對靶組織最終作用的試劑。PG途徑抑制劑包括，但不限于PG抑制劑、前列腺素轉(zhuǎn)運子(prostaglandin transporter，PGT)抑制劑和前列腺素受體(prostaglandin receptor，PGR)抑制劑。然而，術語“PG途徑抑制劑”不包括下文定義的止痛劑。

本文所用的術語“PG抑制劑”包括，但不限于PG合成抑制劑和PG活性抑制劑。本文所用的術語“PG合成抑制劑”指抑制前列腺素產(chǎn)生的試劑，如抑制磷脂酶A2、前列腺素合成酶和組織特異性異構(gòu)酶以及合成酶如凝血脂素(thromboxane)合成酶、PGF合成酶、細胞溶質(zhì)PG合成酶(cytosolic PG synthase，cPGES)、前列腺素I合成酶(prostaglandin I synthase，PGIS)和微粒體PGES酶(microsomal PGES enzymes，mPGES))的表達或活性的試劑。PG合成抑制劑的實例包括氟尼辛葡甲胺(flunixin meglumine)。本文所用的術語“PG合成的抑制劑(inhibitors of PG synthesis)”或“PG合成抑制劑(PG synthesis inhibitors)”不包括下文定義的止痛劑。

本文所用的術語“PG活性抑制劑”指以任何方式拮抗前列腺素本身的作用的試劑。僅干擾前列腺素的合成，如通過干擾前列腺素合成酶的作用，但不干擾前列腺素的作用的試劑不包括在本說明書中所用的PG活性抑制劑的定義內(nèi)。

本文所用的術語“PGT抑制劑”指抑制PG轉(zhuǎn)運子如ATP依賴型多藥抗藥性(MDR)轉(zhuǎn)運子-4(ATP dependent multi-drug resistance transporter-4)或其他MDR通道(MDR channels)如ABCC1、ABCC2、ABCC3、ABCC6、ABCG2和ABCB11的表達或活性的試劑。抑制PGT活性的PGT抑制劑的實例包括但不限于，抑制MDR膜泵的化合物，如三嗪化合物(triazine compounds)、維拉帕米(verapamil)和鈣通道阻斷劑；通道包括奎尼丁(quinidine)、酮康唑(ketoconazole)、伊曲康唑(itraconazole)、阿奇霉素(azithromycin)、伐司撲達(valspodar)、環(huán)孢素(cyclosporine)、依克立達(elacridar)、煙曲霉毒素C(fumitremorgin-C)、吉非替尼(gefitinib)和紅霉素(erythromycin)。抑制PGT表達的PGT抑制劑的實例包括，但不限于通過靶向啟動子區(qū)和/或與啟動子或其他基因控制區(qū)結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子來控制MDR基因轉(zhuǎn)錄的試劑。本文所用的術語“PGR抑制劑”指抑制PGR的活性或表達的試劑。在一些實施例中，PGR包含PGE受體的E前列腺素類受體(E prostanoid receptor，EP)1、EP2、EP3和EP4亞型；PGD受體(DP1)；PGF受體(FP)；PGI受體(IP)和凝血脂素受體(TP)。人類TP的兩種其他異形體(TPα與TPβ)和FP的兩種其他異型體(FPA與FPB)和八種EP3變體均經(jīng)由選擇性剪切而產(chǎn)生，其僅在C端尾部不同。在一些實施例中，PGR還包含G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor)，其被稱為趨化因子受體同源分子(chemo-attractant receptor-homologous molecule，CRHME)。在其他實施例中，PGR包括使類視紫質(zhì)7次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體(rhodopsin-like 7-transmembrane-spanning G protein-coupled receptor)活化的所有受體。

PGR活性抑制劑的實例包括，但不限于抗PGR抗體和抑制G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein coupled receptor)信號傳導途徑的任何試劑。PGR表達抑制劑包括在轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平或轉(zhuǎn)錄后水平抑制PGR表達的試劑。PGR表達抑制劑的實例包括，但不限于抗-PGR siRNA和miRNA。

本文所用的術語“有效量”意指達成所選結(jié)果所必要的量。

本文所用的術語“止痛劑”指用于緩解疼痛且包括抗發(fā)炎化合物的試劑、化合物或藥物。例示性止痛和/或抗發(fā)炎的試劑、化合物或藥物包括，但不限于非類固醇抗發(fā)炎藥物(NSAID)、水楊酸酯(salicylate)、阿司匹林(aspirin)、水楊酸(salicylic acid)、水楊酸甲酯(methyl salicylate)、二氟尼柳(diflunisal)、雙水楊酸酯(salsalate)、奧沙拉嗪(olsalazine)、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、對氨基苯酚(para-aminophenol)衍生物、乙酰苯胺(acetanilide)、乙酰氨基酚(acetaminophen)、非那西汀(phenacetin)、芬那酸(fenamate)、甲芬那酸(mefenamic acid)、甲氯芬那酸(meclofenamate)、甲氯芬那酸鈉(sodium meclofenamate)、雜芳基乙酸(heteroayl acetic acid)衍生物、托美汀(tolmetin)、酮咯酸(ketorolac)、雙氯芬酸(diclofenac)、丙酸(propionic acid)衍生物、布洛芬(ibuprofen)、萘普生鈉(naproxen sodium)、萘普生(naproxen)、非諾洛芬(fenoprofen)、酮洛芬(ketoprofen)、氟比洛芬(flurbiprofen)、奧沙普嗪(oxaprozin)；烯醇酸(enolic acids)、昔康(oxicam)衍生物、吡羅昔康(piroxicam)、美洛昔康(meloxicam)、替諾昔康(tenoxicam)、安吡昔康(ampiroxicam)、屈昔康(droxicam)、吡沃昔康(pivoxicam)、吡唑啉酮(pyrazolon)衍生物、苯基丁氮酮(phenylbutazone)、羥基保泰松(oxyphenbutazone)、安替吡啉(antipyrine)、氨基吡啉(aminopyrine)、安乃近(dipyrone)、昔布類(coxibs)、塞來昔布(celecoxib)、羅非昔布(rofecoxib)、萘丁美酮(nabumetone)、阿扎丙宗(apazone)、吲哚美辛(indomethacin)、舒林酸(sulindac)、依托度酸(etodolac)、異丁基苯基丙酸(isobutylphenyl propionic acid)、羅美昔布(lumiracoxib)、依托昔布(etoricoxib)、帕瑞昔布(parecoxib)、伐地昔布(valdecoxib)、替拉昔布(tiracoxib)、依托度酸(etodolac)、達布非龍(darbufelone)、右旋酮洛芬(dexketoprofen)、醋氯芬酸(aceclofenac)、利克飛龍(licofelone)、溴芬酸(bromfenac)、氯索洛芬(loxoprofen)、普拉洛芬(pranoprofen)、吡羅昔康(piroxicam)、尼美舒利(nimesulide)、西唑利啉(cizolirine)、3-甲酰胺基-7-甲磺酰胺基-6-苯氧基-4H-1-苯并哌喃-4-酮(3-formylamino-7-methylsulfonylamino-6-phenoxy-4H-1-benzopyran-4-one)、美洛昔康(meloxicam)、氯諾昔康(lornoxicam)、d-吲哚布芬(d-indobufen)、莫苯唑酸(mofezolac)、哌氨托美汀(amtolmetin)、普拉洛芬(pranoprofen)、托芬那酸(tolfenamic acid)、氟比洛芬(flurbiprofen)、舒洛芬(suprofen)、奧沙普嗪(oxaprozin)、扎托洛芬(zaltoprofen)、阿米洛芬(alminoprofen)、噻洛芬酸(tiaprofenic acid)、其藥理學鹽、其水合物和其溶劑化物。

本文所用的術語“昔布類(coxib)”指能抑制COX1和COX2酶的活性或表達的化合物或多種化合物的組合物。

本文所用的術語“衍生物”指經(jīng)化學改性的化合物，其中該改性是具有一般技能的化學家所常規(guī)認為的，如酸的酯或酰胺，或保護基，如用于醇或硫醇的芐基或用于胺的叔丁氧羰基(tert-butoxycarbonyl group)。

本文所用的術語“類似物”指包含特定化合物或其種類的化學改性形式且保持該化合物或種類的醫(yī)藥學和/或藥理學活性特征的化合物。

本文所用的術語“藥學上可接受的鹽”指所公開化合物的衍生物，其中母化合物(parent compound)通過制成其酸鹽或堿鹽來改性。藥學上可接受的鹽的實例包括，但不限于堿性殘基的無機或有機酸鹽如胺、酸性殘基的堿鹽或有機鹽如羧酸、和其類似物。藥學上可接受的鹽包括由例如無毒無機酸或有機酸形成的母化合物的習知無毒鹽或季銨鹽。舉例而言，這些習知無毒鹽包括由無機酸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸和其類似物衍生的那些鹽，和由有機酸如乙酸、丙酸、丁二酸、乙醇酸、硬脂酸(stearic acid)、乳酸、蘋果酸(malic acid)、酒石酸、檸檬酸、抗壞血酸、帕莫酸(pamoic acid)、順丁烯二酸(maleic acid)、羥基順丁烯二酸(hydroxymaleic acid)、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水楊酸、對氨基苯磺酸(sulfanilic acid)、2-乙酰氧基苯甲酸(2-acetoxybenzoic acid)、反丁烯二酸(fumaric acid)、甲苯磺酸、甲烷磺酸、乙烷二磺酸(ethane disulfonic acid)、草酸(oxalic acid)、羥乙磺酸(isethionic acid)和其類似物所制備的鹽。

本文所用的詞組“醫(yī)藥學上可接受”涉及化合物、材料、組合物和/或劑型的使用，它們在合理醫(yī)學判斷的范疇內(nèi)適合與人類和動物的組織接觸使用而按照合理的益處/風險比為無過度毒性、刺激、過敏反應或其他問題或并發(fā)癥。

本文使用術語“即刻釋放(immediate-release)”指不含溶解速度控制材料的藥物制劑。在施用即刻釋放的制劑后，活性劑的釋放基本上不延遲。即刻釋放涂層可包括在施用后即刻溶解以釋放其中的藥物內(nèi)容物的合適材料。在一些實施例中，使用術語“即刻釋放”意指在對患者施用后小于10分鐘(min)、20分鐘、30分鐘、40分鐘、50分鐘、60分鐘、90分鐘或120分鐘內(nèi)釋放活性成分的藥物制劑。

本文所用的術語“延長釋放(extended-release)”(亦稱為緩釋(sustained-release；SR)、持續(xù)作用(sustained-action，SA)、定時釋放(time-release，TR)、受控釋放(controlled-release，CR)、改性釋放(modified release，MR)或連續(xù)釋放(continuous-release，CR))指用于醫(yī)學片劑或膠囊的隨時間緩慢溶解并釋放活性成分的機制。延長釋放片劑或膠囊的優(yōu)勢在于，其?？杀认嗤幬锏募纯提尫胖苿┮暂^少頻率服用且其保持藥物在血流中更穩(wěn)定的水平，由此延長藥物作用的持續(xù)時間且降低藥物在血流中的峰值量。在一些實施例中，術語“延長釋放”指片劑或膠囊中的活性成分在施用于患者后在2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22或24小時的時間段(period)內(nèi)連續(xù)或脈沖式地釋放的釋放概況。

本文所用的術語“延遲釋放(delayed-release)”指在施用藥學組合物后，藥學組合物的活性成分的釋放被延遲或延后一個給定的時間段(例如，1、2、3、4或5個小時，或在胃部之后)的藥物釋放概況。

本文所用的術語“延遲延長釋放(delayed-extended-release)”指藥學組合物的活性成分的釋放在施用藥學組合物后被延遲或延后一個給定的時間段(例如，1、2、3、4或5個小時的遲滯期(lag period)，或在胃部之后)的藥物釋放概況。一旦開始釋放，活性成分即隨時間(例如，在2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22或24個小時的時間段內(nèi))連續(xù)或脈沖式地緩慢釋放。

降低排尿頻率的方法

本發(fā)明的一方面涉及一種通過對患有導致非期望排尿頻率的疾病的個體施用有效量的藥學組合物來降低排尿頻率的方法。該藥學組合物包含一種或多種PG途徑抑制劑和藥學上可接受的載體。導致非期望排尿頻率的疾病包括，但不限于夜尿癥(nocturia)、膀胱過動癥(overactive bladder)、尿失禁(urinary incontinence)和尿床(bed wetting)。

在一些實施例中，PG抑制劑是PG合成酶的抑制劑。在其他實施例中，PG抑制劑是PG活性抑制劑。PG活性抑制劑的實例包括，但不限于阻斷PG與其任何受體(EP1、EP2、EP3、EP4、DP1、DP2、FP2、IP和TP)結(jié)合的試劑。這些類型抑制劑的實例包括，但不限于由羅氏(Roche)研發(fā)的IP受體抑制劑RO3244019、EP1受體拮抗劑ONO-85-39、EP1與EP2雙重受體拮抗劑AH 6809和EP4拮抗劑RQ-15986。在某些實施例中，該一種或多種PG途徑抑制劑包含PGT抑制劑。在一些實施例中，PGT抑制劑為PGT活性抑制劑。PGT活性抑制劑的實例包括，但不限于抗PGT的抗體、和任何已知可抑制顯示轉(zhuǎn)運PG的ATP依賴型多藥抗藥性轉(zhuǎn)運子-4或相關MDR泵的化合物。在其他實施例中，PGT抑制劑為PGT表達抑制劑。PGT表達抑制劑的實例包括，但不限于抗-PGT的siRNA、靶向PGT mRNA的反義RNA、和通過影響DNA甲基化和/或染色質(zhì)修飾(chromatin modification)來控制基因轉(zhuǎn)錄的試劑。

在一些實施例中，該一種或多種PG途徑抑制劑包含靶向在COX1與COX2兩者中所含的COX活性位點與POX活性位點的抑制劑。在其他實施例中，該一種或多種PG途徑抑制劑包含抑制PGE₂途徑的抑制劑。

在某些實施例中，該一種或多種PG途徑抑制劑包含PGR抑制劑。PGR是含有七個跨膜域的G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein-coupled receptors)。PGR的實例包括EP1、EP2、EP3、EP4、DP1、DP2、FP、IP1、IP2、CRTH2和TP受體。在一些實施例中，該一種或多種PG途徑抑制劑包含抑制上文所列任何PG受體的抑制劑。在一些實施例中，PGR抑制劑為PGR活性抑制劑。PGR活性抑制劑的實例包括，但不限于抗PGR的抗體。在一些實施例中，PGR抑制劑為PGE2受體活性抑制劑，如EP1活性抑制劑、EP2活性抑制劑、EP3活性抑制劑或EP4活性抑制劑。

在其他實施例中，PGR抑制劑為PGR表達抑制劑。PGR表達抑制劑的實例包括，但不限于抗-PGR的siRNA、靶向PGR mRNA的反義RNA、或通過影響DNA甲基化和/或染色質(zhì)修飾來控制基因轉(zhuǎn)錄的試劑。在一些實施例中，PGR表達抑制劑為PGE2受體表達抑制劑，如EP1表達抑制劑、EP2表達抑制劑、EP3表達抑制劑或EP4表達抑制劑。在一些實施例中，該一種或多種PG途徑抑制劑包含小分子抑制劑。本文所用的術語“小分子抑制劑”指具有1000道爾頓(dalton)或1000道爾頓以下的分子量的抑制劑。

在一些實施例中，PG途徑抑制劑包含短干擾RNA(siRNA)。siRNA為可經(jīng)工程設計以誘發(fā)對應于PG途徑組分的mRNA的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默(gene silencing)的雙鏈RNA。siRNA采用RNA干擾(RNAi)機制，用于使基因例如被靶向的PGE2受體基因的表達“沉默”的目的。最初在將雙鏈RNA(dsRNA)轉(zhuǎn)染至細胞中的情形下觀測到這種“沉默”。在進入其中時，發(fā)現(xiàn)dsRNA經(jīng)類Rnase-III酶Dicer切割成長度為21至23個核苷酸的在其3’端含有2個核苷酸突出的雙鏈小干擾RNA(siRNA)。在ATP依賴性步驟中，siRNA被整合成多次單元RNAi誘導型沉默復合體(RNAi induced silencing complex，RISC)，該復合體給出用于AGO2介導的mRNA互補序列切割的信號，繼而導致隨后被細胞核酸外切酶(cellular exonucleases)降解。

在一些實施例中，PG途徑抑制劑包含合成的siRNA或靶向靶細胞/組織中的PG合成酶RNA、PGT RNA或PGR RNA的其他種類的小RNA。合成產(chǎn)生的siRNA在結(jié)構(gòu)上仿真通常在細胞中由酶Dicer加工的siRNA類型。合成產(chǎn)生的siRNA可向RNA結(jié)構(gòu)引入已知可增強siRNA穩(wěn)定性和功能性的任何化學修飾。舉例而言，在一些情形下，siRNA可合成為鎖核酸(locked nucleic acid，LNA)修飾的siRNA。LNA為含有連接核糖的2’-氧與4’碳的亞甲基(methylene)橋的核苷酸類似物。雙環(huán)結(jié)構(gòu)將LNA分子的呋喃糖環(huán)(furanose ring)鎖定為3’-內(nèi)構(gòu)型(3'-endo conformation)，由此在結(jié)構(gòu)上仿真標準RNA單體。

在其他實施例中，PG途徑抑制劑包含表達載體，其被工程設計成轉(zhuǎn)錄在細胞內(nèi)經(jīng)加工成被靶向的siRNA的短雙鏈類發(fā)夾RNA(short double-stranded hairpin-like RNA，shRNA)?？墒褂萌鏏mbion的siRNA構(gòu)建試劑盒、Imgenex的GENESUPPRESSOR^TM構(gòu)建試劑盒和Invitrogen的BLOCK-IT^TM可誘導型RNAi質(zhì)體與慢病毒載體(lentivirus vectors)在合適的表達載體中克隆shRNA。合成的siRNA與shRNA可使用熟知的算法來設計且使用習知的DNA/RNA合成儀來合成。

在一些實施例中，次級活性劑(secondary active agent)包含能夠抑制PG途徑組分的表達的反義寡核苷酸或多核苷酸。反義寡核苷酸或多核苷酸可包含DNA主鏈、RNA主鏈或其化學衍生物。在一個實施例中，反義寡核苷酸或多核苷酸包含靶向降解的單鏈反義寡核苷酸或多核苷酸。在某些實施例中，抗發(fā)炎劑包含與PG途徑組分的mRNA序列互補的單鏈反義寡核苷酸。單鏈反義寡核苷酸或多核苷酸可被合成產(chǎn)生或可由合適的表達載體來表達。反義核酸被設計為經(jīng)由互補結(jié)合來與mRNA正義鏈(sense strand)結(jié)合以促進RNase H活性(其導致mRNA降解)。反義寡核苷酸優(yōu)選在化學或結(jié)構(gòu)上經(jīng)修飾以提高核酸酶穩(wěn)定性和/或增強結(jié)合。

在一些實施例中，反義寡核苷酸經(jīng)修飾以產(chǎn)生具有非常規(guī)化學或主鏈添加或取代的寡核苷酸，包括，但不限于肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)、嗎啉基(morpholino)主鏈核酸、甲基膦酸酯(methylphosphonates)、雙重穩(wěn)定芪或芘基封端(duplex stabilizing stilbene or pyrenyl caps)、硫代磷酸酯(phosphorothioates)、氨基磷酸鹽(phosphoroamidates)、磷酸三酯(phosphotriesters)和其類似物。舉例而言，經(jīng)修飾的寡核苷酸可將一種或多種天然產(chǎn)生的核苷酸與類似物合并或以類似物取代一種或多種天然產(chǎn)生的核苷酸；核苷酸間的修飾引入有例如不帶電荷鍵聯(lián)(例如，磷酸甲酯(methyl phosphonate)、磷酸三酯(phosphotriester)、磷酰胺酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯(carbamates)等)或帶電荷鍵聯(lián)(例如，硫代磷酸酯(phosphorothioate)、二硫代磷酸酯(phosphorodithioates)等)；修飾引入有嵌入劑(例如，吖啶(acridine)、補骨脂素(psoralen)等)、螯合劑(例如，金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)或烷化劑和/或經(jīng)修飾的鍵聯(lián)(例如，α變旋異構(gòu)核酸(alpha anomeric nucleic acids)等)。

在一些實施例中，單鏈寡核苷酸經(jīng)內(nèi)部修飾以在其主鏈中包括至少一個中性電荷。舉例而言，寡核苷酸可包括與特異性靶序列互補的甲基磷酸酯主鏈或肽核酸(PNA)。已發(fā)現(xiàn)這些修飾預防或減少解旋酶介導的解旋。使用不帶電荷的探針還可通過減輕典型雜交中的負電荷核酸鏈的排斥來增加試樣中與多核苷酸靶的雜交速率。

PNA寡核苷酸是磷酸二酯主鏈經(jīng)聚酰胺置換的不帶電荷的核酸類似物，使得PNA成為由酰胺鍵將2-氨乙基-甘氨酸(2-aminoethyl-glycine)單元結(jié)合在一起的聚合物。使用與標準肽合成中使用的相同Boc或Fmoc化學方法來合成PNA。堿基(腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧碇)通過亞甲基羧基鍵聯(lián)(methylene carboxyl linkage)與主鏈連接。因此，PNA為非環(huán)狀(acyclic)、非手性(achiral)且中性的。PNA的其他特性為相比于核酸提高的特異性和解鏈溫度，形成三鏈螺旋的能力，在酸性pH下的穩(wěn)定性，無法被如核酸酶、聚合酶等細胞酶識別。

含甲基磷酸酯的寡核苷酸為中性DNA類似物，含有取代了其中一個非鍵合磷?；?phosphoryl oxygens)的甲基。具有甲基磷酸酯鍵聯(lián)的寡核苷酸首先被報導經(jīng)由翻譯的反義阻斷來抑制蛋白質(zhì)合成。

在一些實施例中，該寡核苷酸中的磷酸酯主鏈可含有硫代磷酸酯鍵聯(lián)或磷酰胺酯。這些寡核苷酸鍵聯(lián)的組合亦在本發(fā)明的范疇內(nèi)。

在其他實施例中，該寡核苷酸可含有由磷酸二酯核苷酸間鍵聯(lián)接合的經(jīng)修飾糖的主鏈。該經(jīng)修飾的糖可包括呋喃糖(furanose)類似物，包括，但不限于2-脫氧核呋喃糖苷(2-deoxyribofuranosides)、α-D-阿拉伯呋喃糖苷(α-D-arabinofuranosides)、α-2'-脫氧核呋喃糖苷(α-2'-deoxyribofuranosides)和2',3'-二脫氧-3'-氨基核呋喃糖苷(2',3'-dideoxy-3'-aminoribofuranosides)。在替代性實施例中，2-脫氧-β-D-核呋喃糖基(2-deoxy-β-D-ribofuranose groups)可由其他糖(例如β-D-核呋喃糖)置換。另外，可存在β-D-核呋喃糖，其中核糖部分的2-OH經(jīng)C1-6烷基(2-(O--C1-6烷基)核糖)或經(jīng)C2-6烯基(2-(O--C2-6烯基)核糖)烷基化或經(jīng)氟基(2-氟核糖(2-fluororibose))置換。

相關寡聚物形成糖(oligomer-forming sugar)包括在如上文所述的鎖核酸(LNA)中所用的糖。例示性LNA寡核苷酸包括具有2'-O-4'-C亞甲基橋的經(jīng)修飾雙環(huán)單體單元，如美國專利第6,268,490號中所述。

經(jīng)化學修飾的寡核苷酸亦可包括單獨或任何組合的2'-位糖修飾、5-位嘧啶修飾(例如，5-(N-芐基羧酰胺)-2'-脫氧尿苷(5-(N-benzylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine)、5-(N-異丁基羧酰胺)-2'-脫氧尿苷(5-(N-isobutylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine)、5-(N-[2-(1H-吲哚-3-基)乙基]羧酰胺)-2'-脫氧尿苷(5-(N-[2-(1H-indole-3yl)ethyl]carboxyamide)-2'-deoxyuridine)、5-(N-[1-(3-三甲基銨)丙基]羧酰胺)-2'-脫氧尿苷氯化物(5-(N-[1-(3-trimethylammonium)propyl]carboxyamide)-2'-deoxyuridine chloride)、5-(N-萘基羧酰胺)-2'-脫氧尿苷(5-(N-napthylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine)、5-(N-[1-(2,3-二羥丙基)]羧酰胺)-2'-脫氧尿苷)(5-(N-[1-(2,3-dihydroxypropyl)]carboxyamide)-2'-deoxyuridine))、8-位嘌呤修飾、環(huán)外胺(exocyclic amine)的修飾、4-硫尿苷(4-thiouridine)的取代、5-溴-或5-碘-尿嘧啶的取代、甲基化、不尋常的堿基配對組合如異堿基異胞苷(isocytidine)與異胍(isoguanidine)和其類似物。

在一些實施例中，該一種或多種PG途徑抑制劑包含能抑制PG途徑組分的表達的核糖酶(ribozyme)。核糖酶為能催化分子內(nèi)或分子間的化學反應的核酸分子。因此，核糖酶為催化性核酸。核糖酶優(yōu)選催化分子間反應。存在多種不同類型的核糖酶，其催化核酸酶或核酸聚合酶類型的反應，其是基于在天然系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的核糖酶，如錘頭核糖酶(hammerhead ribozymes)、發(fā)夾核糖酶(hairpin ribozymes)和四膜蟲核糖酶(tetrahymena ribozymes)。亦存在多種在天然系統(tǒng)中未發(fā)現(xiàn)，但經(jīng)重新(de novo)工程設計以催化特異性反應的核糖酶。優(yōu)選的核糖酶切割RNA或DNA底物且更優(yōu)選切割RNA底物，如PG途徑組分的mRNA。核糖酶通常經(jīng)由識別并與靶底物結(jié)合然后切割以切割核酸底物。這種識別通常主要基于典型或非典型的堿基對相互作用。這種特性使得核糖酶成為用于核酸靶向特異性切割的尤其良好的候選物，因為對靶底物的識別是基于靶底物序列。

在一些實施例中，該一種或多種PG途徑抑制劑包含能抑制PG途徑組分的表達的三螺旋形成寡核苷酸。三螺旋形成寡核苷酸(triplex forming oligonucleotides，TFO)為可與雙鏈和/或單鏈核酸相互作用的分子，包括基因組DNA靶中的編碼區(qū)和非編碼區(qū)。當TFO與標靶區(qū)相互作用時，形成所謂三螺旋的結(jié)構(gòu)，其中有三鏈DNA形成依賴Watson-Crick與Hoogsteen堿基配對的復合物。TFO可以高親合力和特異性結(jié)合標靶區(qū)。在一些優(yōu)選的實施例中，三螺旋形成分子以小于10^-6、10^-8、10^-10或10^-12的Kd結(jié)合標靶分子。用于本發(fā)明中的例示性TFO包括PNA、LNA和經(jīng)LNA修飾的PNA，如Zorro-LNA。

在一些實施例中，該一種或多種PG途徑抑制劑包含外部引導序列(external guide sequences，EGS)。外部引導序列(EGS)為結(jié)合靶核酸分子形成復合物的分子。這種復合物由RNase P識別，其切割標靶分子。EGS可經(jīng)設計以特異性地靶向所選的mRNA分子。RNAse P有助于在細胞內(nèi)加工轉(zhuǎn)運RNA(transfer RNA，tRNA)?？赏ㄟ^使用導致標靶RNA：EGS復合物模擬天然tRNA底物的EGS，募集細菌RNAse P以實際上切割任何RNA序列。類似地，可利用真核EGS/RNAse P引導的RNA切割來切割真核細胞中的所需標靶。

在其他實施例中，該一種或多種PG途徑抑制劑包含生物分子(biomolecule)。本文所用的術語“生物分子”為由活生物體產(chǎn)生的任何分子，包括如蛋白質(zhì)、多糖、脂質(zhì)和核酸的大型巨分子以及如初級代謝物、二級代謝物和天然產(chǎn)物的小分子。

在其他實施例中，該一種或多種PG途徑抑制劑包含標靶中和劑。本文所用的術語“標靶中和劑”指能直接或間接地特異性地結(jié)合PG途徑的組分以干擾前列腺素對靶組織的最終作用的抗體、抗體片段或任何其他非抗體肽或合成的結(jié)合分子，如適體(aptamer)或合成抗體(synbody)。

標靶中和劑可通過用于產(chǎn)生高親合力結(jié)合配體的任何習知方法來產(chǎn)生，所述方法包括SELEX、噬菌體展示(phase display)和其他方法，包括本領域技術人員已知的組合化學和/或高通量方法。

適體為包含一類寡核苷酸的抗體的核酸變化形式，該寡核苷酸可形成與多種細胞表面分子、蛋白質(zhì)和/或巨分子結(jié)構(gòu)展現(xiàn)高親合力結(jié)合的特異性三維結(jié)構(gòu)。適體通常由體外(in vitro)選擇方法來識別，這種方法有時稱作“指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment)”或“SELEX”。SELEX通常由非常大量的隨機多核苷酸的集合開始，一般將其限制為每個分子靶向一個適體配體。適體通常為長度在15至50個堿基范圍內(nèi)的小核酸，其折疊成所界定的二級和三級結(jié)構(gòu)，如莖環(huán)(stem loop)或G-四分體(G-quartets)。

適體可與上述核酸抑制劑化學連接或接合以形成經(jīng)標靶的核酸抑制劑，如適體-siRNA嵌合體。適體-siRNA嵌合體含有與siRNA連接的適體形式的標靶部分。當使用適體-siRNA嵌合體時，優(yōu)選使用細胞內(nèi)化適體。在與特異性細胞表面分子結(jié)合時，適體可促使內(nèi)化至核酸抑制劑作用的細胞中。在一個實施例中，適體與siRNA均包含RNA。適體與siRNA可包含如本文進一步描述的任何的核苷酸修飾。適體優(yōu)選包含特異性指導結(jié)合表達趨化因子-(chemokine-)、細胞因子-(cytokine-)和/或受體標靶基因的細胞(如類淋巴細胞、上皮細胞和/或內(nèi)皮細胞)的標靶部分。

合成抗體(synbody)由包含經(jīng)篩選用于與所關注的標靶蛋白質(zhì)結(jié)合的隨機肽串組成的文庫中所產(chǎn)生的合成的抗體(synthetic antibody)。

標靶中和劑(包括適體和合成抗體)可經(jīng)工程設計以10^-10至10^-12摩爾濃度(M)的Kd非常緊密地結(jié)合標靶分子。在一些實施例中，標靶中和劑以小于10^-6、小于10^-8、小于10^-9、小于10^-10或小于10^-12M的Kd結(jié)合標靶分子。

在某些實施例中，該一種或多種PG途徑抑制劑為包含編碼PGT抑制劑和/或PGR抑制劑且適于表達PGT抑制劑和/或PGR抑制劑的多核苷酸。在其他實施例中，該一種或多種PG途徑抑制劑為包含編碼PGT抑制劑和/或PGR抑制劑且適于表達PGT抑制劑和/或PGR抑制劑的表達載體。

在一些實施例中，PG途徑抑制劑為工程化蛋白，其含有針對編碼PG途徑的任何組分的基因的TALE序列或工程化鋅指(Zinc Finger)。這種TALE或鋅指可設計為直接與基因結(jié)合，并通過切割基因、改變其核苷酸序列或?qū)⒁种频鞍踪|(zhì)與基因拴在一起使該基因沉默來抑制其表達。

在一些實施例中，使用CRISPR/CAS系統(tǒng)產(chǎn)生PG途徑抑制劑。在此策略中，對每一PG途徑基因的基因序列設計有特異性的引導分子(guide molecule)，并使用上文所述的遞送系統(tǒng)(病毒、質(zhì)體等)將其引入細胞或組織中。CRISPR/CAS系統(tǒng)的運行將修飾基因的DNA序列，以使得PG途徑基因得以刪除或抑制表達RNA的能力。

在一些實施例中，PG途徑抑制劑能通過靶向在染色質(zhì)中翻譯后修飾組織蛋白的染色質(zhì)相關酶來關閉對一種或多種PG途徑基因的轉(zhuǎn)錄。該酶的實例為(但不限于)組織蛋白去乙酰酶(histone deacetylases)、組織蛋白去甲基酶(histone demethylases)、組織蛋白乙酰基移轉(zhuǎn)酶(histone acetyltransferases)、組織蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(histone methyltransferases)和解旋酶(helicases)。

在一些實施例中，PG途徑抑制劑通過改變基因的DNA甲基化狀態(tài)靶向編碼每種組分的基因。靶向DNA去甲基酶(demethylases)與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT1、DNMTa和DNMTb)的TET家族的化合物可改變來自PG途徑中的任何基因的RNA的表達。

本發(fā)明的表達載體包含編碼PG途徑抑制劑或其一部分的多核苷酸。表達載體亦包括一個或多個與所表達的多核苷酸操作性連接的調(diào)節(jié)序列。該調(diào)節(jié)序列基于宿主細胞的類型來選擇。本領域技術人員將了解，表達載體的設計取決于如宿主細胞的選擇以及所期望的表達水平等因素。

在一些實施例中，表達載體為一質(zhì)體載體。在其他實施例中，表達載體為病毒載體。病毒載體的例子包括，但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus)、慢病毒(lentivirus)、腺病毒(adenovirus)、腺相關病毒(adeno-associated virus，AAV)、皰疹病毒(herpes virus)或α病毒(alphavirus)載體。病毒載體亦可為星狀病毒(astrovirus)、冠狀病毒(coronavirus)、正粘液病毒(orthomyxovirus)、乳多泡病毒(papovavirus)、副粘病毒(paramyxovirus)、小病毒(parvovirus)、小核糖核酸病毒(picornavirus)、痘病毒(poxvirus)或披衣病毒(togavirus)載體。在用于哺乳動物細胞中時，表達載體的控制功能常由病毒調(diào)節(jié)元件來提供。舉例而言，常用的啟動子來自于多瘤病毒(polyoma)、腺病毒2型(adenovirus 2)、巨細胞病毒(cytomegalovirus)和猿猴病毒40(Simian Virus 40)。在一些實施例中，表達載體含有組織特異性調(diào)節(jié)元件。表達載體的遞送包括，但不限于使用病毒載體直接感染、使靶組織暴露于與被殺死的病毒連接或未連接的聚陽離子縮合DNA(polycationic condensed DNA)、配體連接的DNA、基因槍、離子化輻射(ionizing radiation)、核電荷(nucleic acid)中和或與細胞膜融合。亦可采用裸質(zhì)體(naked plasmid)或病毒DNA?？墒褂蒙锟山到獾娜槟z珠粒來改良吸收效率。這種方法可通過對珠粒進行處理以增加其疏水性而進一步得到改良。亦可使用基于脂質(zhì)體(liposome)的方法將質(zhì)體或病毒載體引入靶組織中。

在一些實施例中，所述藥學組合物還包含一種或多種選自由以下活性組分組成的組中的一種或者多種活性組分：止痛劑、抗毒蕈堿劑(antimuscarinic agent)、抗利尿劑(antidiuretic)、解痙劑(spasmolytic)、磷酸二酯酶第5型(phosphodiesterase type 5)抑制劑(PDE 5抑制劑)和唑吡坦(zolpedim)。

抗毒蕈堿劑的實例包括，但不限于奧昔布寧(oxybutynin)、索利那新(solifenacin)、達非那新(darifenacin)、弗斯特羅定(fesoterodine)、托特羅定(tolterodine)、曲司氯胺(trospium)、阿托品(atropine)和三環(huán)類抗抑郁劑(tricyclic antidepressant)?？估騽┑膶嵗ǎ幌抻诳估蚣に?ADH)、血管收縮素II(angiotensin II)、醛固酮(aldosterone)、血管加壓素(vasopressin)、血管加壓素類似物(例如，去氨加壓素(desmopressin)、精氨酸加壓素(argipressin)、賴氨酸加壓素(lypressin)、苯賴加壓素(felypressin)、鳥氨酸加壓素(ornipressin)、特利加壓素(terlipressin))、血管加壓素受體促效劑、心房利鈉肽(atrial natriuretic peptide，ANP)和C型利鈉肽(C-type natriuretic peptide，CNP)受體(亦即，NPR1、NPR2和NPR3)拮抗劑(例如，HS-142-1、靛紅(isatin)、[Asu7,23']b-ANP-(7-28)]、安南汀(anantin)(一種來自天藍色鏈霉菌(Streptomyces coerulescens)的環(huán)狀肽)和3G12單克隆抗體)、生長抑制素第2型(somatostatin type 2)受體拮抗劑(例如，生長抑制素)、藥學上可接受的衍生物和其類似物、鹽、水合物和溶劑化物。解痙劑的例子包括，但不限于肌安寧(carisoprodol)、苯二氮類藥物(benzodiazepines)、巴氯芬(baclofen)、環(huán)苯扎林(cyclobenzaprine)、美他沙酮(metaxalone)、美索巴莫(methocarbamol)、可樂寧(clonidine)、可樂寧類似物和丹曲林(dantrolene)。PDE 5抑制劑的實例包括，但不限于他達那非(tadalafil)、西地那非(sildenafil)和伐地那非(vardenafil)。

藥學組合物可被配制成用于即刻釋放、延長釋放、延遲釋放、或其組合。

在一些實施例中，所述藥學組合物被配制成用于即刻釋放。

在其他實施例中，所述藥學組合物被配制成通過將活性成分嵌入如丙烯酸樹脂(acrylics)或甲殼素(chitin)等非可溶性物質(zhì)的基質(zhì)中而用于延長釋放。延長釋放形式經(jīng)設計從而通過在特定時間段內(nèi)維持恒定藥物水平來以預定速率釋放活性成分。這可經(jīng)由各種制劑來實現(xiàn)，該制劑包括，但不限于脂質(zhì)體和藥物-聚合物結(jié)合物，如水凝膠(hydrogels)。

延長釋放制劑可經(jīng)設計從而以預定速率釋放活性成分，以恒定藥物水平維持指定的持續(xù)時間段，如在施用后或在與活性成分的延遲釋放相關的遲滯期后長達約24小時、約22小時、約20小時、約18小時、約16小時、約14小時、約12小時、約10小時、約9小時、約8小時、約7小時、約6小時、約5小時、約4小時、約3小時或約2小時?？赏ㄟ^連續(xù)釋放活性成分或脈沖式地釋放活性成分來維持恒定的活性成分水平。

在某些實施例中，延長釋放制劑中的活性成分在約2小時至約12小時間的時間間隔內(nèi)釋放?；蛘?，活性成分可在約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10小時、約11小時或約12小時內(nèi)釋放。又在其他實施例中，延長釋放制劑中的活性成分在施用后在約5至約8小時間的時間段內(nèi)釋放。

在一些實施例中，延長釋放制劑包含由一個或多個惰性粒子組成的活性核(active core)，該粒子各自為珠粒、丸劑、藥片、顆粒、微膠囊(microcapsule)、微球體(microsphere)、微粒劑(microgranule)、納米膠囊(nanocapsule)或納米球體(nanosphere)的形式，其表面上使用例如流體床技術(fluid bed techniques)或本領域技術人員已知的其他方法涂布有含藥涂層或成膜組合物的形式的藥物。惰性粒子可具有各種尺寸，只要其足夠大以維持不易溶解即可。作為另一選擇，可通過?；?granulating)并研磨和/或通過擠出并滾圓(spheronization)含有藥物物質(zhì)的聚合物組合物來制備活性核。本文所用的術語“藥物”指藥學組合物的活性成分。

可通過本領域技術人員已知的技術將活性成分引入惰性載體，該技術包括如藥物層化(drug layering)、粉末涂布、擠出/滾圓、碾壓(roller compaction)或?；：酥谢钚猿煞值牧繉⑷Q于所需的劑量且通常在約1至100重量％、約5至100重量％、約10至100重量％、約20至100重量％、約30至100重量％、約40至100重量％、約50至100重量％、約60至100重量％，、約70至100重量％、或約80至100重量％間變化。

一般而言，視所需的遲滯時間(lag time)和/或所選的聚合物和涂層溶劑而定，活性核上的聚合物涂層基于經(jīng)涂布的粒子的重量計為約1至50％。本領域技術人員將能夠選擇適當量的藥物用于涂布至核上或并入核中來達成所期望的劑量。在一個實施例中，非活性核可為糖球體或緩沖劑晶體或經(jīng)囊封的緩沖劑晶體，如碳酸鈣、碳酸氫鈉、反丁烯二酸、酒石酸等，其使藥物的微環(huán)境發(fā)生改變以促使其釋放。

延長釋放制劑可利用促使活性劑隨時間逐漸釋放的各種延長釋放涂層或機制。在一些實施例中，延長釋放劑包含通過溶解控制的釋放來控制釋放的聚合物。在一個特定實施例中，將活性劑并入基質(zhì)中，該基質(zhì)包含非可溶性聚合物和涂布有不同厚度的聚合材料的藥物粒子或顆粒。聚合材料可包含脂質(zhì)障壁(lipid barrier)，脂質(zhì)障壁包含蠟狀材料(如棕櫚蠟(carnauba wax)、蜂蠟(beewax)、鯨蠟(spermaceti wax)、小燭樹蠟(candellila wax)、蟲膠蠟(shallac wax)、可可脂(cocoa butter)、鯨蠟硬脂醇(cetostearyl alcohol)、部分氫化植物油、地蠟(ceresin)、石蠟(paraffin wax)、純地蠟(ceresine)、肉豆蔻醇(myristyl alcohol)、硬脂醇(stearyl alcohol)、鯨蠟醇(cetyl alcohol)和硬脂酸(stearic acid))以及表面活性劑(如聚氧乙烯去水山梨醇單油酸酯(polyoxyethylene sorbitan monooleate))。在與例如生物流體(biological fluid)等水性介質(zhì)接觸時，聚合物涂層在預定的遲滯時間后乳化或腐蝕，視聚合物涂層的厚度而定。該遲滯時間與胃腸活動力(motility)、pH或胃滯留(gastric residence)無關。

在其他實施例中，延長釋放劑包含實現(xiàn)擴散控制的釋放的聚合基質(zhì)。所述基質(zhì)可包含一種或多種親水性和/或水溶脹性基質(zhì)形成聚合物、pH依賴性聚合物和/或非pH依賴性聚合物。

在一個實施例中，延長釋放制劑包含水溶性或水溶脹性基質(zhì)形成聚合物，視情況可選地含有一種或多種溶解增強劑和/或釋放促進劑。在水溶性聚合物溶解時，活性劑溶解(若可溶)并經(jīng)基質(zhì)的水合部分逐漸擴散。隨著更多水滲透至基質(zhì)的核中，凝膠層隨時間而增長，使凝膠層的厚度增加且提供阻礙藥物釋放的擴散障壁。當外層完全水合時，聚合物鏈完全松弛且不能再維持凝膠層的完整性，導致在基質(zhì)表面上的外部水合聚合物解纏(disentanglement)以及浸蝕(erosion)。水穿過凝膠層繼續(xù)向核滲透，直至其已被完全浸蝕。盡管可溶性藥物通過擴散與浸蝕機制的組合來釋放，浸蝕是非可溶性藥物的主要機制，與劑量無關。

類似地，水溶脹性聚合物通常在生物流體中水合且溶脹而形成均質(zhì)基質(zhì)結(jié)構(gòu)，該均質(zhì)基質(zhì)結(jié)構(gòu)在藥物釋放期間保持其形狀且作為藥物、溶解性增強劑和/或釋放促進劑的載體。初始的基質(zhì)聚合物水合階段導致藥物的緩慢釋放(遲滯期)。一旦水溶脹性聚合物完全水合且溶脹，則基質(zhì)中的水可同樣溶解藥物物質(zhì)且使其可穿過基質(zhì)涂層向外擴散。

另外，基質(zhì)的孔隙率(porosity)可因pH-依賴性釋放促進劑的濾出(leaching out)而增加，從而以較快速率釋放藥物。藥物釋放的速率隨后變?yōu)楹愣ǎ覟橥高^水合聚合物凝膠的藥物擴散的函數(shù)。自基質(zhì)釋放的速率視各種因素而定，所述因素包括聚合物的類型和水平、藥物的溶解度和劑量、聚合物與藥物的比率、填充劑的類型和水平、聚合物與填充劑的比率、藥物與聚合物的顆粒尺寸以及基質(zhì)的孔隙率和形狀。

例示性親水性和/或水溶脹性基質(zhì)形成聚合物包括，但不限于纖維素聚合物，包括羥烷基纖維素(hydroxyalkyl cellulose)和羧烷基纖維素(carboxyalkyl cellulose)，如羥丙基甲基纖維素(hydroxypropylmethylcellulose，HPMC)、羥丙基纖維素(hydroxypropylcellulose，HPC)、羥乙基纖維素(hydroxyethylcellulose，HEC)、甲基纖維素(methylcellulose，MC)、羧甲基纖維素(carboxymethylcellulose，CMC)；粉末狀纖維素，如微晶纖維素(microcrystalline cellulose)、乙酸纖維素(cellulose acetate)、乙基纖維素(ethylcellulose)、其鹽、及其組合；海藻酸鹽(alginate)；膠類，包括異源多糖膠(heteropolysaccharide gums)和同源多糖膠(homopolysaccharide gums)，如黃原膠(xanthan)、黃蓍膠(tragacanth)、果膠、阿拉伯膠(acacia)、刺梧桐膠(karaya)、海藻酸鹽、瓊脂、瓜爾膠(guar)、羥丙基瓜爾膠(hydroxypropyl guar)、硅酸鎂鋁(veegum)、角叉菜膠(carrageenan)、刺槐豆膠(locust bean gum)、結(jié)蘭膠(gellan gum)、及其衍生物；丙烯酸系樹脂(acrylic resin)，包括丙烯酸(acrylic acid)、甲基丙烯酸(methacrylic acid)、丙烯酸甲酯(methyl acrylate)、和甲基丙烯酸甲酯(methyl methacrylate)的聚合物和共聚物；和交聯(lián)聚丙烯酸(cross-linked polyacrylic acid)衍生物，如卡波姆(Carbomer)(例如，包括自俄亥俄州辛辛那提市諾譽有限公司(Noveon,Inc.,Cincinnati,OH)可購得的各種分子量等級的71G NF)、角叉菜膠；聚乙酸乙烯酯(polyvinylacetate)(例如，SR)；和聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone)和其衍生物，如交聯(lián)聚維酮(crospovidone)、聚氧化乙烯(polyethylene oxide)和聚乙烯醇(polyvinyl alcohol)。優(yōu)選的親水性和水溶脹性聚合物包括纖維素聚合物，尤其為HPMC。

延長釋放制劑可進一步包含至少一種能使親水性化合物在水性介質(zhì)(包括生物流體)中交聯(lián)以形成親水性聚合物基質(zhì)(亦即，凝膠基質(zhì))的粘合劑。

例示性粘合劑包括同源多糖，如半乳甘露聚糖膠

(galactomannan gums)、瓜爾膠、羥丙基瓜爾膠、羥丙基纖維素(HPC；例如Klucel EXF)和刺槐豆膠。在其他實施例中，粘合劑為海藻酸(alginic acid)衍生物、HPC或微晶化纖維素(microcrystallized cellulose，MCC)。其他粘合劑包括，但不限于淀粉、微晶纖維素、羥丙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素和聚乙烯吡咯烷酮。

在一實施例中，引入方法為通過向惰性載體上噴灑活性劑懸浮液和粘合劑的藥物層化法。

粘合劑在珠粒制劑中的存在量按重量計可為約0.1％至約15％，且優(yōu)選為按重量計為約0.2％至約10％。

在一些實施例中，親水性聚合物基質(zhì)更可包括離子型聚合物、非離子型聚合物或非水溶性疏水性聚合物，以提供更結(jié)實的凝膠層和/或減小基質(zhì)中的孔的數(shù)量和尺寸，從而減緩活性劑的擴散速率與浸蝕速率以及伴隨的活性劑的釋放。另外這還可抑制初始的突釋效應(burst effect)，并產(chǎn)生更穩(wěn)定的活性劑的“零級釋放(zero order release)”。

用于減緩溶解速率的例示性離子型聚合物包括陰離子型和陽離子型聚合物。例示性陰離子型聚合物包括，例如羧甲基纖維素鈉(Na CMC)；海藻酸鈉、丙烯酸或卡波姆(例如，934、940、974P NF)的聚合物；腸溶性(enteric)聚合物，如聚醋酸乙烯鄰苯二甲酸酯(polyvinyl acetate phthalate，PVAP)、甲基丙烯酸共聚物(methacrylic acid copolymer)(例如，L100、L 30D 55、A和FS 30D)和羥丙甲纖維素醋酸琥珀酸酯(hypromellose acetate succinate)(AQUAT HPMCAS)；和黃原膠。例示性陽離子型聚合物包括，例如甲基丙烯酸二甲氨基乙酯共聚物(dimethylaminoethyl methacrylate copolymer)(例如，E 100)。陰離子型聚合物(尤其為腸溶性聚合物)的引入有助于研發(fā)相對于單獨親水性聚合物的弱堿性藥物的非pH依賴性釋放概況。

用于減緩溶解速率的例示性非離子型聚合物包括，例如羥丙基纖維素(HPC)和聚氧化乙烯(PEO)(例如，POLYOX^TM)。

例示性疏水性聚合物包括乙基纖維素(例如，ETHOCEL^TM、)、乙酸纖維素、甲基丙烯酸共聚物(例如，NE 30D)、銨基-甲基丙烯酸酯(ammonio-methacrylate)共聚物(例如，RL 100或PO RS 100)、聚乙酸乙烯酯、單硬脂酸甘油酯(glyceryl monostearate)、脂肪酸(如檸檬酸乙酰基三丁酯(acetyl tributyl citrate))、及其組合和衍生物。

膨脹性聚合物可以按重量計為1％至50％、優(yōu)選按重量計為5％至40％、最佳按重量計為5％至20％的比例并入制劑中。膨脹性聚合物和粘合劑可在粒化之前或之后并入制劑中。聚合物亦可分散于有機溶劑或水-醇中并在粒化期間噴灑。

例示性釋放促進劑包括在低于約4.0的pH值下保持完整，并且在高于4.0、優(yōu)選高于5.0、最佳約6.0的pH值下溶解的pH依賴性腸溶性聚合物，且其作為釋放促進劑被認為有助于本發(fā)明。例示性pH依賴性聚合物包括，但不限于甲基丙烯酸共聚物；甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物(methacrylic acid-methyl methacrylate copolymer)(例如，L100(A型)、S100(B型)，德國羅姆股份有限公司(Rohm GmbH,Germany))、甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物(methacrylic acid-ethyl acrylate copolymer)(例如，L100-55(C型)和L30D-55共聚物分散液，德國羅姆股份有限公司(Rohm GmbH,Germany))；甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯與甲基丙烯酸甲酯的共聚物(FS)；甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯和丙烯酸乙酯的三元共聚物(terpolymer)、鄰苯二甲酸乙酸纖維素(cellulose acetate phthalates，CAP)；鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素(hydroxypropyl methylcellulose phthalate，HPMCP)(例如，HP-55、HP-50、HP-55S，日本信越化學公司(Shinetsu Chemical,Japan))；聚醋酸乙烯鄰苯二甲酸酯(PVAP)(例如，腸溶性白色OY-P-7171)；聚乙酸丁酸乙烯酯(polyvinylbutyrate acetate)、丁二酸乙酸纖維素(cellulose acetate succinates，CAS)；羥丙基甲基纖維素乙酸琥珀酸酯(hydroxypropyl methylcellulose acetate succinate，HPMCAS)(例如，HPMCAS LF等級、MF等級和HF等級，包括LF和MF，日本信越化學公司(Shin-Etsu Chemical,Japan))、蟲膠(shellac)(例如，MARCOAT^TM 125和MARCOAT^TM 125N)；乙酸乙烯酯-順丁烯二酸酐共聚物(vinyl acetate-maleic anhydride copolymer)、苯乙烯-順丁烯二酸單酯共聚物(styrene-maleic monoester copolymer)、羧甲基乙基纖維素(carboxymethyl ethylcellulose，CMEC，日本弗羅因德公司(Freund Corporation,Japan))；鄰苯二甲酸乙酸纖維素(CAP)(例如，)、偏苯三酸乙酸纖維素(cellulose acetate trimellitates，CAT)、及其中兩者或兩者以上的重量比在約2：1至約5：1之間的混合物，如重量比為約3：1至約2：1的L 100-55與S 100的混合物，或重量比為約3：1至約5：1的L 30D-55與FS的混合物。

這些聚合物可單獨或組合使用，或與除上文提及聚合物以外的聚合物一起使用。優(yōu)選的腸溶性pH依賴性聚合物為藥學上可接受的甲基丙烯酸共聚物。這些共聚物為基于甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯的陰離子型聚合物，且優(yōu)選具有約50,000至200,000，優(yōu)選約135,000的平均分子量。該共聚物中的游離羧基與甲基酯化羧基的比率可在，例如1：1至1：3的范圍內(nèi)，例如約1：1或1：2。釋放促進劑不限于pH依賴性聚合物?？焖偃芙馇覐膭┬涂焖贋V出而留下多孔結(jié)構(gòu)的其他親水性分子亦可用于同一目的。

在一些實施例中，基質(zhì)可包括釋放促進劑與溶解度增強劑的組合。溶解度增強劑可為離子型和非離子型表面活性劑、絡合劑、親水性聚合物、和pH改性劑(如酸化劑與堿化劑)以及經(jīng)由分子截留(entrapment)增加可溶性不佳藥物的溶解度的分子。可同時使用若干種溶解度增強劑。

溶解度增強劑可包括表面活性劑，如多庫酯鈉(sodium docusate)；月桂基硫酸鈉(sodium lauryl sulfate)；硬脂酰反丁烯二酸鈉(sodium stearyl fumarate)；和Spans(PEO改性的去水山梨醇單酯(sorbitan monoester)和脂肪酸去水山梨醇酯(fatty acid sorbitan ester))；聚(氧化乙烯)-聚氧化丙烯-聚(氧化乙烯)嵌段共聚物(poly(ethylene oxide)-polypropylene oxide-poly(ethylene oxide)block copolymer)(亦稱PLURONICS^TM)；絡合劑，如低分子量聚乙烯吡咯烷酮和低分子量羥丙基甲基纖維素；經(jīng)由分子截留輔助溶解度的分子，如環(huán)糊精；和pH改性劑，包括酸化劑(如檸檬酸、反丁烯二酸、酒石酸、和鹽酸)和堿化劑(如葡甲胺(meglumine)和氫氧化鈉)。

溶解度增強劑通常占劑型的按重量計的1％至80％、按重量計的1％至60％、按重量計的1％至50％、按重量計的1％至40％和按重量計的1％至30％，且可以各種方式并入。它們可在?；耙愿苫驖竦男问讲⑷胫苿┲?。其亦可在剩余材料經(jīng)粒化或以其他方式加工后加入制劑中。?；陂g，溶解度增強劑可以含或不含粘合劑的溶液形式噴灑。

在一個實施例中，延長釋放制劑包含在活性核上形成有包含一種或多種非水溶性的透水性成膜聚合物的非水溶性的透水性聚合物涂層或基質(zhì)。涂層可另外包括一種或多種水溶性聚合物和/或一種或多種增塑劑(plasticizer)。非水溶性聚合物涂層包含針對核中活性劑的釋放的障壁涂層，其中較低分子量(粘度)等級與較高粘度等級相比展示較快的釋放速率。

在一些實施例中，非水溶性成膜聚合物包括一種或多種烷基纖維素醚，如乙基纖維素及其混合物(例如，乙基纖維素等級PR100、PR45、PR20、PR10和PR7；Dow)。

在一些實施例中，非水溶性聚合物無需增塑劑即可提供合適特性(例如，延長釋放特征、機械特性和涂層特性)。舉例而言，包含聚乙酸乙烯酯(PVA)、丙烯酸酯/甲基丙烯酸酯的中性共聚物(如可購自贏創(chuàng)工業(yè)集團(Evonik Industries)的Eudragit NE30D)、乙基纖維素與羥丙基纖維素組合、蠟等的涂層可在無增塑劑的情形下應用。

在又一實施例中，非水溶性聚合物基質(zhì)還可包括增塑劑。所需增塑劑的量取決于增塑劑、非水溶性聚合物的特性和涂層的最終所需特性。增塑劑的合適含量相對于涂層的總重量而言，按重量計在約1％至約20％、約3％至約20％、約3％至約5％、約7％至約10％、約12％至約15％、約17％至約20％的范圍內(nèi)，或按重量計為約1％、約2％、約3％、約4％、約5％、約6％、約7％、約8％、約9％、約10％、約15％或約20％，包括其間的所有范圍和子范圍。

例示性增塑劑包括，但不限于三乙酸甘油(triacetin)、乙?；瘑胃视王?acetylated monoglyceride)、油類(蓖麻油、氫化蓖麻油、葡萄籽油、芝麻油、橄欖油等)、檸檬酸酯、檸檬酸三乙酯、乙?；鶛幟仕崛阴?acetyltriethyl citrate)、乙?；鶛幟仕崛□ァ幟仕崛□?、乙酰基檸檬酸三正丁酯、鄰苯二甲酸二乙酯、鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二辛酯、對羥苯甲酸甲酯、對羥苯甲酸丙酯、對羥苯甲酸丁酯、癸二酸二乙酯、癸二酸二丁酯、三丁酸甘油酯(glyceroltributyrate)、經(jīng)取代的三酸甘油酯和甘油酯、單乙?；?monoacetylated)和二乙?；?diacetylated)甘油酯(例如，9-45)、單硬脂酸甘油酯、三丁酸甘油酯、聚山梨醇酯80、聚乙二醇(如PEG-4000和PEG-400)、丙二醇、1,2-丙二醇、甘油、山梨糖醇(sorbitol)、草酸二乙酯、蘋果酸二乙酯、反丁烯二酸二乙酯(diethyl fumarate)、丙二酸二乙酯、丁二酸二丁酯、脂肪酸、順丁烯二酸二乙酯、丁二酸二乙酯、鄰苯二甲酸二辛酯、癸二酸二丁酯和其混合物。增塑劑可具有表面活性劑特性以使其可充當釋放改性劑(release modifier)。舉例而言，可使用非離子型清潔劑，如Brij 58(聚氧乙烯(20)鯨蠟醚(polyoxyethylene(20)cetyl ether))和其類似物。

增塑劑可為用于對硬質(zhì)或脆性(brittle)聚合材料賦予撓性(flexibility)的高沸點有機溶劑，且可影響活性劑的釋放概況。增塑劑一般導致沿聚合物鏈的分子間內(nèi)聚力減小，從而導致聚合物特性發(fā)生各種改變。該改變包括，但不限于抗拉強度(tensile strength)減小與伸長率增加和聚合物的玻璃轉(zhuǎn)變溫度(trnasition)或軟化溫度降低。增塑劑的量和選擇可影響，例如片劑的硬度，甚至可影響其溶解或崩解(disintegration)特征和其物理與化學穩(wěn)定性。某些增塑劑可增加涂層的彈性和/或可撓性(pliability)，由此減小涂層的脆性。

在另一實施例中，延長釋放制劑包含至少兩種凝膠形成聚合物的組合，包括至少一種非離子型凝膠形成聚合物和/或至少一種陰離子型凝膠形成聚合物。由凝膠形成聚合物的組合形成的凝膠提供受控制的釋放，使得當制劑被攝入并且與胃腸道流體接觸時，最接近表面的聚合物水合以形成粘性凝膠層。由于粘度高，同一過程中粘性層僅逐漸溶解掉使下方材料暴露。團塊因此緩慢溶解掉，由此緩慢釋放活性成分至胃腸道流體中。至少兩種凝膠形成聚合物的組合使得所得凝膠的特性，如粘度可被操控，從而提供所需的釋放概況。

在一個特定實施例中，制劑包含至少一種非離子型凝膠形成聚合物和至少一種陰離子型凝膠形成聚合物。在另一實施例中，制劑包含兩種不同的非離子型凝膠形成聚合物。在又一實施例中，制劑包含具有相同化學性，但溶解度、粘度和/或分子量不同的非離子型凝膠形成聚合物的組合(例如，具有不同粘度等級的羥丙基甲基纖維素的組合，如HPMC K100與HPMC K15M或HPMC K100M)。

例示性陰離子型凝膠形成聚合物包括，但不限于羧甲基纖維素鈉(Na CMC)、羧甲基纖維素(CMC)、陰離子型多糖，如海藻酸鈉、海藻酸、果膠、聚葡萄糖醛酸(polyglucuronic acid)(聚-α-和-β-1,4-葡萄糖醛酸(poly-α-and-β-1,4-glucuronic acid))、聚半乳糖醛酸(polygalacturonic acid)(果膠酸)、硫酸軟骨素、角叉菜膠(carrageenan)、富塞蘭藻膠(furcellaran)、陰離子型膠(如黃原膠(xanthan gum))、丙烯酸或卡波姆(934、940、974P NF)的聚合物、共聚物、聚合物、聚卡波非(polycarbophil)及其他。

例示性非離子型凝膠形成聚合物包括，但不限于聚維酮(Povidone)(PVP：聚乙烯吡咯烷酮)、聚乙烯醇、PVP與聚乙酸乙烯酯的共聚物、羥丙基纖維素(HPC)、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、羥乙基纖維素、羥甲基纖維素、明膠、聚氧化乙烯、阿拉伯膠、糊精、淀粉、聚甲基丙烯酸羥乙酯(polyhydroxyethylmethacrylate，PHEMA)、水溶性非離子型聚甲基丙烯酸酯(polymethacrylates)和其共聚物、經(jīng)改性的纖維素、經(jīng)改性的多糖、非離子型膠、非離子型多糖和/或其混合物。

制劑可選擇性包含如上所述的腸溶性聚合物和/或至少一種賦形劑，如填充劑、粘合劑(如上所述)、崩解劑和/或流動助劑或助流劑(glidant)。

例示性填充劑包括，但不限于乳糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、磷酸氫鈣、糖醇(亦稱為“糖多元醇”)(如山梨糖醇、甘露糖醇、乳糖醇(lactitol)、木糖醇、異麥芽酮糖醇(isomalt)、赤藻糖醇和氫化淀粉水解產(chǎn)物(若干種糖醇的共混物(blend)))、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和乙酸纖維素、腸溶性聚合物或其混合物。

例示性粘合劑包括，但不限于水溶性親水性聚合物，如聚維酮(PVP：聚乙烯吡咯烷酮)、共聚維酮(copovidone)(聚乙烯吡咯烷酮與聚乙酸乙烯酯的共聚物)、低分子量羥丙基纖維素(HPC)、低分子量羥丙基甲基纖維素(HPMC)、低分子量羧甲基纖維素、乙基纖維素、明膠、聚氧化乙烯、阿拉伯膠、糊精、硅酸鎂鋁(magnesium aluminum silicate)和淀粉，以及聚甲基丙烯酸酯如Eudragit NE 30D、Eudragit RL、Eudragit RS、Eudragit E，聚乙酸乙烯酯、腸溶性聚合物或其混合物)。

例示性崩解劑包括，但不限于低取代的羧甲基纖維素鈉、交聯(lián)聚維酮(crospovidone)(交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮)、羧甲基淀粉鈉(sodium carboxymethyl starch)(乙醇酸淀粉鈉(sodium starch glycolate))、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉(交聯(lián)羧甲纖維素(Croscarmellose))、預膠化淀粉(淀粉1500)、微晶纖維素、非水溶性淀粉、羧甲基纖維素鈣、低取代的羥丙基纖維素和硅酸鎂或硅酸鋁。

例示性助流劑包括，但不限于鎂、二氧化硅、滑石、淀粉、二氧化鈦和其類似物。

在又一實施例中，延長釋放制劑通過以涂布材料和可選擇的造孔劑和其他賦形劑來涂布水溶性/分散性含藥粒子(如其中的珠?；蛑榱Ｈ后w(如上文所述))而形成。涂布材料優(yōu)選選自包含以下的組：纖維素聚合物，如乙基纖維素(例如，)、甲基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、乙酸纖維素和鄰苯二甲酸乙酸纖維素；聚乙烯醇；丙烯酸聚合物，如聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯和其共聚物；和其他基于水或基于溶劑的涂布材料。用于給定的珠粒群體的控釋涂層(release-controlling coating)可由該控釋涂層的至少一種參數(shù)來控制，如涂層的性質(zhì)、涂布水平、造孔劑的類型和濃度、加工參數(shù)和其組合。因此，改變參數(shù)(如造孔劑濃度或固化條件)使得自任何指定珠粒群體的活性劑釋放發(fā)生改變，由此可選擇性地將制劑調(diào)整至預定的釋放概況。

適用于本文的控釋涂層中的造孔劑可為有機劑或無機劑且包括在使用的環(huán)境中可自涂層中溶解出、萃取(extract)出或濾出的材料。例示性造孔劑包括，但不限于有機化合物，如單糖、寡糖和多糖(包括蔗糖、葡萄糖、果糖、甘露糖醇、甘露糖、半乳糖、山梨糖醇、普魯蘭糖(pullulan)和聚葡糖(dextran))；在使用的環(huán)境中可溶的聚合物，如水溶性親水性聚合物、羥烷基纖維素、羧烷基纖維素、羥丙基甲基纖維素、纖維素醚、丙烯酸樹脂、聚乙烯吡咯烷酮、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、聚氧化乙烯、卡波蠟(Carbowax)、卡波普(Carbopol)和其類似物、二醇、多元醇、聚羥基醇(polyhydric alcohol)、聚亞烷基二醇(polyalkylene glycol)、聚乙二醇(polyethylene glycol)、聚丙二醇或其嵌段聚合物、聚二醇(polyglycol)和聚(α-Ω)烷二醇(poly(α-Ω)alkylenediols)；和無機化合物，如堿金屬鹽、碳酸鋰、氯化鈉、溴化鈉、氯化鉀、硫酸鉀、磷酸鉀、乙酸鈉、檸檬酸鈉、合適的鈣鹽、其組合和其類似物。

控釋涂層可進一步包含本領域已知的其他添加劑，如增塑劑、抗粘劑、助流劑(或流動助劑)和消泡劑。在一些實施例中，經(jīng)涂布的粒子或珠?？深~外包括“外涂層(overcoat)”，以對珠粒提供例如防潮保護、減少靜電荷、掩味、調(diào)味、著色和/或拋光或其他美化。用于這種外涂層的合適涂布材料在本領域中已知且包括，但不限于纖維素聚合物，如羥丙基甲基纖維素、羥丙基纖維素和微晶纖維素或其組合(例如，各種涂布材料)。

經(jīng)涂布的粒子或珠?？深~外含有增強劑，其可例示為，但不限于溶解度增強劑、溶解增強劑、吸收增強劑、滲透性增強劑、穩(wěn)定劑、絡合劑、酶抑制劑、p-糖蛋白抑制劑和多藥抗性蛋白抑制劑。作為另一選擇，該制劑亦可含有與涂布粒子分離的增強劑，例如在單獨的珠粒群體中或呈粉末形式。在又一實施例中，在控釋涂層下方或上方的經(jīng)涂布的粒子上的隔離層(separate layer)中可含有增強劑。

在其他實施例中，延長釋放制劑被配制成通過滲透機制釋放活性劑。舉例而言，膠囊可被配制成具有單滲透單元或其可引入囊封于硬明膠膠囊中的2、3、4、5或6個推拉式單元(push-pull unit)，由此每個雙層推拉式單元含有滲透推動層(osmatic push layer)和藥物層(drug layer)，二者均由半滲透膜所圍繞。對與藥物層相鄰的膜鉆出一個或多個孔。這種膜可額外以pH依賴性腸溶衣覆蓋，使直至胃排空之后才進行釋放。明膠膠囊在攝入后即刻溶解。在推拉式單元進入小腸時，腸溶衣分解，隨后可使流體經(jīng)由半滲透膜流出，使?jié)B透壓推動隔室溶脹，以驅(qū)使藥物以經(jīng)半滲透膜輸送水的速率精確控制的速率經(jīng)小孔推出。藥物的釋放可在恒定速率下進行長達24小時或更長時間。

滲透推動層包含一種或多種滲透劑，從而產(chǎn)生驅(qū)動力用于將水經(jīng)半滲透膜輸送至遞送媒劑(delivery vehicle)的核中。一類滲透劑包括水溶脹性親水性聚合物，亦稱為“滲透聚合物(osmopolymer)”和“水凝膠(hydrogel)”，其包括，但不限于親水性乙烯和丙烯酸聚合物、多糖(如海藻酸鈣)、聚氧化乙烯(PEO)、聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、聚(2-羥乙基甲基丙烯酸酯)(poly(2-hydroxyethyl methacrylate))、聚(丙烯)酸、聚(甲基丙烯)酸、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、交聯(lián)PVP、聚乙烯醇(PVA)、PVA/PVP共聚物、含有疏水性單體如甲基丙烯酸甲酯和乙酸乙烯酯的PVA/PVP共聚物、含有大PEO嵌段的親水性聚氨酯、交聯(lián)羧甲纖維素鈉、角叉菜膠、羥乙基纖維素(HEC)、羥丙基纖維素(HPC)、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、羧甲基纖維素(CMC)和羧乙基纖維素(CEC)、海藻酸鈉、聚卡波非、明膠、黃原膠和乙醇酸淀粉鈉。

另一類滲透劑包括滲透原(osmogen)，其能夠吸水以影響跨越半滲透膜的滲透壓梯度。例示性滲透原包括，但不限于無機鹽，如硫酸鎂、氯化鎂、氯化鈣、氯化鈉、氯化鋰、硫酸鉀、磷酸鉀、碳酸鈉、亞硫酸鈉、硫酸鋰、氯化鉀和硫酸鈉；糖類，如右旋糖(dextrose)、果糖、葡萄糖、肌醇(inositol)、乳糖、麥芽糖、甘露糖醇、棉籽糖(raffinose)、山梨糖醇、蔗糖、海藻糖和木糖醇；有機酸，如抗壞血酸、苯甲酸、反丁烯二酸、檸檬酸、順丁烯二酸、癸二酸、山梨酸、己二酸、四乙酸乙二胺(edetic acid)、谷氨酸、對甲苯磺酸、丁二酸和酒石酸；尿素；和其混合物。

可用于形成半滲透膜的材料包括在生理相關pH下具有透水性和非水溶性或易于通過化學改變(如交聯(lián))而具備非水溶性的各種等級的丙烯酸類、乙烯類、醚類、聚酰胺類、聚酯類和纖維素衍生物。

在一些實施例中，延長釋放制劑包含在胃和腸中均可抗浸蝕的多糖涂層。該聚合物僅可在結(jié)腸中降解，結(jié)腸中含有大微生物群，其含有的含生物降解酶降解例如多糖涂層從而以受控制的時間依賴性的方式來釋放藥物內(nèi)容物。例示性多糖涂層可包括，例如直鏈淀粉、阿拉伯半乳聚糖(arabinogalactan)、幾丁聚糖(chitosan)、硫酸軟骨素、環(huán)糊精、聚葡糖、瓜爾膠、果膠、木膠(xylan)和其組合或衍生物。

在一些實施例中，藥學組合物被配制成用于延遲釋放或延遲-延長釋放。在一些實施例中，延遲延長釋放制劑包括涂布有腸溶衣的延長釋放制劑，腸溶衣為涂覆于口服藥物上以防止藥物在到達小腸之前釋放的障壁。延遲釋放制劑(如腸溶衣)防止對胃具有刺激作用的藥物(如阿司匹林)在胃中溶解。本文所用的術語“腸溶衣(enteric coating)”包含一種或多種具有pH依賴性或非pH依賴性釋放概況的聚合物的涂層。經(jīng)腸溶性涂布的藥丸在胃的酸性液(pH約為3)中不溶解，但其將在小腸或結(jié)腸的堿性(pH為7至9)環(huán)境中溶解。腸溶性聚合物涂層通常抗拒活性劑釋放直至施用后約3至4小時的胃排空遲滯期后一個時間段。

這些涂層亦用于保護酸不穩(wěn)定藥物免于暴露于胃酸中，而是將其遞送至其不發(fā)生降解且產(chǎn)生其所期望作用的堿性pH環(huán)境(腸的pH 5.5和以上)。術語“脈沖式釋放(pulsatile-release)”為一種延遲釋放，其在本文中的使用涉和藥物制劑，該藥物制劑在預定遲滯期后即刻在短時間內(nèi)提供快速和短暫的藥物釋放，由此在藥物施用后產(chǎn)生藥物的“脈沖式”血漿分布。制劑可被設計為在施用后以預定的時間間隔提供單次脈沖式釋放或多次脈沖式釋放，或以脈沖式釋放(例如，20％至60％的活性成分)而隨后進行一個時間段的延長釋放(例如，連續(xù)釋放剩余的活性成分)。延遲釋放或脈沖式釋放制劑一般包含一種或多種包覆有障壁涂層的成分，其在指定遲滯期后溶解、浸蝕或破裂。

用于延遲釋放的障壁涂層視目標而定可由各種不同材料組成。此外，制劑可包含復數(shù)種障壁涂層以促使以短暫的(temporal)方式釋放。涂層可為糖涂層、膜涂層(例如，基于羥丙基甲基纖維素、甲基纖維素、甲基羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羧甲基纖維素、丙烯酸酯共聚物、聚乙二醇和/或聚乙烯吡咯烷酮)或基于甲基丙烯酸共聚物、鄰苯二甲酸乙酸纖維素、鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素、乙酸丁二酸羥丙基甲基纖維素(hydroxypropyl methylcellulose acetate succinate)、聚醋酸乙烯鄰苯二甲酸酯(polyvinyl acetate phthalate)、蟲膠(shellac)和/或乙基纖維素的涂層。此外，制劑可額外包括延遲時間的材料，如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯(glyceryl distearate)。

在一些實施例中，延遲-延長釋放制劑包括腸溶衣，其包含一種或多種促使活性劑在胃腸道的近端區(qū)或遠程區(qū)中釋放的聚合物。pH依賴性腸溶衣包含一種或多種pH依賴性或pH敏感性聚合物，其在低pH下(如在胃中)維持其結(jié)構(gòu)完整性但在胃腸道更遠程區(qū)(如小腸)的較高pH環(huán)境中溶解并釋放藥物內(nèi)容物。為本發(fā)明的目的，“pH依賴性(pH dependent)”定義為具有根據(jù)環(huán)境pH而變化的特征(例如，溶解)。例示性的pH依賴性聚合物已于前文描述。pH依賴性聚合物通常展示對于溶解而言的特征性pH最佳值。在一些實施例中，pH依賴性聚合物展示在約5.0與5.5之間、約5.5與6.0之間、約6.0與6.5之間或約6.5與7.0之間的pH最佳值。在其他實施例中，pH依賴性聚合物展示≥5.0、≥5.5、≥6.0、≥6.5或≥7.0的pH最佳值。

在某些實施例中，涂布方法采用一種或多種pH依賴性聚合物與一種或多種非pH依賴性聚合物的共混。當可溶性聚合物達到其溶解的最佳pH時，pH依賴性聚合物與非pH依賴性聚合物的共混可降低活性成分的釋放速率。

在一些實施例中，“延遲釋放”或“延遲-延長釋放”的概況可使用含有一種或多種活性劑的非水溶性膠囊體來獲得，其中該膠囊體的一端以不溶性、但具滲透性和溶脹性的水凝膠插塞(plug)來封閉。在與胃腸道流體或溶解介質(zhì)接觸時，插塞溶脹、將其自身推出膠囊且在預定的遲滯時間后釋放藥物，這可由例如插塞的位置和尺寸來控制。膠囊體可進一步涂布有外部pH依賴性腸溶衣，使膠囊在到達小腸前保持完整。合適的插塞材料包括，例如聚甲基丙烯酸酯、易受浸蝕的壓縮聚合物(例如，HPMC、聚乙烯醇)、經(jīng)凝結(jié)(congealed)的熔融聚合物(例如，單油酸甘油酯(glycerl mono oleate))和酶促控制的可受浸蝕聚合物(例如，多糖，如直鏈淀粉、阿拉伯半乳聚糖、幾丁聚糖、硫酸軟骨素、環(huán)糊精、聚葡糖、瓜爾膠、果膠和木糖膠)。

在其他實施例中，膠囊或雙層片劑可被配制成含有含藥核(drug-containing core)，其被溶脹層和外部不溶性、但具半滲透性的聚合物涂層或膜所包覆。破裂前的遲滯時間可由聚合物涂層的滲透性與機械特性和溶脹層的溶脹行為來控制。通常，溶脹層包含一種或多種溶脹劑，如溶脹且在其結(jié)構(gòu)中保留水的溶脹性親水性聚合物。

用于延遲釋放涂層中的例示性水溶脹性材料包括，但不限于聚氧化乙烯(具有例如1,000,000與7,000,000之間的平均分子量，如)；甲基纖維素；羥丙基纖維素；羥丙基甲基纖維素；具有100,000至6,000,000的重量平均分子量的聚環(huán)氧烷(polyalkylene oxides)，包括，但不限于聚(亞甲基氧化物)(poly(methylene oxide))、聚(環(huán)氧丁烷)(poly(butylene oxide))、具有25,000至5,000,000的分子量的聚(羥烷基甲基丙烯酸酯)(poly(hydro alkyl mrthacrylate))、具有低縮醛殘基(low acetal residue)且與乙二醛、甲醛或戊二醛交聯(lián)且具有200至30,000間的聚合度的聚(乙烯)醇(poly(vinyl)alcohol)；甲基纖維素、經(jīng)交聯(lián)的瓊脂和羧甲基纖維素的混合物；通過形成順丁烯二酸酐(maleic anhydride)與苯乙烯、乙烯、丙烯、丁烯或異丁烯的細碎共聚物(finely divided copolymer)的分散體系所產(chǎn)生的水凝膠形成共聚物，其以共聚物中每摩爾順丁烯二酸酐用0.001至0.5摩爾的飽和交聯(lián)劑交聯(lián)；具有450,000至4,000,000的分子量的酸性羧基聚合物；聚丙烯酰胺；經(jīng)交聯(lián)的水溶脹性茚順丁烯二酸酐(indenemaleicanhydride)聚合物；具有80,000至200,000的分子量的聚丙烯酸；淀粉接枝共聚物(starch graft copolymers)；由縮合葡萄糖單元組成的丙烯酸酯聚合物多糖，如二酯交聯(lián)聚葡萄糖(diester cross-linked polyglucan)；具有3,000至60,000毫帕˙秒(mPa˙s)的粘度，且呈質(zhì)量體積比(w/v)為0.5％至1％的水溶液形式的卡波姆(carbomer)；纖維素醚，如具有約1000至7000毫帕·秒的粘度，且呈重量/重量比為1％的水溶液形式(25℃)的羥丙基纖維素；具有約1000或更高、優(yōu)選2,500或更高至最大25,000毫帕·秒的粘度，且呈重量體積比為2％的水溶液形式的羥丙基甲基纖維素；在20℃下具有約300至700毫帕·秒的粘度，且呈重量體積比為10％的水溶液形式的聚乙烯吡咯烷酮；和其組合。

作為另一選擇，可由崩解遲滯時間(disintegration lag time)來控制藥物的釋放時間，這取決于在主體底部含有預定微孔的非水溶性聚合物膜(如乙基纖維素，EC)的耐受度和厚度與溶脹性賦形劑(如經(jīng)低取代的羥丙基纖維素(L-HPC)和乙醇酸鈉)的量之間的平衡?？诜?，GI流體經(jīng)微孔滲透，致使溶脹性賦形劑溶脹，這產(chǎn)生使膠囊組件脫離的內(nèi)壓，該組件包括含有溶脹性材料的第一膠囊主體、含有藥物的第二膠囊主體和附接至第一膠囊主體的外蓋。

延遲釋放涂層可進一步包含抗粘劑，如滑石和單硬脂酸甘油酯。延遲釋放涂層可進一步包含一種或多種增塑劑，包括，但不限于檸檬酸三乙酯、乙?；鶛幟仕崛阴?、乙?；鶛幟仕崛□ァ⒕垡叶家阴；瘑胃视王?polyethylene glycol acetylated monoglycerides)、甘油、三乙酸甘油酯、丙二醇、鄰苯二甲酸酯(例如，鄰苯二甲酸二乙酯、鄰苯二甲酸二丁酯)、二氧化鈦、氧化鐵、蓖麻油、山梨糖醇和癸二酸二丁酯。

在另一個實施例中，延遲釋放制劑采用透水性但非可溶性的膜涂層來封閉活性成分和滲透劑。當來自腸道的水經(jīng)此膜緩慢擴散至核中時，核溶脹直至膜脹裂，由此釋放活性成分。膜涂層可被調(diào)整成實現(xiàn)各種水滲透速率或釋放時間。

在另一個體實施例中，延遲釋放制劑采用不透水的片劑涂層，借此水經(jīng)受控制的孔隙進入涂層中直至核脹裂。當片劑脹裂時，藥物內(nèi)容物即刻釋放或經(jīng)較長時間段釋放。該技術和其他技術可經(jīng)改進以允許在開始釋放藥物之前存在預定的遲滯時間。

在另一個實施例中，活性劑在制劑中遞送以提供延遲釋放和延長釋放(延遲-延長釋放)。本文中所使用的術語“延遲-延長釋放”涉及藥物制劑，提供在施用后以預定的時間或遲滯期活性劑的脈沖式釋放，其后接續(xù)著活性劑的延長釋放。

在一些實施例中，即刻釋放、延長釋放、延遲釋放或延遲-延長釋放制劑包含由一個或多個惰性粒子組成的活性核，該惰性粒子各自為珠粒、丸劑、藥片、顆粒、微膠囊、微球體、微顆粒、納米膠囊或納米球體的形式，其表面使用例如流體床技術或本領域技術人員已知的其他方法涂布有呈例如含藥膜形成組合物(drug-containing film-forming composition)形式的藥物。惰性粒子可具有各種尺寸，只要其足夠大以保持不易溶解即可。作為另一選擇，可通過?；⒀心ズ?或通過擠壓并滾圓含有藥物物質(zhì)的聚合物組合物來制備活性核。

核中的藥物的量將取決于所需的劑量且通常在約1至100重量％、約5至100重量％、約10至100重量％、約20至100重量％、約30至100重量％、約40至100重量％、約50至100重量％、約60至100重量％、約70至100重量％或約80至100重量％的范圍內(nèi)變化。一般而言，視所需釋放概況的遲滯時間與類型和/或所選的聚合物與涂料溶劑而定，活性核上的聚合物涂層基于被涂布粒子的重量計將為約1至50％。本領域技術人員將能夠選擇適當量的藥物用于涂布至核上或并入核中以達成所期望的劑量。在一個實施例中，非活性核可為糖球體或緩沖劑晶體或經(jīng)囊封的緩沖劑晶體，如碳酸鈣、碳酸氫鈉、反丁烯二酸、酒石酸等，其使藥物的微環(huán)境發(fā)生改變以促進其釋放。

在一些實施例中，舉例而言，延遲釋放或延遲-延長釋放組合物可通過以非水溶性聚合物與腸溶性聚合物的混合物涂布水溶性/分散性含藥粒子(如珠粒)來形成，其中非水溶性聚合物與腸溶性聚合物可以4：1至1：1的重量比存在，且涂層的總重量以所涂布珠粒的總重量計為10至60重量％。藥物層積珠?？梢暻闆r包括控制內(nèi)部溶解速率的乙基纖維素膜。聚合膜外層的組成以及內(nèi)層與外層各自的重量經(jīng)優(yōu)化，基于體外/體內(nèi)的相關性進行預測，以對于給定的活性而言達成所期望的生理節(jié)律(circadian rhythm)釋放概況。

在其他實施例中，制劑可包含即刻釋放含藥粒子(無溶解速率控制聚合物膜)與在例如口服后展示2至4小時的遲滯時間的延遲-延長釋放珠粒的混合物，由此提供雙脈沖釋放(two-pulse profile)概況。

在一些實施例中，活性核涂布有一層或多層溶解速率受控制的聚合物，以獲得具有或不具有遲滯時間的所期望的釋放概況。內(nèi)層膜在水或體液吸入核中后可在很大程度上控制藥物的釋放速率，而外層膜可提供所期望的遲滯時間(在水或體液吸入核中后無藥物釋放或藥物釋放極少的時期)。內(nèi)層膜可包含非水溶性聚合物或非水溶性聚合物與水溶性聚合物的混合物。

適用于在很大程度上控制長達6小時的遲滯時間的外膜的聚合物可包含如上所述的腸溶性聚合物和10至50重量％的非水溶性聚合物。非水溶性聚合物與腸溶性聚合物的比率可在4：1至1：2的范圍內(nèi)變化，這些聚合物優(yōu)選以約1：1的比率存在。通常所用的非水溶性聚合物為乙基纖維素。

例示性非水溶性聚合物包括乙基纖維素、聚乙酸乙烯酯(來自BASF的Kollicoat SR#0D)、基于丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸甲酯的中性共聚物、帶季銨基的丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的共聚物，如NE、RS和RS30D、RL或RL30D和其類似物。例示性水溶性聚合物包括低分子量HPMC、HPC、甲基纖維素、聚乙二醇(分子量>3000的PEG)，其厚度視活性劑在水中的溶解度和所用的基于溶劑或乳膠懸浮液的涂料制劑而定，在1重量％至高達10重量％的范圍內(nèi)。非水溶性聚合物與水溶性聚合物的比率通常可在95：5至60：40、優(yōu)選80：20至65：35的范圍內(nèi)變化。在一些實施例中，使用AMBERLITE^TM IRP69樹脂作為延長釋放載體。AMBERLITE^TM IRP69為不溶、強酸性、鈉形式陽離子交換樹脂，其適合作為陽離子性(堿性)物質(zhì)的載體。在其他實施例中，使用DUOLITE^TM AP143/1093樹脂作為延長釋放載體。DUOLITE^TMAP143/1093為不溶、強堿性、陰離子交換樹脂，其適合作為陰離子性(酸性)物質(zhì)的載體。當用作藥物載體時，AMBERLITE^TM IRP69或/和DUOLITE^TM AP143/1093樹脂提供一種使試劑與不溶性聚合基質(zhì)結(jié)合的方法。經(jīng)由形成樹脂-藥物復合物(藥物樹脂酸鹽(drug resinates))來實現(xiàn)延長釋放。當藥物與高電解質(zhì)濃度(此為胃腸道的典型特征)達到平衡時，藥物在體內(nèi)自樹脂釋放。由于與陽離子交換系統(tǒng)的芳香族結(jié)構(gòu)的疏水性相互作用，更多疏水性藥物通常將以較低速率自樹脂溶離。

在一些實施例中，藥學組合物被配制成用于口服。口服劑型包括例如片劑、膠囊和囊片且亦可包含復數(shù)個可經(jīng)囊封或未經(jīng)囊封的顆粒、珠粒、粉末或丸劑。片劑和膠囊代表最便利的口服劑型，在此情形下采用固體醫(yī)藥載體。

在延遲釋放制劑中，可向丸劑、片劑或膠囊涂覆一或更多層障壁涂層以促使藥物緩慢溶解同時釋放至腸道中。障壁涂層通常含有一種或多種在治療性組合物或活性核周圍圍繞、包圍或形成層或膜的聚合物。在一些實施例中，活性劑在制劑中遞送從而在施用后以預定時間提供延遲釋放。延遲可長達約10分鐘、約20分鐘、約30分鐘、約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約5小時、約6小時或更長時間。

可對含有活性劑的顆粒、珠粒、粉末或丸劑、片劑、膠囊或其組合應用各種涂布技術以產(chǎn)生不同且獨特的釋放概況。在一些實施例中，藥學組合物為含有單層涂層的片劑或膠囊形式。在其他實施例中，藥學組合物為含有多層涂層的片劑或膠囊形式。在一些實施例中，本發(fā)明的藥學組合物被配制成用于延長釋放或延遲延長釋放100％的活性成分。

在其他實施例中，本發(fā)明的藥學組合物被配制成用于雙階段延長釋放(two-phase extended-release)或延遲雙階段延長釋放(delayed two-phase extended-release)，其特征在于“即刻釋放”組分在施用兩小時內(nèi)釋放，且“延長釋放”組分在2至12小時的時間段內(nèi)釋放。在一些實施例中，“即刻釋放”組分提供欲由藥物制劑遞送的活性劑總劑量的約1％至90％，而“延長釋放”組分提供欲由藥物制劑遞送的活性劑總劑量的10％至99％。舉例而言，即刻釋放組分可提供欲由藥物制劑遞送的活性劑總劑量的約10％至90％、或約10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％。延長釋放組分提供欲由制劑遞送的活性劑總劑量的約10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。在一些實施例中，即刻釋放組分與延長釋放組分含有相同的活性成分。在其他實施例中，即刻釋放組分與延長釋放組分含有不同的活性成分(例如，一種組分中為一種PG途徑抑制劑，而另一種組分中為另一種PG途徑抑制劑)。在一些實施例中，即刻釋放組分與延長釋放組分各自含有PG途徑抑制劑和選自由阿司匹林、布洛芬、萘普生鈉、吲哚美辛、萘丁美酮和乙酰氨基酚所組成的組的止痛劑。在其他實施例中，即刻釋放組分和/或延長釋放組分進一步包含一種或多種選自由抗毒蕈堿劑、抗利尿劑、解痙劑、磷酸二酯酶(phosphodiesterase)型抑制劑(PDE 5抑制劑)和唑吡坦所組成的組的額外活性劑。

在一些實施例中，藥學組合物包含復數(shù)種選自由PG途徑抑制劑、止痛劑、抗毒蕈堿劑、抗利尿劑、解痙劑、PDE 5抑制劑和唑吡坦所組成的組的活性成分?？苟巨A劑的實例包括，但不限于奧昔布寧、索利那新、達非那新、弗斯特羅定、托特羅定、曲司氯胺、阿托品和三環(huán)狀抗抑郁劑?？估騽┑睦影?，但不限于抗利尿劑激素(ADH)、血管收縮素II、醛固酮、血管加壓素、血管加壓素類似物(例如，去胺加壓素、精氨酸加壓素、賴氨酸加壓素、苯賴加壓素、鳥氨酸加壓素、特利加壓素)、血管加壓素受體促效劑、心房利鈉肽(ANP)和C型利鈉肽(CNP)受體(亦即，NPR1、NPR2和NPR3)拮抗劑(例如，HS-142-1、靛紅、[Asu7,23']b-ANP-(7-28)]、安南汀(一種來自天藍色鏈霉菌的環(huán)狀肽)、和3G12單克隆抗體)、生長抑制素2型受體拮抗劑(例如，生長抑制素)、藥學上可接受的衍生物和其類似物、鹽、水合物和溶劑化物。解痙劑的例子包括，但不限于肌安寧、苯二氮類藥物、巴氯芬、環(huán)苯扎林、美他沙酮、美索巴莫、可樂寧、可樂寧類似物和丹曲林。PDE 5抑制劑的例子包括，但不限于他達那非、西地那非和伐地那非。

在一些實施例中，藥學組合物包含復數(shù)種活性成分，其包含(1)一種或多種PG途徑抑制劑和(2)一種或多種選自由止痛劑、抗毒蕈堿劑、抗利尿劑、解痙劑、PDE 5抑制劑和唑吡坦所組成的組的其他活性成分。在一些實施例中，復數(shù)種活性成分被配制成用于即刻釋放。在其他實施例中，復數(shù)種活性成分被配制成用于延長釋放。在其他實施例中，復數(shù)種活性成分被配制成用于延遲釋放。在其他實施例中，復數(shù)種活性成分被配制成用于即刻釋放與延長釋放(例如，每種活性成分的第一部分被配制成用于即刻釋放而每種活性成分的第二部分被配制成用于延長釋放)。在又一些其他實施例中，該活性成分中的一些被配制成用于即刻釋放且該活性成分中的一些被配制成用于延長釋放(例如，活性成分A、B、C被配制成用于即刻釋放而活性成分C和D被配制成用于延長釋放)。在一些其他實施例中，復數(shù)種活性成分被配制成用于延遲-延長釋放。

在某些實施例中，藥學組合物包含即刻釋放組分與延長釋放組分。即刻釋放組分可包含一種或多種選自由PG途徑抑制劑、止痛劑、抗毒蕈堿劑、抗利尿劑、解痙劑、PDE 5抑制劑和唑吡坦所組成的組的活性成分。延長釋放組分可包含一種或多種選自由PG途徑抑制劑、止痛劑、抗毒蕈堿劑、抗利尿劑、解痙劑、PDE 5抑制劑和唑吡坦所組成的組的活性成分。在一些實施例中，即刻釋放組分與延長釋放組分具有完全相同的活性成分。在其他實施例中，即刻釋放組分與延長釋放組分具有不同的活性成分。在又一些其他實施例中，即刻釋放組分與延長釋放組分具有一種或多種共同的活性成分。在一些其他實施例中，即刻釋放組分和/或延長釋放組分進一步涂布有延遲釋放涂層(如腸溶衣)。在其他實施例中，藥學組合物包含二種或更多種被配制成二種延長釋放組分的活性成分，所述二種延長釋放組分各自提供不同的延長釋放概況。舉例而言，第一延長釋放組分以第一釋放速率釋放第一活性成分而第二延長釋放組分以第二釋放速率釋放第二活性成分。

在一些實施例中，藥學組合物包含即刻釋放組分和延遲釋放組分。在其他實施例中，藥學組合物包含二種或更多種被配制成二種延遲釋放組分的活性成分，所述延遲釋放組分各自提供不同的延遲釋放概況。舉例而言，第一延遲釋放組分在第一時間點釋放第一活性成分而第二延遲釋放組分在第二時間點釋放第二活性成分。

組合釋放概況制劑中的組分(例如，具有即刻釋放組分與延長釋放組分的組合；即刻釋放組分與延遲釋放組分的組合；即刻釋放組分、延遲釋放組分與延長釋放組分的組合；二種或更多種延遲釋放組分的組合；或二種或更多種延長釋放組分的組合的制劑)可含有相同活性成分或不同活性成分。在一些實施例中，即刻釋放組分可提供欲由藥物制劑遞送的活性劑總劑量的約1％至約80％。在一些實施例中，組合釋放概況制劑含有即刻釋放組分且該即刻釋放組分提供欲由制劑遞送的各種活性成分的總劑量的約1％至約90％、約10％至約90％、約20％至約90％、約30％至約90％、約40％至約90％、約50％至約90％、約60％至約90％、約70％至約90％或約80％至約90％。在替代實施例中，即刻釋放組分提供欲由制劑遞送各種成分的總劑量的高達約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。

在一些實施例中，藥物制劑包含由一個或多個惰性粒子所組成的活性核，所述粒子各自為珠粒、丸劑、藥片、顆粒、微膠囊、微球體、微粒劑、納米膠囊、或納米球體的形式，其表面使用例如流體床技術或本領域技術人員已知的其他方法涂布有呈例如含藥膜形成組合物的形式的藥物。惰性粒子可具有各種尺寸，只要其足夠大以維持不易溶解即可。作為另一選擇，可通過粒化并研磨和/或通過擠出并滾圓含有藥物物質(zhì)的聚合物組合物來制備活性核。

核中的藥物的量將取決于所需的劑量且通常在約5至90重量％的范圍內(nèi)變化。一般而言，視所需釋放概況的遲滯時間與類型和/或所選的聚合物與涂料溶劑而定，活性核上的聚合物涂層基于經(jīng)涂布粒子的重量計將為約1至50％。本領域技術人員將能夠選擇適當量的藥物用于涂布至核上或并入核中以達成所期望的劑量。在一個實施例中，非活性核可為糖球體或緩沖劑晶體或囊封緩沖劑晶體，如碳酸鈣、碳酸氫鈉、反丁烯二酸、酒石酸等，其使藥物的微環(huán)境發(fā)生改變以促進其釋放。

在一些實施例中，該藥學組合物包含通過以非水溶性聚合物與腸溶性聚合物的混合物涂布水溶性/分散性含藥粒子(如一珠粒)所形成的延遲釋放組分，其中非水溶性聚合物與腸溶性聚合物可以4：1至1：1的重量比存在，且涂層的總重量以所涂布珠粒的總重量計為10至60重量％。藥物層化珠?？梢暻闆r包括控制內(nèi)部溶解速率的乙基纖維素膜。聚合膜外層的組成以及內(nèi)層與外層各自的重量經(jīng)優(yōu)化，基于體外/體內(nèi)相關性進行預測，以對于給定活性而言達成所期望的生理節(jié)律釋放概況。

在其他實施例中，制劑包含即刻釋放含藥粒子(無控制溶解速率的聚合物膜)與在例如口服后展示2至4小時的遲滯時間的延遲釋放珠粒的混合物，由此提供雙脈沖釋放概況。在又一些其他實施例中，制劑包含兩種類型的延遲釋放珠粒的混合物：第一種類型展示1至3小時的遲滯時間而第二種類型展示4至6小時的遲滯時間。在又一些其他實施例中，制劑包含兩種類型的釋放珠粒的混合物：第一種類型展示即刻釋放，而第二種類型展示1至4小時的遲滯時間，其后為延長釋放。

在一些實施例中，制劑被設計為具有某種釋放概況以使得一部分活性成分(例如，10％至80％)在施用后即刻釋放或在兩小時內(nèi)釋放，而剩余部分在一個延長的時間段內(nèi)(例如，在2至24小時的時間段內(nèi))釋放。在其他實施例中，制劑被設計為具有某種釋放概況以使得一種活性成分(例如，止痛劑)在施用后即刻釋放或在兩小時內(nèi)釋放，而一種或多種其他活性成分(例如，PG途徑抑制劑)在一個延長的時間段內(nèi)(例如，在2至24小時的時間段內(nèi))釋放。

藥學組合物可每日施用或基于需要進行施用。藥學組合物可經(jīng)口、靜脈、或肌肉施用。在優(yōu)選實施例中，藥學組合物為經(jīng)口施用。在其他實施例中，藥學組合物通過經(jīng)泌尿道的逆行灌注(retrograde perfusion)來施用。在其他實施例中，藥學組合物通過直接注射至膀胱肌中來施用。

在一些實施例中，藥學組合物以一天兩次或一天三次的方式來每天施用。在其他實施例中，藥學組合物以每隔一天、每3天、每4天、每5天、每6天、每周、每2周、每3周、每月、每2個月或每3個月的方式來施用。

在一些實施例中，藥學組合物在就寢時間施用。在一些實施例中，藥學組合物在就寢時間前約兩小時內(nèi)、優(yōu)選在就寢時間前約一小時內(nèi)施用。在另一實施例中，藥學組合物在就寢時間前約2至4小時施用。在又一實施例中，藥學組合物在就寢時間前至少4小時施用。

即刻釋放組分、延長釋放組分、延遲釋放組分或延遲-延長釋放組分中的活性成分的適當劑量(“治療有效量”)將取決于例如疾病的嚴重性和過程、施用模式、特定成分的生物利用度(bioavailability)、患者的年齡和體重、患者的臨床病史和對活性劑的反應、醫(yī)生的判斷等。

作為一般主張，即刻釋放組分、延遲釋放組分、延長釋放組分或延遲-延長釋放組分中的PG途徑抑制劑的治療有效量以每天每公斤體重約1微克至每天每公斤體重約100毫克的范圍施用，而無論通過一次或多次施用。在一些實施例中，每種活性劑每日單劑量或多劑量施用的范圍為每天每公斤體重約1微克至每天每公斤體重約100毫克、每天每公斤體重1微克至每天每公斤體重約30毫克、每天每公斤體重1微克至每天每公斤體重約10毫克、每天每公斤體重1微克至每天每公斤體重約3毫克、每天每公斤體重1微克至每天每公斤體重約1毫克、每天每公斤體重1微克至每天每公斤體重約300微克、每天每公斤體重1微克至每天每公斤體重約100微克、每天每公斤體重1微克至每天每公斤體重約30微克、每天每公斤體重1微克至每天每公斤體重約10微克、每天每公斤體重l微克至每天每公斤體重約3微克、每天每公斤體重10微克至每天每公斤體重約100毫克、每天每公斤體重10微克至每天每公斤體重約30毫克、每天每公斤體重10微克至每天每公斤體重約10毫克、每天每公斤體重10微克至每天每公斤體重約3毫克、每天每公斤體重10微克至每天每公斤體重約1毫克、每天每公斤體重10微克至每天每公斤體重約300微克、每天每公斤體重10微克至每天每公斤體重約100微克、每天每公斤體重10微克至每天每公斤體重約30微克、每天每公斤體重30微克至每天每公斤體重約100毫克、每天每公斤體重30微克至每天每公斤體重約30毫克、每天每公斤體重30微克至每天每公斤體重約10毫克、每天每公斤體重30微克至每天每公斤體重約3毫克、每天每公斤體重30微克至每天每公斤體重約1毫克、每天每公斤體重30微克至每天每公斤體重約300微克、每天每公斤體重30微克至每天每公斤體重約100微克、每天每公斤體重100微克至每天每公斤體重約100毫克、每天每公斤體重100微克至每天每公斤體重約30毫克、每天每公斤體重100微克至每天每公斤體重約10毫克、每天每公斤體重100微克至每天每公斤體重約3毫克、每天每公斤體重100微克至每天每公斤體重約1毫克、每天每公斤體重100微克至每天每公斤體重約300微克、每天每公斤體重300微克至每天每公斤體重約100毫克、每天每公斤體重300微克至每天每公斤體重約30毫克、每天每公斤體重300微克至每天每公斤體重約10毫克、每天每公斤體重300微克至每天每公斤體重約3毫克、每天每公斤體重300微克至每天每公斤體重約1毫克、每天每公斤體重1毫克至每天每公斤體重約100毫克、每天每公斤體重1毫克至每天每公斤體重約30毫克、每天每公斤體重1毫克至每天每公斤體重約10毫克、每天每公斤體重1毫克至每天每公斤體重約3毫克、每天每公斤體重3毫克至每天每公斤體重約100毫克、每天每公斤體重3毫克至每天每公斤體重約30毫克、每天每公斤體重3毫克至每天每公斤體重約10毫克、每天每公斤體重10毫克至每天每公斤體重約100毫克、每天每公斤體重10毫克至每天每公斤體重約30毫克或每天每公斤體重30毫克至每天每公斤體重約100毫克。

作為一般主張，即刻釋放組分、延遲釋放組分、延長釋放組分或延遲-延長釋放組分中的止痛劑的治療有效量以每天每公斤體重約10微克至每天每公斤體重約100毫克的范圍施用，而無論通過一次或多次施用。在一些實施例中，每種活性劑每日單劑量或多劑量施用的范圍為每天每公斤體重約10微克至每天每公斤體重約100毫克、每天每公斤體重10微克至每天每公斤體重約30毫克、每天每公斤體重10微克至每天每公斤體重約10毫克、每天每公斤體重10微克至每天每公斤體重約3毫克、每天每公斤體重10微克至每天每公斤體重約1毫克、每天每公斤體重10微克至每天每公斤體重約300微克、每天每公斤體重10微克至每天每公斤體重約100微克、每天每公斤體重10微克至每天每公斤體重約30微克、每天每公斤體重30微克至每天每公斤體重約100毫克、每天每公斤體重30微克至每天每公斤體重約30毫克、每天每公斤體重30微克至每天每公斤體重約10毫克、每天每公斤體重30微克至每天每公斤體重約3毫克、每天每公斤體重30微克至每天每公斤體重約1毫克、每天每公斤體重30微克至每天每公斤體重約300微克、每天每公斤體重30微克至每天每公斤體重約100微克、每天每公斤體重100微克至每天每公斤體重約100毫克、每天每公斤體重100微克至每天每公斤體重約30毫克、每天每公斤體重100微克至每天每公斤體重約10毫克、每天每公斤體重100微克至每天每公斤體重約3毫克、每天每公斤體重100微克至每天每公斤體重約1毫克、每天每公斤體重100微克至每天每公斤體重約300微克、每天每公斤體重300微克至每天每公斤體重約100毫克、每天每公斤體重300微克至每天每公斤體重約30毫克、每天每公斤體重300微克至每天每公斤體重約10毫克、每天每公斤體重300微克至每天每公斤體重約3毫克、每天每公斤體重300微克至每天每公斤體重約1毫克、每天每公斤體重1毫克至每天每公斤體重約100毫克、每天每公斤體重1毫克至每天每公斤體重約30毫克、每天每公斤體重1毫克至每天每公斤體重約10毫克、每天每公斤體重1毫克至每天每公斤體重約3毫克、每天每公斤體重3毫克至每天每公斤體重約100毫克、每天每公斤體重3毫克至每天每公斤體重約30毫克、每天每公斤體重3毫克至每天每公斤體重約10毫克、每天每公斤體重10毫克至每天每公斤體重約100毫克、每天每公斤體重10毫克至每天每公斤體重約30毫克或每天每公斤體重30毫克至每天每公斤體重約100毫克。

本文所述的止痛劑可包括于即刻釋放組分或延長釋放組分、延遲釋放組分、延遲-延長釋放組分或其組合中以用于每日口服施用，其單次劑量或組合劑量范圍為1毫克至2000毫克、1毫克至1000毫克、1毫克至300毫克、1毫克至100毫克、1毫克至30毫克、1毫克至10毫克、1毫克至3毫克、3毫克至2000毫克、3毫克至1000毫克、3毫克至300毫克、3毫克至100毫克、3毫克至30毫克、3毫克至10毫克、10毫克至2000毫克、10毫克至1000毫克、10毫克至300毫克、10毫克至100毫克、10毫克至30毫克、30毫克至2000毫克、30毫克至1000毫克、30毫克至300毫克、30毫克至100毫克、100毫克至2000毫克、100毫克至1000毫克、100毫克至300毫克、300毫克至2000毫克、300毫克至1000毫克或1000毫克至2000毫克。如所預期，劑量將取決于患者的疾病、尺寸、年齡和情況。

在一些實施例中，藥學組合物包含單一止痛劑。在一個實施例中，單一止痛劑為阿司匹林。在另一實施例中，單一止痛劑為布洛芬。在另一實施例中，單一止痛劑為萘普生或萘普生鈉。在另一實施例中，單一止痛劑為吲哚美辛。在另一實施例中，單一止痛劑為萘丁美酮。在另一實施例中，單一止痛劑為乙酰氨基酚。

在其他實施例中，藥學組合物包含一對止痛劑。這種成對止痛劑的實例包括，但不限于乙?；畻钏?acetylsalicylic acid)與布洛芬、乙?；畻钏崤c萘普生鈉、乙?；畻钏崤c萘丁美酮、乙?；畻钏崤c乙酰氨基酚、乙?；畻钏崤c吲哚美辛(indomethancin)、布洛芬與萘普生鈉、布洛芬與萘丁美酮、布洛芬與乙酰氨基酚、布洛芬與吲哚美辛、萘普生、萘普生鈉與萘丁美酮、萘普生鈉與乙酰氨基酚、萘普生鈉與吲哚美辛、萘丁美酮與乙酰氨基酚、萘丁美酮與吲哚美辛、和乙酰氨基酚與吲哚美辛。成對止痛劑以在0.1：1至10：1、0.2：1至5：1或0.3：1至3：1范圍內(nèi)的重量比混合。在一個實施例中，成對止痛劑以1：1的重量比混合。

在一些其他實施例中，本申請的藥學組合物進一步包含一種或多種抗毒蕈堿劑。抗毒蕈堿劑的實例包括，但不限于奧昔布寧、索利那新、達非那新、弗斯特羅定、托特羅定、曲司氯胺、阿托品、和三環(huán)狀抗抑郁劑?？苟巨A劑的每日劑量在1微克至300毫克、1微克至100毫克、1微克至30毫克；1微克至10毫克、1微克至3毫克、1微克至1毫克、1微克至300微克、1微克至100微克、1微克至30微克、1微克至10微克、1微克至3微克、3微克至100毫克、3微克至30毫克；3微克至10毫克、3微克至3毫克、3微克至1毫克、3微克至300微克、3微克至100微克、3微克至30微克、3微克至10微克、10微克至300毫克、10微克至100毫克、10微克至30毫克；10微克至10毫克、10微克至3毫克、10微克至1毫克、10微克至300微克、10微克至100微克、10微克至30微克、30微克至300毫克、30微克至100毫克、30微克至30毫克；30微克至10毫克、30微克至3毫克、30微克至1毫克、30微克至300微克、30微克至100微克、100微克至300毫克、100微克至100毫克、100微克至30毫克；100微克至10毫克、100微克至3毫克、100微克至1毫克、100微克至300微克、300微克至300毫克、300微克至100毫克、300微克至30毫克；300微克至10毫克、300微克至3毫克、300微克至1毫克、1毫克至300毫克、1毫克至100毫克、1毫克至30毫克、1毫克至3毫克、3毫克至300毫克、3毫克至100毫克、3毫克至30毫克、3毫克至10毫克、10毫克至300毫克、10毫克至100毫克、10毫克至30毫克、30毫克至300毫克、30毫克至100毫克或100毫克至300毫克的范圍內(nèi)。

在一些其他實施例中，本申請的藥學組合物進一步包含一種或多種抗利尿劑?？估騽┑膶嵗ǎ幌抻诳估騽┘に?ADH)、血管收縮素II、醛固酮、血管加壓素、血管加壓素類似物(例如，去氨加壓素、精氨酸加壓素、賴氨酸加壓素、苯賴加壓素、鳥氨酸加壓素和特利加壓素)、血管加壓素受體促效劑、心房利鈉肽(ANP)和C型利鈉肽(CNP)受體(亦即，NPR1、NPR2和NPR3)拮抗劑(例如，HS-142-1、靛紅、[Asu7,23']b-ANP-(7-28)]、安南汀(一種來自天藍色鏈霉菌的環(huán)狀肽)、和3G12單克隆抗體)、生長抑制素2型受體拮抗劑(例如，生長抑制素)、藥學上可接受的衍生物和其類似物、鹽、水合物和溶劑化物。在一些實施例中，該一種或多種抗利尿劑包含去氨加壓素。在其他實施例中，該一種或多種抗利尿劑為去氨加壓素?？估騽┑拿咳談┝吭?微克至300毫克、1微克至100毫克、1微克至30毫克；1微克至10毫克、1微克至3毫克、1微克至1毫克、1微克至300微克、1微克至100微克、1微克至30微克、1微克至10微克、1微克至3微克、3微克至100毫克、3微克至100毫克、3微克至30毫克；3微克至10毫克、3微克至3毫克、3微克至1毫克、3微克至300微克、3微克至100微克、3微克至30微克、3微克至10微克、10微克至300毫克、10微克至100毫克、10微克至30毫克；10微克至10毫克、10微克至3毫克、10微克至1毫克、10微克至300微克、10微克至100微克、10微克至30微克、30微克至300毫克、30微克至100毫克、30微克至30毫克；30微克至10毫克、30微克至3毫克、30微克至1毫克、30微克至300微克、30微克至100微克、100微克至300毫克、100微克至100毫克、100微克至30毫克；100微克至10毫克、100微克至3毫克、100微克至1毫克、100微克至300微克、300微克至300毫克、300微克至100毫克、300微克至30毫克；300微克至10毫克、300微克至3毫克、300微克至1毫克、1毫克至300毫克、1毫克至100毫克、1毫克至30毫克、1毫克至3毫克、3毫克至300毫克、3毫克至100毫克、3毫克至30毫克、3毫克至10毫克、10毫克至300毫克、10毫克至100毫克、10毫克至30毫克、30毫克至300毫克、30毫克至100毫克或100毫克至300毫克的范圍內(nèi)。

在其他實施例中，本申請的藥學組合物進一步包含一種或多種解痙劑。解痙劑的實例包括，但不限于肌安寧、苯二氮類藥物、巴氯芬、環(huán)苯扎林、美他沙酮、美索巴莫、可樂寧、可樂寧類似物、和丹曲林。在一些實施例中，解痙劑以0.1毫克至1000毫克、0.1毫克至300毫克、0.1毫克至100毫克、0.1毫克至30毫克、0.1毫克至10毫克、0.1毫克至3毫克、0.1毫克至1毫克、0.1毫克至0.3毫克、0.3毫克至1000毫克、0.3毫克至300毫克、0.3毫克至100毫克、0.3毫克至30毫克、0.3毫克至10毫克、0.3毫克至3毫克、0.3毫克至1毫克、1毫克至1000毫克、1毫克至300毫克、1毫克至100毫克、1毫克至30毫克、1毫克至10毫克、1毫克至3毫克、3毫克至1000毫克、3毫克至300毫克、3毫克至100毫克、3毫克至30毫克、3毫克至10毫克、10毫克至1000毫克、10毫克至300毫克、10毫克至100毫克、10毫克至30毫克、30毫克至1000毫克、30毫克至300毫克、30毫克至100毫克、100毫克至1000毫克、100毫克至300毫克或300毫克至1000毫克的每日劑量使用。

在其他實施例中，本申請的藥學組合物進一步包含一種或多種PDE 5抑制劑。PDE 5抑制劑的實例包括，但不限于他達那非、西地那非和伐地那非。在一些實施例中，一種或多種PDE 5抑制劑包含他達那非。在其他實施例中，一種或多種PDE 5抑制劑為他達那非。在一些實施例中，PDE 5抑制劑以0.1毫克至1000毫克、0.1毫克至300毫克、0.1毫克至100毫克、0.1毫克至30毫克、0.1毫克至10毫克、0.1毫克至3毫克、0.1毫克至1毫克、0.1毫克至0.3毫克、0.3毫克至1000毫克、0.3毫克至300毫克、0.3毫克至100毫克、0.3毫克至30毫克、0.3毫克至10毫克、0.3毫克至3毫克、0.3毫克至1毫克、1毫克至1000毫克、1毫克至300毫克、1毫克至100毫克、1毫克至30毫克、1毫克至10毫克、1毫克至3毫克、3毫克至1000毫克、3毫克至300毫克、3毫克至100毫克、3毫克至30毫克、3毫克至10毫克、10毫克至1000毫克、10毫克至300毫克、10毫克至100毫克、10毫克至30毫克、30毫克至1000毫克、30毫克至300毫克、30毫克至100毫克、100毫克至1000毫克、100毫克至300毫克或300毫克至1000毫克的每日劑量使用。

在一些其他實施例中，本申請的藥學組合物進一步包含唑吡坦。唑吡坦的每日劑量在100微克至100毫克、100微克至30毫克、100微克至10毫克、100微克至3毫克、100微克至1毫克、100微克至300微克、300微克至100毫克、300微克至30毫克、300微克至10毫克、300微克至3毫克、300微克至1毫克、1毫克至100毫克、1毫克至30毫克、1毫克至10毫克、1毫克至3毫克、10毫克至100毫克、10毫克至30毫克或30毫克至100毫克的范圍內(nèi)。

抗毒蕈堿劑、抗利尿劑、解痙劑、唑吡坦和/或PDE 5抑制劑可單獨或與其他活性成分一起配制在藥學組合物中以用于即刻釋放、延長釋放、延遲釋放、延遲-延長釋放或其組合。

在某些實施例中，藥學組合物被配制成用于延長釋放且包含(1)選自由乙?；畻钏?、布洛芬、萘普生、萘普生鈉、萘丁美酮、乙酰氨基酚和吲哚美辛所組成的組的止痛劑和(2)PDE 5抑制劑，如他達那非。

藥學組合物可被配制成片劑、膠囊、糖衣錠(dragee)、散劑、顆粒劑、液體、凝膠或乳液形式。該液體、凝膠或乳液可以裸形式(naked form)或包含于膠囊中由個體攝入。

在一些實施例中，藥學組合物包含單一止痛劑與單一PDE 5抑制劑。在一個實施例中，單一止痛劑為阿司匹林。在另一實施例中，單一止痛劑為布洛芬。在另一實施例中，單一止痛劑為萘普生或萘普生鈉。在另一實施例中，單一止痛劑為吲哚美辛。在另一實施例中，單一止痛劑為萘丁美酮。在另一實施例中，單一止痛劑為乙酰氨基酚。在另一實施例中，單一PDE 5抑制劑為他達那非。止痛劑與PDE 5抑制劑可以前文所述范圍內(nèi)的劑量施用。

在一些實施例中，藥學組合物個別地或組合地包含一種或多種止痛劑，其量在10至1000毫克、10至800毫克、10至600毫克、10至500毫克、10至400毫克、10至300毫克、10至250毫克、10至200毫克、10至150毫克、10至100毫克、30至1000毫克、30至800毫克、30至600毫克、30至500毫克、30至400毫克、30至300毫克、30至250毫克、30至200毫克、30至150毫克、30至100毫克、100至1000毫克、100至800毫克、100至600毫克、100至400毫克、100至250毫克、300至1000毫克、300至800毫克、300至600毫克、300至400毫克、400至1000毫克、400至800毫克、400至600毫克、600至1000毫克、600至800毫克或800至1000毫克之間，其中該組合物被配制成用于延長釋放，其釋放概況為其中一種或多種止痛劑在2至12小時或5至8小時的時間段內(nèi)連續(xù)釋放。

在一些實施例中，組合物被配制成用于延長釋放，其釋放概況為其中一種或多種止痛劑的至少90％在2至12小時或5至8小時的時間段內(nèi)連續(xù)釋放。

在一些實施例中，組合物被配制成用于延長釋放，其釋放概況為其中一種或多種止痛劑在5、6、7、8、10或12小時的時間段內(nèi)連續(xù)釋放。在一些實施例中，藥學組合物進一步包含抗毒蕈堿劑、抗利尿劑、解痙劑、唑吡坦或PDE 5抑制劑。

在其他實施例中，組合物被配制成用于延長釋放，其釋放概況為其止痛劑在2至12小時或5至8小時的時間段內(nèi)以穩(wěn)定速率釋放。在其他實施例中，組合物被配制成用于延長釋放，其釋放概況為其止痛劑在5、6、7、8、10或12小時的時間段內(nèi)以穩(wěn)定速率釋放。本文所用的“在一時間段內(nèi)的穩(wěn)定速率”被定義為其中在給定時間段期間的任意點的釋放速率為在此給定時間段內(nèi)的平均釋放速率的30％至300％以內(nèi)的釋放概況。舉例而言，若80毫克阿司匹林在8小時的時間段內(nèi)以穩(wěn)定速率釋放，則在此時間段期間的平均釋放速率為10毫克/小時，且此時間段期間任意時間的實際釋放速率在3毫克/小時至30毫克/小時的范圍內(nèi)(亦即，在8小時期間10毫克/小時的平均釋放速率的30％至300％以內(nèi))。在一些實施例中，藥學組合物進一步包含抗毒蕈堿劑、抗利尿劑、解痙劑、唑吡坦或PDE 5抑制劑。

在一些實施例中，止痛劑選自由阿司匹林、布洛芬、萘普生鈉、萘普生、吲哚美辛、萘丁美酮和乙酰氨基酚所組成的組。在一個實施例中，止痛劑為乙酰氨基酚。藥學組合物被配制成提供小量止痛劑的穩(wěn)定釋放來維持血液中的有效藥物濃度，從而使單一劑量中的藥物總量相較于即刻釋放制劑減少。

在一些其他實施例中，藥學組合物個別地或組合地包含一種或多種止痛劑，其量在10至1000毫克、10至800毫克、10至600毫克、10至500毫克、10至400毫克、10至300毫克、10至250毫克、10至200毫克、10至150毫克、10至100毫克、30至1000毫克、30至800毫克、30至600毫克、30至500毫克、30至400毫克、30至300毫克、30至250毫克、30至200毫克、30至150毫克、30至100毫克、100至1000毫克、100至800毫克、100至600毫克、100至400毫克、100至250毫克、300至1000毫克、300至800毫克、300至600毫克、300至400毫克、400至1000毫克、400至800毫克、400至600毫克、600至1000毫克、600至800毫克或800至1000毫克之間，其中止痛劑被配制成用于延長釋放，其特征為雙階段釋放概況，其中止痛劑的20％至60％在施用2小時內(nèi)釋放，且剩余部分在2至12小時或5至8小時的時間段內(nèi)連續(xù)釋放或以穩(wěn)定速率釋放。在又一個實施例中，止痛劑被配制成用于具有雙階段釋放概況的延長釋放，其中止痛劑的20％、30％、40％、50％或60％在施用2小時內(nèi)釋放，且剩余部分在2至12小時或5至8小時的時間段內(nèi)連續(xù)釋放或以穩(wěn)定速率釋放。在一個實施例中，止痛劑選自由阿司匹林、布洛芬、萘普生鈉、萘普生、吲哚美辛、萘丁美酮、和乙酰氨基酚所組成的組。在一個實施例中，止痛劑為乙酰氨基酚。在另一實施例中，止痛劑為乙酰氨基酚。在一些實施例中，藥學組合物進一步包含抗毒蕈堿劑、抗利尿劑、解痙劑、唑吡坦和/或PDE 5抑制劑。在一些實施例中，抗毒蕈堿劑、抗利尿劑、解痙劑、唑吡坦和/或PDE 5抑制劑被配制成用于即刻釋放。

本發(fā)明的另一方面涉及一種降低排尿頻率的方法，其通過對有需要的個體交替施用二種或更多種PG途徑抑制劑以防止產(chǎn)生抗藥性。在一個實施例中，該方法包含施用第一PG途徑抑制劑持續(xù)第一時間段且隨后施用第二PG途徑抑制劑持續(xù)第二時間段。在另一個實施例中，該方法進一步包含施用第三PG途徑抑制劑持續(xù)第三時間段。該第一PG途徑抑制劑、第二PG途徑抑制劑、和第三PG途徑抑制劑彼此不同且可被配制成用于即刻釋放、延長釋放、延遲釋放或其組合。

本發(fā)明的另一方面涉及一種治療夜尿癥的方法，其通過對有需要者施用利尿劑，接著施用本申請的藥學組合物。利尿劑經(jīng)定劑量且被配制成在施用6小時內(nèi)具有利尿效應(diuretic effect)，且在就寢時間前至少8或7小時施用。本申請的藥學組合物被配制成用于延長釋放或延遲延長釋放，且在就寢時間前2小時內(nèi)施用。

利尿劑的例子包括，但不限于酸化鹽，如CaCl₂和NH₄Cl；精氨酸血管加壓素受體2拮抗劑，如兩性霉素B(amphotericin B)和檸檬酸鋰；排水劑(aquaretics)，如秋麒麟草(Goldenrod)和檜(Juniper)；Na-H交換拮抗劑(Na-H exchanger antagonist)，如多巴胺(dopamine)；碳酸酐酶(carbonic anhydrase)抑制劑，如乙酰偶氮胺(acetazolamide)和杜塞酰胺(dorzolamide)；環(huán)利尿劑(loop diuretics)，如布美他尼(bumetanide)、依他尼酸(ethacrynic acid)、呋塞米(furosemide)和托拉塞米(torsemide)；滲透利尿劑，如葡萄糖和甘露糖醇；保鉀利尿劑(potassium-sparing diuretics)，如阿米洛利(amiloride)、螺內(nèi)酯(spironolactone)、氨苯喋啶(triamterene)、坎利酸鉀(potassium canrenoate)；噻嗪類(thiazides)，如芐氟噻嗪(bendroflumethiazide)和氫氯噻嗪(hydrochlorothiazide)；和黃嘌呤類(xanthines)，如咖啡因(caffeine)、茶堿(theophylline)和可可堿(theobromine)。

本申請的另一方面涉及一種降低排尿頻率的方法，其包括對有需要的個體施用有效量的本申請的藥學組合物和有效量的肉毒桿菌毒素(botulinum toxin)。

在一些實施例中，肉毒桿菌毒素通過注射至膀胱肌中來施用，且經(jīng)口對個體施用本申請的藥學組合物。在一些實施例中，注射步驟包含在膀胱肌中的5至20個部位以每個部位2至10單位的注射劑量注射10至200單位的肉毒桿菌毒素。在一個實施例中，注射步驟包含在膀胱肌中的5個部位以每個部位2至10單位的注射劑量注射肉毒桿菌毒素。在另一實施例中，注射步驟包含在膀胱肌中的10個部位以每個部位2至10單位的注射劑量注射肉毒桿菌毒素。在另一實施例中，注射步驟包含在膀胱肌中的15個部位以每個部位2至10單位的注射劑量注射肉毒桿菌毒素。在又一實施例中，注射步驟包含在膀胱肌中的20個部位以每個部位2至10單位的注射劑量注射肉毒桿菌毒素。在一些實施例中，每3個月、4個月、6個月、8個月、10個月或12個月重復該注射步驟。

以下實施例進一步說明本發(fā)明，該實施例不應理解為限制本發(fā)明。本發(fā)明中引用的所有參考文件、專利、和公開專利申請的內(nèi)容均以引用方式并入本文中。

例1：用布洛芬抑制尿意

招募20名志愿者個體(包括男性和女性)，其各自均經(jīng)歷過尿意或排尿欲望提早而干擾其無法進行足夠時間的睡眠以得到充分休息。每位個體在就寢時間前以單次施用的形式攝入400至800毫克的布洛芬。至少14位個體報告其可得到更佳的休息，因為其并未頻繁地被尿意喚醒。

若干個體報告在每夜使用布洛芬數(shù)周后，不再感受到尿意頻率減少的益處。然而，所有這些個體均進一步報告在停止服用此劑量數(shù)天后，益處恢復。最近測試已證實以低許多的劑量可達成類似結(jié)果，而益處于后續(xù)無任何減少。

例2：止痛劑、肉毒神經(jīng)毒素、和抗毒蕈堿劑對巨噬細胞對炎性刺激和非炎性刺激反應的影響

實驗設計

設計此研究來確定止痛劑和抗毒蕈堿劑在控制巨噬細胞對于由COX2和前列腺素(PGE、PGH等)所介導的炎性與非炎性刺激的反應的劑量和體外功效。建立對膀胱細胞中炎性與非炎性效應物(effector)的反應的基線(劑量與動力學(kinetic))。簡而言之，在不存在或存在各種效應物的情形下，使所培養(yǎng)的細胞暴露于止痛劑和/或抗毒蕈堿劑。

效應物包括：脂多糖(LPS)，一種致炎劑，以及COX2誘導物，作為炎性刺激；碳酰膽堿(carbachol)或乙酰膽堿，平滑肌收縮的刺激物，作為非炎性刺激；肉毒桿菌神經(jīng)毒素A，一種已知的乙酰膽堿釋放抑制劑，作為陽性對照；和花生油酸(arachidonic acid，AA)、γ次亞麻油酸(linolenic acid，DGLA)、或二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)，作為前列腺素的前驅(qū)體，該前列腺素由環(huán)氧合酶(cyclooxygenase)(COX1和COX2)和末端前列腺素合成酶連續(xù)氧化細胞內(nèi)部的AA、DGLA或EPA而產(chǎn)生。

止痛劑包括：水楊酸酯，如阿司匹林；異丁基-丙酸-酚酸(iso-butyl-propanoic-phenolic acid)衍生物(布洛芬)，如雅維(Advil)、美林(Motrin)、努普林(Nuprin)、和梅迪普萊恩(Medipren)；萘普生鈉，如阿萊韋(Aleve)、阿納普思(Anaprox)、安特經(jīng)(Antalgin)、超非明那斯(Feminax Ultra)、非拉那斯(Flanax)、因薩(Inza)、米朵延伸舒緩劑(Midol Extended Relief)、那捷新(Nalgesin)、能百鎮(zhèn)(Naposin)、那皮蘭(Naprelan)、那波捷新(Naprogesic)、那波新(Naprosyn)、那波新懸浮液、EC-那波新、那羅新(Narocin)、普倫森(Proxen)、迅斐利(Synflex)和新諾比(Xenobid)；乙酸衍生物，如吲哚美辛(印多新(Indocin))；1-萘乙酸(1-naphthaleneacetic acid)衍生物，如萘丁美酮或瑞力芬(relafen)；N-乙?；?對氨基苯酚(N-acetyl-para-aminophenol，APAP)衍生物，如乙酰氨基酚或?qū)σ阴０被?泰勒諾(Tylenol))；和塞來昔布(Celecoxib)。

抗毒蕈堿劑包括奧昔布寧、索利那新、達非那新、和阿托品。

巨噬細胞經(jīng)以下的試劑短期(1至2小時)或長期(24至48小時)刺激：

(1)每種止痛劑單獨以各種劑量刺激。

(2)每種止痛劑在LPS存在的情形下以各種劑量刺激。

(3)每種止痛劑在碳酰膽堿或乙酰膽堿存在的情形下以各種劑量刺激。

(4)每種止痛劑在AA、DGLA或EPA存在的情形下以各種劑量刺激。

(5)肉毒桿菌神經(jīng)毒素A單獨以各種劑量刺激。

(6)肉毒桿菌神經(jīng)毒素A在LPS存在的情形下以各種劑量刺激。

(7)肉毒桿菌神經(jīng)毒素A在碳酰膽堿或乙酰膽堿存在的情形下以各種劑量刺激。

(8)肉毒桿菌神經(jīng)毒素A在AA、DGLA或EPA存在的情形下以各種劑量刺激。

(9)每種抗毒蕈堿劑單獨以各種劑量刺激。

(10)每種抗毒蕈堿劑在LPS存在的情形下以各種劑量刺激。

(11)每種抗毒蕈堿劑在碳酰膽堿或乙酰膽堿存在的情形下以各種劑量刺激。

(12)每種抗毒蕈堿劑在AA、DGLA或EPA存在的情形下以各種劑量刺激。

隨后分析細胞的PGH₂的釋放；PGE的釋放；PGE₂的釋放；前列腺環(huán)素的釋放；凝血脂素的釋放；IL-1β的釋放；IL-6的釋放；TNF-α的釋放；COX2活性；cAMP和cGMP的產(chǎn)生；IL-1β、IL-6、TNF-α、和COX2mRNA的產(chǎn)生；和CD80、CD86、和MHC II類分子的表面表達。

材料和方法

巨噬細胞

在本研究中使用鼠類RAW264.7或J774巨噬細胞(由ATCC獲得)。使細胞維持在含有添加有10％胎牛血清(FBS)、15毫摩爾濃度(mM)的HEPES、2毫摩爾濃度的左旋谷氨酰胺(L-glutamine)、100單位/毫升(U/ml)青霉素、和100微克/毫升(μg/ml)鏈霉素的RPMI 1640的培養(yǎng)基中。在5％CO₂的氣氛(atmosphere)中在37℃下培養(yǎng)細胞，細胞每周分裂(繼代)一次。

在體外以止痛劑處理巨噬細胞

將RAW264.7巨噬細胞在100微升培養(yǎng)基中以每孔1.5×10⁵個細胞的細胞密度接種(seed)于96孔培養(yǎng)板中。用以下各物處理細胞：(1)各種濃度的止痛劑(乙酰氨基酚、阿司匹林、布洛芬或萘普生)、(2)各種濃度的脂多糖(LPS)，其為對巨噬細胞的炎性刺激效應物，(3)各種濃度的碳酰膽堿或乙酰膽堿，其為非炎性刺激的效應物，(4)止痛劑和LPS或(5)止痛劑和碳酰膽堿或乙酰膽堿。簡而言之，將止痛劑溶解于無FBS的培養(yǎng)基(亦即，添加有15毫摩爾濃度的HEPES、2毫摩爾濃度的左旋谷氨酰胺、100單位/毫升青霉素和100微克/毫升鏈霉素的RPMI 1640)中，且使用相同的培養(yǎng)基通過系列稀釋(serial dilution)而稀釋至所需濃度。對于在不存在LPS的情形下經(jīng)止痛劑處理的細胞，于每孔中添加50微升的止痛劑溶液以和50微升的無FBS培養(yǎng)基。對于在存在LPS的情形下經(jīng)止痛劑處理的細胞，于每孔中添加50微升的止痛劑溶液和50微升在無FBS培養(yǎng)基中的LPS(來自鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium))。所有條件都進行二重復測試。

培養(yǎng)24或48小時后，收集150微升的培養(yǎng)物上清液，在4℃下以每分鐘8,000轉(zhuǎn)離心沉降(spin down)2分鐘以移除細胞和碎片并儲存在-70℃，以備通過ELISA來分析細胞因子反應。收集細胞并通過在500微升的磷酸鹽緩沖液(PBS)中離心(4℃，每分鐘1,500轉(zhuǎn)，5分鐘)來洗滌。隨后將一半細胞在液態(tài)氮中速凍并儲存在-70℃。剩余細胞經(jīng)熒光單克隆抗體染色且由流式細胞儀進行分析。

對協(xié)同刺激分子表達的流式細胞儀分析

對于流式細胞儀分析，將巨噬細胞在100微升FACS緩沖液(具有2％牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)和0.01％NaN₃的磷酸鹽緩沖生理鹽水)中稀釋，并通過添加經(jīng)FITC結(jié)合的抗CD40的抗體、經(jīng)PE結(jié)合的抗CD80的抗體、經(jīng)PE結(jié)合的抗CD86的抗體、抗MHC II類(I-Ad)PE(BD BioScience)而在4℃下染色30分鐘。隨后通過在300微升的FACS緩沖液中離心(4℃下，每分鐘1,500轉(zhuǎn)，5分鐘)洗滌細胞。第二次洗滌后，將細胞再懸浮于200微升的FACS緩沖液中，并藉助于Accuri C6流式細胞儀(BD Biosciences)分析表達給定的標記(單陽性(single positive))或標記的組合(雙陽性(double positive))的細胞百分比。

通過ELISA分析細胞因子反應

對培養(yǎng)物上清液進行細胞因子特異性的ELISA，以測定在經(jīng)止痛劑、單獨的LPS或LPS與止痛劑的組合處理的巨噬細胞培養(yǎng)物中的IL-1β、IL-6、和TNF-α反應。對在0.1摩爾濃度碳酸氫鈉緩沖液(pH 9.5)中的100微升抗小鼠IL-6(anti-mouse IL-6)、TNF-α單克隆抗體(TNF-αmAb，BD Biosciences)或IL-1β單克隆抗體(IL-1βmAb，R&D Systems)包覆過夜的Nunc MaxiSorp Immunoplates(Nunc)進行分析。在以PBS(每孔200微升)洗滌兩次之后，于每孔中添加200微升的PBS(3％BSA)(封閉，blocking)且將培養(yǎng)板在室溫下培育2小時。于每孔添加200微升而將培養(yǎng)板再洗滌兩次，添加二重復的100微升細胞因子標準物和培養(yǎng)物上清液的系列稀釋液，并將培養(yǎng)板置于4℃下培育過夜。最后，將培養(yǎng)板洗滌兩次并以100微升經(jīng)二級生物素化(biotinylated)的抗小鼠IL-6、TNFα單克隆抗體(BD Biosciences)或IL-1β(R&D Systems)培育，接著以經(jīng)過氧化物酶標記的山羊抗生物素單克隆抗體(peroxidase-labled goat anti-biotin mAb，Vector Laboratories)培育。通過添加2,2’-次偶氮基-雙(3)-乙基芐基噻唑林-6-磺酸(2,2’-azino-bis(3)-ethylbenzylthiazoline-6-sulfonic acid，ABTS)底物和H₂O₂(Sigma)來進行比色反應(colorimetric reaction)，且在415納米下由V多標記培養(yǎng)板讀取器(multilabel plate reader，PerkinElmer)來測量吸光度。

測定COX2活性以及cAMP和cGMP的產(chǎn)生

通過連續(xù)競爭性ELISA(sequential competitive ELISA，R&D Systems)來測定所培養(yǎng)巨噬細胞中COX2的活性。通過cAMP分析與cGMP分析來測定cAMP與cGMP的產(chǎn)生。該分析以本領域的常規(guī)手段進行。

表1總結(jié)了以Raw 264巨噬細胞株進行的試驗以及關于止痛劑對協(xié)同刺激分子CD40和CD80的細胞表面表達的影響的主要發(fā)現(xiàn)。該分子的表達由COX2和炎性信號來刺激，且因此經(jīng)評估而確定COX2的抑制作用的功能性結(jié)果。

如表2中所示，除了最高劑量(亦即，5×10⁶納摩爾濃度(nM)摩爾)以外，乙酰氨基酚、阿司匹林、布洛芬、和萘普生在所有測試劑量(亦即，5×10⁵nM摩爾、5×10⁴nM摩爾、5×10³nM摩爾、5×10²nM摩爾、50nM摩爾、和5nM摩爾)下均抑制巨噬細胞對協(xié)同刺激分子CD40與CD80的基礎表達，而最高劑量似乎為增強而非抑制協(xié)同刺激分子的表達。如圖1A和圖1B所示，在低至0.05納摩爾濃度(亦即，0.00005微摩爾濃度(μM))的止痛劑劑量下觀測到對CD40和CD50表達的抑制效果。這個發(fā)現(xiàn)支持如下觀點，即受控釋放的小劑量止痛劑比急性遞送的大劑量更佳。這個實驗還表明，乙酰氨基酚、阿司匹林、布洛芬、和萘普生對LPS所誘發(fā)的CD40與CD80表達有類似的抑制效果。

表1.實驗總結(jié)

表2.主要發(fā)現(xiàn)總結(jié)

ND*：未進行(毒性)

表3總結(jié)了測量成人口服治療劑量后的止痛劑血清水平的若干研究的結(jié)果。如表3所示，在口服治療劑量后，止痛劑的最大血清水平在10⁴至10⁵nM摩爾的范圍內(nèi)。因此，表2中的體外(in vitro)測試的止痛劑劑量涵蓋在人類體內(nèi)(in vivo)可達到的濃度范圍。

表3.口服治療劑量后，人類血液中止痛劑的血清水平

例3：止痛劑、肉毒神經(jīng)毒素、和抗毒蕈堿劑對小鼠膀胱平滑肌細胞對炎性刺激和非炎性刺激反應的影響

實驗設計

設計本研究旨在表征實施例2中所確定的止痛劑的最佳劑量如何影響細胞培養(yǎng)物或組織培養(yǎng)物中的膀胱平滑肌細胞，并解決不同種類的止痛劑是否可協(xié)同作用以更有效地抑制COX2和PGE2反應。

效應物、止痛劑和抗毒蕈堿劑描述于實施例2中。

小鼠膀胱平滑肌細胞的初級培養(yǎng)物經(jīng)以下的試劑短期(1至2小時)或長期(24至48小時)刺激：

(1)每種止痛劑單獨以各種劑量刺激。

(2)每種止痛劑在LPS存在的情形下以各種劑量刺激。

(3)每種止痛劑在碳酰膽堿或乙酰膽堿存在的情形下以各種劑量刺激。

(4)每種止痛劑在AA、DGLA、或EPA存在的情形下以各種劑量刺激。

(5)肉毒桿菌神經(jīng)毒素A單獨以各種劑量刺激。

(6)肉毒桿菌神經(jīng)毒素A在LPS存在的情形下以各種劑量刺激。

(7)肉毒桿菌神經(jīng)毒素A在碳酰膽堿或乙酰膽堿存在的情形下以各種劑量刺激。

(8)肉毒桿菌神經(jīng)毒素A在AA、DGLA、或EPA存在的情形下以各種劑量刺激。

(9)每種抗毒蕈堿劑單獨以各種劑量刺激。

(10)每種抗毒蕈堿劑在LPS存在的情形下以各種劑量刺激。

(11)每種抗毒蕈堿劑在碳酰膽堿或乙酰膽堿存在的情形下以各種劑量刺激。

(12)每種抗毒蕈堿劑在AA、DGLA、或EPA存在的情形下以各種劑量刺激。

隨后分析細胞的PGH₂的釋放；PGE的釋放；PGE₂的釋放；前列腺環(huán)素的釋放；凝血脂素的釋放；IL-1β的釋放；IL-6的釋放；TNF-α的釋放；COX2活性；cAMP和cGMP的產(chǎn)生；IL-1β、IL-6、TNF-α、和COX2mRNA的產(chǎn)生；和CD80、CD86、和MHC II類分子的表面表達。

材料和方法

分離且純化小鼠膀胱細胞

自安樂死動物C57BL/6小鼠(8至12周大)移除膀胱細胞，并通過酶消化、接著在Percoll梯度上純化來分離細胞。簡而言之，將來自10只小鼠的膀胱在10毫升的消化緩沖液(RPMI 1640，2％胎牛血清、0.5毫克/毫升膠原酶、30微克/毫升脫氧核糖核酸酶(Dnase))中用剪刀剪碎成細漿。使膀胱漿料在37℃下經(jīng)酶消化30分鐘。未消化的片段經(jīng)細胞訓練器(cell-trainer)進一步分散。將細胞懸浮液制成丸劑且添加至不連續(xù)的20％、40％和75％Percoll梯度，以供純化單核細胞。每次實驗使用50至60個膀胱。

在RPMI 1640中洗滌之后，將膀胱細胞再懸浮于添加有10％胎牛血清、15毫摩爾濃度(mM)的HEPES、2毫摩爾濃度的左旋谷氨酰胺、100單位/毫升青霉素和100微克/毫升鏈霉素的RPMI 1640中，并以100微升的每孔3×10⁴個細胞的細胞密度接種于透明底黑色的96孔細胞培養(yǎng)微量培養(yǎng)板中。在37℃下在5％CO₂的氣氛中培養(yǎng)細胞。

在體外以止痛劑處理細胞

以止痛劑溶液(每孔50微升)單獨或與碳酰膽堿(10摩爾濃度(Molar)摩爾，每孔50微升)(作為非炎性刺激的實例)一起處理膀胱細胞，或與鼠傷寒沙門氏菌的脂多糖(LPS)(1微克/毫升，每孔50微升)(作為炎性刺激的實例)一起處理膀胱細胞。當未向細胞添加其他效應物時，于孔中添加50微升的無胎牛血清的RPMI 1640，以將最終體積調(diào)整至200微升。

培養(yǎng)24小時后，收集150微升的培養(yǎng)物上清液并在4℃下以每分鐘8,000轉(zhuǎn)離心沉降2分鐘以移除細胞和碎片，并儲存在-70℃，以備通過ELISA來分析前列腺素E2(PGE2)反應。將細胞固定、透性化(permeabilized)、并封閉，以使用熒光底物來檢測環(huán)氧合酶-2(COX2)。在選定的實驗中，在體外刺激細胞12小時以分析COX2的反應。

分析COX2的反應

根據(jù)制造商的說明，通過以細胞為基礎的ELISA，使用人類/小鼠總COX2免疫分析(human/mouse total COX2immunoassay，R&D Systems)來分析COX2的反應。簡而言之，在細胞被固定和透性化后，于透明底黑色的96孔細胞培養(yǎng)微量培養(yǎng)板的孔中添加小鼠抗總COX2(mouse anti-total COX2)和兔抗總GAPDH(rabbit anti-total GAPDH)。在培育和洗滌后，添加經(jīng)HRP結(jié)合的抗小鼠IgG(HRP-conjugated anti-mouse IgG)和經(jīng)AP結(jié)合的抗兔IgG(AP-conjugated anti-rabbit IgG)至孔中。在另一次培育和另一組洗滌后，添加HRP熒光底物和AP熒光底物。最后，使用V多標記培養(yǎng)板讀取器(PerkinElmer)來讀取在600納米(COX2熒光)和450納米(GAPDH熒光)下的發(fā)射熒光。通過由相對熒光單位(RFU)測定并以看家蛋白(housekeeping protein)GAPDH為基準的COX2的相對水平表示結(jié)果。

分析PGE2的反應

通過連續(xù)競爭性ELISA(R&D Systems)來分析前列腺素E2的反應。更具體地說，將培養(yǎng)物上清液或PGE2標準物添加至涂布有山羊抗小鼠多株抗體(goat anti-mouse polyclonal antibody)的96孔聚苯乙烯微量培養(yǎng)板的孔中。在微量培養(yǎng)板震蕩器上培育一小時后，添加經(jīng)HRP結(jié)合的PGE2(HRP-conjugated PGE2)，并將培養(yǎng)板置于室溫下再培育兩小時。隨后洗滌培養(yǎng)板且于每孔中添加HRP底物溶液。顯色30分鐘，并在570納米的波長校正下讀取450納米下的培養(yǎng)板之后，通過添加硫酸來終止反應。結(jié)果以PGE2的平均皮克/毫升來表示。

其他分析

如實施例2中所述測定PGH2的釋放；PGE的釋放、前列腺環(huán)素的釋放；凝血脂素的釋放；IL-1β的釋放；IL-6的釋放；和TNF-α的釋放；cAMP和cGMP的產(chǎn)生；IL-1β、IL-6、TNF-α、和COX2mRNA的產(chǎn)生；和CD80、CD86、和MHC II類分子的表面表達。

結(jié)果

止痛劑抑制小鼠膀胱細胞對炎性刺激的COX2反應

在小鼠膀胱細胞上以5微摩爾濃度(μM)或50微摩爾濃度的濃度測試若干種止痛劑(乙酰氨基酚、阿司匹林、布洛芬、和萘普生)，以確定止痛劑是否可誘發(fā)COX2反應。對24小時培養(yǎng)物的分析顯示，所測試的止痛劑在體外對小鼠膀胱細胞均未誘發(fā)COX2反應。

亦測試于體外該止痛劑于小鼠膀胱細胞對碳酰膽堿或LPS刺激的COX2反應的影響。如表1所示，所測試的碳酰膽堿的劑量對小鼠膀胱細胞中COX2的水平并無顯著效應。另一方面，LPS使總COX2水平顯著增加。有趣的是，乙酰氨基酚、阿司匹林、布洛芬、和萘普生均可抑止LPS對COX2水平的影響。在以5微摩爾濃度或50微摩爾濃度測試該藥物時(表4)，可見止痛劑的抑止效果。

表4.在體外刺激并用止痛劑處理后小鼠膀胱細胞的COX2表達

止痛劑抑制小鼠膀胱細胞對炎性刺激的PGE2反應

測量小鼠膀胱細胞的培養(yǎng)物上清液中PGE2的分泌，以確定由止痛劑改變小鼠膀胱細胞COX2水平的生物學意義。如表5所示，在未受刺激的膀胱細胞或在碳酰膽堿存在的情形下培養(yǎng)的膀胱細胞的培養(yǎng)物上清液中并未檢測到PGE2。與上述COX2反應一致，以LPS刺激小鼠膀胱細胞誘發(fā)分泌高水平的PGE2。添加止痛劑(乙酰氨基酚、阿司匹林、布洛芬、和萘普生)抑止LPS對PGE2分泌的影響，且在經(jīng)5或50微摩爾濃度劑量的止痛劑處理的細胞反應之間并未見差異。

表5.在體外刺激并用止痛劑處理后小鼠膀胱細胞所分泌的PGE2

總而言之，這些數(shù)據(jù)顯示，單獨5微摩爾濃度(μM)或50微摩爾濃度的止痛劑在小鼠膀胱細胞中并不誘發(fā)COX2和PGE2反應。然而，5微摩爾濃度或50微摩爾濃度的止痛劑顯著抑制體外的經(jīng)LPS(1微克/毫升(μg/ml))刺激的小鼠膀胱細胞的COX2和PGE2反應。未觀測到止痛劑對經(jīng)碳酰膽堿(1毫摩爾濃度(mM))刺激的小鼠膀胱細胞的COX2和PGE2反應具有顯著影響。

例4：止痛劑、肉毒神經(jīng)毒素、和抗毒蕈堿劑對小鼠膀胱平滑肌細胞收縮的影響

實驗設計

使培養(yǎng)的小鼠或大鼠膀胱平滑肌細胞和小鼠或大鼠膀胱平滑肌組織在各種濃度的止痛劑和/或抗毒蕈堿劑存在的情形下暴露于炎性刺激和非炎性刺激。測量刺激所誘發(fā)的肌肉收縮，以評估止痛劑和/或抗毒蕈堿劑的抑制效果。

效應物、止痛劑和抗毒蕈堿劑描述于實施例2中。

小鼠膀胱平滑肌細胞的初級培養(yǎng)物經(jīng)以下的試劑短期(1至2小時)或長期(24至48小時)刺激：

(1)每種止痛劑單獨以各種劑量刺激。

(2)每種止痛劑在LPS存在的情形下以各種劑量刺激。

(3)每種止痛劑在碳酰膽堿或乙酰膽堿存在的情形下以各種劑量刺激。

(4)每種止痛劑在AA、DGLA、或EPA存在的情形下以各種劑量刺激。

(5)肉毒桿菌神經(jīng)毒素A單獨以各種劑量刺激。

(6)肉毒桿菌神經(jīng)毒素A在LPS存在的情形下以各種劑量刺激。

(7)肉毒桿菌神經(jīng)毒素A在碳酰膽堿或乙酰膽堿存在的情形下以各種劑量刺激。

(8)肉毒桿菌神經(jīng)毒素A在AA、DGLA、或EPA存在的情形下以各種劑量刺激。

(9)每種抗毒蕈堿劑單獨以各種劑量刺激。

(10)每種抗毒蕈堿劑在LPS存在的情形下以各種劑量刺激。

(11)每種抗毒蕈堿劑在碳酰膽堿或乙酰膽堿存在的情形下以各種劑量刺激。

(12)每種抗毒蕈堿劑在AA、DGLA、或EPA存在的情形下以各種劑量刺激。

材料和方法

如實施例3所述分離初級小鼠膀胱細胞。在選定的實驗中，使用膀胱組織培養(yǎng)物。以Grass多種波動描寫器(Grass polygraph，Quincy Mass,USA)記錄膀胱平滑肌細胞收縮。

例5：口服止痛劑和抗毒蕈堿劑對小鼠膀胱平滑肌細胞COX2和PGE2反應的影響

實驗設計

給予正常小鼠和患有膀胱過動癥(over active bladder syndrome)的小鼠口服劑量的阿司匹林、萘普生鈉、布洛芬、印多新、萘丁美酮、泰勒諾、塞來昔布、奧昔布寧、索利那新、達非那新、阿托品、和其組合。對照組包括未經(jīng)處理的正常小鼠和未經(jīng)處理的患有膀胱過動癥的OAB小鼠。給予最后劑量的30分鐘后，收集膀胱并以碳酰膽堿或乙酰膽堿離體(ex vivo)刺激。在選定的實驗中，在以碳酰膽堿刺激之前，先以肉毒桿菌神經(jīng)毒素A對膀胱進行處理。使動物保持在代謝籠(metabolic cages)中并評估其排尿頻率(和體積)。通過監(jiān)控水攝入量和籠垃圾的重量來測定膀胱輸出量。通過ELISA來測定血清PGH₂、PGE、PGE₂、前列腺環(huán)素、凝血脂素、IL-1β、IL-6、TNF-α、cAMP、和cGMP的水平。通過流式細胞儀測定全血細胞中的CD80、CD86、和MHC II類表達。

實驗結(jié)束時，將動物安樂死，并以Grass多種波動描寫器記錄離體膀胱收縮。使膀胱部分固定于福爾馬林(formalin)中，并通過免疫組織化學來分析COX2反應。

例6：止痛劑、肉毒神經(jīng)毒素、和抗毒蕈堿劑對人類膀胱平滑肌細胞對炎性刺激和非炎性刺激反應的影響

實驗設計

設計本研究旨在表征實施例1至實施例5中確定的止痛劑的最佳劑量如何影響細胞培養(yǎng)物或組織培養(yǎng)物中的人類膀胱平滑肌細胞，并解決不同種類的止痛劑是否可協(xié)同作用以更有效地抑制COX2和PGE2反應。

效應物、止痛劑和抗毒蕈堿劑描述于實施例2中。

人類膀胱平滑肌細胞經(jīng)以下的試劑短期(1至2小時)或長期(24至48小時)刺激：

(1)每種止痛劑單獨以各種劑量刺激。

(2)每種止痛劑在LPS存在的情形下以各種劑量刺激。

(3)每種止痛劑在碳酰膽堿或乙酰膽堿存在的情形下以各種劑量刺激。

(4)每種止痛劑在AA、DGLA、或EPA存在的情形下以各種劑量刺激。

(5)肉毒桿菌神經(jīng)毒素A單獨以各種劑量刺激。

(6)肉毒桿菌神經(jīng)毒素A在LPS存在的情形下以各種劑量刺激。

(7)肉毒桿菌神經(jīng)毒素A在碳酰膽堿或乙酰膽堿存在的情形下以各種劑量刺激。

(8)肉毒桿菌神經(jīng)毒素A在AA、DGLA、或EPA存在的情形下以各種劑量刺激。

(9)每種抗毒蕈堿劑單獨以各種劑量刺激。

(10)每種抗毒蕈堿劑在LPS存在的情形下以各種劑量刺激。

(11)每種抗毒蕈堿劑在碳酰膽堿或乙酰膽堿存在的情形下以各種劑量刺激。

(12)每種抗毒蕈堿劑在AA、DGLA、或EPA存在的情形下以各種劑量刺激。

隨后分析細胞的PGH₂的釋放；PGE的釋放；PGE₂的釋放；前列腺環(huán)素的釋放；凝血脂素的釋放；IL-1β的釋放；IL-6的釋放；TNFα的釋放；COX2活性；cAMP和cGMP的產(chǎn)生；IL-1β、IL-6、TNFα、和COX2mRNA的產(chǎn)生；和CD80、CD86、和MHC II類分子的表面表達。

例7：止痛劑、肉毒神經(jīng)毒素、和抗毒蕈堿劑對人類膀胱平滑肌細胞收縮的影響

實驗設計

使培養(yǎng)的人類膀胱平滑肌細胞在各種濃度的止痛劑和/或抗毒蕈堿劑存在的情形下暴露于炎性刺激和非炎性刺激。測量刺激所誘發(fā)的肌肉收縮，以評估止痛劑和/或抗毒蕈堿劑的抑制效果。

效應物、止痛劑和抗毒蕈堿劑描述于實施例2中。

人類膀胱平滑肌細胞經(jīng)以下的試劑短期(1至2小時)或長期(24至48小時)刺激：

(1)每種止痛劑單獨以各種劑量刺激。

(2)每種止痛劑在LPS存在的情形下以各種劑量刺激。

(3)每種止痛劑在碳酰膽堿或乙酰膽堿存在的情形下以各種劑量刺激。

(4)每種止痛劑在AA、DGLA、或EPA存在的情形下以各種劑量刺激。

(5)肉毒桿菌神經(jīng)毒素A單獨以各種劑量刺激。

(6)肉毒桿菌神經(jīng)毒素A在LPS存在的情形下以各種劑量刺激。

(7)肉毒桿菌神經(jīng)毒素A在碳酰膽堿或乙酰膽堿存在的情形下以各種劑量刺激。

(8)肉毒桿菌神經(jīng)毒素A在AA、DGLA、或EPA存在的情形下以各種劑量刺激。

(9)每種抗毒蕈堿劑單獨以各種劑量刺激。

(10)每種抗毒蕈堿劑在LPS存在的情形下以各種劑量刺激。

(11)每種抗毒蕈堿劑在碳酰膽堿或乙酰膽堿存在的情形下以各種劑量刺激。

(12)每種抗毒蕈堿劑在AA、DGLA、或EPA存在的情形下以各種劑量刺激。

以Grass多種波動描寫器(Quincy Mass,USA)記錄膀胱平滑肌細胞收縮。

例8：止痛劑對正常人類膀胱平滑肌細胞對炎性刺激和非炎性刺激反應的影響

實驗設計

培養(yǎng)正常人類膀胱平滑肌細胞

通過酶自目視正常的人類膀胱切片消化分離正常的人類膀胱平滑肌細胞。在體外通過以下擴繁細胞：在5％CO₂的氣氛中在37℃，在添加有10％胎牛血清、15毫摩爾濃度的HEPES、2毫摩爾濃度的左旋谷氨酰胺、100單位/毫升(U/ml)青霉素和100毫克/毫升鏈霉素的RPMI 1640中培養(yǎng)細胞，并通過胰蛋白酶處理細胞來分離細胞，接著再接種于新的培養(yǎng)瓶中來每周繼代一次。在培養(yǎng)的第一周，對培養(yǎng)基添加0.5納克/毫升表皮生長因子(epidermal growth factor)、2納克/毫升纖維母細胞生長因子(fibroblast growth factor)和5微克/毫升胰島素(insulin)。

在體外以止痛劑處理正常人類膀胱平滑肌細胞

以止痛劑溶液(每孔50微升)單獨或與碳酰膽堿(10摩爾濃度(Molar)，每孔50微升)(作為非炎性刺激的實例)一起，或與鼠傷寒沙門氏菌的脂多糖(LPS)(1微克/毫升，每孔50微升)(作為炎性刺激的例子)一起，處理經(jīng)胰蛋白酶處理(trypsinized)且以100微升的每孔3×10⁴個細胞的細胞密度接種于微量培養(yǎng)板中的膀胱平滑肌細胞。當未向細胞中添加其他效應物時，添加50微升的無胎牛血清的RPMI 1640至孔中，以將最終體積調(diào)整至200微升。

培養(yǎng)24小時后，收集150微升的培養(yǎng)物上清液，在4℃以每分鐘8,000轉(zhuǎn)離心沉降2分鐘以移除細胞和碎片，并儲存在-70℃，以備通過ELISA來分析前列腺素E2(PGE2)反應。將細胞固定、透性化并封閉，使用熒光底物來檢測COX2。在選定的實驗中，在體外刺激細胞12小時，以分析COX2、PGE2、和細胞因子反應。

分析COX2、PGE2和細胞因子反應

如實施例3所述分析COX2和PGE2反應。如實施例2所述分析細胞因子反應。

結(jié)果

止痛劑抑制正常人類膀胱平滑肌細胞對炎性與非炎性刺激的COX2反應-培養(yǎng)24小時后對細胞和培養(yǎng)物上清液的分析顯示，所測試的止痛劑均未單獨在正常人類膀胱平滑肌細胞中誘發(fā)COX2反應。然而，如表6所總結(jié)的，碳酰膽堿在正常人類膀胱平滑肌細胞中誘發(fā)低但顯著的COX2反應。另一方面，LPS處理導致正常人類膀胱平滑肌細胞中更高水平的COX2反應。乙酰氨基酚、阿司匹林、布洛芬、和萘普生均可抑止碳酰膽堿和LPS對COX2水平的影響。在以5微摩爾濃度或50微摩爾濃度測試該藥物時，可見止痛劑對LPS誘發(fā)的反應的抑止效果。

表6.在體外以炎性和非炎性刺激物刺激并用止痛劑處理后，正常人類膀胱平滑肌細胞的COX2表達

^#數(shù)據(jù)表示為重復實驗的平均值

止痛劑抑制正常人類膀胱平滑肌細胞對炎性與非炎性刺激的PGE2反應-與上述COX2反應的誘發(fā)一致，碳酰膽堿與LPS兩者均誘發(fā)正常人類膀胱平滑肌細胞產(chǎn)生PGE2。亦發(fā)現(xiàn)乙酰氨基酚、阿司匹林、布洛芬、和萘普生在5微摩爾濃度或50微摩爾濃度下抑止LPS誘發(fā)的PGE2反應(表7)。

表7.在體外以炎性和非炎性刺激物刺激并用止痛劑處理后，正常人類膀胱平滑肌細胞的PGE2表達

^#數(shù)據(jù)表示為重復實驗的平均值

止痛劑抑制正常人類膀胱細胞對炎性刺激的細胞因子反應-在培養(yǎng)24小時后對細胞和培養(yǎng)物上清液的分析顯示，所測試的止痛劑均未單獨在正常人類膀胱平滑肌細胞中誘發(fā)IL-6或TNFα分泌。如表8和表9所示，所測試的碳酰膽堿劑量在正常人類膀胱平滑肌細胞中誘發(fā)低但顯著的TNFα和IL-6反應。另一方面，LPS處理導致大量誘發(fā)該促炎性細胞因子。乙酰氨基酚、阿司匹林、布洛芬、和萘普生抑止碳酰膽堿和LPS對TNFα和IL-6反應的影響。在以5微摩爾濃度或50微摩爾濃度測試該藥物時，可見止痛劑對LPS誘發(fā)的反應的抑止效果。

表8.在體外以炎性和非炎性刺激物刺激并用止痛劑處理后，正常人類膀胱平滑肌細胞的TNFα分泌

^#數(shù)據(jù)表示為重復實驗的平均值

表9.在體外以炎性和非炎性刺激物刺激并用止痛劑處理后，正常人類膀胱平滑肌細胞的IL-6分泌

^#數(shù)據(jù)表示為重復實驗的平均值

將初級正常人類膀胱平滑肌細胞分離、培養(yǎng)，并評估其在非炎性(碳酰膽堿)與炎性(LPS)刺激存在的情形下對止痛劑的反應。本研究的目標在于確定正常人類膀胱平滑肌細胞是否重現(xiàn)先前由鼠類膀胱細胞所得出的觀測結(jié)果。

對在延遲釋放制劑或延長釋放制劑或延遲-延長釋放制劑中的止痛劑和/或抗毒蕈堿劑重復上述實驗。

以上描述用于教示本領域中具有通常知識者如何實踐本發(fā)明，且其并非旨在詳細描述熟習操作者在閱讀此描述后將顯而易見的本發(fā)明的所有那些明顯修改和變化。然而，所有該明顯修改和變化皆包括在本發(fā)明的范疇內(nèi)，其由權利要求書來界定。除非上下文有明確相反指示，否則該權利要求旨在涵蓋有效滿足預期目標的所請求保護的成分和以任何次序的步驟。