融合多肽的重組工程菌株及其構(gòu)建和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 在基因工程領(lǐng)域，本發(fā)明公開了一種以大腸桿菌為載體的重組工程菌，同時涉及 工程菌株的構(gòu)建及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 促性腺激素釋放激素（GnRH)是一種由十個氨基酸殘基組成的肽類激素，其結(jié)構(gòu) 為 PGlul-His2-Trp3-Ser4-Tyr 5-Gly6-Leu7-Arg8-Pro9-Gly lti-NH2a GnRH 最早發(fā)現(xiàn)于下丘腦的 神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中，它以脈沖的方式釋放，與垂體上的GnRH受體特異地結(jié)合，刺激黃體生 成激素（LH)和卵泡刺激素（FSH)的合成與釋放。LH和FSH再促進性腺釋放特異性激素，如 女性刺激卵巢分泌雌二醇和孕酮，男性刺激睪丸分泌睪酮和前列腺素，并對乳腺、腎上腺皮 質(zhì)、甲狀腺和骨骼生長也發(fā)揮作用。除了下丘腦的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞分泌GnRH，許多惡性腫瘤 組織如乳腺癌、前列腺癌、肝癌、黑色素瘤等也能夠自分泌這種激素。GnRH是一種小分子半 抗原，免疫原性很弱，單獨將其作為疫苗很難引起免疫應(yīng)答。
[0003] 研究表明，當(dāng)將GnRH連接在一些大分子載體上免疫動物會引起特異性表位抑 制。因而本實驗室利用輔助T表位來提高GnRH的免疫原性。麻疹病毒融合蛋白序列中 第288位氨基酸到第302位氨基酸片段是一個典型的T細(xì)胞表位（SEIKGVIVRLEGVAK，下 文均簡稱MVP)，可用于人用疫苗中。國外已有報道，用MVP與半抗原相連構(gòu)成雜合肽，能 誘導(dǎo)出針對半抗原的抗體反應(yīng)，而且不會產(chǎn)生明顯的針對該T細(xì)胞表位的抗體。此外，研 究表明含有多拷貝線性連接的自身肽序列蛋白的免疫原性可以得到極大的提高，因而， 本實驗室將編碼三段首尾相連的GnRH的核苷酸片段克隆入高效表達載體。還有研究表 明，半抗原的二聚體能產(chǎn)生很強的免疫原性。人IgG1鉸鏈區(qū)（hinge region)寡肽片段 226-232/226'-232'（CPPCPAP/CPPCPAP)是天然免疫蛋白的樞軸。在天然蛋白中，這個富含 脯氨酸的剛性雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)會自發(fā)折疊成一個雙聚脯氨酸-Π α螺旋，人工合成的鉸鏈區(qū) 多肽225-232/225' -232'的空間構(gòu)型與天然蛋白中鉸鏈片段的構(gòu)型完全一致，進一步研究 還發(fā)現(xiàn)在IgG1鉸鏈區(qū)的一端或兩端連上非IgGl的多肽序列時，仍能形成雙聚脯氨酸-II α 螺旋。因此，我們在hinge region片段N末端加上三段重復(fù)的GnRH片段，在它的C末端連 接麻疹病毒的T表位，希望GnRH能藉此形成二聚體，增強免疫原性。
[0004] 熱休克蛋白家族的mHSP70中的407-426片段（M)作為HSP70主要的非特異性免 疫增強肽段，能通過上調(diào)DC表面的共刺激分子和MHC分子，促進Thl型刺激反應(yīng)，增強了殺 傷細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，從而介導(dǎo)強烈的細(xì)胞免疫應(yīng)答；同時通過與CD40結(jié)合而增強mHSP70 或CD40L誘導(dǎo)的DC成熟，從而高效地攝取、加工處理和遞呈抗原，誘導(dǎo)特異性的細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞生成。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)M經(jīng)過串聯(lián)重復(fù)兩次（M2)后能夠加強對DC的刺激 效果，具有較好的抗腫瘤活性。
[0005] 但是重組GnRH多肽只有50多個氨基酸，如果直接在大腸桿菌表達效率很低，因為 其mRNA和表達產(chǎn)物都易降解。因此可以采取融合表達的方法解決這一問題，選擇本實驗室 已有的表達系統(tǒng)PED。在這一系統(tǒng)中，融合伙伴ansB-C與目的活性肽由氨基酸序列Asp-Pro 連接，其中，Asp-Pro是唯一的酸水解位點。融合蛋白在酸性條件下，Asp-Pro之間的肽鍵斷 開，從而釋放出目的多肽。
[0006] 為了進一步增強GnRH3-hinge-MVP多肽的抗腫瘤活性，本發(fā)明構(gòu)建了 GnRH/M2基因 重組菌，表達純化融合蛋白后同APC體外共培養(yǎng)獲得DC疫苗，回輸體內(nèi)可促使APC具有較 高的裝載和處理抗原能力，可提高機體對腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答，達到識別和殺滅腫瘤細(xì)胞 的目的，進一步增強抗腫瘤作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明公開一種重組大腸桿菌菌株P(guān)EDGM2。
[0008] 本發(fā)明的一個目的是提供重組菌的構(gòu)建方法。
[0009] 本發(fā)明的另一個目的是公開該重組蛋白的用途。
[0010] 在本發(fā)明的第一個方面，提供了一種重組大腸桿菌工程菌株。該大腸桿菌工程 菌株命名為BL21/pEDGM2,菌株已提交中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏地址：中國.武 漢·武漢大學(xué)，保藏日期2015年6月14日，保藏編號為CCTCC NO :M 2015369,分類命名： Escherichia, coli BL21/pEDGM2。該菌株攜帶有能表達 &11813?11冊3-11；[1^6-]\^?-]\12融合 蛋白的重組質(zhì)粒。
[0011] 在本發(fā)明的第二個方面，提供了重組大腸桿菌菌株pET-28a-ansB-C-GnRH3-hinge -MVP-M2的構(gòu)建及其所表達的重組蛋白的純化方法，其技術(shù)路線詳述如下：
[0012] L 重組質(zhì)粒 pET-28a-ansB-C-GnRH3-hinge-MVP-M2及相應(yīng)工程菌的構(gòu)建
[0013] 以本實驗室構(gòu)建的 PED⑶(pET-28a-ansB-C-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG)為 模板，設(shè)計上游引物Pl和下游引物P2,上游含有Nco I酶切位點，下游引入Nhe I位 點。將擴增的ansB-C-GnRH3-hinge-MVP序列與空的pET28a質(zhì)粒連接，獲得重組質(zhì)粒 pET-28a-ansB-C-GnRH3-hinge-MVP〇
[0014] 以本實驗室構(gòu)建的pET28a-hVEGF121 I-M2為模板，設(shè)計上下游引物Vl 和V2,兩端分別引入Nhe I位點和Hind III位點。PCR反應(yīng)擴增M2序列。將 pET-28a-ansB-C-GnRH3-hinge-MVP質(zhì)粒和獲得的M2序列用Nhe I和Hind III限制性內(nèi)切 酶進行雙酶切，再加入DNA連接酶獲重組質(zhì)粒pET-28a-ansB-C-GnRH3-hinge-MVP-M 2。將重 組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E. coli BL21感受態(tài)細(xì)胞，卡那霉素篩選陽性轉(zhuǎn)化子，用引物Pl和V2驗證。
[0015] 經(jīng) DNA 測序分析顯示，M2片段正確插入到了 pET-28a-ansB-C-GnRH 3-hinge-MVP (P EDG)重組質(zhì)粒中，并且位于pET-28a-ansB-C-GnRH3-hinge-MVP基因片段的3'端。至此兩 段目的基因片段按照正確的順序插入pET-28a中，并組成融合蛋白的重組基因片段，pET-2 8a-ansB-C-GnRH3-hinge-MVP_M2表達載體構(gòu)建完成并且測序分析正確。
[0016] 2.融合蛋白的誘導(dǎo)表達和分離純化
[0017] 從平板上挑取工程菌單菌落，接種至含50 μ g/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中震蕩培 養(yǎng)過夜，按1 %轉(zhuǎn)接于新鮮LB培養(yǎng)液中，37°C培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加入乳糖進行誘導(dǎo)表達， 37°C繼續(xù)培養(yǎng)，5h后離心收取菌體沉淀。
[0018] 收集菌體，充分裂解菌體，12000r/min離心10min，棄上清，保留沉淀。沉淀經(jīng)過洗 滌，得到純凈的包涵體，包涵體粗品加入8mol/L尿素至包涵體完全溶解。將包涵體溶液進 行無水乙醇分級沉淀，收集沉淀；將乙醇沉淀的蛋白加入60mM的HC1，置48°C水浴72h。
[0019] 將水浴后的蛋白溶液過陰離子交換柱DEAE-cellulose做進一步純化，用含NaCl 的層析緩沖液梯度洗脫，收集穿透峰和洗脫峰，檢測合并目的蛋白峰組分，對蒸餾水充分透 析后凍干保存。
【附圖說明】
[0020] 圖1重組質(zhì)粒構(gòu)建原理示意圖。
[0021] 圖2 PCR獲得GnRH重組基因的1. 5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。
[0022] Lanel :DNA Marker，Lane2 :PCR 產(chǎn)物。
[0023] 圖3 L 5 %瓊脂糖凝膠中pET28a-ansB-C-GnRH3-hinge-MVP重組質(zhì)粒的PCR驗證
[0024] Lanel :DNA Marker，Lane2 :PCR 產(chǎn)物。
[0025] 圖4 pET-28a-ansB-C-GnRH3-hinge-MVP重組質(zhì)粒的基因正向測序圖。
[0026] 圖5 PCR獲得M2基因的1. 5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。
[0027] Lane I :DNA Marker，Lane2 :PCR 產(chǎn)物。
[0028] 圖6 0. 8%瓊脂糖凝膠中重組質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶驗證電泳圖
[0029] Lanel :DNA Marker，Lane2 :經(jīng) Hind III 單酶切后的重組質(zhì)粒，Lane3 :經(jīng) Nhe I 和 Hind III雙酶切后的重組質(zhì)粒，Lane4 :未經(jīng)酶切的重組質(zhì)粒。
[0030] 圖 7 L 5 %瓊脂糖凝膠中 pET-28a-ansB-C-GnRH3-hinge-MVP-M2重組質(zhì)粒的 PCR驗 證
[0031] Lanel :PCR 產(chǎn)物，Lane2 :DNA Marker。
[0032] 圖 8 pET-28a-ansB-C-GnRH3-hinge-MVP-M2重組質(zhì)粒的基因正向測序圖。
[0033] 圖9 12% SDS-PAGE電泳檢測重組菌經(jīng)乳糖誘導(dǎo)表達融合蛋白的誘導(dǎo)曲線。
[0034] Lanel :Protein Marker，Lane2 :誘導(dǎo)前的全菌蛋白樣品，Lane3_10 :誘導(dǎo)后 1-8 小 時每個小時的全菌蛋白樣品。
[0035] 圖10 12% SDS-PAGE電泳檢測超聲裂解菌體結(jié)果。
[0036] Lanel :Protein Marker，Lane2 :誘導(dǎo)前的全菌蛋白樣品，Lane3 :誘導(dǎo)后5h全菌蛋 白樣品，Lane4 :菌體裂解上清，Lane5 :菌體裂解沉淀。
[0037] 圖11 12% SDS-PAGE電泳檢測乙醇分級沉淀融合蛋白結(jié)果。
[0038] Lanel :乙醇沉淀前，Lane2 :加入0. 5倍體積無水乙醇的蛋白沉淀，Lane3 :加入1 倍體積無水乙醇的蛋白沉淀，Lane4 :加入2倍體積無水乙醇的蛋白沉淀。
[0039] 圖12 12% tricine-SDS-PAGE電泳檢測酸水解目的蛋白結(jié)果
[0040] Lanel :Protein Marker，Lanel :酸水解前的融合蛋白，Lane3 ~8 :酸水解后 12h、 24h、36h、48h、60h、72h 取樣。
[0041] 圖13 12% tricine-SDS-PAGE電泳檢測DEAE52陰離子交換層析對目的蛋白純化 結(jié)果。
[0042] Lanel :Protein Marker，Lane2 :上樣前的蛋白樣品，Lane3 :穿透峰峰頂時的蛋白 樣品，Lane4 :洗脫峰峰頂時的蛋白樣品。
【具體實施方式】
[0043] 材料
[0044] (1)菌株和質(zhì)粒
[0045] 載體pET-28a-ansB-C-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG，Escherichia coli BL21(DE3); pET-28a-hVEGF121 I-M2, Escherichia coli BL21(DE3)，pET-28a-ansB-C-GnRH3-hinge-MV P-NRLLLTG和pET-28a-hVEGF121 I-M2質(zhì)粒均為本實驗室保存。
[0046] (2)酶和試劑
[0047] 分子克隆工具酶為TaKaRa公司產(chǎn)品；質(zhì)粒抽提試劑盒為上海捷瑞生物工程有限 公司產(chǎn)品；PCR膠回收試劑盒為上海生工生物科技有限公司的產(chǎn)品。
[0048] (3)培養(yǎng)基
[0049] LB 培養(yǎng)基，配方見參考文獻 Sambrook J，F(xiàn)ristshE F，Maniatis T. Molecular Cloning ；A Laboratory Manual 2nd ed. NY ：Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989〇
[0050] 本說明書所提及的方法中質(zhì)粒提取、PCR反應(yīng)、內(nèi)切酶酶切、DNA片段的回收、連 接和轉(zhuǎn)化大腸桿菌，這些都是基因工程研究領(lǐng)域的常規(guī)操作方法，具體參見Sambrook J， FristshE F，Maniatis T. Molecular Cloning ；A Laboratory Man ual 2nd ed. NY ：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989,pp.16-340。
[0051] 實施例1攜帶有目的基因 ansB-C-GnRH3-hinge-MVP的質(zhì)粒載體的構(gòu)建
[0052] I. 1模板質(zhì)粒PED⑶和空質(zhì)粒pET28a的提取
[0053] 將本實驗室構(gòu)建的 PED⑶(pET-28a-ansB-C-GnRH3-hinge-