一種利用甘油生產(chǎn)丙烯酸的重組菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種利用甘油生產(chǎn)丙烯酸的重組菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，屬于基因工 程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 由于化石能源危機(jī)日趨嚴(yán)重以及利用化石能源帶來(lái)的環(huán)境問(wèn)題，制造生物燃料成 為迫切問(wèn)題。隨著生物柴油的大量生產(chǎn)，產(chǎn)生了大量副產(chǎn)物甘油。據(jù)估計(jì)，每生產(chǎn)10噸生 物柴油大約生成1噸粗甘油。甘油可以作為低廉的可再生原料，用來(lái)生產(chǎn)化學(xué)品和燃料，可 以帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)和環(huán)境效益。
[0003] 丙烯酸（CH2 = CH-C00H)是一個(gè)重要的不飽和有機(jī)酸和化學(xué)工業(yè)原料。它可以廣 泛的應(yīng)用在聚凝劑、分散劑、油漆和涂料方面，還能作為皮革、造紙、紡織中的粘合劑。同時(shí)， 丙烯酸的聚合物，例如超吸水性分子材料的應(yīng)用，進(jìn)一步推動(dòng)了丙烯酸的需求。
[0004] 丙烯酸可以通過(guò)化學(xué)合成獲得，但是化學(xué)合成途徑具有原料有限、成本居高不下 以及容易造成環(huán)境污染等問(wèn)題；與化學(xué)合成法相比，生物合成操作簡(jiǎn)單、條件溫和、綠色環(huán) 保。越來(lái)越多的科研工作者將研究重點(diǎn)放在了生物合成途徑上。
[0005] 已知一些微生物可以在代謝中間過(guò)程產(chǎn)物微量丙烯酸作為中間體，包括丙酮丁醇 梭菌（Clostridium propionicum)、金屬硫化葉菌（Sulfolobus metallicus)、埃氏巨球 型菌（Megasphaera elsdenii)、澄色綠曲燒菌（Chloroflexus aurantiacus)，布氏酸菌 (Acidianus brierleyi)和脫硫弧菌丙稀酸菌（Desulfovibrio acrylicus)等，但是，以上 微生物大部分屬于厭氧的無(wú)機(jī)自養(yǎng)型細(xì)菌，難以培養(yǎng)，代謝途徑不清，不易進(jìn)行生物改造。 目前，微生物產(chǎn)丙稀酸的研究主要是利用丙酮丁醇梭菌（Clostridium propionicum)作為 宿主菌實(shí)現(xiàn)，但是該菌的生物發(fā)酵產(chǎn)量低，且不能進(jìn)行有效改造。同時(shí)，現(xiàn)有技術(shù)中尚沒(méi)有 一種以模式菌株大腸桿菌為宿主菌，以甘油為底物生產(chǎn)丙烯酸的重組菌。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了 一種利用甘油生產(chǎn)丙烯酸的重組菌，所采取的技 術(shù)方案如下：
[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種利用甘油生產(chǎn)丙烯酸的重組菌。該重組菌過(guò)表達(dá)甘油 脫水酶基因，甘油脫水酶再激活酶基因，3-羥基丙酰輔酶A脫水酶基因和丙醛脫氫酶基因。
[0008] 優(yōu)選地，所述甘油脫水酶基因，為來(lái)源于肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)的甘油脫水酶基因 dhaB123 ;所述甘油脫水酶再激活酶基因，為來(lái)源于肺炎克 雷伯氏菌的甘油脫水酶再激活酶基因 gdrAB ;所述3-羥基丙酰輔酶A脫水酶基因，為來(lái)源 于橙色綠曲燒菌（Chloroflexus aurantiacus)的3-羥基丙酰輔酶A脫水酶基因 pcsll; 所述丙醛脫氫酶基因，為來(lái)源于沙門(mén)氏菌（Salmonella typhimurium)的丙醛脫氫酶基因 pduP〇
[0009] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述重組菌的構(gòu)建方法，該方法的步驟如下：
[0010] 1)克隆獲得甘油脫水酶基因 dhaB123,甘油脫水酶再激活酶基因 gdrAB，3-羥基丙 酰輔酶A脫水酶基因 pcsll和丙醛脫氫酶基因 pduP ;
[0011] 2)將步驟1)所得的3-羥基丙酰輔酶A脫水酶基因 pcsll和丙醛脫氫酶基因 pduP 連接到質(zhì)粒載體上，獲得重組質(zhì)粒；
[0012] 3)將步驟1)所得的甘油脫水酶基因 dhaB 123和甘油脫水酶再激活酶基因 gdrAB 插入到宿主菌的丙酸調(diào)節(jié)子基因 PrpR座位上，得到宿主重組菌；
[0013] 4)將步驟2)所得的重組質(zhì)粒導(dǎo)入到步驟3)所得的宿主重組菌中，獲得重組菌。
[0014] 優(yōu)選地，步驟1)所述克隆甘油脫水酶基因 dhaB123所用引物如SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 2所示；所述克隆甘油脫水酶再激活酶基因 gdrAB所用引物如SEQ ID NO. 3-SEQ ID NO. 4所示；所述克隆3-羥基丙酰輔酶A脫水酶基因 pcsll所用引物如SEQ ID NO. 5-SEQ ID NO. 6所示；所述克隆丙醛脫氫酶基因 pduP所用引物如SEQ ID NO. 7-SEQ ID NO. 8所示。
[0015] 優(yōu)選地，步驟2)所述質(zhì)粒載體，為質(zhì)粒pETDuet-1。
[0016] 優(yōu)選地，步驟3)所述宿主菌為大腸桿菌或肺炎克雷伯氏菌。
[0017] 所述方法的具體步驟如下：
[0018] 1)以肺炎克雷伯氏菌的DNA為模板，分別以如SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 2所示 和SEQ ID NO. 3-SEQ ID勵(lì).4所示的引物克隆甘油脫水酶基因(11^8123和甘油脫水酶基 因 dhaB123;以橙色綠曲撓菌DNA為模板，以如SEQ ID NO. 5-SEQ ID NO. 6所示的引物克隆 3-羥基丙酰輔酶A脫水酶基因 pcsll;以沙門(mén)氏菌的DNA為模板，以如SEQ ID NO. 7-SEQ ID NO. 8所示的引物克隆丙醛脫氫酶基因 pduP ;
[0019] 2)將步驟1)所得的3-羥基丙酰輔酶A脫水酶基因 pcsll和丙醛脫氫酶基因 pduP 連接到質(zhì)粒pETDuet-Ι上，獲得重組質(zhì)粒pETDuet-1-pcsII-pduP ;
[0020] 3)將步驟1)所得的甘油脫水酶基因 dhaB 123和甘油脫水酶再激活酶基因 gdrAB 插入到大腸桿菌的丙酸調(diào)節(jié)子基因 prpR座位上，得到宿主重組菌；
[0021] 4)將步驟2)所得的重組質(zhì)粒pETDuet-1-pcsII-pduP導(dǎo)入到步驟3)所得的宿主 重組菌中，獲得重組菌。
[0022] 所述重組菌可以在發(fā)酵生產(chǎn)丙烯酸中的應(yīng)用。
[0023] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種利用所述重組菌發(fā)酵生產(chǎn)丙烯酸的方法，該方法 的步驟如下：
[0024] 1)活化權(quán)利要求1或2所述的重組菌，獲得活化重組菌；
[0025] 2)將步驟1)所得的活化重組菌接種到含有氨芐青霉素的M9液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā) 酵培養(yǎng)。
[0026] 優(yōu)選地，上述方法中步驟2)所述發(fā)酵培養(yǎng)，是按1 %的接種量接種，在37 °C， ISOrpm的條件下培養(yǎng)至OD6。。達(dá)到1. 0時(shí)，加入異丙基硫代半乳糖苷誘導(dǎo)和維生素 B 12，每隔 12h添加一次異丙基硫代半乳糖苷和抗生素 IPTG，異丙基硫代半乳糖苷誘導(dǎo)后48h終止發(fā) 酵。
[0027] 所述重組載體導(dǎo)入宿主菌的方法采用熱激轉(zhuǎn)化法。
[0028] 本發(fā)明獲得的有益效果如下：
[0029] 本發(fā)明以E. coli宿主菌，實(shí)現(xiàn)了以甘油為底物，在大腸桿菌這種模式菌株中首次 合成得到丙烯酸，為丙烯酸的生產(chǎn)提供了新的技術(shù)方法。
[0030] 本發(fā)明通過(guò)在大腸桿菌prpR基因座位處插入外源的甘油脫水酶基因（dhaB123) 和甘油脫水酶再激活基因（gdrAB)到宿主E. coli上過(guò)表達(dá)，同時(shí)過(guò)表達(dá)外源的3-羥基丙 酰輔酶A脫水酶基因（pcsll)和丙醛脫氫酶基因（pduP)實(shí)現(xiàn)以甘油為碳底物生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn) 丙烯酸。
[0031] 定義和縮寫(xiě)
[0032] 在本發(fā)明中使用下列的縮寫(xiě)或簡(jiǎn)稱(chēng)：
[0033] 甘油脫水酶基因：dhaB123
[0034] 甘油脫水酶再激活酶基因 ：gdrAB
[0035] 3-羥基丙酰輔酶A脫水酶基因 ：pcsll
[0036] 丙醛脫氫酶基因：pduP
[0037] 丙酸調(diào)節(jié)子：prpR
[0038] 大腸埃希氏桿菌（Escherichia coli) :E. coli
[0039] 肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae) :Κ· penumoniae
[0040] 沙門(mén)氏菌（Salmonella typhimurium) ：S. typhimurium [0041 ] pETDuet-1-pcsII-pduP 載體：pETDuet-1-pp 質(zhì)粒
[0042] "基因插入"指將目標(biāo)基因從基因組特定座位處插入到基因組中，從而使宿主菌攜 帶某種特定基因表達(dá)其對(duì)應(yīng)功能的蛋白質(zhì)。
[0043] "熱激轉(zhuǎn)化"或"熱轉(zhuǎn)化"指分子生物學(xué)中轉(zhuǎn)染技術(shù)的一種，用來(lái)將外來(lái)基因整合到 宿主基因中并穩(wěn)定表達(dá)，其利用受到熱激后，細(xì)胞膜出現(xiàn)裂隙，將外來(lái)基因?qū)胨拗骰蚧?將外來(lái)質(zhì)粒導(dǎo)入宿主原生質(zhì)體，又熱激轉(zhuǎn)化或熱轉(zhuǎn)化等。
[0044] "過(guò)量表達(dá)"或"過(guò)表達(dá)"指特定的基因在生物體中大量表達(dá)，表達(dá)量超過(guò)正常水平 (即，野生型表達(dá)水平），可以通過(guò)增強(qiáng)內(nèi)源表達(dá)或引入外源基因來(lái)實(shí)現(xiàn)。
【附圖說(shuō)明】
[0045] 圖1為利用甘油合成丙烯酸的代謝途徑示意圖。
[0046] 圖 2 為 pETDuet-1-pcsII-pduP 載體構(gòu)建示意圖。
[0047] 圖3為重組大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)物丙烯酸的高效液相色譜檢測(cè)；
[0048] (A為標(biāo)準(zhǔn)品，B為菌發(fā)酵產(chǎn)物）。
【具體實(shí)施方式】
[0049] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明不受實(shí)施例的限制。
[0050] 以下實(shí)施例中所用材料、試劑、儀器和方法，未經(jīng)特殊說(shuō)明，均為本領(lǐng)域中的常規(guī) 材料、試劑、儀器和方法，均可通過(guò)商業(yè)渠道獲得。
[0051 ] 所用酶試劑購(gòu)自MBI Fermentas公司，提取質(zhì)粒所用的試劑盒和回收DNA片段所 用的試劑盒購(gòu)自美國(guó)OMEGA公司，相應(yīng)的操作步驟按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；所有培養(yǎng)基如無(wú) 特別說(shuō)明均用去離子水配制。
[0052] 培養(yǎng)基配方：
[0053] 1)種子液搖瓶培養(yǎng)基
[0054] LB培養(yǎng)基：5g/L酵母粉，10g/L NaCl，10g/L蛋白胨，其余為水，121°C，20min滅菌。
[0055] 2)發(fā)酵生產(chǎn)搖瓶培養(yǎng)基
[0056] M9 改良培養(yǎng)基：40g/L glycerol，I. 5g/L KH2PO4, 3g/L(NH4)2S04, lg/L - 水合檸 檬酸，lg/L 二水合檸檬酸三鈉，I. 9g/L KC1，3g/L MgSO4, 0· 138g/L FeSO4 · 7Η20,4· 5mg/L vitamin BI和100 μ L微量元素。
[0057] 微量元素（每升）：3. 7g (NH4) 6Μ〇7024 ·4Η20, 2. 47g Η3Β04, I. 58g MnCl2 ·4Η20, 0· 29g ZnSO4 · 7Η20, 0· 25g CuSO4 · 5Η20。
[0058] 在實(shí)際培養(yǎng)過(guò)程中，可向上述培養(yǎng)基中添加一定濃度的抗生素以維持質(zhì)粒的穩(wěn)定 性，如100mg/L的氨芐青霉素，每隔12h添加維生素 B12用于甘油脫水酶（DhaB123)發(fā)揮作 用。
[0059] 實(shí)施例1外源基因的克隆
[0060] 丙醛脫氫酶基因（pduP) (Gene ID: 1253572)的克隆是以S. typhimurium為模板， 通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得，引物序列如SEQ ID NO. 7-SEQ ID NO. 8所說(shuō)，（引物：5' -GGAATTCCATA TGAATACTTCTGAACTCGAAAC-3' 和 5' -CGGGGTACCTTAGCGAATAGAAAAGCCGTTG-3'），再利用回收 試劑盒回收目的片段。
[0061] 3-羥基丙酰輔酶A脫水酶基因（pcsll)的克隆是以Chloroflexus aurantiacus 為模板，克隆丙酰輔酶A合成酶基因（pcs) (AF445079)的閱讀框區(qū)域2566bp-3552bp，該區(qū) 域?yàn)閜cs水合酶編碼功能域，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得