，引物序列如SEQ ID NO. 5-SEQ ID NO. 6所 示，（引物：5' -CATGGATCCTATGGAACGCTATCGCTACTTC-3' 和 5' -CAGAGCTCCTACAACGGCGCACTCT GGCG-3'），再利用回收試劑盒回收目的片段。
[0062] 甘油脫水酶基因（dhaBl23) (dhaBl Gene ID = 7M7I97 ;dhaB2 Gene ID = 7M7I98 ; dhaB3Gene ID:7947200)和甘油脫水酶再激活酶基因（gdrAB)(gdrA Gene ID :6936977; gdrB Gene ID:6938011)的克隆是以K.peneumoniae為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得，引物 序列分別如 SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 2 和 SEQ ID NO. 3-SEQ ID NO. 4 所示。（引物： 5'-CAGCTCTAGAGGATTTCACCTTTTGAGCCGATG-3' 和 5'-TTAACGGCATGCTGACCTCCGCTTAG-3' ； 5' -GCGGAGGTCAGCATGCCGTTAATAG-3' 和 5' -CAGAAGCTTCAGTTTCTCTCACTTAACG-3'），再利用 回收試劑盒回收目的片段。
[0063] 以甘油脫水酶基因（dhaB123)片段和甘油脫水酶再激活酶基因（gdrAB)片段為底 物，通過(guò)搭橋PCR獲得dhaB123-gdrAB。
[0064] 實(shí)施例2外源基因的插入及重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0065] 1.外源基因插入宿主菌的過(guò)程
[0066] 在E. coli prpR座位處插入基因 dhaB123，gdrAB,形成突變菌株E. coli， Λ prpR: :dhaB123_gdrAB ;菌株構(gòu)建的具體過(guò)程如下：
[0067] 1)以大腸桿菌prpR基因上下游500個(gè)堿基片段為模板設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增prpR 基因上下游片段，利用回收試劑盒回收目的基因片段。
[0068] 2)甘油脫水酶基因和甘油脫水酶再激活酶基因的克隆是以肺炎克雷伯氏菌為模 板，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得，再利用回收試劑盒回收目的片段，以甘油脫水酶基因段和甘油脫水 酶再激活酶基因片段為底物，通過(guò)搭橋PCR獲得dhaB123-gdrAB，利用回收試劑盒回收搭橋 獲得的基因片段。
[0069] 3)以上述1)和2)獲得的基因片段為模板進(jìn)行搭橋PCR，再利用回收試劑盒回收 目的片段A prpR (UP)-dhaB123-gdrAB-prpR (Dn)，以自殺質(zhì)粒PREl 12為媒介與大腸桿菌進(jìn) 行同源重組插入 dhaB123_gdrAB 基因得到 Escherichia coli AprpR: :dhaB123_gdrAB ;
[0070] 2.重組質(zhì)粒 pETDuet-1-pcsII-pduP 的構(gòu)建過(guò)程
[0071] 1) 3-羥基丙酰輔酶A脫水酶基因的克隆是以橙色綠曲撓菌為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增 紅的，再利用回收試劑盒回收目的片段，具體克隆過(guò)程與實(shí)施例1相同；
[0072] 2)丙醛脫氫酶基因的克隆是以沙門(mén)氏菌為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得，再利用回收 試劑盒回收目的片段，具體克隆過(guò)程與實(shí)施例1相同；
[0073] 3)將質(zhì)粒pETDuet-Ι和割膠回收后的pcsll基因片段進(jìn)行酶切，回收酶切產(chǎn)物，再 進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5a，篩選陽(yáng)性克隆，得到重組質(zhì)粒pETDuet-1-pcsII ;
[0074] 4)將質(zhì)粒pETDuet-1-pcsII和割膠回收后的pduP基因片段進(jìn)行酶切，回收 酶切產(chǎn)物，再進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5 a，篩選陽(yáng)性克隆，得到重組質(zhì)粒 pETDuet_l-pcsII-pduP(簡(jiǎn)寫(xiě)為 pETDuet-1-pp)。
[0075] 又或者，重組質(zhì)粒 pETDuet-1-pp (pETDuet-1-pcsII-pduP)的構(gòu)建以質(zhì)粒 pETDuet-1-pduP和割膠回收后的pcsll基因片段為基礎(chǔ)獲得，進(jìn)行雙酶切所用的酶為 BamHI和 HindIII。
[0076] 其中，將質(zhì)粒pETDuet-Ι和割膠回收后的pduP基因片段用NdeI和KpnI酶切，回 收酶切產(chǎn)物，再進(jìn)行連接，載體與PduP基因片段按照摩爾比1:4的比例，16°C連接6h以上， 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5 α，然后涂布在加有100 μ g · mL 1氨芐青霉素的LB固體平板上， PCR篩選陽(yáng)性克隆。從陽(yáng)性克隆中提取重組質(zhì)粒pETDuet-1-pduP后，再通過(guò)限制性酶和測(cè) 序鑒定。
[0077] 實(shí)施例3重組菌株構(gòu)建
[0078] 接E. coli，Λ prpR: : dhaB123_gdrAB于 20mL 的 LB液體培養(yǎng)基中，加入 50 μ g .mL-l 的氨芐青霉素，培養(yǎng)至一定菌體濃度。用滅菌離心管在4°C下4000rpm離心5分鐘，去除 上清，用冰浴的無(wú)菌水懸浮并洗滌菌體，離心棄上清，再用4°C保存的Trans5 a Chemically Competent Cell試劑solution A懸浮并離心，再用4°C冷藏的solution B重懸浮，分 裝，-80°C保存，得到感受態(tài)細(xì)胞。
[0079] 重組質(zhì)粒 pETDuet-1-pp 通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化 E. coli，Λ prpR: :dhaB123_gdrAB 感受態(tài) 細(xì)胞，涂布于加有氨芐青霉素的LB固體平板，通過(guò)PCR篩選獲得陽(yáng)性克隆。得到工程菌株 E. οοΙ?,Δ prpR: :dhaB123-gdrAB(pETDuet-1-pp) 〇
[0080] 實(shí)施例4重組菌株的搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)
[0081] 將活化后的重組菌株按1:100的比例接種到含有50mL的M9改良液體培養(yǎng)基的 250mL擋板搖瓶中（內(nèi)含100 μ g ^mL 1的氨芐青霉素），37°C、180rpm條件下振蕩培養(yǎng)。0D6。。 達(dá)到1.0左右時(shí)，加入50ymol/L異丙基硫代半乳糖苷（IPTG)和5ymol/L VB12，此后，每 隔12h添加一次VB1JP抗生素 IPTG誘導(dǎo)后48h終止發(fā)酵。
[0082] 取ImL發(fā)酵液，4°C，15000rpm離心10min，取上清，用高效液相色譜檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物。 液相色譜（圖3)證實(shí)得到了產(chǎn)物丙烯酸；在搖瓶發(fā)酵中工程菌產(chǎn)量為58. 6mg/L。
[0083] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，上述大腸桿菌（E. coli)基因的插入實(shí)驗(yàn)，各個(gè)步驟均 按照標(biāo)準(zhǔn)的分子克隆技術(shù)進(jìn)行；上述過(guò)量表達(dá)的兩種基因共同克隆到大腸桿菌（E. coli) 中，各個(gè)步驟均按照標(biāo)準(zhǔn)的分子克隆技術(shù)進(jìn)行。
[0084] 雖然本發(fā)明已以較佳的實(shí)施例公開(kāi)如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此 技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明精神和范圍內(nèi)，都可以做各種的改動(dòng)與修飾，因此，本發(fā)明的保 護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書(shū)所界定的為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種利用甘油生產(chǎn)丙烯酸的重組菌，其特征在于，過(guò)表達(dá)甘油脫水酶基因，甘油脫水 酶再激活酶基因，3-羥基丙酰輔酶A脫水酶基因和丙醛脫氫酶基因。2. 權(quán)利要求1所述一種利用甘油生產(chǎn)丙烯酸的重組菌，其特征在于，所述甘油脫水酶 基因，為來(lái)源于肺炎克雷伯氏菌（Klebsiellapneumoniae)的甘油脫水酶基因dhaB123 ;所 述甘油脫水酶再激活酶基因，為來(lái)源于肺炎克雷伯氏菌的甘油脫水酶再激活酶基因gdrAB; 所述3-羥基丙酰輔酶A脫水酶基因，為來(lái)源于橙色綠曲燒菌（Chloroflexusaurantiacus) 的3-羥基丙酰輔酶A脫水酶基因pcsll;所述丙醛脫氫酶基因，為來(lái)源于沙門(mén)氏菌 (Salmonellatyphimurium)的丙酸脫氫酶基因pduP〇3. -種權(quán)利要求1所述重組菌的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟如下： 1) 克隆獲得甘油脫水酶基因dhaB123,甘油脫水酶再激活酶基因gdrAB，3-羥基丙酰輔 酶A脫水酶基因pcsll和丙醛脫氫酶基因pduP; 2) 將步驟1)所得的3-羥基丙酰輔酶A脫水酶基因pcsll和丙醛脫氫酶基因pduP連 接到質(zhì)粒載體上，獲得重組質(zhì)粒； 3) 將步驟1)所得的甘油脫水酶基因dhaB123和甘油脫水酶再激活酶基因gdrAB插入 到宿主菌的丙酸調(diào)節(jié)子基因PrpR座位上，得到宿主重組菌； 4) 將步驟2)所得的重組質(zhì)粒導(dǎo)入到步驟3)所得的宿主重組菌中，獲得重組菌。4. 權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，步驟1)所述克隆甘油脫水酶基因dhaB123所用 引物如SEQIDNO.I-SEQIDNO. 2所示；所述克隆甘油脫水酶再激活酶基因gdrAB所用引 物如SEQIDNO. 3-SEQIDNO. 4所示；所述克隆3-羥基丙酰輔酶A脫水酶基因pcsll所用 引物如SEQIDNO. 5-SEQIDNO. 6所示；所述克隆丙醛脫氫酶基因pduP所用引物如SEQID NO. 7-SEQIDNO. 8 所示。5. 權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，步驟2)所述質(zhì)粒載體，為質(zhì)粒pETDuet-1。6. 權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，步驟3)所述宿主菌為大腸桿菌或肺炎克雷伯氏 菌。7. 權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，具體步驟如下： 1) 以肺炎克雷伯氏菌的DNA為模板，分別以如SEQIDNO.I-SEQIDNO. 2所示和SEQID NO. 3-SEQIDNO. 4所示的引物克隆甘油脫水酶基因dhaB123和甘油脫水酶基因dhaB123 ; 以橙色綠曲撓菌DNA為模板，以如SEQIDNO. 5-SEQIDNO. 6所示的引物克隆3-羥基丙酰 輔酶A脫水酶基因pcsll;以沙門(mén)氏菌的DNA為模板，以如SEQIDNO. 7-SEQIDNO. 8所示 的引物克隆丙醛脫氫酶基因PduP; 2) 將步驟1)所得的3-羥基丙酰輔酶A脫水酶基因pcsll和丙醛脫氫酶基因pduP連 接到質(zhì)粒pETDuet-1上，獲得重組質(zhì)粒pETDuet-1-pcsII-pduP; 3) 將步驟1)所得的甘油脫水酶基因dhaB123和甘油脫水酶再激活酶基因gdrAB插入 到大腸桿菌的丙酸調(diào)節(jié)子基因PrpR座位上，得到宿主重組菌； 4) 將步驟2)所得的重組質(zhì)粒pETDuet-1-pcsII-pduP導(dǎo)入到步驟3)所得的宿主重組 菌中，獲得重組菌。8. 權(quán)利要求1或2所述重組菌在發(fā)酵生產(chǎn)丙烯酸中的應(yīng)用。9. 一種利用權(quán)利要求1或2所述重組菌發(fā)酵生產(chǎn)丙烯酸的方法，其特征在于，步驟如 下： 1) 活化權(quán)利要求1或2所述的重組菌，獲得活化重組菌； 2) 將步驟1)所得的活化重組菌接種到含有氨芐青霉素的M9液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培 養(yǎng)。10.權(quán)利要求9所述方法，其特征在于，步驟2)所述發(fā)酵培養(yǎng)，是按1 %的接種量接種， 在37°C，180rpm的條件下培養(yǎng)至OD6。。達(dá)到I. 0時(shí)，加入異丙基硫代半乳糖苷誘導(dǎo)和維生素 B12，每隔12h添加一次異丙基硫代半乳糖苷和抗生素IPTG，異丙基硫代半乳糖苷誘導(dǎo)后48h 終止發(fā)酵。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種利用甘油生產(chǎn)丙烯酸的重組菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明所提供的重組菌是過(guò)表達(dá)甘油脫水酶基因，甘油脫水酶再激活酶基因，3-羥基丙酰輔酶A脫水酶基因和丙醛脫氫酶基因。本發(fā)明的重組菌中構(gòu)建了以甘油為原料，從頭合成丙烯酸的代謝途徑。同時(shí)，本發(fā)明還提供了該重組菌的構(gòu)建方法以及應(yīng)用方法。本發(fā)明以E.coli宿主菌，實(shí)現(xiàn)了以甘油為底物，在大腸桿菌這種模式菌株中首次合成得到丙烯酸，為丙烯酸的生產(chǎn)提供了新的技術(shù)方法。
【IPC分類(lèi)】C12N15/70, C12R1/19, C12N15/74, C12N1/21, C12R1/01
【公開(kāi)號(hào)】CN105176898
【申請(qǐng)?zhí)枴?br>【發(fā)明人】咸漠, 童文華, 趙廣, 劉會(huì)洲
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所
【公開(kāi)日】2015年12月23日
【申請(qǐng)日】2015年8月19日