技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及治療自身免疫性、呼吸性和/或炎性疾病和病狀的方法，包括對有需要的患者施用雙重PI3K δ/γ抑制劑和至少一種皮質(zhì)類固醇。在優(yōu)選的實施方案中，所述方法涉及銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、特發(fā)性肺纖維化(IPF)、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)及其任意組合的治療。

背景技術(shù)：

諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、特發(fā)性肺纖維化(IPF)、銀屑病、全身性紅斑狼瘡(SLE)、COPD和哮喘的自身免疫性、呼吸性和炎性疾病是分別與失調(diào)或過度活躍的免疫系統(tǒng)相關(guān)的慢性且通常是進展性的疾病。這些疾病的原因和驅(qū)動因素仍不明確。它們通常特征在于先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的多種炎性細(xì)胞之間有復(fù)雜的細(xì)胞相互作用。因此，這些病狀的疾病病因的異質(zhì)性和復(fù)雜性使得尋找新的適當(dāng)細(xì)胞靶標(biāo)具有挑戰(zhàn)性，因為不清楚在細(xì)胞浸潤物中何為病理學(xué)的主要參與者與何為“無辜的”旁觀者。因此，靶向激活多種免疫細(xì)胞所需的信號傳導(dǎo)分子可能會是更有可能成功地對治這些慢性的免疫細(xì)胞介導(dǎo)的疾病的途徑。

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種進展性的全身性自身免疫性疾病，其特征在于多個關(guān)節(jié)的慢性炎癥，具有相關(guān)聯(lián)的全身性癥狀，如疲勞。這種炎癥引起關(guān)節(jié)疼痛、僵硬和腫脹，導(dǎo)致由于骨和軟骨的破壞而喪失關(guān)節(jié)功能，往往造成進展性殘疾。RA患者產(chǎn)生其它全身性并發(fā)癥的可能性也增大，如骨質(zhì)疏松癥、貧血及影響肺和皮膚的其它并發(fā)癥。

RA是自身免疫性疾病的最常見形式之一，影響全世界超過2100萬人口。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎分布全世界，估計的患病率為1至2％。患病率隨著年齡而增加，在55歲以上的婦女中接近5％。在美國年平均發(fā)病率為每年中每100,000人中有約70人。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率和患病率在女性中比在男性中均高兩至三倍。雖然類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎可能存在于任何年齡，但患者最常見的是在第三到第六個十年期間首先受到影響。已知RA影響生活質(zhì)量，不僅引起身體問題，而且還對生活質(zhì)量產(chǎn)生顯著的負(fù)面影響。RA還影響平均預(yù)期壽命，將其縮短三至七年。10年后，能正常進行日常工作或活動的RA患者不到50％。還報道由于住院、醫(yī)護成本和生產(chǎn)力損失原因，RA對國家經(jīng)濟造成經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。RA是每年在英國超過九百萬初級護理醫(yī)師會診的病因，這代表了8.33億英鎊的生產(chǎn)損失。還據(jù)估計在2000年其花費的英國經(jīng)濟成本有55億英鎊。在美國，專家們估計RA對商業(yè)和工業(yè)花費的成本比任何其它疾病都多，每年有500,000例住院治療，并且據(jù)估計關(guān)節(jié)炎(作為整體)的疾病經(jīng)濟負(fù)擔(dān)為1,280億美元。

有多種治療可供用于控制RA。一些涉及RA的體征和癥狀，其它的旨在改變疾病的過程并積極地影響RA的全身影響，如疲勞和貧血。

當(dāng)前的治療包括例如以下的使用：

·生物制劑：這些是在被稱為細(xì)胞因子的免疫系統(tǒng)中靶向特異性細(xì)胞表面標(biāo)志物或信使物質(zhì)的基因工程藥物，所述細(xì)胞因子由細(xì)胞產(chǎn)生，以便在炎性反應(yīng)期間調(diào)節(jié)其它細(xì)胞。生物制劑靶向的特異性細(xì)胞因子的實例有腫瘤壞死因子α(TNFα)。

·傳統(tǒng)的疾病緩解性抗風(fēng)濕藥物(DMARD)：這些是非特異性免疫抑制藥物，其旨在對治RA的體征和癥狀以及減緩進展性關(guān)節(jié)破壞。這些治療往往彼此組合或與生物藥劑組合使用以改善患者反應(yīng)

·糖皮質(zhì)激素(皮質(zhì)類固醇)：這些是與皮質(zhì)醇(體內(nèi)天然產(chǎn)生的類固醇)相關(guān)的抗炎藥物，其通過對抗炎癥而起作用。然而，糖皮質(zhì)激素有副作用，包括高血糖癥、骨質(zhì)疏松癥、高血壓、體重增加、白內(nèi)障、睡眠問題、肌肉損失及易發(fā)感染，這些限制了它們的使用

·非類固醇抗炎藥物(NSAID)：這些控制RA的體征和癥狀，如減輕疼痛、腫脹和炎癥，但不改變疾病的進程或減緩關(guān)節(jié)破壞的進展

還有許多靶向免疫系統(tǒng)的其它組分的RA療法。這些包括靶向諸如白介素-6(IL-6)的替代細(xì)胞因子的生物治療，其有助于減輕關(guān)節(jié)中和整個體內(nèi)的炎癥及RA的進展。

哮喘是兒童當(dāng)中最常見的慢性疾病，并且也影響到數(shù)百萬成年人。全世界大約2.35億人患有這種疾病。哮喘的病因還不是很清楚，但有效的藥物可供治療哮喘，從而在很大程度上避免了其可能帶來的生命減少、殘疾和死亡。遺憾的是，對于許多患有哮喘的人、特別是窮人來說，這些有效的治療太過昂貴或者根本無法得到。

慢性阻塞性肺病(COPD)是高發(fā)病狀并且是全世界發(fā)病率和死亡率的主要原因。隨著疾病的發(fā)展，COPD患者可能會變得易于頻繁惡化，導(dǎo)致患者焦慮、健康狀況惡化、肺功能衰退并且死亡率增加。使呼吸功能惡化的這些發(fā)作導(dǎo)致醫(yī)療護理利用、住院和費用的增加。更糟的是，頻繁惡化與肺功能的較快衰退相關(guān)聯(lián)，從而縮短了預(yù)期壽命。

根據(jù)慢性阻塞性肺病的全球倡議(GOLD)的建議，COPD的一線療法有長效β激動劑、長效毒蕈堿拮抗劑和吸入皮質(zhì)類固醇。然而，這些藥物減少與疾病相關(guān)聯(lián)的癥狀及惡化而不是靶向其分子和細(xì)胞基礎(chǔ)。因此，仍需進一步改進COPD治療。

磷酸肌醇-3激酶(PI3K)屬于一類細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)激酶，其使磷酸肌醇脂質(zhì)(PI)的肌醇環(huán)的3位羥基磷酸化，產(chǎn)生脂質(zhì)第二信使。雖然_α和β同種型在其分布中是普遍存在的，但δ和γ的表達限于循環(huán)造血細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。與PI3K-α或β不同，缺少γ或δ的表達的小鼠不顯示任何不利的表型，表明靶向這些特異性同種型將不會導(dǎo)致明顯的毒性。

近來，已提出將磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)途徑的靶向抑制劑作為免疫調(diào)節(jié)劑。這種關(guān)注源于這樣的事實，即PI3K途徑主要通過產(chǎn)生(3，4，5)-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)(一種膜結(jié)合的第二信使)在免疫細(xì)胞信號傳導(dǎo)中發(fā)揮多種功能。PIP3將蛋白質(zhì)募集到脂質(zhì)雙層的細(xì)胞質(zhì)側(cè)，包括蛋白激酶和GTP酶，啟動在免疫細(xì)胞粘附、遷移和細(xì)胞-細(xì)胞訊息傳遞的調(diào)節(jié)中重要的下游信號傳導(dǎo)級聯(lián)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。

四種I類PI3K同種型在其組織分布上差異顯著。PI3Kα和PI3Kβ在受體酪氨酸激酶(RTK)的下游是普遍存在且激活的，而PI3Kδ和PI3Kγ主要限于造血及內(nèi)皮細(xì)胞，并且分別在RTK和G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)的下游激活。小鼠遺傳研究已表明，PI3Kα和PI3Kβ是正常發(fā)育所必需的，而PI3Kδ和/或PI3Kγ的損失產(chǎn)生具有選擇性免疫缺陷的存活后代

PI3Kδ和PI3Kγ的表達模式和功能已經(jīng)在開發(fā)PI3K δ/γ抑制劑作為用于許多疾病(包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、過敏、哮喘、慢性阻塞性肺病和多發(fā)性硬化)的藥劑方面引起了很大的關(guān)注(Hirsch等人，Pharmacol.Ther.，118，192-205 2008；Marone等人，Biochim.Biophys.Acta.，1784，159-185.2008；Rommel等人，Nat.Rev.Immunol.，7，191-201.，2007；Ruckle等人，Nat.Rev.Drug Discov.，5，903-918.2006)。采用藥理學(xué)和遺傳方法的研究已顯示這兩種同種型往往表現(xiàn)出彼此的協(xié)同相互作用(Konrad等人，J.Biol.Chem.，283，33296-33303，2008；Laffargue等人，Immunity，16，441-451，2002)。

在肥大細(xì)胞中，例如，PI3Kδ對于響應(yīng)于Fc-受體的IgE交聯(lián)而脫粒是必要的(Ali等人，J.Immunol.，180，2538-2544.2008)，但PI3Kγ在擴增響應(yīng)中起重要的作用(Laffargue等人，Immunity，16，441-4512002)。類似的作用已見于其它的細(xì)胞功能，包括淋巴細(xì)胞歸巢和嗜中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)，其中PI3Kγ起關(guān)鍵作用，并且PI3Kδ擴增每一過程。PI3Kδ和PI3Kγ的非冗余但相關(guān)的作用使得難以確定在特定的炎性病癥中最佳地靶向兩種同種型(單獨或組合)中的哪一種。使用缺少PI3Kδ和/或PI3Kγ或表達PI3Kδ和PI3Kγ的激酶死亡變體的小鼠進行的研究已經(jīng)成為了解它們的作用的有價值的工具。例如，PI3Kδ敲除小鼠表現(xiàn)出嗜中性粒細(xì)胞趨化性降低、抗體產(chǎn)生減少(T細(xì)胞依賴性和非依賴性兩者)(Jou等人，Mol.Cell.Biol.，22，8580-8591.2002)且成熟B細(xì)胞的數(shù)目較低(Clayton等人，J.Exp.Med.，196，753-763.2002；Jou等人，Mol.Cell.Biol.，22，8580-8591.2002)以及它們響應(yīng)于抗-IgM的增殖減少(Jou等人，Mol.Cell.Biol.，22，8580-8591.2002)。這種表型在PI3Kδ激酶-死亡變體中被復(fù)制，且在用PI3Kδ選擇性抑制劑的情況下伴隨肥大細(xì)胞的數(shù)量減少和增殖以及過敏反應(yīng)的減弱。PI3Kγ敲除含有較大數(shù)量但較低響應(yīng)性的嗜中性粒細(xì)胞、較小數(shù)量且較低響應(yīng)性的巨噬細(xì)胞，并且樹突細(xì)胞顯示出肥大細(xì)胞脫粒減少((Laffargue等人，Immunity，16，441-4512002)、CD4+與CD8+T細(xì)胞比率較高)、胸腺細(xì)胞凋亡增加、CXCR3對激活的T細(xì)胞誘導(dǎo)減弱以及心肌收縮力減小。對心臟組織的這后一種作用是長期給予患者PI3Kγ抑制劑所擔(dān)憂的事情。然而，當(dāng)PI3Kγ激酶-死亡變體(其更好地模擬激酶的抑制而不是蛋白質(zhì)的損失)顯示類似的免疫細(xì)胞表型時，這種擔(dān)憂大為減輕，但重要的是沒有心臟缺陷。心臟作用后來被顯示是由于支架作用而非PI3Kγ的催化活性所致。雙重PI3Kδ/PI3Kγ敲除是可行的，但在T細(xì)胞發(fā)育及胸腺細(xì)胞存活方面表現(xiàn)出嚴(yán)重缺陷。PI3Kγ敲除/PI3Kδ激酶-死亡組合產(chǎn)生類似的表型，表明至少在免疫系統(tǒng)內(nèi)，PI3Kδ的作用有可能僅是催化性的。解釋使用敲除和激酶-死亡小鼠的研究可能是具有挑戰(zhàn)性的，因為這些模型僅提供免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)圖片，缺乏時間和劑量控制，并且不能使人完全理解動態(tài)免疫應(yīng)答將如何對可逆抑制做出反應(yīng)。具有不同型態(tài)的選擇性抑制劑(PI3Kδ、PI3Kγ和PI3K δ/γ)對于白細(xì)胞信號傳導(dǎo)的研究是必要的，以便評估每種PI3K對免疫細(xì)胞激活的相對貢獻。(參見Olusegon等人，Chemistry&Biology，1，123-134，包括其中引用的參考文獻)。

PI3Kδ/γ的雙重抑制強烈地涉及氣道及其它自身免疫性疾病的過敏及非過敏性炎癥作為干預(yù)策略。PI3K-δ和γ參與哮喘和COPD所潛在的各種細(xì)胞過程的科學(xué)證據(jù)來源于抑制劑研究及基因靶向方法。另外，在一些COPD患者中對諸如皮質(zhì)類固醇的常規(guī)療法的抗性已被歸因于PI3K δ/γ途徑的上調(diào)。因此，PI3K δ/γ信號傳導(dǎo)的破壞提供了一種旨在對抗免疫炎性反應(yīng)的新穎策略。由于PI3K δ和γ在介導(dǎo)諸如白細(xì)胞遷移和激活以及肥大細(xì)胞脫粒的炎性細(xì)胞功能中發(fā)揮關(guān)鍵性作用，因此阻斷這些同種型同樣也可以是治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的有效策略。鑒于這些同種型在免疫監(jiān)控中確立的關(guān)鍵性，預(yù)期特異性地靶向δ和γ同種型的抑制劑將削弱在氣道炎癥和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中所遇到的免疫應(yīng)答的進展。鑒于這些同種型在免疫監(jiān)控中確立的關(guān)鍵性，預(yù)期特異性地靶向δ和γ同種型的抑制劑將削弱在氣道炎癥和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中所遇到的免疫應(yīng)答的進展(William等人，Chemistry&Biology，17：123-134，2010；和Thompson等人，Chemistry&Biology，17：101-102，2010)。Pixu Liu等人已給出了有關(guān)PI3K及相關(guān)蛋白激酶途徑的綜述和研究(Nature Reviews Drug Discovery，2009，8，627-644)；Nathan T.等人，Mol Cancer Ther.，2009；8(1)，2009年1月)；Romina Marone等人，Biochimica et Biophysica Acta.，1784(2008)159-185)和B.Markman等人，Annals of Oncology，Advance Access，2009年8月出版)。William等人，Chemistry&Biology，17：123-134，2010和Timothy等人，J Med.Chem.，2012年8月27日網(wǎng)絡(luò)發(fā)布已給出了有關(guān)PI3K δ和γ的作用的類似綜述和研究。所有這些文獻的公開內(nèi)容出于所有目的以全文引用的方式并入本文。

已報道了作為Pi3K δ/γ的雙重抑制劑的近期開發(fā)的化合物，如IPI-145和CAL130。IPI-145正處于對癌癥以及對哮喘的臨床研究當(dāng)中。目前還沒有針對任何臨床目的的CAL-130研究的報道。

本文另外參考以下文獻：2010年11月3日提交的第PCT/IB2010/002804號和2012年5月4日提交的第PCT/US2012/36594號國際專利申請；2010年11月3日提交的第12/938,609號和2012年5月4日提交的第13/464,587號美國專利申請，以及如第WO 2009/088986、WO 2009/088990、WO 2011/008302和WO 2012/097000號國際公布中公開的化合物，上述文獻中的每一者的內(nèi)容出于所有目的以全文引用的方式并入本文。

皮質(zhì)類固醇是有效的抗炎劑，能夠減少炎性細(xì)胞的數(shù)目、活性和移動。皮質(zhì)類固醇通常用于治療廣泛的慢性和急性炎性病狀，包括哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、過敏性鼻炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病和自身免疫性疾病。皮質(zhì)類固醇通過糖皮質(zhì)激素受體(GR)介導(dǎo)其作用。皮質(zhì)類固醇與GR的結(jié)合誘導(dǎo)其核易位，這繼而經(jīng)由DNA結(jié)合依賴性(例如反式激活)和非依賴性(例如反式表達)機制影響許多下游途徑。

用于治療肺中的慢性炎性病狀(如哮喘和COPD)的皮質(zhì)類固醇目前是通過吸入施用的。使用吸入性皮質(zhì)類固醇(ICS)的優(yōu)點之一是有可能將藥物直接遞送到作用部位，從而限制全身性副作用，并導(dǎo)致更快的臨床反應(yīng)和更高的治療比率。

雖然ICS治療可提供重要的有益效果，特別是治療哮喘，但重要的是使ICS全身性暴露減到最少，這導(dǎo)致可能與長期施用相關(guān)聯(lián)的不利副作用的出現(xiàn)并且變得嚴(yán)重。此外，臨床實踐中目前可得到的ICS的有限作用持續(xù)時間帶來的是對疾病的未達最佳標(biāo)準(zhǔn)的處置。雖然吸入器技術(shù)是靶向肺部的重點，但調(diào)節(jié)皮質(zhì)類固醇分子支架上的取代基對于優(yōu)化藥代動力學(xué)和藥效動力學(xué)性質(zhì)是重要的，以便降低口服生物利用度、將藥理活性僅限制在肺中(前藥和軟藥)并提高全身清除率。此外，肺中長久持續(xù)的ICS活性是高度期望的，因為每日一次施用ICS將使得能降低施用的頻率，且因此基本上改善患者的依從性，其結(jié)果是改善疾病處置和控制。總之，醫(yī)學(xué)上迫切需要開發(fā)具有改善的藥代動力學(xué)和藥效動力學(xué)特性的ICS。

糖皮質(zhì)激素異噁唑烷衍生物例如描述在WO 2006/005611、GB 1,578,446和“Synthesis and topical anti-inflammatory activity of some steroidal[16α，17α-d]isoxazolidines”，M.J.Green等人，J.Med.Chem.，25，1492-1495，1982中，上述文獻每一者的內(nèi)容以全文引用的方式并入本文。WO 2011/029547和WO 2012/123482中也描述了另外的糖皮質(zhì)激素異噁唑烷衍生物。

盡管目前可用干預(yù)療法，但諸如RA、銀屑病的自身免疫性病癥及諸如哮喘和COPD的呼吸性病癥仍然是醫(yī)療需求未得到顯著滿足的疾病類型。

因此，本發(fā)明的目的是提供用于治療呼吸性和/或炎性疾病和病狀的具有增強活性的方法和藥物組合物。所述藥物組合物使得能用較少量的活性化合物治療自身免疫性、呼吸性和炎性疾病和病狀，和/或使得能以更有效的方式治療自身免疫性、呼吸性和炎性疾病和病狀，從而最大限度地減少或避免可能存在的通常與以高劑量活性化合物進行和/或持續(xù)較長時間段的任何種類的治療相關(guān)的副作用。

如本文所述，通過將影響兩種不同但互補的途徑的藥物組合，以便在與單獨的任一種抑制劑相比較低的劑量下有效，由此可實現(xiàn)所述目的。因此，本發(fā)明提供組合兩種不同的信號傳導(dǎo)途徑的有效方法，所述兩種不同的信號傳導(dǎo)途徑當(dāng)組合在一起時具有顯著的治療潛力。特別地，所述組合在降低皮質(zhì)類固醇和雙重PI3K δ-γ抑制劑的任一者或兩者的所需治療有效濃度方面具有治療有益效果。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及包含PI3K δ及γ雙重抑制劑和至少一種皮質(zhì)類固醇的藥物組合物，以及這種藥物組合物用于治療自身免疫性、呼吸性和炎性疾病和病狀的用途。

一個實施方案是包含PI3K δ及γ雙重抑制劑和至少一種皮質(zhì)類固醇的藥物組合物。

另一實施方案是治療罹患自身免疫性、呼吸性和/或炎性疾病或病狀的患者的方法，包括對患者施用PI3K δ及γ雙重抑制劑和至少一種皮質(zhì)類固醇。在一個優(yōu)選的實施方案中，在單一藥物組合物中一起施用PI3K δ及γ雙重抑制劑和至少一種皮質(zhì)類固醇。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述疾病或病狀是特發(fā)性肺纖維化(IPF)、哮喘、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)或COPD。

又一實施方案是PI3K δ及γ雙重抑制劑和至少一種皮質(zhì)類固醇的組合用于在患者中治療自身免疫性、呼吸性和/或炎性疾病或病狀的用途，如用于治療哮喘、RA或COPD。

在優(yōu)選的實施方案中，PI3K δ及γ雙重抑制劑是(下示的)式A的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。

合適的皮質(zhì)類固醇包括但不限于地塞米松、倍他米松、潑尼松龍、甲基潑尼松龍、潑尼松、氫化可的松、氟替卡松、曲安西龍、可的松、萘非可特、地夫可特、醋酸鹵潑尼松、布地奈德、二丙酸倍氯米松、氫化可的松、曲安奈德、氟西奈德(fluocinolone acetonide)、氟輕松(fluocinonide)、特戊酸氯可托龍、醋丙甲潑尼龍、棕櫚酸地塞米松、替潑尼旦、醋丙氫化可的松、潑尼卡酯、二丙酸阿氯米松、鹵米松、磺庚甲潑尼龍、糠酸莫米松、利美索龍、法呢酸潑尼松龍、環(huán)索奈德、丙酸地潑羅酮、丙酸氟替卡松、丙酸鹵倍他索、依碳酸氯替潑諾、丁酸丙酸倍他米松、氟尼縮松、潑尼松、地塞米松磷酸鈉、曲安西龍、17-戊酸倍他米松、倍他米松、二丙酸倍他米松、醋酸氫化可的松、氫化可的松琥珀酸鈉、潑尼松龍磷酸鈉、丙丁酸氫化可的松及其藥學(xué)上可接受的鹽。

在優(yōu)選的實施方案中，皮質(zhì)類固醇選自地塞米松、倍他米松、潑尼松龍、甲基潑尼松龍、潑尼松、氫化可的松、氟替卡松、曲安西龍、布地奈德、可的松及任意前述物質(zhì)的任意組合。

一個實施方案是包含式A的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽和皮質(zhì)類固醇的藥物組合物。在一個優(yōu)選的實施方案中，藥物組合物包含治療有效量的式A的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽和治療有效量的皮質(zhì)類固醇(例如，用于治療哮喘、RA或COPD)。

另一實施方案是治療諸如哮喘、RA或COPD的自身免疫性、呼吸性和/或炎性疾病或病狀的方法，包括對有需要的患者施用式A的化合物：

或其藥學(xué)上可接受的鹽和皮質(zhì)類固醇。在一個優(yōu)選的實施方案中，在單一藥物組合物中一起施用式A的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽和至少一種皮質(zhì)類固醇。在一個實施方案中，所述疾病或病狀是哮喘。在另一實施方案中，所述疾病或病狀是RA。在又一實施方案中，所述疾病或病狀是COPD。

又一實施方案是治療罹患諸如哮喘、RA或COPD的自身免疫性、呼吸性和/或炎性疾病或病狀的患者的方法，包括對患者施用式A的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽和選自以下的皮質(zhì)類固醇：地塞米松、倍他米松、潑尼松龍、甲基潑尼松龍、潑尼松、氫化可的松、氟替卡松、曲安西龍、布地奈德或可的松及其任意組合。在一個優(yōu)選的實施方案中，在單一藥物組合物中一起施用式A的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽和至少一種皮質(zhì)類固醇。

附圖說明

圖1A是柱狀圖，描述根據(jù)實施例1中的程序在TGF-β1處理的A549細(xì)胞中化合物A對地塞米松(Dex)的IC₅₀的影響。

圖1B是柱狀圖，描述根據(jù)實施例2中的程序在H₂O₂處理的U937細(xì)胞中化合物A對地塞米松(Dex)的IC₅₀對IL-8濃度的影響。

圖2A是柱狀圖，描述根據(jù)實施例3中的程序在Balb/c小鼠的BALF中化合物A對香煙煙霧誘導(dǎo)的免疫細(xì)胞浸潤的影響。

圖2B是柱狀圖，描述根據(jù)實施例3中的程序在BALF中化合物A對細(xì)胞因子的影響。

圖3A是柱狀圖，描述根據(jù)實施例4中的程序在Balb/c小鼠的BALF中化合物A和氟替卡松對香煙煙霧誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞浸潤的影響。

圖3B是柱狀圖，描述根據(jù)實施例4中的程序在Balb/c小鼠的BALF中化合物A和氟替卡松的組合對香煙煙霧誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞浸潤的影響。

圖4是柱狀圖，描述來自根據(jù)實施例6中的程序在化合物A(0.01nM-100μM)或地塞米松的存在下用CSE 5％刺激的健康者和COPD患者的嗜中性粒細(xì)胞的IL-8濃度依賴性抑制曲線。

圖5是柱狀圖，描述根據(jù)實施例6中的程序通過將固定濃度的地塞米松1nM添加到0.1nM、1nM和10nM濃度的化合物A中在來自COPD患者的嗜中性粒細(xì)胞中的CSE誘導(dǎo)的IL-8釋放的抑制。

圖6是柱狀圖，描述根據(jù)實施例7中的程序單獨或在10nM或100nM的化合物A存在下用CSE 5％刺激的相對MKP1 mRNA表達。

圖7是柱狀圖，描述根據(jù)實施例7中的程序單獨或在10nM或100nM的化合物A存在下用CSE 5％刺激的相對PI3Kγ mRNA表達。

圖8是柱狀圖，描述在單獨的CSE 5％、CSE5％和10nM的化合物A或單獨10nM的化合物A存在下的PIP3產(chǎn)生。

具體實施方式

在一方面，如本文任意實施方案中所述將雙重PI3K δ及γ抑制劑(如式A的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽)與皮質(zhì)類固醇組合的方法顯示出的活性(即，協(xié)同活性)顯著高于根據(jù)單獨的雙重PI3K δ及γ抑制劑或皮質(zhì)類固醇各自的單獨活性所預(yù)期的活性。

在另一方面，將雙重PI3K δ及γ抑制劑(如式A的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽)與皮質(zhì)類固醇組合的方法即使在單獨的皮質(zhì)類固醇作為單一藥劑不敏感時也顯示出活性。

因此，本文所述的方法使得能用較少量的活性化合物治療自身免疫性、呼吸性和炎性疾病和病狀，和/或使得能以更有效的方式治療自身免疫性、呼吸性和炎性疾病和病狀達較長的時間段。

另一實施方案是包含雙重PI3K δ及γ抑制劑(如式A的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽)與皮質(zhì)類固醇的藥物組合物，用于治療自身免疫性、呼吸性和/或炎性疾病或病狀。

又一實施方案是治療自身免疫性、呼吸性和/或炎性疾病或病狀的方法，包括對有需要的患者施用治療有效量的根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物。

又一實施方案是根據(jù)本文所述的任意實施方案的藥物組合物用于制備藥物的用途，所述藥物適用于治療自身免疫性、呼吸性和/或炎性疾病或病狀。

在本文所述的藥物組合物中，PI3K δ及γ雙重抑制劑(如式A的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽)可呈選自溶劑合物、水合物和/或與藥理學(xué)上可接受的酸或堿的鹽的形式。

在本文所述的藥物組合物中，皮質(zhì)類固醇可呈選自溶劑合物、水合物或與藥理學(xué)上可接受的酸或堿的鹽的形式。

又一實施方案是治療與免疫系統(tǒng)有關(guān)的疾病(例如，自身免疫性疾病)、涉及炎癥的疾病或病癥(例如，哮喘、慢性阻塞性肺病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、腎小球腎炎、神經(jīng)炎性疾病、多發(fā)性硬化、葡萄膜炎和免疫系統(tǒng)的病癥)、癌癥或其它增殖性疾病、肝臟疾病或病癥或腎臟疾病或病癥的方法。所述方法包括施用有效量的一種或多種本發(fā)明的組合物。

可通過本文所述的方法和組合物治療的免疫病癥的實例包括但不限于銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、血管炎、炎性腸病、皮炎、骨關(guān)節(jié)炎、哮喘、炎性肌肉疾病、過敏性鼻炎、陰道炎、間質(zhì)性膀胱炎、硬皮病、骨質(zhì)疏松癥、濕疹、同種異體或異種移植(器官、骨髓、干細(xì)胞及其它細(xì)胞和組織)移植物排斥、移植物抗宿主病、紅斑狼瘡、炎性疾病、I型糖尿病、肺纖維化、皮肌炎、舍格倫綜合征(Sjogren′s syndrome)、甲狀腺炎(例如，橋本氏(Hashimoto′s)和自身免疫性甲狀腺炎)、重癥肌無力、自身免疫性溶血性貧血、多發(fā)性硬化、囊性纖維化、特發(fā)性肺纖維化(IPF)、慢性復(fù)發(fā)性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、過敏性結(jié)膜炎和特應(yīng)性皮炎。

如本文所述的藥學(xué)上可接受的鹽包括來源于諸如Li、Na、K、Ca、Mg、Fe、Cu、Zn和Mn的無機堿的鹽；諸如N，N′-二乙?；叶贰⑵咸前?、三乙胺、膽堿、氫氧化物、二環(huán)己胺、二甲雙胍、芐胺、三烷基胺和硫胺的有機堿的鹽；諸如烷基苯胺、甘氨醇(glycinol)和苯基甘氨醇的手性堿的鹽；諸如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、正亮氨酸、酪氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、羥基脯氨酸、組氨酸、鳥氨酸、賴氨酸、精氨酸和絲氨酸的天然氨基酸的鹽；本發(fā)明的化合物與諸如MeI(甲基碘)和(Me)₂5O₄的烷基鹵化物、硫酸烷基酯的季銨鹽；諸如D-異構(gòu)體或取代的氨基酸的非天然氨基酸的鹽；胍的鹽；和取代的胍的鹽，其中取代基選自硝基、氨基、烷基、烯基、炔基、銨或取代的銨鹽和鋁鹽。適當(dāng)情況下鹽可包括酸加成鹽，其為硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、高氯酸鹽、硼酸鹽、氫鹵化物、醋酸鹽、酒石酸鹽、馬來酸鹽、檸檬酸鹽、富馬酸鹽、琥珀酸鹽、棕櫚酸鹽、甲磺酸鹽、苯甲酸鹽、水楊酸鹽、苯磺酸鹽、抗壞血酸鹽、甘油磷酸鹽和酮戊二酸鹽。

當(dāng)本文中使用范圍時，旨在包括其中的范圍和具體實施方案的所有組合及子組合。當(dāng)提到數(shù)字或數(shù)值范圍時，術(shù)語“約”意指所提到的數(shù)字或數(shù)值范圍是實驗可變性以內(nèi)(或統(tǒng)計實驗誤差以內(nèi))的近似值，因此所述數(shù)字或數(shù)值范圍可例如在規(guī)定的數(shù)字或數(shù)值范圍的1％與15％之間變化。術(shù)語“包含”(comprising/comprise/comprises)(及相關(guān)術(shù)語如“具有”或“包括”)包括“由所述特征組成”或“基本上由所述特征組成”的那些實施方案，例如物質(zhì)、組合物、方法或過程等的任意組合的實施方案。

以下縮寫和術(shù)語在通篇中具有指定的含義：PI3-K＝磷酸肌醇3-激酶；PI＝磷脂酰肌醇。

除另指出外，本文所用的縮寫具有其在化學(xué)和生物領(lǐng)域內(nèi)的常規(guī)含義。

術(shù)語“有效量”或“治療有效量”是指本文所述化合物的量足以實現(xiàn)預(yù)期的應(yīng)用，包括但不限于如下定義的疾病治療。治療有效量可根據(jù)預(yù)期的應(yīng)用(體外或體內(nèi))或所治療的受試者和疾病狀況(例如受試者的體重和年齡)、疾病狀況的嚴(yán)重程度、施用的方式等情況而變化，這可很容易地由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員予以確定。該術(shù)語也適用于將在靶細(xì)胞中誘導(dǎo)特定反應(yīng)(例如血小板粘附和/或細(xì)胞遷移的減少)的劑量。具體劑量將根據(jù)所選擇的特定化合物、遵循的給藥方案、是否與其它化合物組合施用、施用的時機、施用針對的組織以及攜載其的物理遞送系統(tǒng)情況而變化。

如本文所用，術(shù)語“治療”(treatment/treating)是指用于獲得有益或所需結(jié)果(包括但不限于治療有益效果和/或預(yù)防有益效果)的方法。所謂治療有益效果意指根除或減輕所治療的潛在病癥。另外，與潛在病癥相關(guān)聯(lián)的一種或多種生理癥狀得到根除或減輕，使得在患者中觀察到改善，這樣即實現(xiàn)了治療有益效果，盡管患者可能仍在遭受潛在病癥之苦。對于預(yù)防有益效果而言，可對有發(fā)生特定疾病風(fēng)險的患者或?qū)蟾嬗屑膊〉囊环N或多種生理癥狀的患者施用組合物，即使可能尚未做出此疾病的診斷。

術(shù)語“治療效果”如在本文中所用涵蓋如上所述的治療有益效果和/或預(yù)防有益效果。預(yù)防效果包括延遲或消除疾病或病狀的出現(xiàn)、延遲或消除疾病或病狀的癥狀發(fā)作、減緩、停止或逆轉(zhuǎn)疾病或病狀的進展或其任意組合。

術(shù)語“受試者”或“患者”是指諸如哺乳動物的動物，例如人。本文所述的方法可適用于人的治療和獸醫(yī)應(yīng)用。在一些實施方案中，患者是哺乳動物，且在一些實施方案中，患者是人。對于獸醫(yī)目的，術(shù)語“受試者”和“患者”包括但不限于農(nóng)場動物，包括牛、綿羊、豬、馬和山羊；伴侶動物，如狗和貓；珍奇動物和/或動物園動物；實驗室動物，包括小鼠、大鼠、兔、豚鼠和倉鼠；及家禽，如雞、火雞、鴨和鵝。

術(shù)語“選擇性抑制”或“選擇性地抑制”在應(yīng)用于生物活性劑時是指與脫靶信號傳導(dǎo)活性相比，藥劑經(jīng)由與靶標(biāo)直接或間接相互作用選擇性地降低靶信號傳導(dǎo)活性的能力。

如本文所用，術(shù)語“雙重PI3-激酶德爾塔(δ)及伽瑪(γ)抑制劑”通常是指抑制PI3-激酶δ和γ同功酶兩者的活性比抑制PI3K家族的其它同功酶的活性更有效的化合物。因此PI3-激酶δ及γ雙重抑制劑化合物比諸如CAL-130、渥曼青霉素和LY294002(它們是“非選擇性PI3K抑制劑”)的常規(guī)PI3K抑制劑對PI3-激酶δ和γ更具選擇性。“雙重PI3-激酶德爾塔(δ)及伽瑪(γ)抑制劑”的實例包括但不限于諸如IPI-145的化合物和以下文獻中公開的化合物：2010年11月3日提交的第PCT/IB2010/002804號和2012年5月4日提交的第PCT/US2012/36594號國際專利申請；2010年11月3日提交的第12/938,609號和2012年5月4日提交的第13/464,587號美國專利申請，以及第WO 2009/088986、WO 2009/088990、WO 2011/008302和WO 2012/097000號國際公布中公開的化合物，上述文獻每一者的內(nèi)容出于所有目的以全文引用的方式并入本文。

例如，雙重PI3-激酶δ及γ選擇性抑制劑可指相對于δ和γI型PI3-激酶顯示出50％抑制濃度(IC₅₀)的化合物，這比抑制劑相對于其它類型的PI3激酶(即，α和β)的IC₅₀低至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍。

PI3-激酶δ和γ的抑制可在各種病狀的治療中具有治療有益效果，例如治療以炎性反應(yīng)為特征的病狀，包括但不限于自身免疫性疾病、過敏性疾病和關(guān)節(jié)炎疾病。重要的是，抑制PI3-激酶δ和γ功能似乎不影響諸如存活力和生育力的生物功能。

如本文所用的“炎性反應(yīng)”特征在于發(fā)紅、發(fā)熱、腫脹和疼痛(即，發(fā)炎)且通常涉及組織損傷或破壞。炎性反應(yīng)通常是由組織的損傷或破壞引起的局部保護性反應(yīng)，其起到破壞、稀釋或隔開(隔離)損傷劑和受損組織的作用。炎性反應(yīng)顯著地與白細(xì)胞的流入和/或白細(xì)胞(例如嗜中性粒細(xì)胞)趨化性相關(guān)聯(lián)。炎性反應(yīng)可能起因于被病原生物體和病毒感染、心肌梗塞或中風(fēng)后諸如創(chuàng)傷或再灌注的非感染方式、對外源抗原的免疫應(yīng)答以及自身免疫性疾病?？山邮芨鶕?jù)本發(fā)明的方法及化合物治療的炎性反應(yīng)涵蓋與特異性防御系統(tǒng)的反應(yīng)相關(guān)聯(lián)的病狀以及與非特異性防御系統(tǒng)的反應(yīng)相關(guān)聯(lián)的病狀。

本發(fā)明的治療方法包括治療與炎性細(xì)胞激活相關(guān)聯(lián)的病狀的方法?！把仔约?xì)胞激活”是指通過刺激物(包括但不限于細(xì)胞因子、抗原或自身抗體)誘導(dǎo)增殖性細(xì)胞反應(yīng)、產(chǎn)生可溶性介體(包括但不限于細(xì)胞因子、氧自由基、酶、前列腺素或血管活性胺)或炎性細(xì)胞(包括但不限于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞(多形核白細(xì)胞，包括嗜中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞)肥大細(xì)胞、樹突細(xì)胞、朗格漢斯(Langerhans)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞)中的新的或增加數(shù)量的介體(包括但不限于主要組織相容性抗原或細(xì)胞粘附分子)的細(xì)胞表面表達。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解的是，這些細(xì)胞中的這些表型之一或組合的激活可有助于炎性病狀的引發(fā)、持續(xù)或惡化。

如本文所用的“自身免疫性疾病”是指其中組織損傷與體液或細(xì)胞介導(dǎo)的對身體的自身成分反應(yīng)相關(guān)聯(lián)的任意一組病癥。

如本文所用的“移植排斥”是指針對移植組織(包括器官或細(xì)胞(例如，骨髓)的免疫應(yīng)答，特征在于移植及周圍組織的功能喪失、疼痛、腫脹、白細(xì)胞增多和血小板減少)。

如本文所用的“過敏性疾病”是指起因于過敏的任何癥狀、組織損傷或組織功能的喪失。

如本文所用的“關(guān)節(jié)炎疾病”是指可歸因于多種病因的以關(guān)節(jié)的炎性病變?yōu)樘卣鞯娜魏渭膊　?/p>

如本文所用的“皮炎”是指皮膚的疾病大家族中的任一種，其特征在于可歸因于多種病因的皮膚的炎癥。

一個實施方案是包含雙重PI3K δ及γ抑制劑(如式A的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽)和至少一種皮質(zhì)類固醇及任選一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑的藥物組合物。

在一個實施方案中，藥物組合物包括治療有效量的雙重PI3K δ及γ抑制劑(如式A的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽)和至少一種皮質(zhì)類固醇及任選一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。藥物組合物可包括一種或多種本文所述的附加活性成分。

藥物載體和/或賦形劑可選自稀釋劑、填充劑、鹽、崩解劑、粘結(jié)劑、潤滑劑、助流劑、潤濕劑、控釋基質(zhì)、著色劑、調(diào)味劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑、增溶劑及其組合。

可單獨或與一種或多種其它活性劑組合施用本發(fā)明的藥物組合物。在需要時，可將主題化合物和其它藥劑混合成制劑或者可將兩種組分配制成分開的制劑，以單獨或同時組合使用它們。

可與一種或多種其它活性劑一起或按順序的方式施用雙重PI3Kδ及γ抑制劑和皮質(zhì)類固醇。在需要時，可共同施用主題化合物及其它藥劑，或者可按順序施用兩種組分以將它們作為組合使用。

可通過能夠?qū)⒒衔镞f送到作用部位的任何途徑施用本發(fā)明的化合物和藥物組合物，如口服、鼻內(nèi)、局部(例如，透皮)、十二指腸內(nèi)、胃腸外(包括靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、血管內(nèi)、腹膜內(nèi)或通過注射或輸注)、皮內(nèi)、通過乳房內(nèi)、鞘內(nèi)、眼內(nèi)、眼球后、肺內(nèi)(例如，霧化藥物)或皮下(包括用于長期釋放的儲庫施用，例如嵌在脾包膜、腦下或角膜中)、舌下、經(jīng)肛門、經(jīng)直腸、經(jīng)陰道、或通過外科植入(例如嵌在脾包膜、腦下或角膜中)。

可以固體、半固體、液體或氣體形式或者可以諸如凍干形式的干粉形式施用組合物?？梢员阌谶f送的形式包裝藥物組合物，包括例如固體劑型，如膠囊、小袋、扁囊、明膠、紙片、片劑、栓劑、團粒、丸劑、糖錠和錠劑。包裝的類型通常將取決于所需的施用途徑。也設(shè)想了可植入的持續(xù)釋放制劑，如透皮制劑。

可改變化合物的給藥頻率。例如，可按從每日兩次至每三周一次的頻率施用雙重PI3K δ及γ抑制劑?？砂磸拿咳諆纱沃撩咳芤淮蔚念l率施用皮質(zhì)類固醇。

待施用的化合物的量取決于所治療的哺乳動物、病癥或病狀的嚴(yán)重程度、施用的速率、化合物的性質(zhì)和處方醫(yī)師的判斷。然而，有效劑量按單次或分次劑量在每天每kg體重約0.001至約100mg的范圍內(nèi)，優(yōu)選為約1至約35mg/kg/天。對于70kg的人，這將相當(dāng)于約0.05至7g/天，優(yōu)選約0.05至約2.5g/天?？砂磫未位蚨啻蝿┝?例如，一天兩次或三次)施用有效量的本發(fā)明的化合物。

在一個實施方案中，本文所述的藥物組合物包含約0.001mg至約1000mg(如約0.01mg至約500mg或約0.010mg至約250mg或約0.030mg至約125mg)的雙重PI3K δ及γ抑制劑(如式A的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽)和/或約0.001mg至約1000mg(如約0.01mg至約500mg或約0.010mg至約250mg或約0.010mg至約125mg或約0.030mg至約50mg)的至少一種皮質(zhì)類固醇。

在一個實施方案中，本文所述的藥物組合物以按重量計約100∶1與約1∶100之間(如按重量計約50∶1與約1∶50之間或按重量計約1∶10與約10∶1之間或按重量計約1∶5與約5∶1之間)的比例包含雙重PI3K δ及γ抑制劑和皮質(zhì)類固醇。

如本文所用的術(shù)語“共同施用”、“與...組合施用”及其語法等同表述涵蓋對動物施用兩種或更多種藥劑(如雙重PI3K δ及γ抑制劑和皮質(zhì)類固醇)，使得兩種藥劑和/或其代謝物同時存在于動物中。共同施用包括以分開的組合物同時施用、以分開的組合物在不同的時間施用或者以其中兩種藥劑都存在的組合物施用。

本文所述的藥物組合物可含有一種或多種選自以下的皮質(zhì)類固醇：地塞米松、倍他米松、潑尼松龍、甲基潑尼松龍、潑尼松、氫化可的松、氟替卡松、曲安西龍、布地奈德或可的松潑尼松龍、甲潑尼龍、萘非可特、地夫可特、醋酸鹵潑尼松、布地奈德、二丙酸倍氯米松、氫化可的松、曲安奈德、氟西奈德、氟輕松、特戊酸氯可托龍、醋丙甲潑尼龍、棕櫚酸地塞米松、替潑尼旦、醋丙氫化可的松、潑尼卡酯、二丙酸阿氯米松、鹵米松、磺庚甲潑尼龍、糠酸莫米松、利美索龍、法呢酸潑尼松龍、環(huán)索奈德、丙酸地潑羅酮、丙酸氟替卡松、丙酸鹵倍他索、依碳酸氯替潑諾、丁酸丙酸倍他米松、氟尼縮松、潑尼松、地塞米松磷酸鈉、曲安西龍、17-戊酸倍他米松、倍他米松、二丙酸倍他米松、醋酸氫化可的松、氫化可的松琥珀酸鈉、潑尼松龍磷酸鈉和丙丁酸氫化可的松以及任意前述物質(zhì)的任意組合。

在某些實施方案中，皮質(zhì)類固醇選自地塞米松、倍他米松、潑尼松龍、甲基潑尼松龍、潑尼松、氫化可的松、氟替卡松、曲安西龍、布地奈德或可的松及其任意組合。

本發(fā)明的一個特定實施方案涉及其中皮質(zhì)類固醇是氟替卡松的藥物組合物。

本發(fā)明的另一特定實施方案涉及其中皮質(zhì)類固醇是布地奈德的藥物組合物。

本發(fā)明的又一特定實施方案涉及其中皮質(zhì)類固醇是潑尼松龍的藥物組合物。

本發(fā)明的又一特定實施方案涉及其中皮質(zhì)類固醇是地塞米松的藥物組合物。

本發(fā)明進一步的實施方案涉及治療選自呼吸性疾病和病狀的指征的方法，如治療伴有粘液的產(chǎn)生增加或改變的氣道和肺的疾病和/或氣道的炎性和/或阻塞性疾病，如急性支氣管炎、慢性支氣管炎、慢性阻塞性支氣管炎(COPD)、咳嗽、肺氣腫、過敏或非過敏性鼻炎或鼻竇炎、慢性鼻竇炎或鼻炎、鼻息肉、慢性鼻竇炎、急性鼻竇炎、哮喘、過敏性支氣管炎、肺泡炎、農(nóng)夫病(Farmer′s disease)、反應(yīng)過度的氣道、由感染引起的支氣管炎或肺炎(例如通過細(xì)菌或病毒或蠕蟲或真菌或原生動物或其它病原體)、兒科哮喘、支氣管擴張、肺纖維化、成人呼吸窘迫綜合征、支氣管和肺水腫、由不同的起源(例如有毒氣體、蒸氣的吸進、吸入)引起的支氣管炎或肺炎或間質(zhì)性肺炎、由心力衰竭、X射線、輻射、化療引起的支氣管炎或肺炎或間質(zhì)性肺炎、與膠原病(例如紅斑狼瘡)相關(guān)聯(lián)的支氣管炎或肺炎或間質(zhì)性肺炎、全身性硬皮病、肺纖維化、特發(fā)性肺部肺纖維化(IPF)、間質(zhì)性肺疾病或不同起源的間質(zhì)性肺炎(包括石棉肺、硅肺)、布氏肉瘤(M.Boeck)或肉狀瘤病、肉芽腫病、囊性纖維化或粘液粘稠病或a-1-抗胰蛋白酶缺乏癥；或選自炎性疾病和病狀，如各種起源的胃腸道的炎性疾病，如炎性假息肉、克羅恩氏病(Crohn′s disease)、潰瘍性結(jié)腸炎、關(guān)節(jié)的炎性疾病(如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)或口-鼻咽、皮膚或眼晴的過敏性炎性疾病(如特應(yīng)性皮炎)、季節(jié)性和常年性慢性尿道炎、未知病因的蕁麻疹和過敏性結(jié)膜炎；且特別是選自哮喘、過敏及非過敏性鼻炎、COPD和特應(yīng)性皮炎；包括對有需要的患者施用治療有效量的根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物。

本發(fā)明進一步的實施方案涉及根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療呼吸性和/或炎性疾病和病狀，特別是其中呼吸性和/或炎性疾病或病狀選自哮喘、過敏及非過敏性鼻炎、COPD和特應(yīng)性皮炎。

本發(fā)明進一步的實施方案涉及根據(jù)本文任意實施方案的藥物組合物，其用于治療呼吸性和炎性疾病和病狀，特別是其中呼吸性和炎性疾病或病狀選自哮喘、過敏及非過敏性鼻炎、COPD和特應(yīng)性皮炎。

現(xiàn)在借助以下非限制性實施例進一步說明本發(fā)明。

實施例

下文提供PI3K δ及γ雙重抑制劑和皮質(zhì)類固醇的組合的說明性實施例。

實施例1：A549細(xì)胞中TGF-β1誘導(dǎo)的皮質(zhì)類固醇不敏感性

測試程序

使A549細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶處理，按每孔2*104個細(xì)胞接種在96孔板中并在37℃和5％CO₂下溫育。

除去培養(yǎng)基，添加100μl含有0.1μM的化合物A的無血清培養(yǎng)基并溫育30分鐘。

添加50μl含有0.5％BSA的F12K中的3X TGF-β1，使得最終濃度為400pM，并在37℃和5％CO₂下溫育4h。

添加50μl的4X所需濃度的地塞米松(Dex)，并在37℃和5％CO₂下溫育45分鐘。

添加50μl的5X濃度的TNF-α，使得最終濃度為1ng/ml以誘導(dǎo)IL-8并溫育24h。

收集上清液并通過ELISA估算IL-8。

細(xì)胞因子測定

用新鮮或解凍的上清液涂鋪IL-8條帶并在室溫下溫育2h或在4℃下溫育過夜。

棄去內(nèi)容物并用200μl洗滌緩沖液/孔洗滌條帶15s，共5次。

將條帶吸干，添加100μl/孔的1X檢測抗體并在室溫下溫育1h。

棄去內(nèi)容物并用200μl洗滌緩沖液/孔洗滌條帶15s，共5次。

將條帶吸干，添加100μl/孔的1X抗生物素蛋白-HRP抗體，并在室溫下溫育30分鐘。

棄去內(nèi)容物并用200μl/孔的洗滌緩沖液洗滌條帶15s，共5次。

添加100μl/孔的TMB底物并在室溫下溫育5-15分鐘。

通過添加50μl/孔的2N H₂SO₄終止反應(yīng)。

在讀板儀上讀取A450nm和A570nm處的吸光度。

基于對照孔確定減去空白的吸光度值的％抑制。使用GraphPad Prism(5.02版)對數(shù)據(jù)作圖。

結(jié)果

結(jié)果描述于圖1A中?；衔顰(化合物A)降低地塞米松對TGF-β1處理的A549細(xì)胞中的IL-8濃度的IC₅₀，表明地塞米松活性的顯著增強。

實施例2：U937細(xì)胞中H₂O₂誘導(dǎo)的皮質(zhì)類固醇不敏感性

測試程序

將U937細(xì)胞保持在含有15mM谷氨酰胺的RPMI-1640中。取6*10⁶個細(xì)胞放入含有12ml新鮮培養(yǎng)基的T-25燒瓶中，用1μM的化合物A處理并在37℃和5％CO₂下溫育30分鐘。

按200μM的最終濃度將H₂O₂添加到上述細(xì)胞中并溫育2h。

將細(xì)胞沉淀，再懸浮于無血清培養(yǎng)基中，并以100μl中0.15*10⁶個細(xì)胞/孔接種到96孔板上。

以所需濃度添加50μl的3X地塞米松并溫育45分鐘。

添加50μl的4X濃度的TNF-α，使得最終濃度為10ng/ml以誘導(dǎo)IL-8并溫育18h。

收集上清液并通過ELISA估算IL-8。

細(xì)胞因子測定

用新鮮或解凍的上清液涂鋪IL-8條帶并在室溫下溫育2h或在4℃下溫育過夜。

棄去內(nèi)容物并用200μl洗滌緩沖液/孔洗滌條帶15s，共5次。

將條帶吸干，添加100μl/孔的1X檢測抗體并在室溫下溫育1h。

棄去內(nèi)容物并用200μl洗滌緩沖液/孔洗滌條帶15s，共5次。

將條帶吸干，添加100μl/孔的1X抗生物素蛋白-HRP抗體，并在室溫下溫育30分鐘。

棄去內(nèi)容物并用200μl/孔的洗滌緩沖液洗滌條帶15s，共5次。

添加100μl/孔的TMB底物并在室溫下溫育5-15分鐘。

通過添加50μl/孔的2N H₂SO₄終止反應(yīng)。

在讀板儀上讀取A₄₅₀ nm和A₅₇₀nm處的吸光度。

結(jié)果

如圖1B中所示，化合物A(化合物A)降低地塞米松(Dex)對H₂O₂處理的U937細(xì)胞中的IL-8濃度的IC₅₀，表明地塞米松活性的顯著增強。

實施例3：在雄性Balb/c小鼠中長期香煙煙霧誘導(dǎo)的細(xì)胞浸潤

在實驗開始之前使動物適應(yīng)環(huán)境七天。基于動物的體重將它們隨機分配到各組中。從第1天至第11天使小鼠暴露于2根香煙的主流煙霧。暴露于每根香煙的煙霧持續(xù)10分鐘(每根香煙在頭兩分鐘內(nèi)完全燃盡，隨后是采用動物呼吸機的空氣流)，并用新鮮室內(nèi)空氣接著暴露20分鐘。在每第二根香煙之后，進行暴露于新鮮室內(nèi)空氣的額外20分鐘間斷。使對照動物暴露于室內(nèi)空氣室。從第12天至第14天在30分鐘全身煙霧暴露前通過鼻內(nèi)途徑將測試化合物作為懸浮液施用。從第12天至第14天使小鼠暴露于1根香煙的主流煙霧。在第15天，在最后的香煙煙霧(CS)暴露后24小時，在麻醉下將動物放血并將氣管插管，用肝素化PBS(1單位/ml)的0.5ml等分試樣通過氣管插管灌洗肺四次(總體積2ml)。直到測定總細(xì)胞和白細(xì)胞分類計數(shù)之前將收集的支氣管肺泡(BAL)儲存在2-8℃下。將BAL液離心(500×g持續(xù)10分鐘)并將所得細(xì)胞團再懸浮于0.5ml肝素化鹽水中。使用血細(xì)胞計數(shù)器在BAL液和血液中測定白血細(xì)胞的總數(shù)并調(diào)節(jié)至1×10⁶個細(xì)胞/ml。手動計算分化細(xì)胞計數(shù)。使用細(xì)胞離心涂片器3(cytospin3)離心四十微升細(xì)胞懸浮液以制備細(xì)胞涂片。將細(xì)胞涂片以用于分化的血液染色溶液染色，并通過根據(jù)各細(xì)胞的形態(tài)特征對其識別來進行顯微觀察。測定細(xì)胞涂片中300個白血細(xì)胞當(dāng)中的各細(xì)胞類型的數(shù)目，以百分比表示，并計算各BAL液中嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的數(shù)目。此外，采用ELISA測定法分析BAL上清液的各種細(xì)胞因子。

結(jié)果示于表1及圖2A和2B中。

所有動物都存活到預(yù)定的終止。如通過BAL中細(xì)胞計數(shù)的評估所確定，化合物A在確立的鼠慢性COPD模型中顯示出顯著的有益治療效果。采用經(jīng)處理的動物的BAL液中的巨噬細(xì)胞浸潤與疾病對照顯著不同，在用化合物A(0.003-3mg/kg)處理的小鼠中看到BAL細(xì)胞計數(shù)以劑量依賴性方式顯著減少(偏向正常)。對于給予0.003-3mg/kg化合物A的小鼠，巨噬細(xì)胞計數(shù)偏向正常顯著減少。表1中給出了細(xì)胞因子的百分比抑制。

實施例4：在雄性Balb/c小鼠的長期香煙煙霧誘導(dǎo)的細(xì)胞浸潤中的皮質(zhì)類固醇不敏感性的逆轉(zhuǎn)

在實驗開始之前使動物適應(yīng)環(huán)境七天?；趧游锏捏w重將它們隨機分配到各組中。從第1天至第11天使小鼠暴露于2根香煙的主流煙霧。暴露于每根香煙的煙霧持續(xù)10分鐘(每根香煙在頭兩分鐘內(nèi)完全燃盡，隨后是采用動物呼吸機的空氣流)，并用新鮮室內(nèi)空氣接著暴露20分鐘。在每第二根香煙之后，進行暴露于新鮮室內(nèi)空氣的額外20分鐘間斷。使對照動物暴露于室內(nèi)空氣室。從第6天至第11天在30分鐘全身煙霧暴露前通過鼻內(nèi)途徑施用皮質(zhì)類固醇、氟替卡松。從第12天至第14天使小鼠暴露于1根香煙的主流煙霧。從第12天至第14天在30分鐘全身煙霧暴露前通過鼻內(nèi)途徑將測試化合物作為懸浮液施用。在第15天，在最后的香煙煙霧(CS)暴露后24小時，在麻醉下將動物放血并將氣管插管，用肝素化PBS(1單位/ml)的0.5ml等分試樣通過氣管插管灌洗肺四次(總體積2ml)。直到測定總細(xì)胞和白細(xì)胞分類計數(shù)之前將收集的支氣管肺泡(BAL)儲存在2-8℃下。將BAL液離心(500×g持續(xù)10分鐘)并將所得細(xì)胞團再懸浮于0.5ml肝素化鹽水中。使用血細(xì)胞計數(shù)器在BAL液和血液中測定白血細(xì)胞的總數(shù)并調(diào)節(jié)至1×10⁶個細(xì)胞/ml。手動計算分化細(xì)胞計數(shù)。使用細(xì)胞離心涂片器3離心四十微升細(xì)胞懸浮液以制備細(xì)胞涂片。將細(xì)胞涂片以用于分化的血液染色溶液染色，并通過根據(jù)各細(xì)胞的形態(tài)特征對其識別來進行顯微觀察。測定細(xì)胞涂片中300個白血細(xì)胞當(dāng)中的各細(xì)胞類型的數(shù)目，以百分比表示，并計算各BAL液中嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的數(shù)目。此外，采用ELISA測定法分析BAL上清液的各種細(xì)胞因子。

與氟替卡松(FLT)相組合，化合物A通過對巨噬細(xì)胞浸潤顯示協(xié)同作用而顯示出顯著的有益治療效果并逆轉(zhuǎn)皮質(zhì)類固醇不敏感性。如通過BAL中細(xì)胞計數(shù)的評估所確定，在確立的鼠慢性COPD模型中，組合的ED₅₀為0.021mg/kg，相比之下單獨的化合物A的ED₅₀為0.093mg/kg。結(jié)果也示于圖3A和3B中。

實施例5：有關(guān)患者身份、嗜中性粒細(xì)胞的分離和用于化合物A的體外測試的香煙煙霧提取物(CSE)的制備的一般描述

A.患者選擇

白細(xì)胞實驗包括健康受試者和COPD患者。在采樣之前的數(shù)天期間進行肺功能測試(用力呼吸量測定)和動脈血氣測量。根據(jù)患者的呼吸量測定結(jié)果和吸煙習(xí)慣，將他們分成兩組：A)健康受試者，肺功能正常且不吸煙的患者；B)COPD，吸煙已超過10包-年且通過1s的用力呼氣量(FEV1)＜80％預(yù)測值和FEV1用力肺活量(FVC)比率＜70％證明氣道阻塞的患者。

表2中提供了患者的臨床特征。

表2：臨床特征。COPD：慢性阻塞性肺?。籉EV1：一秒的用力呼氣量；FVC：用力肺活量；包-年＝1年吸煙，一天20根香煙。數(shù)據(jù)為平均值±SE。

外周嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞以及全血得自根據(jù)GOLD指南定義的8名COPD患者和7名健康受試者?；颊吣挲g65.1±14歲，F(xiàn)EV158.2±3％預(yù)測值。所有患者當(dāng)前都吸煙。在取血樣之前2周內(nèi)沒有疾病的惡化。

還分別招募了7名肺功能正常的年齡匹配的非吸煙的對照受試者(年齡66.1±6歲，F(xiàn)EV1 98±3％預(yù)測值)作為正常對照，他們沒有任何呼吸性疾病。使用alpha III呼吸量計(Vitalograph，Maids Moreton，UK)進行常規(guī)肺功能測試以評估用力肺活量(FVC)、1s的用力呼氣量(FEV1)和FEV1/FVC比率。此項目經(jīng)西班牙瓦倫西亞(Valencia)的普通高校醫(yī)院(General University Hospital)的地方倫理委員會批準(zhǔn)，在開始取血樣和肺功能測試之前得到了每位患者或志愿者的書面知情同意書。

B.人嗜中性粒細(xì)胞的分離

通過標(biāo)準(zhǔn)實驗室程序自外周靜脈血分離嗜中性粒細(xì)胞。簡言之，將外周靜脈血與3％(在0.9％鹽水中)的葡聚糖500以2∶1的比例混合。將此混合物在室溫下溫育30分鐘，直到紅細(xì)胞沉降。小心地收集上層相，并以3∶1的比例添加到Ficoll-Paque Histopaque 1077(Amershan Pharmacia Biotech，Barcelona，)密度梯度液上。將產(chǎn)生的兩相在150g、4℃下離心30分鐘。因此，在冰中將獲得的團粒(由嗜中性粒細(xì)胞和低比例的殘余紅細(xì)胞及痕量的嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞的混合物組成)在紅細(xì)胞裂解緩沖液(Biolegend，UK)中再懸浮5分鐘。將細(xì)胞懸浮液用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌兩次。如通過吉姆薩(Giemsa)染色評估，制劑的嗜中性粒細(xì)胞純度＞97％，且通過臺盼藍排除法測量存活力＞99％。在研究的不同實驗條件下純度及存活力都不受影響。

C.香煙煙霧提取物溶液的制備

如下制備CSE：簡言之，通過與人吸煙模式有關(guān)的噴吹機制(3次噴吹/分鐘；1次噴吹35ml；每次噴吹在濾器上方0.5em處持續(xù)時間2s)，由呼吸泵(Apparatus Rodent Respirator 680；Harvard，Germany)產(chǎn)生研究香煙(2R4F；Tobacco Health Research，University of Kentucky，KY，USA)的煙霧，并將其鼓泡到容納25ml預(yù)溫?zé)?37℃)的Roswell Park Memorial Institute(RPMI)-1640培養(yǎng)基的燒瓶里。通過經(jīng)0.22-μm醋酸纖維素滅菌系統(tǒng)(Corning，NY)過濾來將CSE溶液滅菌。將所得CSE溶液視為是100％CSE并在制備的30分鐘內(nèi)用于實驗。CSE 10％大致對應(yīng)于與每天吸兩包煙相關(guān)聯(lián)的暴露量?；谠?20nm(其為過氧亞硝酸鹽的特定吸收波長)處的吸光度評估所制備的CSE溶液的質(zhì)量。使用具有3.0±0.1的吸光度值的儲備溶液。為了測試來自CSE的細(xì)胞毒性，用高達5％濃度的CSE處理分離的嗜中性粒細(xì)胞24。與對照組(數(shù)據(jù)未顯示)相比沒有觀察到乳酸脫氫酶上清液水平(乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性測定；Cayman，Spain)的顯著差異。

實施例6

測定：化合物A、地塞米松及其組合對由來自健康非吸煙者和COPD吸煙患者的外周血嗜中性粒細(xì)胞中的CSE誘導(dǎo)的分泌炎性標(biāo)志物IL-8的影響。

將分離自健康志愿者和COPD患者的人嗜中性粒細(xì)胞在于標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)條件(37℃和5％CO₂)下用或不用CSE 5％溫育6小時前用化合物A(0.01nM-100μM)和地塞米松(0.1nM-1μM)或媒介物溫育30分鐘。收集上清液以測量不同的炎性標(biāo)志物。

使用市售的藥劑盒通過ELISA測量IL-8。

在每一實驗條件下在差不多三名患者中進行三次重復(fù)實驗。

在化合物A(0.01nM-100μM)或地塞米松(DEX；0.1nM-1μM)的存在下將來自健康和COPD患者的嗜中性粒細(xì)胞用CSE 5％刺激6h并測量IL-8上清液。濃度依賴性抑制曲線示于圖4和表3中。

表3.分離自健康(N＝3)和COPD患者(N＝3)的外周血嗜中性粒細(xì)胞中的IL-8釋放的抑制。通過響應(yīng)于香煙煙霧提取物(CSE 5％)用化合物A(化合物A；0.01nM-100μM)或地塞米松(DEX；0.1nM-1μM)溫育產(chǎn)生抑制濃度依賴性曲線。值為按三次重復(fù)實施的3個獨立實驗的平均值±SEM。通過非線性回歸分析計算半數(shù)最大抑制的IC₅₀值。*p＜0.05對比健康值。

向0.1nM、1nM和10nM增加濃度的化合物A中添加固定濃度的地塞米松1nM顯示在來自COPD患者的嗜中性粒細(xì)胞中抑制CSE誘導(dǎo)的IL-8釋放的增加(圖5)。

化合物A以濃度依賴性方式抑制來自健康和COPD患者的嗜中性粒細(xì)胞中的IL-8分泌，最大抑制百分比分別為97.4±5.3％和85.14±8.24％。作為參考，抗炎性地塞米松僅在來自健康患者的嗜中性粒細(xì)胞中顯示出對CSE誘導(dǎo)的IL-8釋放的有利的抑制特征，最大抑制百分比為83.9±10％。然而在來自COPD患者的嗜中性粒細(xì)胞中，地塞米松不能顯著地抑制IL-8釋放，顯示出皮質(zhì)類固醇不敏感特征。

實施例7

測定：使用來自健康非吸煙者和COPD吸煙患者的外周血嗜中性粒細(xì)胞，化合物A對皮質(zhì)類固醇抗性介體和PI3K同種型的基礎(chǔ)RNA表達的影響

皮質(zhì)類固醇抗性介體的基礎(chǔ)RNA表達的測量：在基礎(chǔ)條件下且依照實驗條件從來自COPD患者的外周人嗜中性粒細(xì)胞中分離總RNA。將細(xì)胞均化并使用分離試劑(Roche，Indianapolis，USA)提取RNA。用TaqMan逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Applied Biosystems，Perkin-Elmer Corporation，CA，USA)在300ng總RNA中進行逆轉(zhuǎn)錄。在使用Universal Master Mix(Applied Biosystems)的7900HT快速實時PCR系統(tǒng)(Applied Biosystem)中，用對MIF(目錄號Hs00236988)、MKP-1(目錄號Hs00610256)、PI3K-δ(目錄號Hs00192399)、PI3Kγ(目錄號Hs00277090)和GAPDH(目錄號4310884E)特定的預(yù)設(shè)計引物(Applied Biosystems)為內(nèi)源對照擴增1.5μl所得cDNA。采用2^-ΔΔCt方法測定這些不同轉(zhuǎn)錄物的相對定量并針對于對照組標(biāo)準(zhǔn)化。

在基礎(chǔ)條件下且在實驗結(jié)束時測量MIF、MKP-1、PI3K-δ和PI3Kγ基因的mRNA表達。

在每一實驗條件下在至少三名患者中進行三次重復(fù)實驗。

結(jié)果：MIF的表達不受CSE或化合物A暴露的顯著影響。相反，CSE將MKP1的表達減少至對照的大約0.4倍。化合物A將MKP1的表達增加到接近對照水平，這與化合物A對IL-8釋放的抑制作用良好地相關(guān)。參見圖6。盡管PI3Kδ不受CSE處理的影響，但施用化合物A使CSE誘導(dǎo)的PI3Kγ表達顯著減少(圖7)。

實施例8

測定：使用來自健康非吸煙者和COPD吸煙患者的外周血嗜中性粒細(xì)胞，化合物A、地塞米松及其組合對PI3K同種型的基礎(chǔ)表達的影響。

Pi3K同種型的測量：為了測量PI3K活性，分離來自COPD患者的嗜中性粒細(xì)胞并用10nM的化合物A溫育1h。然后將細(xì)胞用CSE5％刺激30分鐘。細(xì)胞刺激后，將嗜中性粒細(xì)胞離心并從嗜中性粒細(xì)胞中提取總蛋白。采用Bio-Rad測定(Bio-Rad Laboratories Ltd.，Herts，UK)測量總蛋白量以確保等量。根據(jù)制造商的方案采用PI3-激酶活性ELISA測量PI3K活性：Pico(目錄號k-1000s，Echelon Bioscience，Salt Lake City，USA)。簡言之，用I類PI3-K生理底物PI(4，5)P2(PIP2)實施PI3-K反應(yīng)。然后將酶反應(yīng)物、PIP3標(biāo)準(zhǔn)物和對照物混合并與對PIP3具有高度特異性和敏感性的PIP3結(jié)合蛋白一起溫育。然后將此混合物轉(zhuǎn)移至涂布PIP3的微孔板用于競爭性結(jié)合。之后，采用過氧化物酶連接的次級檢測器和比色檢測通過將酶反應(yīng)與PIP3標(biāo)準(zhǔn)曲線進行比較來檢測由PI3-K產(chǎn)生的PIP3的量。

在每一實驗條件下在至少三名患者中進行三次重復(fù)實驗。

結(jié)果：在來自COPD患者的嗜中性粒細(xì)胞中，CSE 5％增加了以PIP3產(chǎn)生測量的PI3K活性。添加10nM的化合物A完全抑制了PI3K活性(圖8)。

雖然本文已經(jīng)參考了具體的實施方案描述了本發(fā)明，但要理解的是，這些實施方案僅是用于說明本發(fā)明的原理和應(yīng)用。因此要理解的是，可以對說明性實施方案進行多種修改，并且在不偏離如上所述的本發(fā)明實質(zhì)和范圍的情況下可設(shè)計出其它的布置方式。所附權(quán)利要求旨在限定本發(fā)明的范圍，并且由此涵蓋這些權(quán)利要求及其等同方案范圍內(nèi)的方法及結(jié)構(gòu)。

本申請中引用的所有出版物、專利及專利申請以引用的方式并入本文，其引用程度如同具體和單獨地指明將每一單獨的出版物、專利或?qū)＠暾堃砸玫姆绞讲⑷氡疚摹?/p>