本公開文本公開了取代的噁唑衍生物，所述衍生物選擇性地調(diào)整、調(diào)節(jié)和/或抑制由某些天然和/或突變的蛋白激酶介導的信號轉(zhuǎn)導，所述蛋白激酶與多種人和動物的疾病(如細胞增殖病癥、代謝病癥、自身免疫病癥、變應性病癥(allergic disorders)和退行性病癥)有關。尤其是，這些化合物中的數(shù)種為強效的選擇性脾酪氨酸激酶(Syk)抑制劑。
背景技術：
蛋白激酶是受體型或非受體型蛋白，將ATP的末端磷酸根轉(zhuǎn)移到蛋白的氨基酸殘基上(如酪氨酸殘基、蘇氨酸殘基、絲氨酸殘基)，由此使信號轉(zhuǎn)導通路活化或失活。已知這些蛋白參與許多在被破壞的情況下導致病癥(如異常的細胞增殖和遷移以及炎癥)的細胞機制。
迄今為止，已知的蛋白激酶超過了500種。所包括在內(nèi)的有眾所周知的Abl、Akt1、Akt2、Akt3、ALK、Alk5、A-Raf、Axl、B-Raf、Brk、Btk、Cdk2、Cdk4、Cdk5、Cdk6、CHK1、c-Raf-1、Csk、EGFR、EphA1、EphA2、EphB2、EphB4、Erk2、Fak、Fes、Fer、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、Flt-3、Fms、Frk、Fyn、Gsk3α、Gsk3β、HCK、Her2/Erbb2、Her4/Erbb4、IGF1R、IKKβ、Irak4、Itk、Jak1、Jak2、Jak3、Jnk1、Jnk2、Jnk3、KDR、Kit、Lck、Lyn、MAP2K1、MAP2K2、MAP4K4、MAPKAPK2、Met、Mer、MNK1、MLK1、mTOR、p38、PDGFRα、PDGFRβ、PDPK1、PI3Kα、PI3Kβ、PI3Kδ、PI3Kγ、Pim1、Pim2、Pim3、PKCα、PKCβ、PKCθ、Plk1、Pyk2、Ret、ROCK1、ROCK2、RON、Src、Stk6、Syk、TEC、Tie2、TrkA、TrkB、Tyk2、VEGFR1/Flt-1、VEGFR2/Kdr、VEGFR3/Flt-4、Yes和Zap70。
脾酪氨酸激酶(Syk)(胞內(nèi)蛋白酪氨酸激酶)是包括B細胞、肥大細胞、巨噬細胞和中性粒細胞在內(nèi)的許多炎性細胞中的免疫受體信號的關鍵介導體(Wong Br等，(2004)，Expert Opin Investig Drugs，13，743-762)。Syk還在非造血細胞樣成纖維細胞、乳腺癌細胞、結腸癌細胞、肝細胞、神經(jīng)元細胞和血管內(nèi)皮細胞中廣泛表達(Okamura S等，(1999)，Oncol Res，11，281-285)。起初，Syk被認為主要在免疫受體(如Fc受體(FcR)和B細胞受體(BCR))的信號發(fā)出(signaling)中起作用。然而，近期研究顯示出了Syk在多種細胞刺激物(包括IL-1、腫瘤壞死因子-α(TNFα)、脂多糖、和β1-整合素)的細胞信號發(fā)出中的關鍵角色(Yamada T等，(2001)，J Immunol，167，283-288)。例如，Syk可被TNFα活化，引起造血細胞系中的MAKP磷酸化和NF-κB轉(zhuǎn)位(Takada Y和Aggarwal BB(2004)，J Immunol，173，1066-1077)。鼻息肉成纖維細胞中產(chǎn)生IL-1誘發(fā)的趨化因子也通過Syk活化而介導(Yamada T等，(2001)，J Immunol，167，283-288)。Syk已成為用于治療變應性病癥和自身免疫病癥的潛在治療靶點。
技術實現(xiàn)要素：
對于蛋白激酶有活性的現(xiàn)有化合物并不總是具有令人滿意的特性，例如效力和選擇性。另外，對于蛋白激酶有活性的現(xiàn)有化合物并不總是具有令人滿意的體內(nèi)生物利用度。本公開文本公開了對于野生型和/或突變的蛋白激酶、尤其是野生型和/或突變的酪氨酸激酶、更尤其是Syk顯示出強效的選擇性抑制活性的化合物。尤其是，本公開文本公開了用于選擇性地調(diào)整、調(diào)節(jié)和/或抑制由某些天然和/或突變的蛋白激酶、尤其是酪氨酸激酶介導的信號轉(zhuǎn)導的方法和化合物，所述蛋白激酶與多種人和動物的疾病(如細胞增殖病癥、代謝病癥、自身免疫病癥、變應性病癥和退行性病癥)有關。更尤其是，這些化合物為強效的選擇性Syk抑制劑。更尤其是，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)了在噁唑衍生物中具有特定取代的化合物是強效的選擇性Syk酪氨酸激酶抑制劑。
在第一方面，本公開文本涉及式(I)的化合物，所述式(I)的化合物可代表物質(zhì)的游離堿形式或其藥學上可接受的鹽：
其中：
R1，R2，R3和R4各自獨立地選自于：
氫、
氰基、
CF3、
鹵素(選自于F、Cl、Br或I)、
任選取代有雜環(huán)的烷基基團、
任選取代有雜環(huán)的烷氧基基團、
增溶基團、
雜環(huán)、
-CO-NRR'、
-SO2-NRR'、
-NRR'、
-NR-CO-R'以及
-NR-SO2R'基團，
其中，R和R'各自獨立地為氫或烷基基團；
W是芳基或雜芳基基團，其為未取代的或由一個或多個(例如1至4個，如1個或2個或3個，如1個)取代基取代，上述取代基選自于：
氰基、
CF3、
鹵素(選自于F、Cl、Br或I)、
任選取代有雜環(huán)的烷基基團、
環(huán)烷基基團、
任選取代有雜環(huán)的烷氧基基團、
芳基基團、
雜芳基基團、
雜環(huán)烷基基團、
增溶基團、
-CO-NRR'、
-SO2-NRR'、
-NRR'、
-NR-CO-R'以及
-NR-SO2R'基團，
其中，R和R'各自獨立地為氫或烷基基團；
X選自于O、S、N(R5)、N[C(＝O)R6]和(CH2)n，其中，n為0、1或2，R5和R6各自獨立地為H或C1-4烷基基團；
Y為(CH2)m，其中，m為1、2、3或4；
Z為(CH2)p，其中，p為1或2。
本公開文本公開了下述化合物，其中，X可為(CH2)n，n可為0、1或2，m和p可為1。例如，n為0，m和p為1(從而得到環(huán)丙基)?；蛘撸琻為1，m和p為1(從而得到環(huán)丁基)?；蛘撸琻為2，m和p為1(從而得到環(huán)戊基)。
本公開文本公開了下述化合物，其中，W可以是取代的(如單取代)雜芳基或取代的(如單取代)芳基。例如，W為單取代的雜芳基。
當W為雜芳基時，雜芳基可為5-8元單環(huán)。該環(huán)可包含至少一個(例如1至3個，如1個或2個)氮原子。例如，雜芳基為嘧啶，如嘧啶-2-基。W的實例為4-取代的嘧啶-2-基。
本公開文本公開了下述化合物，其中，W取代基可各自獨立地選自于由以下基團所組成的組：氰基、CF3、鹵素、任選取代有雜環(huán)的烷基基團(例如未取代的C1-C3烷基，如甲基、乙基、丙基)、環(huán)烷基基團、任選取代有雜環(huán)的烷氧基基團、芳基基團(如苯基)、雜芳基基團(如噻吩或吡啶)以及雜環(huán)烷基基團(如嗎啉)。例如，W取代基可各自獨立地選自于由以下基團所組成的組：氰基、CF3、任選取代有雜環(huán)的烷基基團(例如未取代的C1-C3烷基，如甲基、乙基、丙基)、芳基基團(如苯基)、雜芳基基團(如噻吩或吡啶)以及雜環(huán)烷基基團(如嗎啉)。例如，W取代基可各自獨立地為任選取代有雜環(huán)的烷基基團(例如未取代的C1-C3烷基，如甲基、乙基、丙基)。W的實例是4-(C1-3)烷基嘧啶-2-基。
本公開文本公開了下述化合物，其中，R1、R2、R3和R4可各自獨立地選自于由以下基團所組成的組：氫、鹵素、任選取代有雜環(huán)的烷基基團、任選取代有雜環(huán)的烷氧基基團以及增溶基團。例如，R1、R2、R3和R4中的至少三個為氫。例如，R3和R4為氫，R1和R2的其中一個為氫，另一個選自于由以下基團所組成的組：氫、鹵素、任選取代有雜環(huán)的烷基基團、任選取代有雜環(huán)的烷氧基基團。例如，R1、R2、R3和R4全部為氫。
本公開文本公開了如下式(II)的化合物或其藥學上的鹽：
其中，W、R1、R2、R3、R4和X如上所定義。例如，W、R1、R2、R3、R4如上所定義，X為(CH2)n，n為0、1或2(如0)。例如，在式(II)的化合物中，R1至R4中的至少三個為氫，例如R1至R4均為氫，W是單取代的芳基或單取代的雜芳基(如單取代的雜芳基)，X為(CH2)n，n為0、1或2(如0)。
本公開文本公開了如下式(III)的化合物或其藥學上的鹽：
其中，R1、R2、R3、R4和X如上所定義，R7選自于由以下基團所組成的組：
氫、
氰基、
CF3、
鹵素(選自于F、Cl、Br或I)、
烷基基團、
環(huán)烷基基團、
烷氧基基團、
芳基基團、
雜芳基基團、
雜環(huán)烷基基團、
增溶基團以及
-NRR'基團，其中，R和R'各自獨立地選自于氫或烷基基團。
例如，在式(III)的化合物中，R1至R4和R7如上所定義，X為(CH2)n，n為0、1或2(如0)。例如，R1至R4如上所定義，R7為烷基(例如C1-C3烷基，如甲基、乙基或丙基)，X為(CH2)n，n為0、1或2(如0)。例如，R3和R4為氫，R1和R2的其中一個為氫，另一個選自于由以下基團所組成的組：氫、鹵素、任選取代有雜環(huán)的烷基基團、任選取代有雜環(huán)的烷氧基基團，X為(CH2)n，n為0、1或2(如0)，R7為C1-C3烷基(如甲基、乙基或丙基)。
除非另有規(guī)定，本文所使用的下列術語定義如下。
本文所使用的術語“烷基”或“烷基基團”意味著飽和直鏈或支鏈非環(huán)狀烴。除非另有說明，烷基基團可具有1至10個、例如1至6個或1至4個碳原子、例如1至3個碳原子。具有代表性的飽和直鏈烷基包括甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基和正癸基；而飽和支鏈烷基包括異丙基、仲丁基、異丁基、叔丁基、異戊基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2,3-二甲基丁基、2,3-二甲基戊基、2,4-二甲基戊基、2,3-二甲基己基、2,4-二甲基己基、2,5-二甲基己基、2,2-二甲基戊基、2,2-二甲基己基、3,3-二甲基戊基、3,3-二甲基己基、4,4-二甲基己基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基、2-甲基-4-乙基戊基、2-甲基-2-乙基己基、2-甲基-3-乙基己基、2-甲基-4-乙基己基、2,2-二乙基戊基、3,3-二乙基己基、2,2-二乙基己基以及3,3-二乙基己基。包含在本發(fā)明化合物中的烷基可以是未取代的，或取代有一個或多個(例如1至5個、如1個)取代基。任選的取代基可以是增溶基團。
本文所使用的術語“芳基”或“芳基基團”意味著單環(huán)或多環(huán)芳香烴基團。除非另有說明，芳基基團可具有6至14個碳原子。合適的芳基基團的實例包括：苯基、甲苯基、蒽基、芴基、茚基、薁基和萘基；以及苯并稠合碳環(huán)部分，例如5,6,7,8-四氫萘基。芳基基團可以是未取代的，或取代有一個或多個(例如1至5個、例如1至4個、例如1個或2個或3個)取代基。任選的取代基可以是增溶基團。
術語“環(huán)烷基”或“環(huán)烷基基團”意味著飽和或部分不飽和的單環(huán)、稠合雙環(huán)或橋連多環(huán)集合體(assembly)。這包括取代或未取代的環(huán)烷基基團。例如，環(huán)烷基基團可為C3-C10環(huán)烷基基團，如C3或C4環(huán)烷基基團、如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基或環(huán)辛基基團。
本文所用術語“烷氧基”或“烷氧基基團”是指通過氧原子連接至另一部分的、如上所定義的烷基基團。烷氧基基團的實例包括甲氧基、異丙氧基、乙氧基和叔丁氧基。
本文所使用的術語“雜環(huán)”泛指雜環(huán)烷基基團和雜芳基基團。
本文所使用的術語“雜環(huán)烷基”或“雜環(huán)烷基基團”意味著具有至少一個(例如1至5個、如1個或2個或3個或4個)選自于O、N或S的雜原子的單環(huán)或多環(huán)基團，所述基團可以是飽和的或不飽和的，但不是芳香族的基團。雜環(huán)烷基可具有2至11個碳原子。雜環(huán)烷基基團的實例包括：哌啶基、哌嗪基、N-甲基哌嗪基、2-氧代哌嗪基、2-氧代哌啶基、2-氧代吡咯烷基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、乙內(nèi)酰脲基、戊內(nèi)酰胺基、氧雜環(huán)丙烷基、氧雜環(huán)丁基、四氫吡喃基、四氫噻喃基、四氫吡啶基、四氫嘧啶基、四氫噻喃基砜、四氫噻喃基亞砜、嗎啉基、硫代嗎啉基、硫代嗎啉基亞砜、硫代嗎啉基砜、1,3-二氧戊環(huán)、四氫呋喃基、二氫呋喃基-2-酮、四氫噻吩基以及四氫-1,1-二氧代噻吩基。通常，單環(huán)雜環(huán)烷基基團具有3至7個環(huán)原子。優(yōu)選的3至7元單環(huán)雜環(huán)烷基基團具有5或6個環(huán)原子。雜原子上可以取代有本領域普通技術人員已知的保護基團，例如，氮上的氫可以被叔丁氧基羰基取代。此外，雜環(huán)烷基基團可以是未取代的，或取代有一個或多個(例如1至4個、如1個或2個)取代基。此外，雜環(huán)與另一基團的連接位點可以在雜環(huán)的碳原子或雜原子上。
本文所使用的術語“雜芳基”或“雜芳基基團”意味著單環(huán)或多環(huán)雜芳環(huán)，包括碳原子環(huán)成員以及一個或多個雜原子環(huán)成員(例如，如氧、硫或氮)。通常，雜芳基基團可具有5至14個、如5至8個環(huán)成員。通常，雜芳基基團具有1至5個、如1個或2個或3個或4個雜原子環(huán)成員。通常可具有1至約14個碳原子環(huán)成員。具有代表性的雜芳基基團包括吡啶基、1-氧代-吡啶基、呋喃基、苯并[1,3]二氧雜環(huán)戊烯基、苯并[1,4]二氧雜環(huán)己二烯基、噻吩基、吡咯基、噁唑基、咪唑基、噻唑基、異噁唑基、喹啉基、吡唑基、異噻唑基、噠嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、三唑基、噻二唑基、異喹啉基、吲唑基、苯并噁唑基、苯并呋喃基、吲嗪基、咪唑并吡啶基、四唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并噁二唑基、吲哚基、四氫吲哚基、氮雜吲哚基、咪唑并吡啶基、喹唑啉基、嘌呤基、吡咯并[2,3]嘧啶基、吡唑并[3,4]嘧啶基、咪唑并[1,2-a]吡啶基以及苯并(b)噻吩基。雜原子上可以取代有本領域普通技術人員已知的保護基團，例如，氮上的氫可以被叔丁氧基羰基取代。雜芳基基團可以是未取代的，或取代有一個或多個取代基。此外，氮或硫雜原子環(huán)成員可以被氧化。雜芳環(huán)可以為5-8元單環(huán)雜芳環(huán)。雜芳環(huán)或雜芳香環(huán)與另一基團的連接位點可以在雜芳環(huán)或雜芳香環(huán)的碳原子或雜原子上。
本文所使用的術語“取代基”或“取代的”意味著化合物或基團中的氫基團被替換為任何所期望的基團，所述所期望的基團以未受保護的形式或者在使用保護基團保護時，對于反應條件保持基本穩(wěn)定。取代基的實例為見于本文所公開的示例性化合物和實施方式中出現(xiàn)的基團、以及鹵素、如上所定義的烷基或芳基基團、羥基、如上所定義的烷氧基、硝基、巰基、雜環(huán)烷基基團、雜芳基基團、氰基、如上所定義的環(huán)烷基基團、以及增溶基團、-NRR'、-NR-CO-R'、-CONRR'、-SO2NRR'基團，其中，R和R'各自獨立地為氫或如上所定義的烷基。取代基的實例是鹵素、C1-C10未取代的烷基、C6-C14未取代的芳基、羥基、C1-C10未取代的烷氧基、硝基、巰基、未取代的3-7元雜環(huán)烷基、未取代的3-7元雜芳基、氰基、C1-C10的未取代環(huán)烷基、增溶基團、-NRR'、-NR-CO-R'、-CONRR'、-SO2NRR'基團，其中，R和R'各自獨立地為氫或C1-C10未取代的烷基。
本文所使用的術語“增溶”基團意味著相比于不含有該基團的類似化合物，具有足夠親水特性以改善或增加含有該基團的化合物的水溶性的基團。所述親水特性可以通過任何手段來實現(xiàn)，例如通過包含在使用條件下電離以形成帶電荷部分的官能團(例如，羧酸、磺酸、磷酸和胺等)、含有永久電荷的基團(例如，季銨基團)和/或雜原子或雜原子基團。
“雜原子基團”的實例為N-(CH2)zR”、N-(CH2)z-C(O)R”、N-(CH2)z-C(O)OR”、N-(CH2)z-S(O)2R”、N-(CH2)z-S(O)2OR”、N-(CH2)z-C(O)NR”R”'，其中z是0至6的整數(shù)，例如0、1、2、3、4、5或6，R”和R”'各自獨立地選自于由以下基團所組成的組：
氫；
C1-C10烷基基團，任選地取代有一個或多個雜原子、例如鹵素(選自于F、Cl、Br或I)、氧和氮；
C1-C10烷氧基基團；
未取代的芳基；以及
未取代的雜芳基基團。
所述增溶基團可以是具有下列結構之一的部分：
其中，
L選自于由CH和N所組成的組；
M選自于由–CH(R”)-、-CH2-、-O-、-S-、-NH-、-N(-(CH2)z-R”)-、-N(-(CH2)z-C(O)R”)-、-N(-(CH2)z-C(O)OR”)-、-N(-(CH2)z-S(O)2R”)-、-N(-(CH2)z-S(O)2OR”)-和-N(-(CH2)z-C(O)NR”R”')-所組成的組，其中z是0至6的整數(shù)，R”和R”'各自獨立地選自于：
氫；
C1-C10烷基基團，任選地取代有一個或多個雜原子、例如鹵素(選自于F、Cl、Br或I)、氧和氮；
C1-C10烷氧基基團；
未取代的芳基；以及
未取代的雜芳基；
或者基團-NR”R”'為基團-NRR'基團，其中Ra和Rb各自獨立地選自于氫或未取代的烷基；
但L和M不能同時分別為CH和CH2。
所述增溶基團的實例為：嗎啉基、哌啶基、吡咯烷基、N-(C1-C6)烷基哌啶基(尤其是N-甲基哌啶基和N-乙基哌啶基)、N-(4-哌啶基)哌啶基、4-(1-哌啶基)哌啶基、1-吡咯烷基哌啶基、4-嗎啉基哌啶基、4-(N-甲基-1-哌嗪基)哌啶基、哌嗪基、N-(C1-C6)烷基哌嗪基(尤其是N-甲基哌嗪基和N-乙基哌嗪基)、N-(C3-C6)環(huán)烷基哌嗪基(尤其是N-環(huán)己基哌嗪基)、吡咯烷基、N-(C1-C6)烷基吡咯烷基(尤其是N-甲基吡咯烷基和N-乙基吡咯烷基)、二氮雜基、N-(C1-C6)烷基氮雜基(尤其是N-甲基氮雜基和N-乙基氮雜基)、高哌嗪基、N-甲基高哌嗪基、N-乙基高哌嗪基和咪唑基。
可將式(I)的化合物以衍生自藥學上可接受的無機酸或有機酸的鹽的形式使用。除非另有說明，“藥學上可接受的鹽”是指通過使式(I)的化合物與以下酸或堿結合而制備的鹽：所述酸的陰離子或所述堿的陽離子通常認為適于人類服用。藥學上可接受的鹽作為本發(fā)明的產(chǎn)品特別有用，這是因為它們相對于母體化合物具有更大的水溶性。對于用于藥物而言，本發(fā)明的化合物的鹽是無毒的“藥學上可接受的鹽”。術語“藥學上可接受的鹽”中涵蓋的鹽是指通常通過使游離堿與合適的有機酸或無機酸反應來制備的本發(fā)明化合物的無毒鹽。有可能的話，本發(fā)明化合物的合適的藥學上可接受的酸加成鹽包括衍生自以下酸的酸加成鹽：無機酸，如鹽酸、氫溴酸、氫氟酸、硼酸、氟硼酸、磷酸、偏磷酸、硝酸、碳酸、磺酸和硫酸；以及有機酸，如乙酸、苯磺酸、苯甲酸、檸檬酸、乙磺酸、富馬酸、葡糖酸、乙醇酸、異硫羰(isothiotonic)酸、乳酸、乳糖酸、馬來酸、蘋果酸、甲磺酸、三氟甲磺酸、琥珀酸、甲苯磺酸、酒石酸以及三氟乙酸。合適的有機酸通常包括例如脂族類、環(huán)脂族類、芳族類、芳脂族類、雜環(huán)類、羧酸類和磺酸類的有機酸。合適的有機酸的具體實例包括：乙酸鹽、三氟乙酸鹽、甲酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽、乙醇酸鹽、葡糖酸鹽、二葡糖酸鹽、乳酸鹽、蘋果酸鹽、酒石酸、檸檬酸鹽、抗壞血酸鹽、葡糖醛酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、丙酮酸鹽、天冬氨酸鹽、谷氨酸鹽、苯甲酸鹽、鄰氨基苯甲酸、硬脂酸鹽、水楊酸鹽、對羥基苯甲酸鹽、苯基乙酸鹽、扁桃酸鹽、雙羥萘酸鹽(撲酸鹽)、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、泛酸鹽、甲苯磺酸鹽、2-羥基乙磺酸鹽、磺胺酸鹽、環(huán)己基氨基磺酸鹽、β-羥基丁酸鹽、半乳糖二酸鹽(galactarate)、半乳糖醛酸鹽、己二酸鹽、藻酸鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、環(huán)戊烷丙酸鹽、十二烷基硫酸鹽、葡庚酸鹽、甘油磷酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、2-萘磺酸鹽、草酸鹽、撲酸鹽(palmoate)、果膠酸鹽、3-苯基丙酸鹽、苦味酸鹽、新戊酸鹽、硫氰酸鹽以及十一烷酸鹽。另外，在本發(fā)明的化合物帶有酸性部分的情況中，其合適的藥學上可接受的鹽可以包括：堿金屬鹽，即鈉鹽或鉀鹽；堿土金屬鹽，例如鈣鹽或鎂鹽；以及與合適的有機配體形成的鹽，例如季銨鹽。在另一實施方式中，堿鹽由形成無毒鹽的堿形成，包括鋁鹽、精氨酸鹽、芐星(benzathine)鹽、膽堿鹽、二乙胺鹽、二乙醇胺鹽、甘氨酸鹽、賴氨酸鹽、葡甲胺鹽、乙醇胺鹽、氨丁三醇鹽和鋅鹽。有機鹽可以由仲胺鹽、叔胺鹽或季胺鹽制成，例如氨丁三醇、二乙胺、N,N’-二芐基乙二胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(N-甲基葡糖胺)和普魯卡因。堿性含氮基團可以用以下試劑進行季銨化，例如：低級烷基(C1-C6)鹵化物(例如甲基、乙基、丙基和丁基的氯化物、溴化物和碘化物)、二烷基硫酸鹽(例如二甲基、二乙基、二丁基和二戊基硫酸鹽)、長鏈鹵化物(例如癸基、十二烷基、十四烷基和十八烷基的氯化物、溴化物和碘化物)、芳烷基鹵化物(例如芐基和苯乙基的溴化物)等。還可形成酸和堿的半鹽，例如半硫酸鹽和半鈣鹽。
除非另有說明，語句“式(I)的化合物”包括式I化合物的所有形式，包括其水合物、溶劑合物、異構體、結晶及非結晶形式、同晶型體、多晶型物以及代謝物。例如，式(I)的化合物或其藥學上可接受的鹽可以以未溶劑化和溶劑化的形式存在。當溶劑或水被緊密結合時，復合物將具有與濕度無關的明確定義的化學計量。然而，當溶劑或水被弱結合時(正如在通道溶劑合物(channel solvates)和吸濕性化合物中)，水/溶劑的含量將取決于濕度和干燥條件。在這類情況中，非化學計量將是正常情況。式(I)的化合物的立體異構體包括：本發(fā)明化合物的順式和反式異構體、光學異構體(如R和S對映體)、非對映體、幾何異構體、旋轉(zhuǎn)異構體、構象異構體、互變體，包括表現(xiàn)出多于一種異構現(xiàn)象的化合物；以及它們的混合物(如外消旋體和非對映體對)。除非另有說明，語句“式(I)的化合物”包括化合物的互變形式。在結構異構體可經(jīng)由低能壘互相轉(zhuǎn)化的情況中，可發(fā)生互變異構(“互變現(xiàn)象”)。這可在含有例如亞氨基、酮基或肟基基團的本發(fā)明化合物中采取質(zhì)子互變現(xiàn)象的形式，或在含有芳香族部分的化合物中采取所謂的價態(tài)互變現(xiàn)象的形式。這遵循了單一化合物可表現(xiàn)出多于一種類型的異構現(xiàn)象。處于固體和液體形式的互變體的不同比例取決于分子上的不同取代基以及用于分離化合物的具體結晶技術。
可使用如下通用的實驗方案來制備本發(fā)明化合物：
通用合成步驟
本發(fā)明的化合物可通過多種方法(包括方案1-4中所概述的方法)來制備，其中，除非進一步指明，取代基如上述式(I)所定義。以下描述的合成方法僅僅是示例性的，本發(fā)明的化合物可通過本領域普通技術人員所明了的替代路線來合成。
使用A.Benjahad等(Tetrahedron Letters，(1994)，9545-9548)所述的方法，使乙二胺與2-溴酯(1)反應來制備哌嗪酮(2)(方案1)。
方案1
可替代性地根據(jù)方案2中概述的實驗方案經(jīng)由N-對硝基苯磺酰基氮丙啶(4)來制備哌嗪酮(2)。使用改編自Iwaki等的方法(Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters，(2012)，2798-2802)來制備中間體N-對硝基苯磺?；?4)：首先通過使2-氯乙胺鹽酸鹽與對硝基磺酰氯反應，以得到N-對硝基苯磺酰胺(3)，隨后用氫氧化鉀將其環(huán)化以獲得(4)。如Maligres等(Tetrahedron Letters，(1997)，5253-5256)所述，用氨基酸乙酯鹽酸鹽(5)開環(huán)得到無環(huán)氨基酯(6)，再在2個步驟中將其環(huán)化：用苯硫酚進行N-脫保護，然后加熱以獲得哌嗪酮(2)。
方案2
使用Van Leusen等(Tetrahedron Letters，(1972)，2369-2372)的方法，使芳香醛(7)與對甲苯磺?；谆愲?TosMIC)反應，制備相應的5-芳基取代的噁唑(8)(方案3)。使用文獻方法制備非商品化的醛(7)。通過合適的有機堿(如六甲基二硅基氨基鋰，LiHMDS)將噁唑部分(8)去質(zhì)子化，隨后用親電氯化來制備2-氯噁唑化合物(9)。這使得能通過取代的哌嗪酮(2)將氯取代來獲得化合物(10)。這一取代在溶劑(如異丙醇)的存在下加熱進行，或在無溶劑的條件下加熱進行。在一些情況中，在溶劑的存在下，可通過使用酸(如鹽酸)來獲得化合物(10)。將硝基化合物(10)還原以形成相應的苯胺(11)。優(yōu)選地，還原反應在氫氣的存在下用催化劑(如鈀碳(10wt％))進行。在合適的溶劑(如醇)的存在下并在高溫中加熱，用化合物(11)通過直接的親核取代反應來制備式(I)的進一步類似物(12)，其中W-X的X可以為F、I、Br或Cl。對于推動反應完成或獲得提高的產(chǎn)率而言，酸(如鹽酸)的存在可以是必需的或非必需的。在一些情況中，可通過使用已知的金屬催化的N-芳基化的實驗方案，用配體和無機堿的適當組合來獲得化合物(12)。
方案3
根據(jù)方案4描述的反應方案，通過使用上述相同的實驗方案獲得式(I)的化合物(12)。
方案4
在第二方面，本公開文本公開了藥物組合物，所述藥物組合物包含如上所定義的式(I)化合物(如式(II)或式(III)化合物)或其藥學上可接受的鹽以及藥學上可接受的賦形劑和/或載體。在藥物組合物中，式(I)化合物可以是唯一的藥學活性成分，或者式(I)化合物可以與一種或多種不同的藥學活性成分組合。
合適的載體和賦形劑在本領域中是公知的，通常用于例如促進將活性化合物加工成可在藥學上使用的制劑。關于制劑和給藥技術的進一步細節(jié)可見于最新版的Remington's Pharmaceutical Sciences(Maack Publishing Co.，Easton，Pa.)。
取決于所期望的給予模式可使用各種形式的賦形劑，這些形式中的某些可促進或調(diào)整活性化合物的有效性，例如通過促進釋放性能(release profile)使得這一活性化合物整體上對于所期望的治療來說更有效。本發(fā)明的藥物組合物適于以各種形式、例如可注射形式、可粉化形式或可攝取形式進行給予，例如通過肌內(nèi)途徑、靜脈內(nèi)途徑、皮下途徑、皮內(nèi)途徑、口服途徑、局部途徑、直腸途徑、陰道途徑、眼部途徑、鼻部途徑、經(jīng)皮途徑或胃腸外途徑。
本文所公開的藥物組合物可旨在用于口服給予。在該情況中，可將所述組合物配制成如下制劑用于患者攝?。浩瑒?、丸劑、糖衣劑(dragees)、膠囊劑、液體劑、凝膠劑、糖漿劑、膏劑(slurries)和懸浮液劑等。
本文所公開的組合物可以是藥物組合物或化妝品組合物。所述組合物可旨在用于局部給予。此類組合物可以如下形式呈現(xiàn)：凝膠劑；糊劑；軟膏劑(ointment)；霜劑；乳液劑；液態(tài)懸浮劑；水醇溶液或者油性溶液；或者精華型或乳液劑的分散劑；或者無水凝膠劑或親脂凝膠劑；或者通過將脂相分散入水相中(或反之)得到的、奶型(milk type)的液態(tài)或半固態(tài)稠度的乳劑；或者霜劑或凝膠型的、軟質(zhì)半固體稠度的乳劑或懸浮液劑；或者可選地，針對離子型和/或非離子型的囊泡分散劑(vesicular dispersions)、微顆粒劑、微膠囊劑或微乳劑。根據(jù)標準方法制備這些組合物。
目前所定義的組合物可包含任何通常用于皮膚病學和化妝品中的成分。該組合物可包含選自如下成分中的至少一種：親水膠凝劑或親脂膠凝劑、親水活化劑或親脂活化劑、防腐劑、軟化劑、粘度增強聚合物、保濕劑、表面活性劑、防腐劑、抗氧化劑、溶劑、香料、填料、掩蔽劑、殺菌劑、吸味劑和著色劑。作為可用于本發(fā)明中的油可提及：礦物油(液體石蠟)、植物油(牛油樹脂的液體部分、葵花油)、動物油、合成油、硅油(環(huán)甲硅油)和氟化油。還可將脂肪醇、脂肪酸(硬脂酸)和蠟(石蠟、棕櫚蠟(carnauba)、蜂蠟)用作脂類物質(zhì)?？捎糜诒景l(fā)明的乳化劑包括例如硬脂酸甘油酯、聚山梨酯60和PEG-6/PEG-32/硬脂酸乙二醇酯混合物。可用于本發(fā)明的親水膠凝劑包括例如羧乙烯聚合物(卡波姆)、丙烯酸共聚物(如丙烯酸酯/烷基丙烯酸酯共聚物)、聚丙烯酰胺、多糖(如羥丙基纖維素)、粘土和天然膠，可用于本發(fā)明的親脂膠凝劑包括例如改性粘土(如有機皂土)、脂肪酸的金屬鹽(如硬脂酸鋁)和疏水性二氧化硅、或者乙基纖維素和聚乙烯。作為親水活化劑可使用：蛋白或蛋白水解物、氨基酸、多元醇、尿素、尿囊素、糖和糖衍生物、維生素、淀粉和植物提取物(尤其是蘆薈(Aloe vera)的提取物)。作為親脂活化劑可使用：視黃醇(維生素A)及其衍生物、生育酚(維生素E)及其衍生物、必需脂肪酸、神經(jīng)酰胺和精油(essential oil)。這些試劑在使用時增添了額外的保濕或軟化皮膚的特征。此外，組合物中可包含表面活性劑，以便對能夠去除肥大細胞的化合物(如酪氨酸激酶抑制劑)提供更深的穿透(penetration)。在所考慮的成分中，可選擇：穿透增強劑，選自例如由礦物油、水、乙醇、三醋精、甘油和丙二醇所組成的組；凝聚劑(cohesion agent)，選自例如由聚異丁烯、聚乙酸乙烯酯和聚乙烯醇組成的組；以及增稠劑。增強藥物局部吸收的化學方法是本領域公知的。例如，具有穿透增強特性的化合物包括十二烷基硫酸鈉(Dugard,P.H.和Sheuplein,R.J.，"Effects of Ionic Surfactants on the Permeability of Human Epidermis:An Electrometric Study"，J.Ivest.Dermatol.，V.60，(1973)，pp.263-69)、十二烷基胺氧化物(Johnson等，US 4,411,893)、氮酮(Rajadhyaksha，US 4,405,616和3,989,816)和癸甲基亞砜(Sekura,D.L.和Scala,J.，"The Percutaneous Absorption of Alkylmethyl Sulfides"，Pharmacology of the Skin，Advances In Biolocy of Skin，(Appleton-Century Craft)V.12，(1972)，pp.257-69)。已觀察到，提高兩性分子中頭部基團的極性使其穿透增強特性增加，但要以增加其皮膚刺激特性為代價(Cooper,E.R.和Berner,B.，"Interaction of Surfactants with Epidermal Tissues:Physiochemical Aspects"，Surfactant Science Series，V.16，Reiger,M.M.編著，(Marcel Dekker,Inc.)，(1987)，pp.195-210)。化學增強劑還可以是共溶劑。這些材料相對易于通過各種機制進行局部吸收，對于一些藥物而言實現(xiàn)滲透增強。在顯示出使得各種化合物的吸收得以增強的能力方面，乙醇(Gale等，美國專利號4,615,699和Campbell等，美國專利號4,460,372和4,379,454)、二甲亞砜(US 3,740,420和US 3,743,727以及US 4,575,515)和甘油衍生物(US 4,322,433)為這類化合物的幾個實例。
本文所公開的藥物組合物還可旨在用于以氣霧制劑給予至患者呼吸道的目標區(qū)域。在US 5,906,202中公開了用于遞送藥物制劑氣霧噴射(aerosolized bursts)的裝置和方法學。制劑優(yōu)選為溶液，例如水溶液、乙醇溶液、水/乙醇溶液、鹽水溶液、膠態(tài)懸浮液和微晶懸浮液。例如，氣霧顆粒包含上文所述活性成分和載體(例如，藥學上活性的呼吸藥物和載體)，所述氣霧顆粒通過推動制劑通過噴嘴而形成，所述噴嘴優(yōu)選為柔性多孔膜的形式。所述顆粒具有足夠小的尺寸，使得顆粒形成時仍然在空氣中懸浮足夠長的時間，從而使患者可將顆粒吸入患者的肺內(nèi)。例如在US 5,556,611中探討了用于將本發(fā)明化合物給予至患者呼吸道的合適的裝置：
-液態(tài)氣體體系(將液化氣體用作推進氣體，例如低沸點的FCHC或丙烷、丁烷，其處于壓力容器中)；
-懸浮氣霧劑(活性物質(zhì)顆粒以固態(tài)形式懸浮在液態(tài)推進相中)；
-加壓的氣體體系(使用壓縮氣體，如氮氣、二氧化碳、一氧化二氮或空氣)。
因此，本文所公開的藥物組合物通過如下方式制成：將活性物質(zhì)溶于或分散在合適的無毒介質(zhì)中，并將所述溶液或分散液霧化成氣霧劑，即，極其細微地分布在載氣中。這在技術上是可行的，例如為如下形式：氣霧劑推進氣體包；泵送氣霧劑；或本身已知用于液體成霧和固體霧化的其它裝置，尤其是允許精確個體用量的裝置。因此，本公開文本還公開了包含如上所定義的化合物和此類制劑的氣霧劑裝置，優(yōu)選具有計量的給藥閥。
本文所公開的藥物組合物還可旨在用于鼻內(nèi)給予。關于這一點，本領域普通技術人員將容易地明白用于向鼻粘膜表面給予化合物的藥學上可接受的載體。在Remington’s Pharmaceutical Sciences，第16版，(1980)，Arthur Osol編著中描述了這些載體，以引用的方式將其公開文本并入本文。
為了通過上呼吸道進行給予，可將所述組合物配制成溶液，例如，緩沖或無緩沖的水或等滲鹽水；或配制成懸浮液，以滴劑或噴霧劑用于鼻內(nèi)給予。優(yōu)選地，此類溶液或懸浮液相對于鼻部分泌物而言是等滲的、并且具有相同的pH，例如約pH 4.0-約pH 7.4或pH 6.0-pH 7.0。緩沖液應該是生理上相容的，僅舉一例來說包括磷酸鹽緩沖液。例如，代表性的鼻減充血劑描述為緩沖至pH約6.2(Remington’s，同前，第1445頁)。當然，對于鼻部和/或上呼吸道給予而言，本領域普通技術人員能夠容易地確定無害的水性載體合適的pH和鹽水含量。還可將粘度例如約10cps-約3000cps或約2500cps-6500cps以上的常見鼻內(nèi)載體(包括鼻部凝膠劑、霜劑、糊劑或軟膏劑)用于提供與鼻粘膜表面的更持久接觸。僅以舉例的方式來說，此類載體粘性制劑可基于本領域公知烷基纖維素和/或其它高粘度的生物相容載體(參見例如，上文所引用的Remington’s)。優(yōu)選烷基纖維素例如，濃度為每100ml載體約5mg-約1000mg的甲基纖維素。僅以舉例的方式來說，更優(yōu)選的甲基纖維素濃度是每100ml載體約25mg-大約150mg。還可包含其它成分對制劑提供額外的粘度、保濕性和合意的質(zhì)地和氣味，所述其它成分例如已知的防腐劑、著色劑、潤滑或粘性的礦物油或植物油、香料、天然或合成的植物提取物(例如芳香油)、以及保濕劑和粘度增強劑(例如甘油)。對于溶液或懸浮液的鼻部給予，可利用本領域用于生成液滴(drops)、霧滴(droplets)和噴霧(sprays)的各種裝置。
將含有滴量器(dropper)或噴霧裝置的預先測定單位劑量分配器制成包含一個或多個劑量的待給予藥物，所述滴量器或噴霧裝置含有作為液滴或作為噴霧進行遞送的溶液或懸浮液。還公開了準備通過加入適量水制成溶液或懸浮液的試劑盒，所述試劑盒含有一個或多個單位脫水劑量的本文所公開的式(I)化合物以及任何所需的鹽和/或緩沖劑、防腐劑和著色劑等。
本公開文本的另一方面針對如上所定義的式(I)化合物(如式(II)或式(III)化合物)或其藥學上可接受的鹽，將其作為藥物使用。
本文所公開的式(I)化合物或其藥學上可接受的鹽(也被共同稱為“式(I)化合物”)具有Syk酪氨酸激酶抑制活性。尤其是，所述化合物能夠抑制(從而調(diào)節(jié))由Syk介導的信號轉(zhuǎn)導。
因此，本公開文本的一個方面公開了用于對與Syk活性不受調(diào)控或失調(diào)(unregulated or deregulated)相關的疾病或病癥進行治療的方法，所述方法包括向需要該治療的受試者(例如人或動物受試者)給予有效量的式(I)化合物。例如，本公開文本公開了用于對與Syk介導的信號轉(zhuǎn)導相關的疾病或病癥進行治療的方法，本公開文本還公開了用于治療相關疾病或病癥的方法。
對于每天每千克體重而言，通常以0.1mg至2g化合物的量包含有效量的式(I)化合物。
另一方面，本公開文本公開了用于在細胞中調(diào)整、調(diào)節(jié)和/或抑制由Syk蛋白激酶介導的信號轉(zhuǎn)導的方法。所述方法包括向細胞給予至少一種如上所定義的式(I)化合物(如式(II)或式(III)化合物)、或其藥學上可接受的鹽。
本公開文本公開了至少一種式(I)化合物或其藥學上可接受的鹽用于體外或體內(nèi)選擇性抑制Syk的用途。
本發(fā)明公開的方法可用于在患者中治療血液疾病或病癥、炎性疾病或病癥、自身免疫疾病或病癥、增殖疾病或病癥、代謝疾病或病癥、變應性疾病或病癥和/或退行性疾病或病癥。
在一個實施方式中，所述受試者或患者已被診斷患有血液病癥、變應性病癥、代謝病癥、炎性病癥、自身免疫病癥和/或增殖病癥。
已知與Syk介導的信號轉(zhuǎn)導不受調(diào)控或失調(diào)相關的疾病和病癥例如：
-血液病癥，如非霍奇金淋巴瘤和白血病，包括彌漫性大B-細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、B細胞慢性淋巴細胞性白血病(B-CLL)/小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL)、Waldenstrom巨球蛋白血癥(WM)、邊緣區(qū)淋巴瘤(MZL)、伯基特淋巴瘤、外周T-細胞淋巴瘤(PTCL)以及多發(fā)性骨髓瘤(MM)、骨髓增生異常綜合征(MDS)、伴有骨髓纖維化的骨髓增生異常；
-腫瘤性疾病，如肥大細胞病、實體瘤，包括頭頸癌、肝細胞癌以及人胃腸道病癥；
-代謝疾病，如糖尿病及其慢性并發(fā)癥、肥胖癥、II型糖尿病、高脂血癥和血脂異常、動脈粥樣硬化、高血壓和心血管疾病；
-變應性疾病，如哮喘、變應性鼻炎、變應性竇炎、過敏性綜合征(anaphylactic syndrome)、蕁麻疹、血管性水腫、特應性皮炎、變應性接觸性皮炎、結節(jié)性紅斑、多形性紅斑、皮膚壞死性小靜脈炎(cutaneous necrotizing venulitis)和蟲咬性皮膚炎癥以及吸血寄生蟲感染；
-骨吸收(骨質(zhì)疏松癥)；
-血管生成；
-炎性疾病，如類風濕性關節(jié)炎、結膜炎、類風濕性脊椎炎、骨關節(jié)炎、痛風性關節(jié)炎及其他關節(jié)炎病情；
-自身免疫疾病，如多發(fā)性硬化、牛皮癬、腸道炎性疾病、潰瘍性結腸炎、克羅恩氏病、類風濕性關節(jié)炎和多發(fā)性關節(jié)炎、局部和全身性硬皮病、全身性紅斑狼瘡、盤狀紅斑狼瘡、皮膚狼瘡(cutaneous lupus)、皮肌炎、多發(fā)性肌炎、斯耶格倫氏綜合征、結節(jié)性全身動脈炎、自身免疫性腸病以及增生性腎小球腎炎和T-細胞介導的自身免疫糖尿?。?/p>
-在任何器官移植(包括腎、胰腺、肝、肺)中以及對于治療白血病和淋巴瘤、異位心臟移植而言，對同種異體造血細胞移植的移植物排斥或移植物抗宿主疾?。?/p>
-本發(fā)明所涵蓋的其它自身免疫疾病，包括慢性活動性肝炎和慢性疲勞綜合征；
-血管炎；
-病毒感染；
-真菌感染；
-細菌感染；
-CNS病癥，如Nasu-Hakola疾病、精神病癥、偏頭痛、疼痛、記憶喪失和神經(jīng)細胞退化。具體而言，將本發(fā)明所述方法用于治療下述病癥：抑郁癥，包括心境惡劣障礙、循環(huán)情感性障礙、兩極型憂郁癥、重度抑郁或“憂郁質(zhì)”抑郁、非典型性抑郁、難治性抑郁、季節(jié)性抑郁；厭食癥；貪食癥；經(jīng)期前綜合征；絕經(jīng)后綜合征(post-menopause syndrome)；其它綜合征，如精神遲鈍(mental slowing)和注意力不集中；悲觀憂慮(pessimistic worry)；激動；自我貶損(self-deprecation)；性欲降低；疼痛，包括急性疼痛、術后疼痛、慢性疼痛、傷害感受性疼痛、癌性疼痛、神經(jīng)性疼痛、心因性疼痛綜合征；焦慮病癥，包括與換氣過度和心率失常相關的焦慮、恐怖癥、強迫癥、創(chuàng)傷后應激障礙、急性應激障礙、泛化性焦慮癥；諸如驚恐發(fā)作(panic attacks)的精神病急癥，包括精神異常、妄想性障礙、轉(zhuǎn)換障礙(conversion disorders)、恐懼癥、躁狂癥、譫妄(delirium)；解離型發(fā)作(dissociative episode)，包括解離型健忘癥、解離型神游癥和解離型認同癥、人格解體、緊張癥、癲癇(seizures)；重度精神病急癥，包括自殺行為、自我忽視、暴力或攻擊性行為、創(chuàng)傷、邊緣型人格和急性精神異常；精神分裂癥，包括類偏狂型精神分裂癥、錯亂型精神分裂癥、緊張型精神分裂癥和混合型精神分裂癥；
-神經(jīng)退行性疾病，包括阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷頓氏病、朊病毒病、運動神經(jīng)元病(MND)和肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS)；
-腦缺血；
-視網(wǎng)膜缺血；
-缺血性中風；
-纖維癥。
惡性血液病可以是非霍奇金淋巴瘤(NHL)，包括B-CLL/SLL、DLBCL、FL、MCL和WM、外周T-細胞淋巴瘤和骨髓增生異常綜合征(MDS)。增殖病癥可以是癌癥。自身免疫病癥可以是多發(fā)性硬化、牛皮癬、腸道炎性疾病、潰瘍性結腸炎、克羅恩氏病、類風濕性關節(jié)炎和多發(fā)性關節(jié)炎、局部和全身性硬皮病、全身性紅斑狼瘡、盤狀紅斑狼瘡、皮膚狼瘡(cutaneous lupus)、皮肌炎、多發(fā)性肌炎、斯耶格倫氏綜合征、結節(jié)性全身動脈炎、自身免疫性腸病、特應性皮炎和/或增生性腎小球腎炎。變應性疾病可以是哮喘、變應性鼻炎、變應性竇炎、過敏性綜合征(anaphylactic syndrome)、蕁麻疹、血管性水腫、特應性皮炎、變應性接觸性皮炎、結節(jié)性紅斑、多形性紅斑、皮膚壞死性小靜脈炎(cutaneous necrotizing venulitis)和蟲咬性皮膚炎癥以及吸血寄生蟲感染。神經(jīng)疾病可以是亨廷頓氏病、精神分裂癥、帕金森氏病和/或阿爾茨海默氏病。
在一個特定的實施方式中，本發(fā)明公開的方法可以用于預防或治療選自于以下的疾病或病癥：類風濕性關節(jié)炎、哮喘、多發(fā)性硬化、特應性皮炎、克羅恩氏病、間質(zhì)性膀胱炎、強直性脊柱炎、慢性阻塞性肺病、牛皮癬、肥大細胞病、B-細胞惡性腫瘤、結腸直腸癌、肺癌、胃癌、膠質(zhì)母細胞瘤、胃腸道間質(zhì)瘤(GIST)、黑素瘤、乳腺癌、三陰性乳腺癌、胃癌、oesogastric癌、胰腺癌、前列腺癌、多發(fā)性骨髓瘤、T細胞淋巴瘤、頭頸癌、肝細胞癌、霍奇金淋巴瘤、缺血性肝炎，乙型肝炎、肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS)、帕金森氏病、肌肉萎縮癥(de Duchene)、進行性核上性麻痹(PSP)、腦缺血、成癮、可卡因成癮、抑郁癥、與重性抑郁癥或心境惡劣障礙相關的情緒病癥、以及阿爾茨海默氏病。
可將式(I)化合物(如式(II)或式(III)化合物)或其藥學上可接受的鹽用于治療上述所公開的疾病或病癥，例如血液病癥、增殖病癥、自身免疫病癥、代謝病癥、炎性病癥和/或變應性病癥。
在本文所公開的方法中，可將式(I)化合物或其藥學上可接受的鹽用作唯一的活性藥物成分，或與另一活性藥物成分組合使用。
本公開文本公開了用于預防或治療選自于血液病癥、細胞增殖病癥、代謝病癥、炎性病癥、自身免疫病癥和變應性病癥的疾病或病癥的方法，所述方法包括：以足夠提供治療效果的量，向有需要的人或動物受試者同時或順序地給予與另一活性藥物成分相組合的至少一種式(I)化合物或其藥學上可接受的鹽。
本公開文本公開了藥物組合物，所述藥物組合物包含式(I)化合物(如式(II)或式(III)化合物)或其藥學上可接受的鹽以及另一活性藥物試劑作為組合制劑，以順序、同時或分別用于治療選自于由血液病癥、增殖病癥、自身免疫病癥、炎性病癥和變應性病癥所組成的組中的疾病或病癥。
本公開文本公開了任選與另一藥學活性試劑相組合的式(I)化合物(如式(II)或式(III)化合物)或其藥學上可接受的鹽在制造藥物方面的用途，所述藥物用于治療選自于由血液病癥、增殖病癥、代謝病癥、自身免疫病癥、炎性病癥和變應性病癥所組成的組中的疾病或病癥。
盡管上述所公開的方法與用途是指式(I)化合物(如式(II)或(III)化合物)或其藥學上可接受的鹽，但只要技術上兼容，應將它們理解為同樣是指包含相同化合物的藥物組合物。
通過下述實施例對本發(fā)明加以闡明，其代表了目前的優(yōu)選實施方式(構成了本發(fā)明的一部分)，但不應將實施例用于對本發(fā)明的范圍進行限定。
化合物合成的實施例
通過參考下述制備實例將更全面地理解本發(fā)明，但不應將所述制備實例視為對本發(fā)明的范圍的限定。通用內(nèi)容：所有使用的化學品都是商品試劑級產(chǎn)品。溶劑為無水的商品級，并且無需進一步純化而直接使用。通過使用預涂硅膠60F 254(Merck TLC板)的薄層色譜對反應進程進行監(jiān)測，在UV光下加以可視化。1H NMR光譜中的多重性表示為單峰(s)、寬單峰(br s)、雙峰(d)、三重峰(t)、四重峰(q)以及多重峰(m)，NMR譜在Bruker 300或400MHz光譜儀中進行。在連接至TQD質(zhì)譜儀的超高壓液相色譜(UPLC)ACQUITY Waters儀器上運行液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LCMS)。使用的梯度為：在t＝0.0min時以處于水+0.1％甲酸中的5％CH3CN+0.1％甲酸起始，直至t＝0.5min；然后，從t＝0.5min至t＝7.0min以線性梯度達到100％CH3CN+0.1％甲酸；然后，從t＝7.0min至t＝10.0min保持這一狀態(tài)。使用的柱為Waters HSS C18 1.8μm，2.1×50mm。使用的檢測儀器為使用電噴霧離子化(ESI)正離子模式的三重四極質(zhì)譜儀(TQD)。使用ChemDraw Ultra版本7.0.1生成化學名稱。
縮寫：
CDCl3 氘代氯仿
Conc.HCl 濃鹽酸(37％)
Cs2CO3 碳酸銫
DCM 二氯甲烷
DMSO-d6 六氘代二甲亞砜
EtOAc 乙酸乙酯
EtOH 乙醇
Et3N 三乙胺
Fe(acac)3 三(乙酰丙酮)鐵(III)
h 小時
iPrOH 2-丙醇
K2CO3 碳酸鉀
KOH 氫氧化鉀
LiHMDS 二(三甲基硅基)氨基鋰
MeCN 乙腈
MeOH 甲醇
MgSO4 硫酸鎂
Mins 分鐘
NaCl 氯化鈉
Na2CO3 碳酸鈉
NaHCO3 碳酸氫鈉
Ns 對硝基苯磺酰基或p-硝基苯磺?；?/p>
Pd2(dba)3 三(二亞芐基丙酮)二鈀(0)
Pd(PPh3)4 四(三苯基膦)鈀(0)
RT 室溫
SiO2 硅膠
TosMIC 對甲苯磺酰基甲基異腈
THF 四氫呋喃
tR 保留時間
Xantphos 4,5-雙(二苯基膦)-9,9-二甲基氧雜蒽
實施例001：
化合物001的合成途徑
4,7-二氮雜-螺[2.5]辛烷-8-酮(Ie)的制備
中間體(Ie)的合成途徑
N-(2-氯-乙基)-4-硝基苯磺酰胺(If)的制備
在0℃，滴加處于干燥DCM(25ml)中的對硝基苯磺酰氯(1.91g，8.62mmol)溶液，對處于干燥DCM(25ml)中的2-氯乙胺鹽酸鹽(1.00g，8.62mmol)和Et3N(3.60ml，25.9mmol)攪拌后的溶液進行處理。加入完成后，將溶液升至環(huán)境溫度并攪拌過夜。將溶液蒸發(fā)，通過柱色譜(SiO2，處于環(huán)己烷中的20％EtOAc至30％EtOAc)將殘余物純化，獲得白色固體狀的標題化合物(2.03g，89％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.45-8.38(m,3H),8.09-8.04(m,2H),3.59(t,J＝6.0Hz,2H),3.17(s,2H)。
1-(4-硝基-苯磺酰基)-氮丙啶(Ig)的制備
根據(jù)Iwaki等(Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,(2012)，2798-2802)的方法制備中間體Ig。用處于水(12ml)中的KOH(2.54g，45.3mmol)溶液一次性對處于甲苯(100ml)中的If(2.00g，7.56mmol)攪拌后的漿狀物進行處理，然后在環(huán)境溫度下攪拌3h。將溶液用EtOAc稀釋，將有機相分離，用飽和NaCl水溶液洗滌，干燥(MgSO4)，過濾并蒸發(fā)，獲得淺黃色固體狀的標題化合物(1.41g，82％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.47-8.26(m,2H),8.24-8.10(m,2H),2.48(s,4H)。
1-[2-(4-硝基-苯磺?；被?-乙基氨基]-環(huán)丙烷甲酸乙酯(Ih)的制備
將處于干燥乙腈(120ml)中的Ns-氮丙啶的Ig(6.89g，30.2mmol)、1-氨基-環(huán)丙烷甲酸乙酯鹽酸鹽(5.00g，30.2mmol)和Na2CO3(3.20g，30.2mmol)的混合物加熱回流3h。將混合物冷卻，過濾并蒸發(fā)。通過柱色譜(SiO2，處于DCM中的5％丙酮至10％丙酮)將殘余物純化，獲得淺黃色固體狀的標題化合物(6.58g，61％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.41(d,J＝8.8Hz,2H),8.04(d,J＝8.8Hz,2H),7.84(br s,1H),4.02(q,J＝7.1Hz,2H),2.84(s,2H),2.72-2.58(m,3H),1.14(t,J＝7.1Hz,3H),1.07(dd,J＝7.0,3.7Hz,2H),0.81(dd,J＝7.0,3.8Hz,2H)。
4,7-二氮雜-螺[2.5]辛烷-8-酮的制備(Ie)
主要根據(jù)Maligres等(Tetrahedron Letters，(1997)，5253-5256)的方法進行制備。將處于干燥乙腈(250ml)中的保護的氨基酯Ih(5.45g，15.3mmol)的溶液用K2CO3(8.95g，64.8mmol)和苯硫酚(4.96ml，48.6mmol)進行處理，并在50℃下攪拌過夜。在真空下將混合物蒸發(fā)，通過柱色譜(SiO2，10:90:1EtOH:DCM:NH4OH(體積比))將殘余物純化，獲得灰白色固體狀的標題化合物(1.14g，59％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.53(s,1H),3.26(s,2H),2.84(s,3H),1.01(dd,J＝6.1,3.1Hz,2H),0.60(dd,J＝6.1,3.1Hz,2H)。
5-(3-硝基-苯基)-噁唑(Ia)的制備
將處于甲醇(400ml)中的3-硝基苯甲醛(15.0g，99.3mmol)的溶液用TosMIC(21.3g，109mmol)和K2CO3(16.5g，119mmol)進行處理，并加熱回流30分鐘。將冷卻的溶液濃縮，用水(400ml)處理以形成大量沉淀，過濾。將濾餅用水洗滌，然后將固體置于EtOAc中，并用MgSO4干燥。將溶液過濾并蒸發(fā)，將所得固體在真空下干燥，得到米色固體狀的標題化合物(18.0g，95％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.56(s,1H),8.50(t,J＝1.9Hz,1H),8.21(ddd,J＝8.2,2.3,1.0Hz,1H),8.17(ddd,J＝7.8,1.6,1.0Hz,1H),7.99(s,1H),7.78(t,J＝8.0Hz,1H)。
3-噁唑-5-基-苯胺(Ib)的制備
將處于無水乙醇(210ml)中的中間體Ia(3.52g，18.5mmol)的溶液用水(21ml)、然后用SnCl2·2H2O(20.9g，92.6mmol)和濃HCl(15ml，180mmol)進行處理。在室溫下攪拌過夜后，用10％NaOH水溶液將溶液調(diào)至pH 7，并用EtOAc重復萃取。將有機物干燥(MgSO4)，過濾并蒸發(fā)，獲得淺橙色粉末狀的標題化合物(2.74g，93％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.37(s,1H),7.49(s,1H),7.10(t,J＝7.8Hz,1H),6.90(t,J＝1.8Hz,1H),6.86(d,J＝7.6Hz,1H),6.59–6.54(m,1H),5.25(s,2H)。
(4-甲基-嘧啶-2-基)-(3-噁唑-5-基-苯基)-胺(Ic)的制備
將處于2-丙醇(50ml)中的中間體Ib(1.00g，6.24mmol)的溶液用處于乙醇(7.5ml，9.38mmol)中的2-氯-4-甲基嘧啶(800mg，6.22mmol)和1.25M HCl溶液進行處理，加熱回流40h。將溶劑蒸發(fā)，將殘余物用飽和NaHCO3水溶液調(diào)成堿性，并用EtOAc萃取。將有機物干燥(MgSO4)，過濾并蒸發(fā)，獲得米色固體狀的標題化合物(1.04g，67％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.71(s,1H),8.45(s,1H),8.37(d,J＝4.9Hz,1H),8.23(s,1H),7.76(d,J＝7.9Hz,1H),7.60(s,1H),7.37(t,J＝7.8Hz,1H),7.30(d,J＝7.5Hz,1H),6.77(d,J＝4.9Hz,1H),2.38(s,3H)。
[3-(2-氯-噁唑-5-基)-苯基]-(4-甲基-嘧啶-2-基)-胺(Id)的制備
在氬氣、-78℃下，滴加處于THF中的1M LiHMDS溶液(7.20mmol，7.20mmol)，對處于干燥THF(60ml)中的中間體Ic(1.23g，4.88mmol)的溶液進行處理。在-78℃下45分鐘后，一次性加入六氯乙烷(1.39g，5.87mmol)，繼續(xù)進一步攪拌40分鐘，再升溫至RT。然后再次將溶液冷卻至-78℃，滴加1M LiHMDS(7.20ml，7.20mmol)進行處理，并立即使其升溫至室溫。將溶液用水處理，并用EtOAc萃取。將合并的有機相用鹽水洗滌，干燥(MgSO4)，過濾并蒸發(fā)。通過柱色譜(SiO2，處于環(huán)己烷中的20％至30％EtOAc)將殘余物純化，獲得淺黃色固體狀的標題化合物(1.17g，84％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.74(s,1H),8.37(d,J＝5.0Hz,1H),8.19(t,J＝1.8Hz,1H),7.79(dd,J＝8.0,1.8Hz,1H),7.70(s,1H),7.38(t,J＝7.9Hz,1H),7.27(d,J＝7.7Hz,1H),6.78(d,J＝5.0Hz,1H),2.38(s,3H)。
4-{5-[3-(4-甲基-嘧啶-2-基氨基)-苯基]-噁唑-2-基}-4,7-二氮雜-螺[2.5]辛烷-8-酮(化合物001)的制備
將中間體Id(800mg，2.79mmol)和Ie(704mg，5.58mmol)的混合物研磨在一起，并加熱至140℃1h。將冷卻的固體殘余物置于少量熱乙醇中，用NaHCO3溶液(飽和水溶液)處理，并用處于DCM中的10％乙醇萃取。將合并的有機相用鹽水洗滌，干燥(MgSO4)，過濾并蒸發(fā)。通過柱色譜(SiO2，處于DCM中的10％EtOH)將殘余物純化，獲得米色固體狀的標題化合物(691mg，66％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.63(s,1H),8.35(d,J＝5.0Hz,1H),8.09(t,J＝1.8Hz,1H),7.77(s,1H),7.66(dd,J＝8.1,1.3Hz,1H),7.31–7.26(m,2H),7.14(d,J＝7.8Hz,1H),6.76(d,J＝5.0Hz,1H),3.85(t,J＝5.7Hz,2H),3.44(td,J＝5.7,1.5Hz,2H),2.38(s,3H),1.46(dd,J＝7.8,4.5Hz,2H),1.32(dd,J＝7.7,4.4Hz,2H)。
實施例002：
化合物002的合成途徑
2-氯-5-(3-硝基-苯基)-噁唑(IIa)的制備
按如上對中間體Id所述，由中間體Ia進行制備，隨后通過柱色譜(SiO2，處于環(huán)己烷中的20％EtOAc)純化，獲得淺黃色固體狀的標題化合物(77％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.45–8.43(m,1H),8.21(ddd,J＝8.2,2.2,0.9Hz,1H),7.91(ddd,J＝7.8,1.5,1.0Hz,1H),7.64(t,J＝8.0Hz,1H),7.46(s,1H)。
4-[5-(3-硝基-苯基)-噁唑-2-基]-4,7-二氮雜-螺[2.5]辛烷-8-酮(IIb)的制備
將處于2-丙醇(100ml)中的中間體IIa(500mg，2.23mmol)和4,7-二氮雜-螺[2.5]辛烷-8-酮Ie(842mg，6.68mmol)的溶液加熱回流10天。將混合物冷卻至環(huán)境溫度，在真空下濃縮，通過過濾將形成的黃色沉淀除去，在干燥器中干燥，得到黃色固體狀的標題化合物(410mg，59％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.33(s,1H),8.08(dd,J＝8.1,1.9Hz,1H),7.99(d,J＝7.9Hz,1H),7.80(s,1H),7.75–7.66(m,2H),3.90(t,J＝5.6Hz,2H),3.42(t,J＝4.6Hz,2H),1.45(dd,J＝7.7,4.5Hz,2H),1.32(dd,J＝7.7,4.4Hz,2H)。
4-[5-(3-氨基-苯基)-噁唑-2-基]-4,7-二氮雜-螺[2.5]辛烷-8-酮(IIc)的制備
在環(huán)境溫度和大氣壓力下，將處于THF(60ml)和甲醇(40ml)中的硝基噁唑IIb(360mg，1.15mmol)的漿狀物和10％Pd/C(50mg)在氫氣氣氛下攪拌16h。將溶液過濾并在真空下蒸發(fā)后，通過柱色譜(SiO2，處于DCM中的5％EtOH)純化，獲得白色固體狀的標題化合物(230mg，79％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.79(s,1H),7.19(s,1H),7.04(t,J＝7.8Hz,1H),6.74–6.69(m,2H),6.46(dd,J＝7.9,1.9Hz,1H),5.19(s,2H),3.82(t,J＝5.6Hz,2H),3.43–3.38(m,2H),1.43(dd,J＝7.8,4.5Hz,2H),1.27(dd,J＝7.7,4.4Hz,2H)。
2-氯-4-氰基嘧啶(IId)的制備
主要根據(jù)WO2005/075468中所述的方法進行制備。在15℃下，用亞硝酸鈉(10.4g，150mmol)一次性對處于50％乙酸水溶液(100ml)中的4-甲基-1H-嘧啶-2-酮鹽酸鹽(14.7g，100mmol)進行處理，并劇烈攪拌引起放熱反應(40℃)。過濾出黃色沉淀，用冷水洗滌并在真空干燥器中干燥，獲得淡黃色固體狀的2-羥基-嘧啶-4-甲醛肟中間體(13.1g，94％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.44(s,1H),11.87(br s,1H),7.92(d,J＝6.3Hz,1H),7.77(d,J＝0.4Hz,1H),6.66(dd,J＝6.4,0.9Hz,1H)。將上述肟用磷酰氯(20ml)處理，并緩慢升溫至45℃。當溫度突然上升至70℃時，停止升溫，將混合物攪拌3h。加入二異丙基乙胺(2ml)，將混合物回流30分鐘后，傾入冰中并用DCM萃取。將有機物用水、然后用NaHCO3(飽和水溶液)、然后再次用水洗滌，干燥(MgSO4)，過濾并蒸發(fā)，獲得黃色油狀的中間體IId，該黃色油狀的中間體IId在靜置時結晶(1.51g，30％)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.15(d,J＝4.9Hz,1H),8.25(d,J＝4.9Hz,1H)。
2-{3-[2-(8-氧代-4,7-二氮雜-螺[2.5]辛-4-基)-噁唑-5-基]-苯基氨基}-嘧啶-4-甲腈(化合物002)的制備
將處于2-丙醇(3ml)中的中間體IIc(45mg，0.158mmol)和2-氯-4-氰基嘧啶IId(66mg，0.474mmol)的溶液加熱回流40h。將所形成的沉淀物過濾，并用NaHCO3溶液(飽和水溶液)處理，用處于DCM(50mL)中的10％乙醇萃取。將合并的有機相干燥(MgSO4)，過濾，然后在真空下部分濃縮。通過過濾將沉淀物收集，用乙醚洗滌并干燥，獲得黃色固體狀的化合物002(39mg，64％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.31(s,1H),8.79(d,J＝4.7Hz,1H),7.95(s,1H),7.81(s,1H),7.59(d,J＝8.2Hz,1H),7.41(d,J＝4.8Hz,1H),7.39–7.33(m,2H),7.25(d,J＝7.7Hz,1H),3.85(t,J＝5.6Hz,2H),3.44(t,J＝6.0Hz,2H),1.46(dd,J＝7.8,4.5Hz,2H),1.32(dd,J＝7.6,4.4Hz,2H)。
根據(jù)Jorgensen等(J.Am.Chem.Soc.，(2011)，15686-15696)的方法對非市售的2-氯-4-烷基嘧啶中間體進行制備，將該中間體用于制備化合物表中列出的化合物。
2-氯-4-乙基嘧啶(IIIa)的制備
在氬氣、-78℃下，滴加乙基溴化鎂溶液(處于THF中1M，16.2ml，16.2mmol)，從而對處于干燥THF(24ml)中的2,4-二氯嘧啶(2.00g，13.4mmol)和Fe(acac)3(954mg，2.70mmol)的混合物進行處理。在-78℃下攪拌30分鐘后，將混合物升溫至環(huán)境溫度并進一步攪拌1小時。將混合物再次冷卻至-78℃，用乙基溴化鎂溶液(10ml，10mmol)進行處理，升溫至RT。將該混合物用水稀釋，用EtOAc萃取，再將有機相干燥(MgSO4)，過濾并蒸發(fā)。通過柱色譜(SiO2，處于環(huán)己烷中的20％EtOAc)將殘余物純化，獲得澄清液體狀的標題化合物(642mg，34％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.64(d,J＝5.1Hz,1H),7.47(d,J＝5.1Hz,1H),2.76(q,J＝7.6Hz,2H),1.21(t,J＝7.6Hz,3H)。
通過Suzuki偶聯(lián)方法(參見例如N.Miyaura和A.Suzuki，Chemical Reviews，(1995)，2457-2483)，對2-氯-4-芳基-2-基-嘧啶和2-氯-4-雜芳基-2-基-嘧啶中間體進行制備，將該中間體用于制備化合物表中列出的化合物。
2-氯-4-噻吩-2-基-嘧啶(IIIb)的制備
將處于THF(20ml)中的2,4-二氯嘧啶(1.00g，6.71mmol)、2-噻吩硼酸(430mg，3.36mmol)、Na2CO3(處于水中的0.4M溶液，20ml，8.06mmol)和Pd(PPh3)4(78mg，0.067mmol)的混合物加熱至90℃過夜。將冷卻的混合物用水稀釋，用DCM萃取，將有機相干燥(MgSO4)，過濾并蒸發(fā)。通過柱色譜(SiO2，處于環(huán)己烷中的20％EtOAc)將殘余物純化，獲得白色固體狀的標題化合物(591mg，89％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.73(d,J＝5.3Hz,1H),8.16(dd,J＝3.8,1.1Hz,1H),8.04(d,J＝5.3Hz,1H),7.95(dd,J＝5.0,1.1Hz,1H),7.29(dd,J＝5.0,3.8Hz,1H)。
主要基于US2006/199804中所述的方法對4-氨基-2-氯-嘧啶中間體進行制備，將該中間體用于制備化合物表中列出的化合物。
4-(2-氯-嘧啶-4-基)-嗎啉(IIIc)的制備
在0℃下，用嗎啉(3.18ml，36.5mmol)對處于EtOH(60ml)中的2,4-二氯嘧啶(5.00g，36.5mmol)和二異丙基乙基胺(14.0ml，80.4mmol)的攪拌后的溶液進行處理，并升溫至環(huán)境溫度過夜。將溶液傾入鹽水中，并用DCM萃取。將有機相干燥(MgSO4)，過濾并蒸發(fā)。通過柱色譜(SiO2，處于DCM中的5％EtOH)將殘余物純化，得到白色固體狀的標題化合物IIIc(1.3g，36％)。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.10(d,J＝6.2Hz,1H),6.83(d,J＝6.2Hz,1H),3.72–3.49(m,8H)。
4-{5-[3-(4-甲基-吡啶-2-基氨基)-苯基]-噁唑-2-基}-4,7-二氮雜-螺[2.5]辛烷-8-酮(化合物021)的制備：
如對中間體Ia、IIa和IIb所述，由3-溴苯甲醛以3個步驟對4-[5-(3-溴-苯基)-噁唑-2-基]-4,7-二氮雜-螺[2.5]辛烷-8-酮(IVa)進行制備。1H NMR(400MHz,,DMSO-d6)δ7.81(s,1H),7.77(t,J＝1.7Hz,1H),7.58–7.54(m,1H),7.54(s,1H),7.44(ddd,J＝8.0,1.7,1.1Hz,1H),7.37(t,J＝7.9Hz,1H),3.87(t,J＝5.7Hz,2H),3.40(td,J＝5.5,1.6Hz,2H),1.42(dd,J＝7.8,4.5Hz,2H),1.29(dd,J＝7.7,4.4Hz,2H)。
將處于脫氣后的二氧六環(huán)(5ml)中的中間體IVa(100mg，0.287mmol)的溶液在密封管中用2-氨基-4-甲基吡啶(47mg，0.431mmol)、Pd2(dba)3(5mg，0.00574mmol)、4,5-雙(二苯基膦)-9,9-二甲基氧雜蒽(7mg，0.0115mmol)和Cs2CO3(140mg，0.431mmol)進行處理。將管密封并加熱至100℃過夜。進一步加入Pd2(dba)3(20mg，0.0218mmol)和4,5-雙(二苯基膦)-9,9-二甲基氧雜蒽(28mg，0.0484mmol)后，將混合物進一步加熱24h。將冷卻的混合物用水處理，并用DCM萃取，將有機相干燥(MgSO4)，過濾并蒸發(fā)。首先通過柱色譜(SiO2，處于DCM中的5％-10％乙醇)將殘余物純化，然后用EtOAc研磨，獲得奶油色固體狀的化合物021(32mg，30％)。1H NMR(400MHz,,DMSO-d6)δ9.01(s,1H),8.04(d,J＝5.1Hz,1H),7.95(s,1H),7.79(s,1H),7.54(dd,J＝8.2,1.2Hz,1H),7.29(s,J＝2.7Hz,1H),7.26(t,J＝8.0Hz,1H),7.08(d,J＝7.7Hz,1H),6.66(s,1H),6.62(d,J＝5.2Hz,1H),3.85(t,J＝5.5Hz,2H),3.44(t,J＝4.4Hz,2H),2.24(s,3H),1.46(dd,J＝7.7,4.4Hz,2H),1.32(dd,J＝7.6,4.4Hz,2H)。
4-{5-[3-(噻唑-2-基氨基)-苯基]-噁唑-2-基}-4,7-二氮雜-螺[2.5]辛烷-8-酮(化合物022)的制備：
將處于EtOH(45ml)和水(5ml)中的中間體Ib(1.50g，9.37mmol)的溶液用2-溴噻唑(1.69ml，18.7mmol)和濃HCl(1.61ml，187mmol)進行處理，并在100℃下攪拌6小時。進一步加入2-溴噻唑(1.69ml，18.7mmol)后，將溶液進一步加熱24h，然后冷卻并用NaOH水溶液調(diào)至pH 14。用處于DCM中的10％EtOH以及隨后的DCM萃取之后，將有機相干燥(MgSO4)，過濾并蒸發(fā)。通過柱色譜(SiO2，處于DCM中的5％丙酮)將殘余物純化，獲得白色固體狀的中間體IVb(493mg，22％)。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ10.36(s,1H),8.46(s,1H),8.10(t,J＝1.8Hz,1H),7.63(s,1H),7.56(ddd,J＝8.1,2.2,1.1Hz,1H),7.39(t,J＝7.9Hz,1H),7.33–7.29(m,2H),6.95(d,J＝3.7Hz,1H)。
然后，如對上述中間體Id和化合物001所述，由中間體IVb制備化合物022：1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ10.29(s,1H),7.84(s,1H),7.81(s,1H),7.54(dd,J＝8.1,1.3Hz,1H),7.37–7.29(m,2H),7.27(d,J＝3.6Hz,1H),7.15(d,J＝7.8Hz,1H),6.94(d,J＝3.7Hz,1H),3.85(t,J＝5.5Hz,2H),3.43(s,2H),1.46(dd,J＝7.7,4.5Hz,2H),1.32(dd,J＝7.6,4.5Hz,2H)。
通過使用合適的起始材料和條件重復上文所述方法，得以對化合物表1中下述另外的類似物進行制備和表征。
化合物表1：
IC 50：抑制50％蛋白激酶的濃度。
將上述化合物表中給出的Syk活性表示為：
+++：IC50<500nM
++：500>IC50<2000nM
+：IC50>2000nM
藥理學實施例：
1)體外SYK抑制試驗
抑制試驗方案
將SYK激酶純化為近似均一的桿狀病毒系統(tǒng)中的全長蛋白。用Cisbio international開發(fā)的Kinease TK(酪氨酸激酶)HTRF(均相時間分辨熒光)試驗進行所有的激酶試驗。這些試驗在室溫下、于96孔半?yún)^(qū)白色培養(yǎng)板中、在25μl終體積的激酶緩沖液(10mM MgCl2；2mM MnCl2；50mM HEPES-鈉pH7.8；BRIJ-35 0.01％，1μM底物)(含濃度至少兩倍于各酶Km的ATP以及適量的重組酶)中進行，從而確保線性反應速率。反應在引入酶時起始，隨著加入一反應體積(25μl)的HTRF檢測緩沖液而終止。將培養(yǎng)板在室溫下孵育1小時，并在Pherastar FS酶標儀(BMG Labtech)中測量時間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移信號。所有數(shù)據(jù)均為三個平行實驗的平均值，標準偏差<10％。
實驗結果
化合物表1列出了使用上述實驗方案的本發(fā)明各種化合物的實驗結果。
實驗和結果的說明
本發(fā)明人觀察到本文所公開的式(I)化合物類極其有效地抑制了SYK?；衔锉碇辛谐龅幕衔锖芎玫卮砹耸?I)化合物類。
對化合物001的以下引用是指上述化合物表1中的相同編號的化合物。將化合物001與R406進行比較，R406是fostamatinib/R788的活性代謝物、Rigel Pharmaceutical SYK抑制劑(WO2006/078846A1；Drugs Future，(2011)，36(4):273-280)。
2)體外抗-SYK激酶活性和選擇性
通過使用體外重組激酶試驗和基于細胞的增殖試驗，針對各種酪氨酸激酶對測試化合物進行篩選，來測定SYK靶標的活性和選擇性。
抑制試驗方案
基于細胞的增殖和存活力試驗
在BaF3模型上進行CellTiter-Bleue基于細胞的存活/增殖試驗(Promega G8080)。
總共將1×104細胞/孔/50μl接種于96孔板中。通過加入2×的從0μM至10μM的1/2系列稀釋的藥物溶液，開始進行處理。使細胞在37℃下生長48h-72h，然后在37℃下與10μl/孔的Promega CellTiter-Bleue試劑一起孵育4h。使用掃描多孔分光光度計(POLARstar Omega，BMG labtech，法國)，通過其在450nm處的吸光度，對形成的甲臜染料的量進行定量。將無細胞的空白孔用作分光光度計的本底對照，并且所有的試驗均以兩個平行實驗重復進行至少兩次。
重組SYK和各種蛋白激酶的體外激酶試驗
激酶的克隆和表達
在本發(fā)明人的設施中，對該研究中測試的大多數(shù)激酶進行克隆、表達和純化。在桿狀病毒或在大腸桿菌表達系統(tǒng)中，將所述激酶表達為N-末端六聚組氨酸標記的酶、六聚組氨酸-天冬酰胺標記的酶或GST標記的酶。其余的酶(JAKs)購自Millipore或Proqinase。對于每種酶，對穩(wěn)態(tài)動力學參數(shù)進行測定，并用已知抑制劑進行驗證。所有實驗均在大過量的底物中進行，并就ATP而言具有對應于至少2*Km的ATP濃度。
HTRF激酶試驗
用 KinEASE試驗(Cisbio International)對于化合物對激酶活性影響的分析進行評價， KinEASE試驗是使用標記有銪(Eu3+)穴狀化合物的抗磷酸化特異性抗體、基于對生物素化的肽底物的磷酸化水平加以定量的免疫試驗。該試驗包括兩個步驟：-酶促步驟，在此期間，用不同濃度的藥物(0μM-10μM)對肽底物、激酶、ATP、Mg2+和/或Mn2+進行孵育；-檢測步驟，在反應結束時(通過加入螯合Mg2+的EDTA而停止)，向反應混合物加入抗體抗磷酸化肽-Eu3+(發(fā)射620nm)和鏈霉親和素XL-665(發(fā)射665nm)。孵育后，所得到的信號與樣品中的磷酸化的肽的濃度成比例。所有測量均在BMG Labtech Pherastar FS設備上進行。將結果表示為按照以下定義的delta熒光(DF)單位：DF％＝[(比值-空白比值)/(空白比值)]*100，其中，比值＝(665nm/620nm)*104。每個實驗均以兩個平行實驗重復進行兩次或三次。
實驗結果
表2：抗-SYK化合物的活性和選擇性(IC50μM)
*測試化合物的激酶抑制活性的酶法測定(否則為基于細胞的試驗)，R406是R788/fostamatinib的活性代謝物。
實驗和結果的說明
上述體外數(shù)據(jù)顯示化合物001具有良好的抗-SYK活性。與多激酶抑制劑R406相比，發(fā)現(xiàn)化合物001比R406在Ba/F3TEL-SYK模型上更加有效，并在基于細胞的試驗和激酶試驗中均表現(xiàn)出非常好的選擇性。
3)鼠骨髓肥大脫粒試驗中的體外抗-SYK活性
抑制試驗方案
通過β-氨基己糖苷酶的釋放對體外肥大細胞脫粒試驗進行監(jiān)測。通過從C57BL/6J小鼠的股骨沖洗骨髓細胞，來獲得鼠骨髓肥大細胞(BMMC)，然后將其在含有小鼠重組IL-3(30ng/ml)的RPMI中培養(yǎng)3周-4周。RBL-2H3是保持于EMEM(補充有20％FCS、1mM谷氨酰胺和1×抗生素)的單層培養(yǎng)物中的大鼠嗜堿性粒細胞系。用0.2μg/ml抗-DNP-IgE(Sigma-Aldrich D8406)對細胞進行敏化過夜。將細胞在Tyrode緩沖液(10mM Hepes、130mM NaCl、6.2mM D-葡萄糖、3mM KCl、1.4mM CaCl2、1mM MgCl2和0.1％BSA)中充分洗滌。將細胞(5×104細胞/孔/90μl)以三個平行實驗鋪于96孔板中。通過加入10μl的10×濃縮的稀釋液，獲得0.01μM、0.1μM、1μM和10μM的終濃度，來開始用SYK激酶抑制劑進行處理。在2小時的藥物處理后，用110μl終體積的125ng/ml DNP-HAS(Sigma-Aldrich A6661)對細胞進行刺激90min。對于β-氨基己糖苷酶活性的測量而言，收集50μl的上清液，并在檸檬酸緩沖液(pH 4.5)中與制備的50μl 3.7mM的對硝基苯酚-N-乙?；?β-D-氨基葡萄糖苷(PNAG，Sigma-Aldrich N9376)一起孵育。在37℃下孵育90min后，通過加入100μl的碳酸鈉緩沖液(0.1M Na2CO3/NaHCO3pH 10.0)將反應淬滅。使用PolarSTAR酶標儀(BMG labech)，參比620nm處的板吸光度，通過讀取405nm處的板吸光度對β-氨基己糖苷酶的活性進行定量。
實驗結果
在IgE-介導的肥大細胞脫粒試驗中，對抗-SYK化合物的活性進行測試。在FcεRI的聚集后，SYK被鑒定為對于肥大細胞介體釋放的起始而言是關鍵的。在其阻斷IgE-介導的顆粒組分β-氨基己糖苷酶的釋放的能力中，對抗-SYK化合物001和R406進行了比較。如下列表3所示，相較于未處理的細胞(100％)，將結果表示為β-氨基己糖苷酶殘余活性的％。
表3：抗-SYK對β-氨基己糖苷酶釋放/活性的影響
*測試化合物的基于細胞的試驗(否則為激酶抑制活性的酶法測定)。
實驗和結果的說明
與純化SYK的體外激酶試驗以及Ba/F3tel-SYK細胞系的基于細胞的增殖試驗一致，化合物001有效地抑制了肥大細胞脫粒(IC50＝50nM)。在這些實驗中，SYK抑制劑化合物001與多激酶抑制劑R406同樣強效地抑制肥大細胞脫粒。
4)鼠骨髓肥大細胞因子產(chǎn)生中的體外抗-SYK活性
試驗方案
通過從C57BL/6J小鼠的股骨沖洗骨髓細胞來獲得鼠骨髓肥大細胞(BMMC)，然后將其在含有小鼠重組IL-3(30ng/ml)的RPMI中培養(yǎng)3周-4周。在IL3-耗盡的培養(yǎng)基中，將細胞用0.1μg/ml-0.2μg/ml的抗-DNP-IgE(Sigma-Aldrich D8406)敏化過夜。將細胞用抑制劑預孵育30min，然后用10ng/ml抗原(Ag)和/或干細胞因子(SCF，30ng/ml)刺激。將細胞孵育6h。收獲上清液，使用CISBIO IL6和TNFαHTRF試驗(分別為cat#63ADKEBU043和6FMTNPEB)對細胞因子含量進行測量。
實驗結果
為了探討化合物001對細胞因子產(chǎn)生的影響，對鼠骨髓肥大細胞(BMMC)中的IL-6和TNFα的產(chǎn)生進行了考查(表4和表5)。
表4：在BMMC中FcεRI和Kit-誘發(fā)的TNFα細胞因子釋放
*Ag＝抗原；**SCF＝干細胞因子
表5：在BMMC中FcεRI和Kit-誘發(fā)的IL6細胞因子釋放
*Ag＝抗原；**SCF＝干細胞因子
實驗和結果的說明
根據(jù)以前的報道，在SCF的缺乏下，IgE-刺激的FcεRI聚集在最低程度上誘發(fā)了BMMC中的細胞因子的產(chǎn)生。然而，在SCF的存在下，IL-6和TNFα的產(chǎn)生和釋放明顯增加?；衔?01(IC50～50nM)有效地阻斷了此類細胞因子的釋放。在這些實驗中，化合物001與R406同樣有效地阻斷了細胞因子的釋放，并在低至0.1μM的濃度下觀察到抑制作用。
5)小鼠哮喘模型中的體外抗-SYK活性
試驗方案
Balb/c雄性小鼠(8周齡)購自Janvier(Le Genest-Saint-Isle；法國)并在動物設施中飼養(yǎng)4周。將藥物溶解在飲用溶劑中(80％水；10％Tween 80和10％異丙二醇)。將其分成小份試樣并儲存在-20℃。每只小鼠每天接受兩次藥物。在處理前和處理后對動物的重量進行計算。
敏化和處理
用吸附至2mg Al(OH)3(Prolabo，法國)并稀釋于生理鹽水(0.9％NaCl)中的50μg卵清蛋白(Sigma-Aldrich，德國)對小鼠(9周齡)進行敏化。在第1天和第7天，腹膜內(nèi)注射卵清蛋白。接著從第18天至第21天，每天用稀釋于0.9％NaCl中的10μg卵清蛋白通過鼻內(nèi)激發(fā)進行敏化。在第17天至第21天的5天期間，以15mg/ml、7.5mg/ml或3.75mg/ml每天口服給予兩次，使藥物處理的動物接受100μl的溶液。這些處理分別對應于60mg/小鼠kg、30mg/小鼠kg以及15mg/小鼠kg的濃度。
氣道反應性及肺功能的評價
使用侵入性(SCIREQ)技術對氣道反應性進行測量。簡言之，將小鼠稱重，并用6mg/kg的甲苯噻嗪溶液(Bayer，法國)和10分鐘后的6mg/kg的戊巴比妥溶液(CEVA)進行i.p.麻醉。將各麻醉劑稀釋于生理鹽水溶液中。當小鼠被深度麻醉時，將氣管插管并連接至計算機控制的小動物呼吸機當連接后，電腦通過不同體積和壓力控制策略來控制機械通氣，以獲取準確、可重復的呼吸力學(氣道阻力、彈性和順應性)測量。在鹽水溶液霧化后對基線值進行測量，并在0.26M乙酰甲膽堿溶液(50mg/ml)霧化后對氣道高反應性進行評估。
氣道炎癥的評價
將動物從斷開后，進行支氣管肺泡灌洗(Bronchio-alveolar lavage，BAL)。用5ml(0.5ml，10次)冰冷的0.9％NaCl 2.6mM EDTA對氣道進行灌洗。將BAL樣品在1200rpm、4℃下離心5分鐘。收集沉淀的細胞，并加入1.5ml去離子水對紅細胞進行裂解30秒。用0.5ml的0.6M KCl中和后，將細胞在1200rpm、4℃下離心5分鐘。將BAL樣品用于計算總細胞數(shù)，并用于進行離心涂片(shandon，Pontoise)。Hemacolor(Merck)染色后，通過形態(tài)標準對細胞類型進行鑒定。
實驗結果
相較于Syk抑制劑R406和抗-Kit抑制劑馬賽替尼(用于治療哮喘的AB Science候選藥物)，就化合物001在鼠哮喘模型中對氣道炎癥和反應性的影響，對其進行了評估(Allergy，(2009)，64(8):1194-201)。如以上試驗方案所述，用卵清蛋白對小鼠進行敏化和激發(fā)。將小鼠分成具有5只-6只動物的組，用7.5mg/Kg-60mg/Kg的抗-SYK/KIT藥物(PO)每天處理兩次。
表6呈現(xiàn)了若干實驗中獲得的數(shù)據(jù)的總結。
表6：在鼠哮喘模型中馬賽替尼和R406與化合物001活性的比較
實驗和結果的說明
卵清蛋白的敏化和激發(fā)誘發(fā)了細胞(主要是巨噬細胞和嗜酸性粒細胞)總數(shù)的明顯增加。結果顯示化合物001以劑量依賴性方式誘發(fā)了嗜酸性粒細胞募集作用的顯著降低。在該哮喘模型中，在來自敏化小鼠的BAL中，C-kit抑制劑馬賽替尼和化合物001在30mg/kg的劑量下誘發(fā)了嗜酸性粒細胞數(shù)量顯著并相似的降低(表6，實驗#2)，而馬賽替尼比R406更強效(表6，實驗#1)。確實使用較低劑量的馬賽替尼或化合物001，獲得了與R406相同的效果(表6，實驗#1和實驗#2)。根據(jù)氣道炎癥分析，化合物001處理以劑量依賴性方式降低了支氣管高反應性。
6)類風濕性關節(jié)炎的小鼠模型中的體內(nèi)抗-SYK活性
試驗方案
從8周齡的關節(jié)炎小鼠對K/BxN血清池進行制備。在誘發(fā)關節(jié)炎之前，用SYK抑制劑通過兩次口服給予對小鼠進行預處理兩天。在第0天和第2天，通過腹腔內(nèi)注射(每g體重7.5μl血清)在C57Bl/6小鼠(8周齡)中誘發(fā)關節(jié)炎。
持續(xù)用SYK抑制劑處理13天。在誘發(fā)關節(jié)炎之前和疾病進展期間，將對照小鼠用溶劑注射。將化合物溶解于含有10％Tween 80和10％1,2-丙二醇的溶液中。在給予前對其進行制備。
使用精密測徑器對踝增厚程度(定義為與第0天的踝厚度的差值)進行測量。將關節(jié)炎/臨床得分定義為各lim得分的總和(0沒有疾??；1爪子或僅有一些足趾輕度腫脹；2明顯的關節(jié)炎癥；3嚴重的關節(jié)炎癥)，滿分＝12。
髓過氧化物酶活性
在炎性疾病中，髓過氧化物酶(MPO)是原代中性粒細胞中最豐富的酶，并被證明是中性粒細胞浸潤的有用的可靠標志物。根據(jù)已發(fā)表的實驗方案對MPO活性進行測定(American Journal of Pathology，(2000)，56(6):2169-2177)。簡言之，將組織樣品稱重，并以50mg組織比1ml緩沖液的比例，懸浮在含有5mg/ml十六烷基三甲基溴化銨(Sigma Chemical Co.)的50mmol/L的磷酸鉀緩沖液(pH 6.0)中。通過polytron組織均質(zhì)器對組織進行均質(zhì)化1min，將1ml傾入無菌Eppendorf管中并在12,000rpm下離心15分鐘。使用微量滴定板掃描儀，在標準96孔板中，向含有7μl樣品的各孔加入200μl的反應混合物(含有16.7mg的鄰聯(lián)茴香胺(Sigma Chemical Co.)、90μl的蒸餾H2O、10μl的磷酸鉀緩沖液和50μl的1％H2O2)，并在450nm處以5min的間隔記錄三個吸光度讀數(shù)。
實驗結果
K/BxN是自發(fā)性類風濕性關節(jié)炎的鼠模型，該模型模擬了主要在遠端小關節(jié)具有滑膜炎的人類疾病的許多臨床和組織學特征。如上述試驗方案所述，通過在第0天和第2天腹腔內(nèi)注射K/BxN小鼠的關節(jié)炎血清來誘發(fā)關節(jié)炎。與50mg/kg/天b.i.d.的馬賽替尼(用于治療類風濕性關節(jié)炎的AB Science候選藥物)相比，在15和50mg/kg/天b.i.d.下，對化合物001進行測試(Arthritis Res Ther.，(2009)，11(3):R95)。將踝增厚得分和關節(jié)炎得分用于監(jiān)測化合物的體內(nèi)活性。數(shù)據(jù)顯示化合物001以劑量依賴性方式顯著改善了關節(jié)炎癥狀(表7)。
表7：在鼠關節(jié)炎模型中化合物001和馬賽替尼的比較
在炎性疾病中，髓過氧化物酶(MPO)是原代中性粒細胞中最豐富的酶，并被證明是中性粒細胞浸潤的有用的可靠標志物。已用不同劑量的化合物001對MPO活性進行了測量(表8)。
表8：化合物001處理后的MPO劑量
實驗和結果的說明
表7的結果顯示，以2×50mg/kg/天給予的化合物001以劑量依賴性效應極其有效地降低了關節(jié)炎得分(踝增厚得分和關節(jié)炎得分各自降低52％和68％)。在該類風濕性關節(jié)炎模型中，當與相同劑量的馬賽替尼相比時，化合物001明顯且顯著地更加強效。
與通過50mg/kg b.i.d.劑量的化合物001處理顯著降低的對照小鼠相比，在KBxN小鼠中測量到MPO活性(U/ml)增加(表8)。
7)心臟毒性：心肌細胞的細胞增殖試驗和活力試驗
試驗方案
對原代成人心肌細胞和新生大鼠心肌細胞進行WST-1細胞存活/增殖試驗(Roche Diagnostic ref N1644807)。
人心肌細胞分離自成人心臟的正常人心室組織，并能夠增殖若干代。新生心室大鼠心肌細胞(P1-3)保留其收縮特性并在培養(yǎng)基中具有電生理學活性。將1×104個原代大鼠細胞或2×104-2.5×104個成人細胞鋪于96孔板的各孔中。在藥物處理之前，使細胞粘附至板5天。通過加入從0μM至10μM的1/2系列稀釋的2X藥物溶液，開始進行處理。使細胞在37℃下生長48h，然后在37℃下用10μl/孔的WST-1試劑孵育4h。使用掃描多孔分光光度計(MultiSkan MS，Thermo-LabSystems，法國)，通過其在450nm處的吸光度，對形成的甲臜染料的量進行定量。將無細胞的空白孔用作分光光度計的本底對照，并且所有的試驗均以三個平行實驗重復。
實驗結果
可使用原代心肌細胞對藥物的心臟毒性進行體外測定。使用體外增殖試驗和存活試驗，對測試物質(zhì)對于大鼠和人心肌細胞的細胞毒性進行分析。將結果報道于表9中。
表9：藥物誘發(fā)的人和大鼠心肌細胞的細胞毒性
人-CM＝人心肌細胞，大鼠-CM＝大鼠心肌細胞
實驗和結果的說明
上述數(shù)據(jù)清楚顯示在上至10μM的濃度下，化合物001對人和大鼠心肌細胞均未表現(xiàn)出細胞毒性作用。相反，IC50≤2.6μM的R406對人和大鼠心肌細胞均具有毒性。
8)心臟毒性：功能性hERG/Kv11.1鉀通道
試驗方案
使用Invitrogen提供的結合試驗(Predictor hERG熒光偏振試驗試劑盒PV5365)，對測試化合物在hERG鉀通道上的活性進行評估。以3μM單一濃度的藥物進行測試。將E-4031(公知的hERG鉀通道選擇性抑制劑)用作陽性對照。將數(shù)據(jù)表示為hERG抑制的百分比，100％對應于E-4031獲得的抑制作用，0％對應于溶劑DMSO獲得的抑制作用(陰性對照)。
實驗結果
心臟毒性作用可能通過人Ether-a-go-go-相關(hERG)鉀通道的非期望的堵塞而出現(xiàn)。因此，在小分子療法的開發(fā)中，為了預測其潛在的心臟毒性副作用，對hERG通道功能的影響進行評估是至關重要的。將結合試驗(“Predictor hERG熒光偏振試驗”(Invitrogen PV5365))用于測定化合物001對于hERG功能的活性(表10)。
表10：藥物誘發(fā)的hERG功能的抑制
實驗和結果的說明
化合物001對hERG功能沒有影響。
9)心肌細胞中的細胞內(nèi)ROS
試驗方案
在藥物處理之前24小時，將2×103個人心肌細胞(Promocell C-12810)或4×104個新生大鼠心肌細胞(R-CM-561Lonza)接種于96孔板的各孔(黑色壁以用于熒光分析(655090Greiner Bio one))。通過加入10μM終濃度的藥物溶液，開始進行處理。將5μM的阿霉素用作誘發(fā)ROS的陽性對照。藥物處理8小時后，使細胞加載10μM的CM-H2DCFDA(C6827Invitrogen)1小時，接著在PBS中洗滌兩次。CM-H2DCFDA是膜滲透性試劑，該試劑在ROS的存在下能夠以酶促方式轉(zhuǎn)化為二氫二氯熒光素(DCF)。使用熒光分光光度計(BMG Labtech)，以485nm的激發(fā)和560nm的發(fā)射對發(fā)熒光的DCF進行檢測。將結果表示為對照細胞中的DCF-熒光的相對百分比。
實驗結果
對預測藥物的心臟毒性副作用而言，對心肌細胞中藥物誘發(fā)的反應性氧類(ROS)的產(chǎn)生增加進行監(jiān)測將會是重要的(表11)。在10μM濃度下，在8小時的藥物處理之后，對人和大鼠心肌細胞中的ROS的產(chǎn)生進行研究。將結果表示為相對于心臟毒性化療劑阿霉素誘發(fā)的ROS的產(chǎn)生(100％)的百分比。
表11：在人和大鼠心肌細胞中藥物誘發(fā)的ROS的產(chǎn)生
人-CM＝人心肌細胞，大鼠-CM＝大鼠心肌細胞
實驗和結果的說明
這些結果顯示化合物001在心臟產(chǎn)生ROS方面沒有誘發(fā)顯著增加。
10)線粒體功能
試驗方案
在分離自健康小鼠心臟的線粒體上，通過使用Clark氧電極監(jiān)測氧消耗，來對藥物誘發(fā)的線粒體毒性進行評估(Mitologics S.A.S，法國)。簡言之，在37℃下，將分離的線粒體置于暴露至Clark氧電極表面的密封腔室中。氧的存在使得電極向氧監(jiān)視器傳遞電流，氧監(jiān)視器將電流放大，并將其轉(zhuǎn)換成與腔室中的氧濃度直接成比例的電壓輸出。還通過使用基于細胞的試驗(線粒體ToxGloTM試驗，Promega Corporation(cat#G8000))監(jiān)測線粒體ATP產(chǎn)生，來對藥物誘發(fā)的線粒體毒性進行評估。這一多重試驗同時測量了細胞膜完整性(作為細胞毒性的函數(shù))和線粒體功能(經(jīng)由ATP產(chǎn)生)，從而將表現(xiàn)出線粒體毒性與明顯細胞毒性的化合物區(qū)分開來。一般毒性的特征為ATP產(chǎn)生降低以及膜完整性的喪失，而線粒體毒性導致ATP產(chǎn)生降低而膜完整性幾乎沒有變化。為了迫使癌細胞經(jīng)由氧化磷酸化作用(crabtree效應)產(chǎn)生ATP，在生長于半乳糖培養(yǎng)基中的HepG2腫瘤細胞系上進行測試。將細胞用20μM藥物處理2小時后，如制造商所述，使用PHERAstar和POLARstar OMEGA酶標儀(BMG Labteck Sarl)分別對ATP檢測(發(fā)光信號)和細胞毒性(熒光信號)進行分析。
實驗結果
線粒體功能障礙是藥物誘發(fā)毒性的主要機制。氧消耗是線粒體功能最具信息量且最直接的量度之一。為了評估測試化合物潛在的線粒體毒性，在藥物的存在下使用氧敏感探針(MitoXpress-Xtra，Luxcel Biosciences)進行O2消耗測量。
在20min的40μM和80μM濃度下的藥物處理期間，對氧消耗進行分析(表12)。
表12：藥物誘發(fā)的O2消耗的抑制
實驗和結果的說明
數(shù)據(jù)顯示化合物001未表現(xiàn)出對心肌線粒體ATP產(chǎn)生的抑制作用(104％，相較于100％DMSO對照)，并具有低的細胞毒性(11％)。這些結果顯示在使用的實驗條件中，化合物001沒有影響HepG2細胞中的線粒體功能。
11)AMES誘變試驗
試驗方案
根據(jù)Ames試驗，在鼠傷寒沙門氏菌菌株TA100和TA98中，對測試化合物及其代謝物(產(chǎn)生自大鼠肝臟S9部分)的誘變活性進行評估(Toxicology in vitro，(2001)，15:105-114)。將兩種菌株用從0.5μg至1000μg的不同濃度的測試化合物進行處理，并在37℃孵育過夜。然后，相較于無S9部分的陽性對照2-硝基芴(TA98)和疊氮化鈉(TA100)以及有大鼠S9混合物的2-氨基蒽(TA98和TA100)，對TA100和TA98菌株進行誘變性分析。將結果表示為相較于溶劑對照的誘變性比值。如果誘變性比值≥2，認為測試物質(zhì)有活性。
實驗結果
表13和表14分別報道了經(jīng)化合物001處理的TA98和TA100菌株的每板回復突變菌落數(shù)。將結果表示為菌落數(shù)與陰性對照中菌落數(shù)(DMSO)的比值。如果誘變性比值≥2，測試物質(zhì)有活性。
表13：經(jīng)化合物001處理的TA98菌株的每板回復突變菌落數(shù)
表14：經(jīng)化合物001處理的TA100菌株的每板回復突變菌落數(shù)
-S-9不存在，+S-9存在，2-NF＝2-硝基芴，NAN3＝疊氮化鈉，2-AM＝2-氨基蒽
實驗和結果的說明
在有S9混合物的TA98菌株中，在所有的測試劑量下均觀察到回復突變數(shù)顯著增加。增加超過了輔料對照值的2倍閾值，但該增加與劑量不相關。此外，在這些劑量水平下觀察到的回復突變數(shù)和相應的個體回復突變菌落計數(shù)仍保持在相應輔料對照的歷史范圍內(nèi)。因此，認為這些增加不是生物學相關的。
在研究的實驗條件下，對于有或無肝臟代謝活化系統(tǒng)(S9混合物)的情況，測試化合物001均未顯示任何誘變活性。
12)早期生物利用度測定
試驗方案
進行早期篩選，以對Sprague Dawley大鼠口服或靜脈內(nèi)給予后所獲得的測試化合物的血漿濃度進行估計。將DMSO用作口服和靜脈內(nèi)給予的輔料。簡言之，使用4只約5周齡的雄性Sprague Dawley大鼠。PO(10mg/kg)或IV(2mg/kg)給予藥物。根據(jù)定義的時間表收集血液樣品，并用LC-MS/MS測定法對血液樣品進行分析以用于PK參數(shù)計算。
實驗結果
基于平均數(shù)據(jù)對PK參數(shù)進行計算，并呈現(xiàn)于表15中。
表15：基于平均數(shù)據(jù)計算的PK參數(shù)
Cmax(ng/mL)＝最大血漿濃度，Tmax(h)＝達到Cmax的第一時間，AUCt(ng/mL*h)＝在血漿濃度-時間曲線下從給予直到時間t時最后可量化濃度的面積，絕對生物利用度＝F(％)＝(AUC PO/劑量PO)/(AUC IV/劑量IV)*100。
實驗和結果的說明
化合物001具有優(yōu)異的藥代動力學特性，生物利用度為97.5％。
在這些體外和體內(nèi)研究中，發(fā)明人觀察到本發(fā)明公開的式(I)化合物類極其有效地抑制了SYK激酶活性。使用毒理學和生理測試系統(tǒng)中已建立的模型對體外心臟毒性、誘變性和生物可用度進行評估，本發(fā)明人證明了抗-SYK的式(I)化合物具有良好的安全性概況。
雖然已參照其具體實施例對本發(fā)明進行了描述，本領域技術人員應當理解，可進行各種改變并可對等同物進行替代，而不脫離本發(fā)明的真實精神和范圍。此外，可進行許多修改以使特定的情形、材料、物質(zhì)組成、方法、方法步驟或步驟適于本發(fā)明的目的、精神和范圍。所有的此類修改均意在落入所附權利要求的范圍之內(nèi)。