本申請(qǐng)要求2013年10月14日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)第61/890,718號(hào)的優(yōu)先權(quán)。該申請(qǐng)通過引用并入本文。

發(fā)明背景

技術(shù)領(lǐng)域

本公開內(nèi)容的實(shí)施方案涉及選擇性取代的喹啉化合物和包含一種或多種所述化合物作為活性成分的藥物試劑。更具體地，本公開內(nèi)容的實(shí)施方案涉及用作針對(duì)Toll樣受體(TLR)7和Toll樣受體8的拮抗劑或抑制劑的化合物，以及所述化合物在有效治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)和狼瘡腎炎的藥物組合物中的用途。

相關(guān)技術(shù)描述

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)和狼瘡腎炎是以炎癥和組織損傷為特征的自身免疫性疾病。例如，SLE可以對(duì)皮膚、肝臟、腎臟、關(guān)節(jié)、肺和中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成損傷。SLE患者可經(jīng)歷全身癥狀，例如極度疲勞、關(guān)節(jié)疼痛和腫脹、不明原因發(fā)熱、皮疹、腎功能障礙。因?yàn)樵诨颊咧猩婕暗钠鞴俨煌虼税Y狀可多樣化。SLE是主要發(fā)于年輕女性的疾病，發(fā)作高峰為15-40歲，并且在女性中的患病率比男性高約10倍。

目前對(duì)SLE的治療通常涉及免疫調(diào)節(jié)藥物，例如貝利單抗(belimumab)、羥氯喹、強(qiáng)的松(prednisone)和環(huán)磷酰胺。所有這些藥物可具有劑量限制性副作用，并且許多患者仍然患有難以控制的疾病。

發(fā)明概述

本公開內(nèi)容的實(shí)施方案提供用于預(yù)防或治療患者中以Toll樣受體7活化或Toll樣受體8活化為特征的疾病或病況的化合物及方法。一個(gè)實(shí)施方案以式(I)的化合物為特征：

其中R₁和R₂中的至少一個(gè)為-H、甲基或乙基，而另一個(gè)為

-H；或另一個(gè)為

被以下任選取代的C₁-C₆烴基：

-OH、甲氧基、乙氧基、-OCH(CH₃)₂、-O(CH₂)₂CH₃、苯基、呋喃基、-O(CH₂)₂OH、苯氧基、甲硫基、-F、-N(CH₃)₂、氰基、吡啶基氧基、氟苯氧基、異色滿基、苯酚、芐基氨基、-NHCH₃、氧代-、氨基、羧基、7元螺氨基、飽和或不飽和的且任選地包括選自O(shè)和N的一個(gè)或多個(gè)雜原子以及在一個(gè)或多個(gè)C或N原子上由甲基、氰基、氟、甲基氨基或三氟甲基任選取代的三元至六元環(huán)烴基；或者另一個(gè)為

飽和或不飽和的、任選橋接的、任選包括選自O(shè)、S和N的一個(gè)或多個(gè)雜原子以及在一個(gè)或多個(gè)C或N原子上由甲基、乙基、吡啶基、氮雜環(huán)丁基、乙酰氨基、甲酰氨基、氰基、氟、甲基氨基或三氟甲基任選取代的C₃-C₇環(huán)烴；或者

R₁和R₂連同它們所連接的氮原子一起形成8元至11元螺環(huán)二胺、8元二環(huán)二胺、7元螺噁茂胺、被乙基任選取代的哌啶基或被甲酰氨基、氨基甲基、甲基、(乙基氨基)甲基、(二甲基氨基)甲基、二甲基氨基、(甲基氨基)甲基和氨基中的至少一個(gè)任選取代的四元至六元環(huán)烴基；并且其中R₃為-H或甲基。

在另一實(shí)施方案中，化合物為式(I)的化合物，其具有在式(Ia)、式(Ib)、式(Ic)或(Id)之一中所闡述的立體化學(xué)，其具有與以上式(Ia)所闡述的相同的取代基選擇：

另一實(shí)施方案提供了式(Ie)(相對(duì)立體化學(xué)顯示如下)的化合物：

在另一實(shí)施方案中，化合物為式(II)的化合物：

其中

R₄為-H或甲基；

R₅為飽和的、部分飽和的或不飽和的C₁-C₅烴基以及被以下任選取代的C₁-C₅烴基：

-H、-Cl、-F、-OH、-NH₂、氧代-、-N(CH₂CH₃)₂、苯基、環(huán)己基、苯基三唑基、環(huán)己基三唑基、吡啶基、吡咯烷基，

被甲基或羥甲基任選取代的嗎啉基，

被以下取代的-O-：

C₁-C₆烴基、甲基苯基、甲基環(huán)己基、吡啶基、二嗪基或者被-F或甲基任選取代的苯基，

被以下取代的-NH-：

直鏈的、支鏈的或環(huán)狀的、飽和的或不飽和的以及被氧代-、苯基、甲基、或-OH任選取代的C₂-C₇烴基，

被甲基、甲氧基、苯基或氨基任選取代的吡啶基，

被乙基任選取代的二嗪基，

苯并咪唑基、甲基苯基、苯基吡唑基、萘啶基，

被-F、甲基、乙基或乙氧基任選取代的苯基，

被甲基任選取代的咪唑烷基

或者R₅為其中n為1-3，并且其中所述環(huán)狀胺被以下任選取代

被以下任選取代的C₁-C₃烴基：

-OH、-F、苯基、-NH₂、環(huán)己基、-N(CH₃)₂、-C(O)NH₂、甲基磺酰氨基、苯磺酰氨基、甲基苯磺酰氨基，或者

被甲基或羥基任選取代的吡咯烷基，或者

-NHC(O)R₆，其中R₆為

C₁-C₅烴基、苯基、吡啶基、氟苯基、甲基磺?；⒎交酋；⒍谆吝蚧酋；蛘?/p>

被甲基任選取代的吡唑基；

被-C(O)CH₃、-C(O)CH₂CH₃、甲基、氧代-、C(O)Ph、-NH₂、-NH-C(O)CH₃或者任選取代的哌啶基，

被-C(O)OC(CH₃)₃、甲基、-C(O)CH₃、-C(O)Ph、C(O)CH(CH₃)₂、-C(O)CH₃或者甲基磺?；芜x取代的哌嗪基；或者

R₅為其中n為1或2，并且其中所述環(huán)狀二胺在至少一個(gè)碳原子上被以下任選取代

甲基、氧代-、-N(CH₃)₂、氨基、-CH₂CH₃，或者

被甲基、-C(O)CH₃、-C(O)CH(CH₃)₂、-C(O)Ph或–C(O)OC(CH₃)₃任選取代的哌啶基，并且

其中R₇為–H、苯基、-C(O)CH₃、C₁-C₃烴基、-C(O)NH₂或–C(O)Ph；并且R₈為甲氧基或氰基。

另一實(shí)施方案提供式(III)的化合物：

其中

R₁₁為H或甲基；

R₁₀為H，或者當(dāng)R₁₄和R₉都是H時(shí)，R₁₀為甲基-1,4’-聯(lián)哌啶基；

R₉為-H或?yàn)楸?,4’-聯(lián)哌啶基、氧代-、羥基、甲基吡啶基或由羥基、-N(CH₃)₂或哌啶基任選取代的哌啶基取代的-CH₂-；

在另一實(shí)施方案中，化合物選自rel-(2R,6R)-4-(8-氰基喹啉-5-基)-N-((3R,4S)-4-氟吡咯烷-3-基)-6-甲基嗎啉-2-甲酰胺鹽酸鹽、(2R,6R)-4-(8-氰基喹啉-5-基)-6-甲基-N-(1-甲基哌啶-4-基)嗎啉-2-甲酰胺、5-((2S,6R)-2-([1,4’-聯(lián)哌啶]-1’-基甲基)-6-甲基嗎啉代)喹啉-8-甲腈以及5-((2R,7R)-2-(羥甲基)-7-甲基-1,4-氧雜氮雜環(huán)庚烷-4-基)喹啉-8-甲腈。

在另一實(shí)施方案中，前述段落的化合物或其藥物有效的鹽對(duì)在HEK-293細(xì)胞系中表達(dá)的人TLR7受體的IC50小于或等于20nM。在另一實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容的前述段落的化合物或其藥物有效的鹽對(duì)在HEK-293細(xì)胞系中表達(dá)的人TLR7受體的IC50小于或等于100nM。在另一實(shí)施方案中，對(duì)在HEK-293細(xì)胞系中表達(dá)的人TLR7受體的IC50通過以下測(cè)量：(1)將在包含10％胎牛血清的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基中密度為2.22×10⁵個(gè)細(xì)胞/ml的穩(wěn)定表達(dá)TLR7的HEK-293細(xì)胞系的細(xì)胞接種至384孔板內(nèi)，并且在37℃、5％CO₂下孵育2天；(2)添加所述化合物或其藥物可接受的鹽，并且將所述細(xì)胞孵育30分鐘；(3)添加3μg/ml的CL097(InvivoGen)并且將所述細(xì)胞孵育約20小時(shí)；以及(4)通過測(cè)量發(fā)光對(duì)NF-κB依賴性報(bào)告物活化進(jìn)行定量。

在本公開內(nèi)容的其它實(shí)施方案中，化合物對(duì)在HEK-293細(xì)胞系中表達(dá)的人TLR7受體的IC50小于或等于200nM、小于或等于180nM、小于或等于160nM、小于或等于140nM、小于或等于120nM、小于或等于100nM、小于或等于80nM、小于或等于60nM、小于或等于40nM、小于或等于20nM。在本公開內(nèi)容的其它實(shí)施方案中，化合物對(duì)在HEK-293細(xì)胞系中表達(dá)的人TLR7受體的IC50為10nM至30nM、10nM至50nM、10nM至100nM、30nM至50nM、30nM至100nM或50nM至100nM。在其它實(shí)施方案中，對(duì)在HEK-293細(xì)胞系中表達(dá)的人TLR7受體的IC50通過以下測(cè)量：(1)將在包含10％胎牛血清的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基中密度為2.22×105個(gè)細(xì)胞/ml的穩(wěn)定表達(dá)TLR7的HEK-293細(xì)胞系的細(xì)胞接種至384孔板內(nèi)，并且在37℃、5％CO₂下孵育2天；(2)添加所述化合物或其藥物可接受的鹽，并且將所述細(xì)胞孵育30分鐘；(3)添加3μg/ml的CL097(InvivoGen)并且將所述細(xì)胞孵育約20小時(shí)；以及(4)通過測(cè)量發(fā)光對(duì)NF-κB依賴性報(bào)告物活化進(jìn)行定量。

其它實(shí)施方案提供了治療狼瘡的方法，包括但不限于治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡、皮膚型狼瘡、神經(jīng)精神性狼瘡、胎兒心臟傳導(dǎo)阻滯和抗磷脂綜合征，所述方法包括施用藥物有效量的本公開內(nèi)容的化合物或藥物可接受的鹽。

其它實(shí)施方案提供了拮抗TLR7的方法，包括施用藥物有效量的本公開內(nèi)容的化合物或藥物可接受的鹽。

其它實(shí)施方案提供了拮抗TLR8的方法，包括施用藥物有效量的本公開內(nèi)容的化合物或藥物可接受的鹽。

其它實(shí)施方案提供了包含至少一種本公開內(nèi)容的化合物或藥物可接受的鹽和至少一種藥物可接受的載體的藥物組合物。

其它實(shí)施方案提供了治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡或狼瘡的方法，包括施用藥物有效量的本公開內(nèi)容的化合物或藥物可接受的鹽。

其它實(shí)施方案提供了拮抗TLR7的方法，包括施用藥物有效量的本公開內(nèi)容的化合物或藥物可接受的鹽。

其它實(shí)施方案提供了拮抗TLR8的方法，包括施用藥物有效量的本公開內(nèi)容的化合物或藥物可接受的鹽。

其它實(shí)施方案提供了包含本公開內(nèi)容的至少一種化合物或藥物可接受的鹽和至少一種藥物可接受的載體的藥物組合物。

本文所使用的術(shù)語“任選取代的”意為主體結(jié)構(gòu)可以包括但不必須包括獨(dú)立地選自低級(jí)烷基、甲氧基-、-OH、-NH₂、-CH₂-NH-CH₂、-OCH₂CH₂CH₃或-OCH(CH₃)₂中的一個(gè)或多個(gè)取代基。如果任選取代的部分是環(huán)狀的，那么任選取代可以是環(huán)中兩個(gè)原子之間的甲基橋。

本文所使用的符號(hào)“C(O)”指的是具有式C＝O的羰基。

除非另有說明，否則在本公開內(nèi)容(包括權(quán)利要求)中所使用的“一個(gè)(種)(a)”和“一個(gè)(種)(an)”意為“一個(gè)(種)或多個(gè)(種)”。

如本文所使用，“低級(jí)烷基”指的是具有一個(gè)至四個(gè)碳原子的直鏈的飽和烴，或在三個(gè)碳基團(tuán)和四個(gè)碳基團(tuán)的情況下為直鏈、支鏈或環(huán)狀的飽和烴。

如本文所使用，當(dāng)涉及包含氮的雜環(huán)部分時(shí)，術(shù)語“通過氮連接”意為所述部分與另一結(jié)構(gòu)連接的點(diǎn)是通過作為雜環(huán)的一部分的氮。

如本文所使用，術(shù)語“TLR7/8”意為“TLR7和TLR8”或者“TLR7或TLR8”或者“TLR7和/或TLR8”?；诔霈F(xiàn)“TLR7/8”的上下文，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解具體的含義。

本文所述的雜環(huán)部分包括氮雜環(huán)丁基、吡咯烷基、哌啶基、甲基氮雜環(huán)丁基、吡唑基、哌嗪基、嗎啉基、噻唑基、吡咯并吡咯基、咪唑烷基和異噻唑基。在提及雜環(huán)基團(tuán)的情況下，除非另外說明，否則應(yīng)當(dāng)理解的是，在基團(tuán)中的雜環(huán)原子可以處于基團(tuán)中的任何位置。還應(yīng)當(dāng)理解的是，咪唑基、吡唑基、噻唑基和吡咯基可以是不飽和的或部分不飽和的。本公開內(nèi)容的實(shí)施方案可以包括藥物組合物，所述藥物組合物包含一種或多種本公開內(nèi)容的化合物與藥物可接受的賦形劑。這些藥物組合物可以用于治療或預(yù)防患者(通常是人類患者)中以TLR7/8活化為特征的疾病或病況，所述患者患有或易患此類病況或疾病。以TLR7/8活化為特征的疾病或病況的實(shí)例包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)和狼瘡腎炎。

如本文所使用，本公開內(nèi)容的實(shí)施方案的化合物的“有效量”為以足以治療或預(yù)防SLE和狼瘡腎炎的量的上述化合物的有效量。

本文所提供的實(shí)施方案可以包括不對(duì)稱中心或手性中心。實(shí)施方案包括各種立體異構(gòu)體及其混合物。本公開內(nèi)容的實(shí)施方案的化合物的各個(gè)立體異構(gòu)體可以由包含不對(duì)稱中心或手性中心的商購原料來合成制備，或通過制備對(duì)映體化合物的混合物然后拆分那些化合物來制備。適當(dāng)?shù)牟鸱址椒òǎ簩⒅付?+/-)的對(duì)映體的外消旋混合物附著于手性助劑，通過色譜法或重結(jié)晶分離所產(chǎn)生的非對(duì)映體，并且從所述助劑中分離光學(xué)純產(chǎn)物；或在手性色譜柱上直接分離光學(xué)對(duì)映體的混合物。

本公開內(nèi)容的實(shí)施方案還包括包含本公開內(nèi)容的任何化合物以及藥物可接受的賦形劑的藥物組合物。藥物組合物可以用于治療或預(yù)防SLE和狼瘡腎炎。因此，本公開內(nèi)容的實(shí)施方案還可以以用于治療或預(yù)防患有或易患狼瘡腎炎或SLE的人類患者中的SLE或狼瘡腎炎的方法為特征。

本公開內(nèi)容的實(shí)施方案包括本文所提供的化合物的藥物可接受的鹽。術(shù)語“藥物可接受的鹽”指的是在合理的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)適用于與人類和動(dòng)物的組織接觸而沒有異常毒性、刺激性或過敏反應(yīng)的那些鹽。藥物可接受的鹽是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，S.M.Berge等人在J.Pharmaceutical Sciences 66:1-19,1977中詳細(xì)描述了藥物可接受的鹽?？梢栽诨衔锏淖罱K分離和純化過程中原位制備鹽或單獨(dú)通過游離的堿性基團(tuán)與適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)酸的反應(yīng)原位制備鹽。代表性的酸加成鹽包括乙酸鹽、己二酸鹽、藻酸鹽、抗壞血酸鹽、天冬氨酸鹽、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽(camphersulfonate)、檸檬酸鹽、環(huán)戊烷丙酸鹽、二葡糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、富馬酸鹽、葡庚糖酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚糖酸鹽(heptonate)、己酸鹽、氫溴酸鹽、鹽酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基-乙磺酸鹽、乳糖酸鹽、乳酸鹽、月桂酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、單馬來酸鹽、丙二酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、煙酸鹽、硝酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、雙羥萘酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽、新戊酸鹽、丙酸鹽、硬脂酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽、三氟乙酸鹽、十一烷酸鹽、戊酸鹽等。代表性的堿金屬鹽或堿土金屬鹽包括鈉鹽、鋰鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽等，以及無毒性銨鹽、季銨鹽和胺陽離子鹽，包括但不限于銨、四甲基銨、四乙基銨、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。

本文所用的術(shù)語“藥物可接受的酯”表示在體內(nèi)水解并且包括在人體內(nèi)容易分解以留下母體化合物或其鹽的那些酯。適當(dāng)?shù)孽セ鶊F(tuán)包括，例如衍生自藥物可接受的脂肪族羧酸，特別是鏈烷酸、鏈烯酸、環(huán)烷酸和鏈烷雙酸，其中各個(gè)烷基或烯基基團(tuán)通常具有不超過6個(gè)碳原子的那些酯基團(tuán)。具體的酯的實(shí)例包括甲酸酯、乙酸酯、丙酸酯、丁酸酯、丙烯酸酯和乙基琥珀酸酯。

在本申請(qǐng)中，對(duì)映體通過符號(hào)“R”或“S”指定，或通過常規(guī)方法用定義在三維空間中位于頁面平面上方的取代基的加粗線以及定義在三維空間中位于打印頁面平面下方的取代基的點(diǎn)劃線或虛線來繪制。如果沒有進(jìn)行立體化學(xué)指定，那么結(jié)構(gòu)定義包括兩種立體化學(xué)選擇。如果結(jié)構(gòu)或化學(xué)名稱包括“REL”或“rel”，那么將該結(jié)構(gòu)理解為顯示相對(duì)立體化學(xué)。

附圖簡(jiǎn)述

圖1A和圖1B示出了通過化合物ER-899742和ER-899464對(duì)小鼠中的TLR7途徑的短期體內(nèi)抑制。圖例：將雌性BALB/c小鼠通過灌胃口服單獨(dú)的媒介物(0.5％甲基纖維素水溶液)或者以33mg/kg、100mg/kg或300mg/kg在媒介物中配制的化合物給藥。在口服給藥6小時(shí)、13小時(shí)或24小時(shí)后，對(duì)小鼠皮下注射15μg R848以刺激TLR7。通過心臟穿刺收集血漿，然后通過標(biāo)準(zhǔn)ELISA程序評(píng)估在TLR7刺激之后1.5小時(shí)的IL-6的水平。在單個(gè)實(shí)驗(yàn)中并排測(cè)試了ER-899742和ER-899464(圖1A)。用ER-899742進(jìn)行了重復(fù)實(shí)驗(yàn)，其在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢驗(yàn)了所有三種劑量(圖1B)。

圖2A至圖2C示出了在NZBxNZW品系(下文中縮寫為NZBWF1/J或NZB/W)狼瘡疾病模型中測(cè)試ER-899742的結(jié)果。圖例：接收5周齡的雌性NZBWF1/J小鼠，進(jìn)行基線取血，并且通過以下抗-dsDNA滴度監(jiān)控小鼠的疾病進(jìn)展。在27周齡后，將小鼠隨機(jī)分成具有相等中值的抗-dsDNA滴度的小組，并且在29周齡時(shí)用單獨(dú)的媒介物(Veh；0.5％甲基纖維素)或者以33mg/kg、100mg/kg或300mg/kg每天一次口服(QD PO)治療。在治療17周后，在46周齡時(shí)，對(duì)小鼠取血并且測(cè)試抗-dsDNA滴度。在50周齡(21周的化合物治療)處死所有小鼠。在50周齡結(jié)束之前(21周的治療后)，從各個(gè)小鼠收集尿液，并且測(cè)定各只動(dòng)物的尿白蛋白/肌酸酐比(UACR，蛋白尿)作為腎功能的間接量度(圖2A)。在本研究中觀察了最高劑量組和最低劑量組的死亡率的時(shí)間進(jìn)程(圖2B)。并未見到用化合物治療的死亡率。此外，在中劑量組未觀察到死亡率(未示出)。顯示了在給藥17周后，在46周齡時(shí)，治療對(duì)抗-dsDNA滴度的影響(圖2C)。未觀察到統(tǒng)計(jì)上的顯著效果。

圖3A至圖3E示出了在姥鮫烷:DBA/1品系狼瘡疾病模型中測(cè)試化合物ER-899742的結(jié)果。圖例：向9周齡的雌性DBA/1小鼠給予腹膜內(nèi)注射0.5ml姥鮫烷或PBS。在注射姥鮫烷后的9周，將動(dòng)物進(jìn)行取血用于自身抗體滴度。在注射姥鮫烷之后10周，開始用媒介物(Veh；0.5％甲基纖維素)或33mg/kg ER-899742、100mg/kg ER-899742或300mg/kg的ER-899742進(jìn)行一天一次的口服給藥，并且持續(xù)治療13周。在化合物治療13周后，使小鼠安樂死，并且通過ELISA在血漿樣品中測(cè)量抗-dsDNA(圖3A)滴度、抗-Sm/nRNP(圖3B)滴度、抗-組蛋白(圖3C)滴度和抗-RiboP(圖3D)滴度(通過ANOVA用Dunnett后檢驗(yàn)測(cè)定治療相對(duì)于媒介物的統(tǒng)計(jì)顯著性)。在用300mg/kg的ER-899742治療13周之后，通過qPCR板測(cè)量全血中IFN調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，并且計(jì)算IFN基因標(biāo)簽評(píng)分(關(guān)于IFN評(píng)分計(jì)算的細(xì)節(jié)，參見“藥理學(xué)材料和方法”部分)(圖3E)。表格示出了相對(duì)于PBS對(duì)照，通過姥鮫烷治療而顯著上調(diào)的基因的完整列表。當(dāng)計(jì)算干擾素評(píng)分時(shí)，在治療的動(dòng)物與媒介物治療的動(dòng)物之間未見顯著差異。然而，相對(duì)于媒介物治療，化合物治療使六個(gè)基因出現(xiàn)顯著減低(學(xué)生t檢驗(yàn))，并且將該六個(gè)基因在表格中進(jìn)行了標(biāo)記。

圖4A至圖4C示出了在與圖2A相同的實(shí)驗(yàn)中，在NZB/W疾病模型中測(cè)試ER-899464的結(jié)果。圖例：在50周齡結(jié)束之前(21周的治療后)，從各個(gè)小鼠收集尿液，并且測(cè)定各只動(dòng)物的尿白蛋白/肌酸酐比(UACR，蛋白尿)作為腎功能的間接量度(圖4A)。在本研究中觀察了最高劑量組和最低劑量組的死亡率的概括(圖4B)。在中劑量組未見死亡率(未示出)。顯示了在給藥17周后，在46周齡時(shí)，治療對(duì)抗-dsDNA滴度的影響(圖5C)。未觀察到統(tǒng)計(jì)上的顯著效果。

圖5A至圖5D示出了在與圖3A至圖3E中所示的實(shí)驗(yàn)相同的實(shí)驗(yàn)中，在姥鮫烷疾病模型中測(cè)試ER-899464的結(jié)果。圖例：在化合物治療13周后，使小鼠安樂死，并且通過ELISA在血漿樣品中測(cè)量抗-dsDNA(圖5A)滴度、抗-Sm/nRNP(圖5B)滴度、抗-組蛋白(圖5C)滴度和抗-RiboP(圖5D)滴度(通過ANOVA用Dunnett后檢驗(yàn)測(cè)定治療相對(duì)于媒介物的統(tǒng)計(jì)顯著性)。正如針對(duì)ER-899742所進(jìn)行的，測(cè)試了干擾素驅(qū)動(dòng)的基因表達(dá)，但是圖3B中所示的疾病上調(diào)基因未受到用ER-899464治療的影響。

圖6示出了根據(jù)本文所示的各種實(shí)施方案的結(jié)構(gòu)和相應(yīng)的化學(xué)名稱?！癊R-編號(hào)”是對(duì)各個(gè)化合物所指定的參考編號(hào)。在可獲得的情況下，還包括對(duì)穩(wěn)定表達(dá)人TLR7的HEK細(xì)胞系的活性、對(duì)穩(wěn)定表達(dá)人TLR9的HEK細(xì)胞系的活性、1H NMR數(shù)據(jù)和質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)。

圖7A至圖7G示出了在DBA/1J小鼠中的姥鮫烷誘導(dǎo)的疾病中用ER-899742給藥的作用。圖例：向9周齡的雌性DBA/1小鼠給予腹膜內(nèi)注射0.5ml姥鮫烷或PBS。在注射姥鮫烷后的10周，將動(dòng)物進(jìn)行取血用于自身抗體滴度。在注射姥鮫烷之后11周，開始用媒介物(Veh；0.5％甲基纖維素)或33mg/kg ER-899742或300mg/kg ER-899742進(jìn)行一天一次的口服給藥，并且持續(xù)治療14周。在化合物治療14周后，使小鼠安樂死，并且通過ELISA在血漿樣品中測(cè)量抗-dsDNA(圖7A)滴度、抗-RiboP(圖7B)滴度、抗-Sm/nRNP(圖7C)滴度和抗-組蛋白(圖7D)滴度(通過ANOVA用Dunnett后檢驗(yàn)測(cè)定治療相對(duì)于媒介物的統(tǒng)計(jì)顯著性)。在給藥結(jié)束時(shí)，將相同的血漿用于通過ELISA測(cè)量總的IgG滴度(圖7E)。在總體IgG水平存在最小變化的情況下，可見自身抗體對(duì)dsDNA和RiboP的控制。在本實(shí)驗(yàn)中的姥鮫烷治療的小鼠患有關(guān)節(jié)炎，其中發(fā)生了在后爪的關(guān)節(jié)具有腫脹關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)炎。根據(jù)嚴(yán)重程度指定關(guān)節(jié)炎評(píng)分，基于腫脹和炎癥的指征，將各只爪在0-4級(jí)進(jìn)行評(píng)分。概括了在各只動(dòng)物上進(jìn)行評(píng)估的兩只后爪的評(píng)分，并且如以上ELISA滴度，將所述評(píng)分用統(tǒng)計(jì)評(píng)估描繪于圖7F中。觀察到了劑量依賴性的統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著抑制。當(dāng)計(jì)算干擾素評(píng)分時(shí)，在治療的動(dòng)物與媒介物治療的動(dòng)物之間未見顯著差異。然而，圖7G顯示在用ER-899742治療時(shí)，28個(gè)疾病相關(guān)的干擾素調(diào)節(jié)基因中有五個(gè)發(fā)生下調(diào)。

在產(chǎn)生高水平的自身抗體之后，圖8包含對(duì)具有晚期疾病的DBA/1J小鼠中的姥鮫烷誘導(dǎo)的疾病用ER-899742治療一個(gè)月的結(jié)果。圖例：向10周齡的DBA/1J小鼠i.p.注射姥鮫烷。三個(gè)月后，獲得抗-RiboP滴度和抗-dsDNA滴度，并且將動(dòng)物隨機(jī)分成具有一致平均滴度的組。在口服給藥ER-899742一周、兩周或四周后處死各組，并且在血清中測(cè)量RiboP滴度。圖8顯示在給藥28天后，無統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著反轉(zhuǎn)的抗-RiboP滴度或抗-DNA滴度，盡管給藥與滴度缺乏增長(zhǎng)有關(guān)。

圖9為作為HCl鹽的ER-899742的晶體結(jié)構(gòu)的ORTEP圖。

發(fā)明詳述

I.TLR和狼瘡

哺乳動(dòng)物Toll樣受體(TLR)除了起到能夠檢測(cè)外源性(“非自身”)病原體相關(guān)分子模式(PAMP-即通過TLR4檢測(cè)細(xì)菌LPS)的先天免疫受體的作用以外，它們還能夠識(shí)別宿主組織損傷或應(yīng)激反應(yīng)后釋放的內(nèi)源性刺激物(DAMP)。Kono,H.和K.L.Rock,How dying cells alert the immune system to danger.Nat Rev Immunol,2008.8(4):p.279-89。在最近的十年中，已經(jīng)出現(xiàn)了對(duì)內(nèi)源性(“自身”)危險(xiǎn)相關(guān)分子模式(DAMP)的TLR活化與自身免疫紊亂的病因?qū)W之間的關(guān)聯(lián)的理解。具體地，TLR7可以通過來源于哺乳動(dòng)物源和病毒源的單鏈RNA(ssRNA)來活化，而TLR9可以通過來源于哺乳動(dòng)物源、病毒源和細(xì)菌源的DNA來活化。

狼瘡的特征在于針對(duì)雙鏈DNA(dsDNA)本身和相關(guān)的蛋白質(zhì)(組蛋白)的自身抗體反應(yīng)性，以及針對(duì)諸如Ro、La、Smith(Sm)和U1snRNP的大量RNA相關(guān)蛋白質(zhì)的自身抗體反應(yīng)性。Kirou,K.A.等人，Activation of the interferon-alpha pathway identifies a subgroup of systemic lupus erythematosus patients with distinct serologic features and active disease.Arthritis Rheum,2005.52(5):p.1491-503。顯示與疾病嚴(yán)重程度直接相關(guān)的狼瘡的第二種常見標(biāo)志為：在狼瘡患者的PBMC(所謂的1型IFN基因標(biāo)簽)中1型干擾素(IFN)(特別是IFNα)的異常表達(dá)以及多組IFNα調(diào)節(jié)基因的相應(yīng)提高。Kirou,K.A.等人，同上。血液中的IFN主要來源于稱作漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(pDC)的特化的免疫細(xì)胞，其組成型表達(dá)TLR7和TLR9。

當(dāng)許多研究小組共同證明了從狼瘡患者中而不是從健康供體中分離的抗體復(fù)合物能夠以TLR7/9依賴性方式和RNA/DNA依賴性方式驅(qū)動(dòng)pDC產(chǎn)生IFN時(shí)，推測(cè)了這兩種疾病特性、自身抗體以及IFN水平之間的因果關(guān)系。Means,T.K.等人，Human lupus autoantibody-DNA complexes activate DCs throμgh cooperation of CD32and TLR9.J Clin Invest,2005.115(2):407-17頁；Vollmer,J.等人，Immune stimulation mediated by autoantigen binding sites within small nuclear RNAs involves Toll-like receptors 7and 8.J Exp Med,2005.202(11):1575-85頁；Savarese,E.等人，U1small nuclear ribonucleoprotein immune complexes induce type I interferon in plasmacytoid dendritic cells throμgh TLR7.Blood,2006.107(8):3229-34頁。此外，IFN刺激TLR7/9在B細(xì)胞上的表達(dá)增加，由此增強(qiáng)自身反應(yīng)性B細(xì)胞分化成產(chǎn)生抗體的漿細(xì)胞的TLR/BCR(B細(xì)胞受體)活化。Banchereau,J.和V.Pascual,Type I interferon in systemic lupus erythematosus and other autoimmune diseases.Immunity,2006.25(3):383-92頁。以這種方式，包含核酸TLR7/9配體的自身抗體復(fù)合物的水平驅(qū)動(dòng)促炎性循環(huán)和狼瘡疾病發(fā)展。我們認(rèn)為有可能TLR7/8的藥理學(xué)拮抗將通過破壞這種促炎性循環(huán)、降低IFN水平以及抑制由pDC和B細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫疾病過程來為狼瘡患者提供治療益處。

幾種其它證據(jù)表明TLR7在人狼瘡病因?qū)W中的作用，并且支持了TLR受體是疾病干預(yù)的有效靶標(biāo)的觀點(diǎn)。已經(jīng)鑒定了TLR7的3’UTR中的特異性多態(tài)性，并且顯示出與TLR7表達(dá)提高和IFN基因標(biāo)簽增強(qiáng)兩者相關(guān)。Shen,N.等人，Sex-specific association of X-linked Toll-like receptor 7(TLR7)with male systemic lupus erythematosus.Proc Natl Acad Sci U S A,2010.107(36):15838-43頁。Deng,Y.等人，MicroRNA-3148modulates allelic expression of toll-like receptor 7variant associated with systemic lupus erythematosus.PLOS Genetics,2013.e1003336。此外，狼瘡護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)(SOC)抗瘧藥物(例如氯喹)破壞內(nèi)體TLR7/9信號(hào)傳導(dǎo)并抑制由ssRNA-核糖核蛋白復(fù)合物或狼瘡患者血清誘導(dǎo)的PBMC和/或pDC IFNα的產(chǎn)生。此外，骨髓DC和單核細(xì)胞在自身RNA/TLR8信號(hào)傳導(dǎo)后產(chǎn)生IL-12p40、TNFα和IL-6，表明除了TLR7驅(qū)動(dòng)pDC產(chǎn)生IFN的作用以外，TLR8依賴性促炎癥細(xì)胞因子對(duì)人狼瘡病因?qū)W存在額外的貢獻(xiàn)。Vollmer，同上；Gorden,K.B.等人，Synthetic TLR agonists reveal functional differences between human TLR7and TLR8.J Immunol,2005.174(3):1259-68頁。

小鼠模型證明在狼瘡中也存在TLR的作用。公開的研究已經(jīng)共同證明，單TLR7基因缺失或雙TLR7/9基因缺失或雙TLR7/9藥理學(xué)抑制在四種不同的狼瘡模型中降低了疾病的嚴(yán)重程度。Nickerson,K.M.等人，TLR9regulates TLR7-and MyD88-dependent autoantibody production and disease in a murine model of lupus.J Immunol,2010.184(4):1840-8頁；Fairhurst,A.M.等人，Yaa autoimmune phenotypes are conferred by overexpression of TLR7.Eur J Immunol,2008.38(7):1971-8頁；Deane,J.A.等人，Control of toll-like receptor 7expression is essential to restrict autoimmunity and dendritic cell proliferation.Immunity,2007.27(5):801-10頁；Savarese,E.等人，Requirement of Toll-like receptor 7for pristane-induced production of autoantibodies and development of murine lupus nephritis.Arthritis Rheum,2008.58(4):1107-15頁。單獨(dú)的TLR7的轉(zhuǎn)基因過表達(dá)在正常的抗疾病C57BL/6品系中導(dǎo)致自發(fā)性抗-RNA自身反應(yīng)性和腎炎，這突出了TLR7作為自身免疫的關(guān)鍵性決定因素的作用。Deane，同上。

從安全性角度來看，并沒有報(bào)道TLR7、TLR8或TLR9單基因缺陷型小鼠或者TLR7/8和TLR7/9雙基因缺陷型小鼠免疫受損至觀測(cè)到機(jī)會(huì)致病菌感染的程度。同樣地，認(rèn)為SOC抗瘧藥物以預(yù)測(cè)至少部分抑制TLR7/9信號(hào)傳導(dǎo)的劑量長(zhǎng)期用于人類中，以控制狼瘡疾病發(fā)作是非常安全和有效的。Lafyatis,R.,M.York和A.Marshak-Rothstein,Antimalarial agents:closing the gate on Toll-like receptors？Arthritis Rheum,2006.54(10):3068-70頁；Costedoat-Chalumeau,N.等人，Low blood concentration of hydroxychloroquine is a marker for and predictor of disease exacerbations in patients with systemic lupus erythematosus.Arthritis Rheum,2006.54(10):3284-90頁。事實(shí)上，除了兒童期及較小范圍的成人期對(duì)革蘭氏陽性細(xì)菌感染的敏感性增加外，然而具有高度受損的TLR和IL-1R信號(hào)傳導(dǎo)途徑(MyD88缺陷或IRAK-4缺陷)的人類仍然是健康的并且維持了足夠的宿主防御機(jī)制。Casanova,J.L.,L.Abel和L.Quintana-Murci,Human TLRs and IL-1Rs in Host Defense:Natural Insights from Evolutionary,Epidemiological,and Clinical Genetics.Annu Rev Immunol,2010。

基于此信息和其它信息，我們認(rèn)為，在小鼠臨床前SLE模型的情況中尤其充分證實(shí)TLR7是靶標(biāo)。基因性人體研究和功能性人體研究?jī)烧咧С忠韵录僭O(shè)：TLR7和/或TLR8途徑的拮抗為對(duì)狼瘡患者提供治療益處。此外，小鼠TLR基因缺失研究和人類中抗瘧藥物的長(zhǎng)期使用表明可以在未顯著損害宿主防御的情況下進(jìn)行藥理學(xué)的TLR7、TLR8和/或TLR9抑制。

因此可以期望，抑制TLR7、TLR8或者TLR7和TLR8兩者的化合物用作對(duì)SLE或狼瘡腎炎的治療劑或預(yù)防劑。

本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)抑制TLR 7和/或TLR 8的化合物，并且因此期望對(duì)SLE或狼瘡腎炎具有預(yù)防或治療性效果。本文描述了本公開內(nèi)容的化合物和方法。

II.治療用途

可以改變?cè)诒竟_內(nèi)容的藥物組合物中的活性成分的劑量水平，以獲得實(shí)現(xiàn)所期望的對(duì)特定患者的治療反應(yīng)、組成和施用模式的活性化合物的量。所選擇的劑量水平取決于特定化合物的活性、施用途徑、所治療的病況的嚴(yán)重程度以及所治療的患者的病況和既往病史。根據(jù)患者特有的因素，包括年齡、體重、總的健康狀態(tài)以及其它可以影響本公開內(nèi)容的化合物的功效的因素，使用標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定各個(gè)特定情況的劑量。通常，在口服施用的情況下，本公開內(nèi)容的化合物或其藥物可接受的鹽以每個(gè)成人每天約30μg至100μg的劑量、30μg至500μg的劑量、30μg至10g的劑量、100μg至5g的劑量或100μg至1g的劑量施用。在經(jīng)由注射施用的情況下，其以每個(gè)成人每天約30μg至1g的劑量、100μg至500mg的劑量或100μg至300mg的劑量施用。在兩種情況下，劑量以一次施用或分幾次施用?？梢岳缡褂贸绦蚰M劑量。

但是并不意味著向哺乳動(dòng)物(包括人類)施用本公開內(nèi)容的化合物要限于特定的施用模式、劑量或給藥頻率。本公開內(nèi)容涵蓋所有的施用模式，包括口服施用、腹膜內(nèi)施用、肌內(nèi)施用、靜脈內(nèi)施用、關(guān)節(jié)內(nèi)施用、病灶內(nèi)施用、皮下施用或任何其它足以提供適于預(yù)防或治療SLE或狼瘡腎炎的劑量的途徑?？梢詫⒈竟_內(nèi)容的一種或多種化合物以單劑量或多劑量施用于哺乳動(dòng)物。當(dāng)以多劑量施用時(shí)，所述劑量可以彼此間隔例如幾個(gè)小時(shí)、一天、一周、一個(gè)月或一年。應(yīng)當(dāng)理解，對(duì)于任何特定的對(duì)象，應(yīng)當(dāng)根據(jù)個(gè)體需要以及實(shí)施或指導(dǎo)施用包含本公開內(nèi)容的化合物的藥物組合物的人員的專業(yè)判斷，隨時(shí)間調(diào)整特定的劑量方案。

對(duì)于臨床應(yīng)用，本公開內(nèi)容的化合物通?？梢造o脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、經(jīng)結(jié)腸、經(jīng)鼻、腹膜內(nèi)、經(jīng)直腸、經(jīng)頰或口服施用。包含至少一種本公開內(nèi)容的化合物(適用于人用藥物或獸用藥物)的組合物可以以允許通過適當(dāng)?shù)耐緩绞┯玫男问教峁?。可以使用一種或多種藥物可接受的佐劑或賦形劑，根據(jù)常規(guī)方法來制備這些組合物。所述佐劑尤其包括稀釋劑、無菌水介質(zhì)和各種無毒的有機(jī)溶劑。用于治療用途的可接受的載體或稀釋劑在制藥領(lǐng)域是眾所周知的，并且例如描述于Remington:The Science and Practice of Pharmacy(第20版),A.R.Gennaro編輯，Lippincott Williams和Wilkins,2000,Philadelphia,以及Encyclopedia of Pharmaceutical Technology,J.Swarbrick和J.C.Boylan編輯,1988,1999,Marcel Dekker,New York。所述組合物可以以片劑、丸劑、顆粒劑、粉劑、水溶液或混懸劑、可注射溶液、酏劑或糖漿的形式提供，并且所述組合物可以任選地包含選自甜味劑、調(diào)味劑、著色劑和穩(wěn)定劑中的一種或多種試劑以獲得藥物可接受的制劑。

媒介物的選擇以及媒介物中活性物質(zhì)的含量通常根據(jù)產(chǎn)品的溶解性和化學(xué)性質(zhì)、特定的施用模式和在藥學(xué)實(shí)踐中需遵守的規(guī)定來確定。例如，諸如乳糖、檸檬酸鈉、碳酸鈣和磷酸二鈣的賦形劑以及諸如淀粉、海藻酸和與潤(rùn)滑劑(例如，硬脂酸鎂、十二烷基硫酸鈉和滑石)組合的某些復(fù)合硅酸鹽的崩解劑，可以用于制備片劑。為了制備膠囊，使用乳糖和高分子量聚乙二醇是有利的。當(dāng)使用水性懸浮液時(shí)，可以包含促進(jìn)懸浮的乳化劑。還可以使用稀釋劑，例如蔗糖、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、甘油、氯仿或它們的混合物。

對(duì)于腸胃外施用，使用本公開內(nèi)容的組合物在植物油(例如，芝麻油、花生油或橄欖油)中的乳液、懸液或溶液，藥物可接受的鹽的水性有機(jī)溶液(例如，水和丙二醇)、可注射的有機(jī)酯(例如，油酸乙酯)或無菌水溶液。本公開內(nèi)容的組合物的鹽的溶液尤其可用于通過肌內(nèi)注射或皮下注射而施用?？梢詫}在純蒸餾水中的溶液的水溶液用于靜脈內(nèi)施用，條件是：(i)適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)它們的pH，(ii)用足量的葡萄糖或氯化鈉適當(dāng)?shù)鼐彌_并且使其等滲，以及(iii)通過加熱、輻照或微濾對(duì)它們進(jìn)行殺菌。包含本公開內(nèi)容的化合物的適當(dāng)組合物可以溶于或懸浮于適當(dāng)?shù)妮d體中用于噴霧器或者懸浮液氣霧劑或溶液氣霧劑，或可以被吸收到或吸附于適當(dāng)?shù)墓腆w載體上以用于干粉吸入器中。用于直腸施用的固體組合物包括根據(jù)已知方法配制的并且包含至少一種本公開內(nèi)容的化合物的栓劑。

待用于治療性施用的本公開內(nèi)容的化合物的劑量制劑應(yīng)當(dāng)是無菌的。通過經(jīng)無菌膜(例如，0.2微米膜)過濾或通過其它常規(guī)方法從而易于實(shí)現(xiàn)無菌化。制劑通常以凍干形式或作為水溶液儲(chǔ)存。在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容的組合物的pH例如可以為包括端值在內(nèi)的3至11，可以為包括端值在內(nèi)的5至9，或可以為包括端值在內(nèi)的7至8。

雖然一種施用途徑為通過口服劑量施用，但可以使用其它施用方法。例如，組合物可以以各種劑型通過皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、經(jīng)結(jié)腸、經(jīng)直腸、經(jīng)鼻或腹膜內(nèi)施用，所述劑型例如栓劑、植入的丸劑或小圓柱劑、氣霧劑、口服劑量制劑以及諸如軟膏劑、滴劑和皮膚貼劑的外用制劑。本公開內(nèi)容的實(shí)施方案的化合物可以摻入諸如植入物的成型制品中，包括但不限于瓣膜、支架、管和假體，其可以使用惰性材料，例如合成聚合物或硅酮(例如，組合物、硅酮橡膠或其它可商購的聚合物)。此類聚合物可以包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羥基-丙基-甲基丙烯酰胺-苯酚、聚羥乙基-天冬酰胺-苯酚或被棕櫚酰殘基取代的聚環(huán)氧乙烷-聚賴氨酸。此外，本公開內(nèi)容的化合物可以與一類用于實(shí)現(xiàn)藥物控釋的生物可降解的聚合物結(jié)合，所述聚合物例如聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸與聚乙醇酸的共聚物、聚ε己內(nèi)酯、聚羥基丁酸、聚原酸酯、聚縮醛、聚二氫吡喃、聚氰基丙烯酸酯以及水凝膠的交聯(lián)共聚物或兩親性嵌段共聚物。

本公開內(nèi)容的化合物還可以以脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)的形式，例如小的單層囊泡、大的單層囊泡和多層囊泡，來進(jìn)行施用。脂質(zhì)體可以由各種脂質(zhì)，例如膽固醇、硬脂胺或磷脂酰膽堿形成。還可以使用與化合物分子偶聯(lián)的抗體、抗體片段、生長(zhǎng)因子、激素或其它靶標(biāo)部分(例如，參見Remington:The Science and Practice of Pharmacy，見上文)來遞送本公開內(nèi)容的化合物，包括與本公開內(nèi)容的實(shí)施方案的化合物的血液組分體內(nèi)結(jié)合。

III.合成

提供了用于制備本公開內(nèi)容的實(shí)施方案的一般合成路線和特定合成路線。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以認(rèn)識(shí)到對(duì)這些程序進(jìn)行某些改變或修飾也可以致使合成本公開內(nèi)容的化合物。在一些情況下，短語“例如/諸如”用于列舉更多的一般性化合物或結(jié)構(gòu)的各種可選方案。應(yīng)當(dāng)理解，“例如/諸如”不應(yīng)理解為是限制性的，而且其含義與“包括，例如，但不限于”一致。

以下所提供的具體實(shí)例的某些條件是共有的。使用Emrys Liberator或Initiator微波反應(yīng)器進(jìn)行微波加熱。使用SP4快速色譜系統(tǒng)進(jìn)行柱色譜法。使用Büchii旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器或離心蒸發(fā)器進(jìn)行溶劑去除。使用氘代溶劑在Varian光譜儀上在400MHz處記錄NMR光譜。將相對(duì)于殘余質(zhì)子化溶劑的化學(xué)位移進(jìn)行報(bào)告。

使用各種比例的一種或多種以下溶劑在預(yù)涂有0.25mm硅膠層的玻璃板上進(jìn)行薄層色譜：EtOAc、庚烷、二氯甲烷或MeOH。

使用XBridge^TM C18 1.7μm 2.1×50mm柱在Waters Acquity^TM系統(tǒng)上對(duì)許多實(shí)例進(jìn)行分析性LC/MS。溶劑A和溶劑B分別為水w/0.1％甲酸和乙腈w/0.1％甲酸。5分鐘總的方法時(shí)間，5％B至99％B經(jīng)4分鐘，流速為0.3ml/min。以電噴霧正離子模式在Waters SQD上從100-2000amu獲得質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

可選地，使用XBridge^TM C8 3.5μm 4.6×50mm柱在Waters自動(dòng)純化系統(tǒng)上進(jìn)行純度和質(zhì)量確認(rèn)。溶劑A和溶劑B分別為水w/0.1％甲酸和乙腈w/0.1％甲酸。6分鐘總的方法時(shí)間，10％B至95％B經(jīng)5分鐘，流速為2.5ml/min。以電噴霧正離子模式在Micromass ZQ^TM上從130-1000amu獲得質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

使用XBridge^TMC8 5μm,19×100mm柱在Waters自動(dòng)純化系統(tǒng)上對(duì)許多實(shí)例進(jìn)行制備型反相LC/MS。溶劑A和溶劑B分別為水w/0.1％甲酸和乙腈w/0.1％甲酸。12分鐘總的方法時(shí)間，30％B至95％B經(jīng)10分鐘，流速為20ml/min。以電噴霧正離子模式在Micromass ZQ^TM上從130-1000amu獲得質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

使用以下手性柱中的一個(gè)：IA(5cm×50cm或2cm×25cm)、AD(2cm×25cm)或OD(2cm×25cm)，對(duì)許多實(shí)例進(jìn)行外消旋化合物的制備型HPLC拆分。在由相同的固定相構(gòu)成的0.45cm×25cm柱(IA、AD或OD)上通過HPLC分析來測(cè)定經(jīng)純化的化合物的對(duì)映體比例。

以下闡明了用于制備本公開內(nèi)容的化合物的一般方法和實(shí)驗(yàn)。在某些情況下，通過實(shí)施例描述具體的化合物。然而，應(yīng)當(dāng)理解，在各個(gè)情況中，根據(jù)以下所描述的方案和實(shí)驗(yàn)來制備一系列本公開內(nèi)容的化合物。對(duì)于可獲得NMR和/或質(zhì)譜數(shù)據(jù)的那些化合物，該數(shù)據(jù)示于圖6中。

以下縮寫用于本文中：

定義：以下縮寫具有所指出的含義：

AcOH：乙酸

anhyd：無水的

aq.：水性的

Bn：芐基

Boc：叔丁氧基羰基

CSA：樟腦磺酸

d：天

DAMP：危險(xiǎn)相關(guān)分子模式

DBU：1,8-重氮雙環(huán)[5.4.0]十一碳-7-烯

DCE：1,2-二氯乙烷

DCM：二氯甲烷

DIPEA：N,N-二異丙基乙胺

DMA：N,N-二甲基乙酰胺

DMAP：4-二甲基氨基吡啶

DMF：N,N-二甲基甲酰胺

DMSO：二甲基亞楓

dsDNA：雙鏈DNA

EDC：1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽

ee：對(duì)映體過量

EtOAc：乙酸乙酯

EtOH：乙醇

h：小時(shí)

HATU：N,N,N’,N’-四甲基-O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)脲六氟磷酸鹽

HCl：鹽酸

HCQ：羥氯喹

hep：正庚烷

HEPES：4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸

HPLC：高效液相色譜

IFN：干擾素

IPA：異丙基醇或異丙醇

K₂CO₃：碳酸鉀

MeOH：甲醇

MgSO4：硫酸鎂(無水的)

min：分鐘

MTBE：甲基叔丁基醚

Na₂CO₃：碳酸鈉

Na₂SO₄：硫酸鈉(無水的)

NaBH₄：硼氫化鈉

NaCl：氯化鈉

NaH：分散在油中的60％氫化鈉

NaHCO3：碳酸氫鈉

NaOH：氫氧化鈉

NBS：N-溴丁二酰亞胺

NH₄Cl：氯化銨

NH₄Cl：氯化銨

NH₄OH：氫氧化銨

NMP：N-甲基吡咯烷酮

Ns：對(duì)硝基苯磺?；蜞徬趸交酋；?/p>

℃：攝氏度

PAMP：病原體相關(guān)分子模式

PBMC：外周血單核細(xì)胞

PBS：磷酸鹽緩沖鹽水

pDC：漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞

PhNTf₂：N-苯基三氟甲烷磺酰亞胺

qPCR：定量聚合酶鏈反應(yīng)

R848：瑞喹莫德(resiquimod)

rt：室溫

sat：飽和的

SNAP：牌快速色譜柱

SOC：護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)

ssRNA：?jiǎn)捂淩NA

T3P：丙基磷酸酐

tBuOK：叔丁醇鉀

TEA：三乙胺

TEMPO：2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧化物

Tf：三氟甲磺酸酯

TFA：三氟乙酸

THF：四氫呋喃

TLDA：低密度陣列

TLR：Toll樣受體

TSA：對(duì)甲苯磺酸

一般合成方法

根據(jù)方案1-31中所示的一般合成方法制備化合物：

方案1

利用關(guān)鍵中間體3來制備若干實(shí)例，所述中間體3可以根據(jù)方案1中所描述的路線來制備。用鹽酸羥胺處理可商購的5-溴喹啉-8-甲醛1(Frédérieric de Montigny,Gilles Argouarch,Claude Lapinte,“New Route to Unsymmetrical 9,10-Disubstituted Ethynylanthracene Derivatives,”Synthesis,2006,293-298.)以得到肟2。隨后在催化量的乙酸銅存在下將2轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的腈3以得到本文所報(bào)告的關(guān)鍵中間體之一。使用以下詳述的適當(dāng)條件，通過用適當(dāng)?shù)姆枷阕寤衔铩㈦s芳香族化合物和飽和的雜環(huán)化合物例如哌啶、哌嗪和嗎啉，來取代5-溴喹啉-8-甲醛的5-位，使中間體3用于產(chǎn)生本文所報(bào)告的化合物。

在方案2中示出了產(chǎn)生關(guān)鍵中間體3的可選方法，其中用乙酸鈉代替合成中第一步的三乙胺。

方案2

通過如方案3中所描述的一般縮合方法產(chǎn)生若干實(shí)例，其中溴喹啉3與適當(dāng)?shù)挠H核試劑4縮合以形成可以是以下更詳細(xì)描述的關(guān)鍵中間體或最終化合物的5。

方案3

通過如方案4中所示的一般方法中所描述的高級(jí)中間體14制備由化合物15表示的許多實(shí)例。適當(dāng)保護(hù)的手性環(huán)氧化物6與烯丙胺縮合以提供手性氨基醇7。在用nesylate保護(hù)仲胺后，將所得的中間體8進(jìn)行分子間環(huán)化以形成不飽和的吡喃9。烯胺雙鍵的還原以形成10之后是對(duì)nesyl基團(tuán)進(jìn)行去保護(hù)以提供9。在使用或未使用鈀催化劑的情況下，將11與溴化物3(方案1或2)進(jìn)行縮合以得到12，在對(duì)13進(jìn)行去保護(hù)后，然后活化所得醇以得到關(guān)鍵中間體14?；罨?4可以通過使用適當(dāng)取代的胺和縮合試劑易于轉(zhuǎn)變?yōu)橐韵绿峁┑脑S多實(shí)例，以得到一般結(jié)構(gòu)15的化合物。

方案4

在方案5中描述了制備一般結(jié)構(gòu)10的可選方法。通過用N-溴代丁二酰亞胺處理可以獲得經(jīng)保護(hù)的醇8的自由基環(huán)化以得到16。使用堿消除溴基團(tuán)得到烯醇17，然后用硅烷還原所述烯醇17以得到中間體10。

方案5

在方案6中描述了制備一般結(jié)構(gòu)11的可選方法。用手性環(huán)氧樹脂原料6起始，在用Boc保護(hù)基團(tuán)對(duì)仲胺進(jìn)行保護(hù)后，形成醇18。使用水溶性DCC的內(nèi)脂化(lactonation)提供19，所述19然后可以使用烷基鋰?yán)缂谆囘M(jìn)行烷基化，以形成縮酮20和21的混合物。然后將縮酮混合物進(jìn)行還原以形成嗎啉化合物22(為所需的非對(duì)映體異構(gòu)體)和23的非對(duì)映體混合物，所述非對(duì)映混合物可以易于通過硅膠柱色譜法進(jìn)行分離。發(fā)現(xiàn)甲基嗎啉混合物的比率為有利于結(jié)構(gòu)22的4:1至9:1。隨后獲得高級(jí)化合物的X射線晶體結(jié)構(gòu)以確認(rèn)化合物22的絕對(duì)立體化學(xué)。通過酸例如TFA進(jìn)行去保護(hù)然后用堿中和，化合物22易于轉(zhuǎn)化為11。

方案6

在方案7中示出了制備關(guān)鍵中間體11的第三種方法?？缮藤彽慕?jīng)保護(hù)的環(huán)氧化物6與氨水縮合以得到氨基醇23，所述氨基醇23繼而與手性氯丙酸甲酯24縮合以形成光學(xué)純酰胺25。使用強(qiáng)堿例如氫化鈉形成醚得到內(nèi)酰胺26，所述內(nèi)酰胺26可以通過將酰胺還原為環(huán)胺而被轉(zhuǎn)化為中間體11。

方案7

方案8中示例了產(chǎn)生涵蓋方案3中的一般結(jié)構(gòu)5和方案4中的化合物12的實(shí)例的可選方法。由可商購來源(27和29)制備的原料28和30可以易于在無機(jī)堿存在下縮合以形成31。經(jīng)由還原性水解去除酚保護(hù)基團(tuán)以形成32，用酸水解縮醛保護(hù)基團(tuán)以形成醛33，并且然后在催化酸性縮合條件下形成二環(huán)雜環(huán)34。然后將34上的酚羥基團(tuán)活化以形成35，所述35隨后可以與11縮合以形成如方案4中所示的12?；衔?1可以由如以下實(shí)例中所示的其它親核試劑取代。

方案8

制備具有一般結(jié)構(gòu)15的化合物的兩種可選方法使用方案9和方案10中描述的方法。將中間體13通過形成三氟甲磺酸酯36來活化，然后在諸如碳酸鉀的堿存在下用適當(dāng)?shù)陌啡〈?，以形成如方?中所描述的所需目標(biāo)化合物15。

方案9

用來自方案6的Boc保護(hù)的手性嗎啉22起始，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠通過將保護(hù)的醇轉(zhuǎn)化為如方案10中所示的疊氮化物中間體37來產(chǎn)生具有一般結(jié)構(gòu)15的化合物的其它實(shí)例。在還原疊氮化物、Boc基團(tuán)去保護(hù)以及與3縮合后，37易于轉(zhuǎn)化為伯胺ER-884884。通過烷基化或?；^程，ER-884884同樣可以轉(zhuǎn)化為由一般結(jié)構(gòu)15描述的其它類似物。

方案10

可選的一組化合物實(shí)例的制備為通過關(guān)鍵中間體13的氧化以形成38，然后經(jīng)由酰胺偶聯(lián)條件形成實(shí)例，以形成如方案11中所示的39。使用這種一般方法制備一些實(shí)例將需要一個(gè)或兩個(gè)額外的步驟，以得到一般結(jié)構(gòu)40的所需目標(biāo)化合物。同樣地，通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員使用各種方法可以易于由38產(chǎn)生一般結(jié)構(gòu)41所描述的各種酯。

方案11

同樣地，通過以下兩種可行方法制備醚實(shí)例：(1)用堿和來自方案4的化合物11取代烷基、烯基或芳基官能團(tuán)上的活化基團(tuán)；或者在適當(dāng)?shù)膲A存在下，使用具有酚或烷基醇的活化的醇14或36。在方案12中示出了提供具有一般化學(xué)結(jié)構(gòu)42的實(shí)例的兩種方法。

方案12

還可以將關(guān)鍵中間體13進(jìn)行氧化以形成醛43，然后與各種烷基和芳基偶聯(lián)試劑縮合以得到如方案13中所描述的實(shí)例44或46。然后可以將所得的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為其它實(shí)例：通過44的氧化以得到一般結(jié)構(gòu)45的化合物或46的還原以得到n＝2的一般結(jié)構(gòu)47的化合物。同樣地，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以通過活化羥基由中間體44產(chǎn)生其它實(shí)例，例如形成三氟甲磺酸酯，然后使用幾種可行的還原劑進(jìn)行還原以得到包含減少一個(gè)亞甲基的實(shí)例或n＝1的47。

方案13

通過使用方案14制備最后一組實(shí)例。使用相同的合成方法以制備方案4中的化合物13，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以用1-氨基-3-丁烯62取代烯丙胺來制備所需的七元雜環(huán)68。然后可以活化68，并且然后以上述的幾個(gè)方案中所示的類似方式與各種取代的胺縮合以產(chǎn)生其它類似物。

方案14

實(shí)例的制備

化合物3-方案1

向5-溴喹啉-8-甲醛1(1.00g,4.24mmol)和鹽酸羥胺(1.177g,16.94mmol)在乙腈(110mL)中的懸浮液添加TEA(2.362mL,16.94mmol)，然后加熱至回流3h以提供黃色懸浮液。在完成的反應(yīng)完全冷卻至室溫，過濾沉淀物，用乙腈(50mL)沖洗濾餅。將粗制固體經(jīng)過用EtOAc(300mL)洗脫的短的硅膠墊(10g)純化，以得到黃色固體狀的醛肟2。

將無水乙腈(180mL)中的醛肟2(1.001g,4.0mmol)和一水合乙酸銅(II)(84.6mg,0.424mmol)攪拌回流12h。將完成的反應(yīng)冷卻至室溫，過濾并且用H₂O洗滌濾墊以提供褐色固體。將粗制固體經(jīng)過用DCM(100mL)洗脫的短的硅膠墊(約10g)純化，以在真空中濃縮和干燥洗脫產(chǎn)物后提供米白色固體狀的5-溴喹啉-8-甲腈3(0.783g，3.4mmol，收率為79.3％，經(jīng)過兩步)。參見：Frédérieric de Montigny,Gilles Argouarch,Claude Lapinte,Synthesis,2006,293。

化合物3-方案2

在15℃下向三水合乙酸鈉(31.6g,0.232mol)在EtOH(0.498L)中的經(jīng)攪拌的溶液添加5-溴喹啉-8-甲醛(49.84g,0.211mol)，然后添加鹽酸羥胺(15.55g,0.223mol)。將所得的混合物加熱至70℃持續(xù)3h，此后將反應(yīng)冷卻至35℃，然后用水(250mL)稀釋。將混合物部分濃縮至約250mL，此后添加水(250mL)、2-甲氧基-2-甲基丙烷(120mL)和庚烷(120mL)，然后將混合物再濃縮至約250mL。用水(250mL)稀釋所獲得的漿料并且冷卻至0℃，此后添加1M NaOH水溶液(211mL)，并且將最終的混合物劇烈攪拌10min。過濾懸浮液，用水(498mL)沖洗，并且將濾餅在30℃下干燥18h以得到呈棕褐色粉末的醛肟2(49.75g,0.198mol,93.9％收率)。

在15℃下向2(48.21g,0.192mol)在乙腈(386mL)中的經(jīng)攪拌的懸浮液添加乙酸銅(II)(0.523g,2.9mmol)，然后添加乙酸(13.1mL,0.229mol)。將所得的混合物加熱至回流21h，此后將完成的反應(yīng)冷卻至50℃。添加水(0.39L)，并且將混合物部分濃縮，然后用水(290mL)稀釋并冷卻至5℃。添加1M NaOH水溶液(230mL)，并且持續(xù)劇烈攪拌10min。過濾懸浮液，用水(500mL)沖洗濾餅并且干燥以得到呈灰黑色粉末狀的化合物3(42.80g,0.183mol,95.6％收率)。

ER-878952的合成-方案3和方案15(方法1)

方案15

將NMP(1mL)中的3(200.2mg,0.86mmol)和可商購的順式-2,6二甲基嗎啉69(133.4mg,1.16mmol-作為方案3中的化合物4的代表)在150℃下微波處理1h。將完成的反應(yīng)物進(jìn)行過濾并且分成幾個(gè)小瓶，用NMP稀釋并且通過HPLC(C18柱，具有0.1％TFA的乙腈/水的10/90-95/5梯度，運(yùn)行15min,t＝8.5-9min)純化，以在真空中濃縮和干燥所需合并的部分后獲得ER-878952(180mg.0.68mmol,79.1％收率)。

以與ER-878952相似的方式使用3(15mg,0.064mmol)和2-乙基嗎啉(22.2mg,0.191mmol)產(chǎn)生ER-880369(8.2mg,0.031mmol,48.4％收率)。未進(jìn)行對(duì)映體的分離。

以與ER-878952相似的方式使用3(400mg,1.716mmol)和來自方案4的11(398.1mg,1.799mmol)產(chǎn)生ER-885618(385.2mg,1.032mmol,60.7％收率)。

化合物ER-878952的合成(方法2，方案3和方案15)

向化合物3(12.00g,0.0515mol)在NMP(30.0mL)中的經(jīng)攪拌的懸浮液添加69(14.8g,0.129mol)，然后在120℃下加熱4h。將完成的反應(yīng)物冷卻至50℃，用IPA(30mL)、庚烷(60mL)稀釋，然后進(jìn)一步冷卻至0℃。在30min后，通過過濾收集沉淀，用預(yù)先冷卻(在0℃)的IPA(18.0mL)/庚烷(36mL)混合物沖洗，并且在N₂/真空下干燥2h以得到呈黃色粉末狀的ER-878952(11.00g)。將濾液進(jìn)行濃縮，在EtOAc(120mL)和飽和NaHCO₃水溶液(60mL)之間分配。分離有機(jī)層，用水(60mL)洗滌并且經(jīng)過預(yù)處理(庚烷-EtOAc 1:1)的硅膠，用EtOAc(120mL)洗脫，然后濃縮。因此將獲得的褐色固體懸浮于EtOAc(10mL)庚烷(10mL)中并且加熱至70℃，然后使其冷卻至20℃。通過過濾收集沉淀，用EtOAc(5.0mL)和庚烷(5.0mL)的混合物沖洗，然后在N₂/真空下干燥1h，以提供呈黃色粉末狀的額外的ER-878952(0.649g)?？偟倪^程提供ER-878952(11.64g,43.6mmol,89.6％收率)。

ER-879484(方法3，方案3和方案16)

方案16

向3(15mg,64.4mmol)和4-芐基-2-(氯甲基)嗎啉70(43.6mg(0.193mmol)在DMF(0.5mL)中的經(jīng)攪拌的溶液添加TEA(0.27μL,0.194mmol)。將反應(yīng)混合物在160℃下微波處理1h，此后將完成的反應(yīng)物經(jīng)C-18反相制備型HPLC柱(Water's X-Bridge C18 19x 100mm柱；用具有0.05％TFA的0％–40％梯度的乙腈水溶液洗脫)直接純化。將包含所需產(chǎn)物的部分合并，在真空中濃縮并且干燥以得到ER-879484(4.2mg,0.015mmol,22.7％收率)。使用手性HPLC柱分離ER-879484(3.0mg,0.010mmol)的對(duì)映體，以在真空中濃縮所需部分并且干燥后得到ER-879569(1.0mg,0.004mmol)和ER-879570(1.0mg,0.004mmol)。雖然絕對(duì)立體化學(xué)式是未知的，但可任意指定。

以與ER-879484相似的方式產(chǎn)生ER-879739(12mg,0.047mmol,73.6％收率)，其中使用3(15mg,0.064mmol)和2-甲基嗎啉(19.5mg,0.195mmol)起始。未進(jìn)行對(duì)映體的分離。

以與ER-879484相似的方式產(chǎn)生ER-880191(9.5mg,0.036mmol,23.7％收率)，其中使用3(35mg,0.150mmol)和(2S,6S)-2,6-二甲基嗎啉(741mg,6.434mmol)起始。還分離順式異構(gòu)體ER-878952(15.2mg,0.057mmol,37.9％收率)。在這個(gè)制備過程中未使用TEA。

衍生自ER-878952的其它實(shí)例：

ER-885160：將ER-878952(85.6mg,0.320mmol)溶于1,2-乙二醇(1mL)，然后添加氫氧化鉀(60mg,1.069mmol)。將反應(yīng)混合物在120℃下微波處理10h，此后將其過濾，然后直接注入C-18反相制備型HPLC進(jìn)行純化(Water's X-Bridge C18 19x 100mm柱；用具有0.05％TFA的10％–100％乙腈水溶液洗脫)。將所需的部分濃縮至干燥，溶于MeOH(3mL)并且經(jīng)碳酸鹽浸漬的硅膠柱(Biotage Isolute SPE,Si-CO₃,1g)洗脫，用MeOH(3mL)洗滌，在真空中濃縮并且干燥以得到ER-885160(56.2mg,0.197mmol,61.6％收率)。

作為方案4中的化合物15的實(shí)例的化合物ER-890963的制備

化合物7：在內(nèi)部溫度為18-19℃下，將22L的反應(yīng)器裝載(2R)-芐基2-環(huán)氧丙基醚(0.7692kg,4.684mol)。在18-19℃下添加烯丙胺(3800mL,51mol)，并且將所得的混合物加熱至50℃。在20h后，將混合物進(jìn)行濃縮，與MTBE(4L x 3)共沸以產(chǎn)生呈無色油狀的(R)-1-(烯丙基氨基)-3-(芐氧基)丙-2-醇7(約1037g,4.684mol,假設(shè)100％收率)。

化合物8：在10-11℃下向碳酸氫鈉(1180g,14.0mol)在水(7.2L)中的經(jīng)攪拌的懸浮液添加鄰硝基苯磺酰氯(1038g,4.684mol)在DCM(3100mL)中的溶液，然后將所得的兩相混合物升溫至20℃。在3h內(nèi)添加7(約1037g，假設(shè)4.684mol)在DCM(4100mL)中的溶液，同時(shí)將內(nèi)部溫度維持在20-23℃并且持續(xù)劇烈攪拌過夜。將混合物在攪拌下用水(4100mL)稀釋，然后分離各層。用MTBE(4100ml)萃取水層。用正庚烷(4100mL)稀釋合并的有機(jī)層，依次用1.0M HCl(4700mL)、飽和NaHCO₃(2.0kg)、水(4100mL)洗滌，濃縮并且與MTBE(5200mLx 3)共沸至干燥，以在真空中干燥3天后得到呈褐綠色油狀的(R)-N-烯丙基-N-(3-(芐氧基)-2-羥丙基)-2-硝基苯磺酰胺8(1.855kg,4.56mol,97％收率)。

化合物9：將8(1.80kg,4.429mol)在DMA(5.40L)中的經(jīng)攪拌的懸浮液加熱至40℃以實(shí)現(xiàn)完全溶解，然后冷卻至25℃，此后將混合物添加至包含乙酸銅(II)(0.145kg,0.797mol)的分離反應(yīng)器，然后用DMA(5.40L)沖洗原始容器。添加氯化鈀(II)(0.063kg,0.354mol)，然后用氧氣(1bar)取代內(nèi)部氣氛并且升溫至28-32℃持續(xù)3天。將完成的反應(yīng)混合物分成相等的2部分以促進(jìn)處理。將各個(gè)部分分別傾入0.1M HCl(23L)和MTBE(9.0L)的混合物中，同時(shí)控制T-內(nèi)部<25℃。分離各層并且用MTBE(9.0L和5.4L)萃取水層。合并所有有機(jī)層，依次用0.1M HCl(5.5L)、8％NaHCO3(5.9kg)、29％NaCl(6.3kg)洗滌。將硅藻土545(270g)添加至有機(jī)層，攪拌30min，過濾并且用MTBE(2.7L)沖洗濾餅。合并所有濾液并且濃縮。將微紅色油狀物再溶于DCM(3.6L)中，并且用1,3,5-三嗪烷(triazinane)-2,4,6-三硫酮(79gkg,0.44mol)在25℃下處理1h。將混合物用MTBE(18L)稀釋并且經(jīng)過硅藻土545(270g)過濾。用MTBE(3.6L)沖洗反應(yīng)器和濾餅，并且將合并的濾液進(jìn)行濃縮以產(chǎn)生呈黃色油狀的(R)-2-((芐氧基)甲基)-6-甲基-4-((2-硝基苯基)磺?；?-3,4-二氫-2H-1,4-噁嗪9(1748g,4.322mol,97.6％收率)。

化合物10：將9(1748g,4.322mol)在DCM(3.5L)中的經(jīng)攪拌的懸浮液加熱至33-35℃，直到獲得自由流動(dòng)的懸浮液，此后將混合物冷卻至18-20℃。在攪拌下將分離反應(yīng)器中的DCM(2.62L)中的TFA(1.67L,21.6mol)冷卻至5℃，此后在將溫度維持在5-6℃下添加三乙基硅烷(1.04L,6.48mol)，然后冷卻至-5℃。將9在DCM中的懸浮液在1.5h內(nèi)緩慢添加至主反應(yīng)器中，同時(shí)將溫度維持在-5℃至-3℃，然后在-5℃至-3℃持續(xù)攪拌4h。用預(yù)先冷卻的正庚烷(8.74L，在-10℃下)稀釋完成的反應(yīng)物，然后傾入預(yù)先冷卻的NaOH溶液(NaOH：890g,在水中為22.3mol：8.7L，在5℃下)，同時(shí)控制T-內(nèi)部<15℃(在1h內(nèi))，然后用MTBE(3.5L)沖洗反應(yīng)器。用MTBE(5.2L)稀釋混合物并且分離各層。將有機(jī)層依次用水(8.7L)、30wt％NaCl(3.5kg)水溶液、水(5.2L)洗滌，用硅藻土545(175g)處理并且過濾。用MTBE(1.75L)沖洗處理的容器和濾餅，并且將合并的濾液在真空下濃縮至約3.5L，與正庚烷(8.7L)共沸并且濃縮至約5L。通過過濾收集黃褐色沉淀，用正庚烷(3.5L)沖洗并且在N₂/真空下干燥1h。將1.65kg所得的固體與從單獨(dú)批次獲得的353g固體合并，并且懸浮于1:1的正庚烷/EtOAc(8.0L)中。將混合物加熱至61-63℃以實(shí)現(xiàn)完全溶解，在1h內(nèi)冷卻至23-25℃，用庚烷(4L)稀釋并且在30min內(nèi)進(jìn)一步冷卻至10-12℃。在此溫度下持續(xù)攪拌30min。通過過濾收集淡黃褐色沉淀，用正庚烷/EtOAc 6:1(2L)沖洗，然后用正庚烷(4L)沖洗，然后在N₂/真空下干燥過夜，然后在35℃下在真空烘箱中干燥2d，以產(chǎn)生呈黃褐色固體狀的(2R,6R)-2-((芐氧基)甲基)-6-甲基-4-((2-硝基苯基)磺?；?嗎啉10(1616g,3.98mol,74％收率，從8經(jīng)2個(gè)步驟)。

次要產(chǎn)物：通過母液10的純化分離(2R,6S)-2-((芐氧基)甲基)-6-甲基-4-((2-硝基苯基)-磺?；?嗎啉71(非對(duì)映異構(gòu)體)。

化合物11：向1.0M t-BuOK(0.650L,0.650mol)在冷卻至5℃的THF(0.310L)中的經(jīng)攪拌的溶液添加苯硫醇(63.66mL,0.620mol)，同時(shí)維持在<10℃。將混合物在10℃下攪拌30min，然后升溫至15℃持續(xù)1h，此后添加10(240.00g,590.5mmol)在THF(0.60L)中的溶液，同時(shí)將溫度維持在15-20℃，然后攪拌2h。用1.0M HCl(1.30L)在正庚烷(3.60L，預(yù)先冷卻至10℃)中的混合物緩慢淬滅完成的反應(yīng)，同時(shí)將反應(yīng)混合物維持<15℃。將所得的混合物劇烈攪拌10min，然后分離各層。用水(0.24L)萃取有機(jī)層，用正庚烷(0.24L)沖洗。合并所有的水層，并且用正庚烷(3.60L)洗滌，然后在攪拌下添加NaCl(240g)。用5.0M NaOH(165mL)使水性混合物堿化，然后用DCM(每次3.60L和2.40L)萃取兩次。用20wt％NaCl水溶液(1400g)洗滌合并的有機(jī)層，濃縮，與MTBE(1400mL)共沸，用MTBE(960mL)再稀釋并且經(jīng)玻璃過濾器過濾。將濾液進(jìn)行濃縮以產(chǎn)生呈褐色透明油狀的(2R,6R)-2-((芐氧基)甲基)-6-甲基嗎啉11，其未經(jīng)進(jìn)一步純化用于后續(xù)反應(yīng)。

化合物12：向3(137.6g,0.591mol)在DMA(260mL)中的經(jīng)攪拌的溶液添加DIPEA(308mL,1.77mol)，然后添加經(jīng)DMA(130mL)沖洗的11(130.67g,0.5905mol)在DMA(260ml)中的溶液。將反應(yīng)混合物在125-130℃加熱2h。將完成的反應(yīng)混合物冷卻至30℃，并且用EtOAc(1.96L)和水(0.65L)稀釋，此后在劇烈攪拌下將其傾入水(2.61L)中。將所得的混合物經(jīng)過硅藻土545墊(260g)過濾并且分離各層。用EtOAc(1.31L)萃取水層，然后合并有機(jī)層，用5％NaCl(每次1.0kg)洗滌兩次并且進(jìn)行濃縮以產(chǎn)生黑色固體。將所述固體溶于DCM(1L)，用正庚烷(520mL)稀釋，然后添加硅膠(196g)和MgSO₄(130g)。將所得的漿料在20℃下攪拌30min，過濾并且用乙酸異丙酯(2.09L)洗脫。濃縮合并的濾液并且將所得的褐色固體懸浮于EtOAc(196mL)和正庚烷(523mL)的混合物中。將混合物加熱至70℃，然后冷卻至室溫并且攪拌過夜。通過過濾收集沉淀，用EtOAc/正庚烷3:8(220mL)的混合物洗滌，并且在真空下干燥以得到呈黃褐色粉末狀的5-((2R,6R)-2-((芐氧基)甲基)-6-甲基嗎啉代)喹啉-8-甲腈12(178.44g,0.478mol,80％收率)。

化合物13：在室溫下，向12(167.3g,0.45mol)在乙腈(500mL)中的經(jīng)攪拌的懸浮液添加三甲基碘硅烷(82.9mL,0.582mol)。將所得的混合物在70℃下加熱2h，此后將其冷卻至室溫，用水(167g)緩慢淬滅并且在25-30℃下攪拌1h。將反應(yīng)混合物冷卻至15℃，然后添加28％氫氧化銨水溶液(500g)，此后將反應(yīng)在室溫下攪拌過夜。將混合物進(jìn)行部分濃縮，然后用水(0.5L)、MTBE(0.04L)和正庚烷(0.3L)稀釋，然后冷卻至0-5℃。通過過濾收集沉淀并且用預(yù)先冷卻的水(500ml)沖洗，然后用正庚烷/MTBE 7:1(400ml)沖洗，然后在真空下(40℃)干燥過夜以得到呈黃褐色粉末狀的5-((2R,6R)-2-(羥甲基)-6-甲基嗎啉代)喹啉-8-甲腈13或ER-885493(127.2g,0.45mol,100％收率)。

化合物14：在室溫下向13(24.8g,0.0875mol)在DCM(200mL)中的經(jīng)攪拌的溶液分批添加對(duì)甲苯磺酰氯(17.95g,94.17mmol)，然后添加TEA(24.60mL,0.1765mol)。將反應(yīng)攪拌3h，此后用水(200mL)淬滅完成的反應(yīng)。用鹽水(50mL)洗滌分離的有機(jī)層，經(jīng)Na₂SO₄干燥，過濾并且濃縮為褐色焦油。將粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠(SNAP 340x 2g，用庚烷/EtOAc＝5/1至3/1洗脫、TLC庚烷/EtOAc＝3/1,rf＝0.6)純化，以在真空中濃縮所需部分并且干燥后得到呈黃色粉末狀的((2R,6R)-4-(8-氰基喹啉-5-基)-6-甲基嗎啉-2-基)甲基4-甲基苯磺酸酯14(34.98g.79.95mmol,84.9％收率)。

作為Boc保護(hù)的ER-890963的化合物15：在室溫下向14(13.9g,31.77mmol)和TEA(8.86mL,63.541mmol)在DMA(89mL)中的溶液在5min內(nèi)逐滴添加可商購的(S)-叔丁基2-乙基哌嗪-1-甲酸酯(7.49g,34.95mmol)。將反應(yīng)混合物在110℃下攪拌12h以完成反應(yīng)，此后將反應(yīng)冷卻至室溫。將反應(yīng)物進(jìn)行濃縮以去除DMA，然后用DCM(30mL)稀釋。將所得的有機(jī)溶液用水(每次30mL)、鹽水(30mL)洗滌兩次，并且經(jīng)MgSO₄干燥。將粗產(chǎn)物進(jìn)行過濾，在真空中濃縮，并且經(jīng)硅膠(SNAP 340g，用庚烷中的10％至30％EtOAc洗脫，TLC庚烷/EtOAc＝3/1,rt＝0.6)純化，以在真空中濃縮合并的所需部分并且干燥后產(chǎn)生呈黃色粉末狀的5-((2S,6R)-2-(((S)-4-(3,3-二甲基丁酰基)-3-乙基哌嗪-1-基)甲基)-6-甲基嗎啉代)喹啉-8-甲腈或Boc保護(hù)的ER-890963(12.27g,24.15mmol,76％收率)。

ER-890963或化合物15：

在室溫下將Boc保護(hù)的ER-890963(23.55g,49.10mmol)在攪拌下溶于DCM(50mL)，然后將TFA(50mL)溶于其中。將反應(yīng)在室溫下攪拌4h，此后將完成的反應(yīng)物在真空中進(jìn)行濃縮。將粗制深橙色材料在攪拌下溶于DCM(50mL)中，并且在20℃下添加飽和NaHCO₃水溶液進(jìn)行中和，直到溶液的pH變?yōu)閜H 5-6。將分離的水層用DCM(每次50mL)萃取兩次，此后用鹽水(20mL)洗滌合并的有機(jī)層，經(jīng)Na₂SO₄干燥，過濾并且濃縮至干燥。將粗制殘余物從DCM/iPrOH/庚烷/Et₂O＝1/1/1/1中結(jié)晶以得到呈黃色粉末狀的ER-890963(17.89g,47.14mmol,96％收率)。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-886604(7.8mg,0.021mmol,73％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和1-氨基-4-甲基苯(0.030mL,0.290mmol)起始，在180℃下使用微波處理15min。將ER-886604通過反相HPLC(Water's X-Bridge C18 19x 100mm柱，用包含0.05％TFA的10％乙腈水溶液進(jìn)行洗脫)純化。將產(chǎn)物部分進(jìn)行合并以及濃縮至干燥，然后在MeOH(1mL)中稀釋，經(jīng)過堿性硅膠塞(Biotage SiCO₃,1g，用MeOH(1mL)洗脫)，在真空中濃縮并且干燥。不需要進(jìn)行Boc去保護(hù)。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-886608(8.2mg,0.019mmol,67％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和5-氨基-1,2-二甲基苯并咪唑二鹽酸鹽(30mg,0.128mmol)連同TEA(0.040mL,0.290mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-886609(7.4mg,0.017mmol,59％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和5-氨基-1-乙基-2-甲基苯并咪唑(30mg,0.171mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-886611(9.2mg,0.027mmol,88％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和1-氨基環(huán)己烷(30mg,0.171mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-886787(4.5mg,0.012mmol,43.9％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和2-氨基嘧啶(24.7mg,0.263mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-886788(5.2mg,0.014mmol,51％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和2-氨基吡啶(24.4mg,0.263mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-886789(4.5mg,0.012mmol,42％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和2-氨基-6-甲基吡啶(28.1mg,0.263mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-886790(4.6mg,0.012mmol,43％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和2-氨基-5-甲基吡啶(28.1mg,0.263mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-886814(4.2mg,0.012mmol,40.4％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和D-脯氨醇(26.2mg,0.263mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-886815(4.0mg,0.011mmol,38.2％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和2,2-二甲基吡咯烷(14.2mg,0.145mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-886816(6.0mg,0.016mmol,60％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和2-異丙基吡咯烷(29.4mg,0.263mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-886817(4.2mg,0.012mmol,62％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和(R)-2-甲基吡咯烷(22.1mg,0.263mmol)起始。

通過ER-890604所述的相似方法制備ER-886818(4.2mg,0.010mmol,35.2％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和(S)3-苯基吡咯烷(38.2mg,0.263mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-886819(5.2mg,0.015mmol,52％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和(R)-3-甲基吡咯烷(22.1mg,0.263mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-886820(6.2mg,0.018mmol,62％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和(S)-3-羥基吡咯烷(22.6mg,0.263mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-886853(6.2mg,0.017mmol,58％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和2-氨基-4-甲基吡啶(28.1mg,0.263mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-886854(2.9mg,0.007mmol,25％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和3-苯基吡咯烷鹽酸鹽(47.7mg,0.263mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-886855(4.9mg,0.013mmol,44％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和2-氨基-5-甲氧基吡啶(32.2mg,0.263mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-886856(7.8mg,0.022mmol,78％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和(S)-2-甲基吡咯烷(22.1mg,0.263mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-886857(5.6mg,0.015mmol,54％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和2,5-二甲基吡咯烷(25.7mg,0.263mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-886858(3.6mg,0.009mmol,32％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和2-氨基-4-甲氧基吡啶(32.2mg,0.263mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-886859(2mg,0.005mmol,20％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和2-氨基-6-甲氧基吡啶(32.2mg,0.263mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-886860(2.5mg,0.006mmol,21％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和5-氨基-1-苯基吡唑(41.3mg,0.263mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-886866(8.2mg,0.022mmol,78％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和L-脯氨醇(22.1mg,0.263mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-886867(4.5mg,0.013mmol,45％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和(R)-3-羥基吡咯烷(22.6mg,0.263mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-886868(6.5mg,0.019mmol,65％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和(S)-3-甲基吡咯烷(22.1mg,0.263mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-886869(5.3mg,0.015mmol,51％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和3,3-二甲基吡咯烷(25.7mg,0.263mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-886948(6.2mg,0.016mmol,56％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和2-氨基-3-甲氧基吡啶(32.2mg,0.263mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-886949(4.8mg,0.013mmol,46％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和(R)-3羥基哌啶(26.2mg,0.263mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-886950(5.0mg,0.013mmol,46％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和(R,S)-2,6-二甲基哌啶(29.4mg,0.263mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-886951(3.2mg,0.009mmol,31％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和(S)-3-羥基哌啶(26.2mg,0.263mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-886953(5.8mg,0.016mmol,55％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和4-羥基哌啶(26.2mg,0.263mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-886955(7.5mg,0.020mmol,69％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和2-羥甲基哌啶(29.9mg,0.263mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-887137(4.5mg,0.012mmol,42％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和2,3-二甲基哌嗪(29.6mg,0.263mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-887138(5.9mg,0.016mmol,57％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和2-氨基吡啶(24.4mg,0.263mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-887139(6.5mg,0.018mmol,63％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和3-氨基吡啶(24.4mg,0.263mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-887141(5.2mg,0.014mmol,50％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和4-甲基哌啶(25.7mg,0.263mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-887142(4.5mg,0.012mmol,41％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和4,4-二氟哌啶(31.4mg,0.263mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-887143(4.7mg,0.011mmol,38％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和4-苯基哌啶(41.8mg,0.263mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-887144(6.2mg,0.017mmol,59％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和4-氟哌啶(26.8mg,0.263mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-887145(6.5mg,0.019mmol,65％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和1-氨基環(huán)戊烷(22.1mg,0.263mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-887146(7mg,0.018mmol,60％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和1-氨基-3-甲基環(huán)己烷(29.4mg,0.263mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-887177(5.3mg,0.014mmol,49％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和2-氨基-3-甲基吡啶(20mg,0.145mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-887253(10.2mg,0.029mmol,60％收率)，其中以14(20mg,0.046mmol)和哌嗪(40mg,0.460mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-887442(6.2mg,0.016mmol,59％收率)，其中以14(12.2mg,0.028mmol)和1-氨基-4-甲基環(huán)己烷(30mg,0.265mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-887443(4.5mg,0.013mmol,47％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和1-氨基-環(huán)丁烷(10mg,0.141mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-887444(7.7mg,0.020mmol,70.7％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和1-氨基-環(huán)庚烷(20mg,0.177mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-887526(6.2mg,0.016mmol,57％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和1-氨基-4-羥基環(huán)己烷(30mg,0.260mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-887528(5.4mg,0.015mmol,51.2％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和1-氨基-2-羥基環(huán)戊烷(30mg,0.297mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-887539(5.3mg,0.014mmol,49％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和1-氨基-2-甲基環(huán)己烷(30mg,0.265mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-887538(6.5mg,0.014mmol,51.8％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和2-氨基-5-苯基吡啶(50mg,0.294mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-887540(6.1mg,0.014mmol,49％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和2-氨基-3-苯基吡啶(50mg,0.294mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-887586(6.2mg,0.017mmol,59％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和(S,R)-1-氨基-2-羥基吡咯烷(10mg,0.099mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-887587(7.5mg,0.019mmol,65％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和2-氨基-3-乙氧基吡啶(40mg,0.290mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-887588(5.6mg,0.013mmol,45％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和4-氨基-2-苯基吡啶(20mg,0.118mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-887589(2.4mg,0.006mmol,19％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和2-氨基-6-苯基吡啶(20mg,0.118mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-887722(3.5mg,0.009mmol,32％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和5-甲基哌嗪-2-酮(20mg,0.175mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-887723(6.2mg,0.017mmol,59％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和1-N-甲基哌嗪(10mg,0.100mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-887724(6.2mg,0.016mmol,55％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和1-N-丙基哌嗪(40mg,0.138mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-887725(7.2mg,0.018mmol,64％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和4-(二甲基氨基)-哌啶(20mg,0.156mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-887927(10.2mg,0.024mmol,82.3％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和1,4’-聯(lián)哌啶(20mg,0.119mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-887928(3.2mg,0.009mmol,31％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和(R)-叔丁基哌啶-3-基氨基甲酸酯(30mg,0.150mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-888070(4.5mg,0.012mmol,43％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和哌啶-4-基氨基甲酸叔丁酯(30mg,0.150mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-888202(6.2mg,0.018mmol,62％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和哌啶(0.034mL,0.348mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-888203(7.2mg,0.020mmol,58％收率)，其中以14(15.5mg,0.035mmol)和嗎啉(0.030mL,0.350mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-888204(6.2mg,0.016mmol,57％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和(2S,6R)-2,6-二甲基嗎啉(0.070mL,0.580mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-888205(4.6mg,0.012mmol,41％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和((2R,6R)-6-甲基嗎啉-2-基)甲醇或ER-885491(40mg,0.305mmol)起始。

ER-885491：向11(890.2mg,4.023mmol)在MeOH(8mL)中的經(jīng)攪拌的懸浮液添加5％鈀碳(270mg)，此后將混合物用H₂氣體吹掃三次，同時(shí)在充氣間隔抽真空。將反應(yīng)在H₂atm、40℃下攪拌8h。將未完成的反應(yīng)在用N₂氣體吹掃下于真空中脫氣，然后添加5％鈀碳(100mg)和2滴濃HCl，此后在40℃下將反應(yīng)如上所述在H₂atm下放置4h。用N₂氣體吹掃完成的反應(yīng)，然后經(jīng)硅藻土545過濾，用MeOH(5mL)洗脫，在真空中濃縮并且干燥。將粗產(chǎn)物ER-885491(378.2mg,2.883mmol,71.7％收率)未經(jīng)進(jìn)一步純化用于先前步驟中。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-888285(8.6mg,0.020mmol,59％收率)，其中以14(15mg,0.034mmol)和N-(2-吡啶基)哌嗪(30mg,0.184mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-888286(10.2mg,0.020mmol,71.3％收率)，其中以14(14.6mg,0.033mmol)和N-(4-吡啶基)哌嗪(30mg,0.184mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-888288(7.2mg,0.016mmol,52％收率)，其中以14(15mg,0.034mmol)和N-(哌啶-4-基)乙酰胺(20mg,0.141mmol)起始。通過先前所述的程序形成HCl鹽。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-888289(16.2mg,0.039mmol,21.6％收率)，其中以14(80mg,0.183mmol)和1,8-萘啶-2-胺(100mg,0.689mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-888320(5.8mg,0.015mmol,42％收率)，其中以14(15.5mg,0.035mmol)和哌啶-4-甲酰胺(20mg,0.156mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-888321(6.2mg,0.013mmol,37％收率)，其中以14(15.5mg,0.035mmol)和N-(哌啶-4-基)苯甲酰胺(40mg,0.196mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-888322(10.5mg,0.027mmol,75.3％收率)，其中以14(15.5mg,0.035mmol)和1-異丙基哌嗪(20mg,0.156mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-888330(4.2mg,0.011mmol,30％收率)，其中以14(15.5mg,0.035mmol)和哌嗪-1-甲酰胺(20mg,0.155mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-888479(7.6mg,0.018mmol,51％收率)，其中以14(15mg,0.034mmol)和4-環(huán)己基哌啶(30mg,0.179mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-888480(8.3mg,0.020mmol,58％收率)，其中以14(15mg,0.034mmol)和4-(吡咯烷-1-基哌啶(30mg,0.194mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-888838(6.2mg,0.015mmol,45％收率)，其中以14(15mg,0.034mmol)和3,5-二甲基吡啶-2,6-二胺(20mg,0.146mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-888977(1.2mg,0.003mmol,11％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和1,3-二甲基-1H-吡唑-5-胺(28.8mg,0.259mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-889448(8.2mg,0.022mmol,63％收率)，其中以14(15mg,0.034mmol)和1-乙基哌嗪(0.020mL,0.136mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-889469(6.5mg,0.018mmol,52％收率)，其中以14(15mg,0.034mmol)和1-(氮雜環(huán)丁烷-3-基)吡咯烷(20mg,0.158mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-889470(7.2mg,0.017mmol,48％收率)，其中以14(15mg,0.034mmol)和1-(氮雜環(huán)丁烷-3-基)哌啶(20mg,0.158mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-889557(7.7mg,0.020mmol,58.6％收率)，其中以14(15mg,0.034mmol)和哌啶-4-基甲醇(20mg,0.174mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-889571(3.2mg,0.008mmol,23％收率)，其中以14(15mg,0.034mmol)和(R)-1,3’-二吡咯烷(20mg,0.143mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-889572(1.1mg,0.003mmol,7.7％收率)，其中以14(15mg,0.034mmol)和(R)-1-(吡咯烷-3-基)哌啶(20mg,0.130mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-889601(6.7mg,0.018mmol,51％收率)，其中以14(15mg,0.034mmol)和1-甲基-1,4-二氮雜環(huán)庚烷(20mg,0.175mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-889602(10.2mg,0.022mmol,65.3％收率)，其中以14(15mg,0.034mmol)和苯基(哌嗪-1-基)甲酮(30mg,0.158mmol)起始。

通過ER-886608所述的相似方法制備ER-891084(7.2mg,0.016mmol,47％收率)，其中以14(15mg,0.034mmol)和1-(哌啶-4-基)氮雜環(huán)庚烷(30mg,0.165mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-890108(15.2mg,0.036mmol,58.6％收率)，其中以14(27mg,0.062mmol)和1-(氮雜環(huán)丁烷-3-基)-4-甲基哌嗪(90.2mg,0.581mmol)起始。還將三乙胺(0.008mL,0.062mmol)添加至反應(yīng)。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-890112(296.5mg,0.683mmol,74.7％收率)，其中以14(400.6mg,0.916mmol)和4,4’-聯(lián)哌啶(290mg,1.723mmol)起始。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-894472(53.9mg,0.143mmol,25％收率)和ER-894473(51.2mg,0.135mmol,23.6％收率)，其中以14(250mg,0.571mmol)和5-甲基哌嗪-2-酮(78.3mg,0.686mmol)起始。任意指定各個(gè)非對(duì)映甲基的立體化學(xué)。

通過ER-886604所述的相似方法制備ER-886507(4.2mg,0.013mmol,51.9％收率)，其中以14(10.6mg,0.024mmol)和吡咯烷(0.022mL,0.257mmol)起始，使用甲苯(1mL)代替DMA作為溶劑。不需要進(jìn)行Boc去保護(hù)。

通過ER-890507所述的相似方法制備ER-886508(3.3mg,0.010mmol,38.9％收率)，其中以14(10.8mg,0.025mmol)和N,N-二乙胺(0.027mL,0.262mmol)起始。

通過ER-890507所述的相似方法制備ER-886509(4.8mg,0.013mmol,44.9％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和芐胺(0.028mL,0.263mmol)起始。

通過ER-890507所述的相似方法制備ER-886601(6.6mg,0.018mmol,64.2％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和苯胺(0.008mL,0.087mmol)起始。

通過ER-890507所述的相似方法制備ER-886602(6.4mg,0.017mmol,60.1％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和1-氨基-3-甲苯(0.028mL,0.263mmol)起始。

通過ER-890507所述的相似方法制備ER-887104(2.1mg,0.005mmol,17.9％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和(S)-2-(三氟甲基)吡咯烷(36.1mg,0.260mmol)起始。

通過ER-890507所述的相似方法制備ER-886603(7.6mg,0.020mmol,71％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和1-氨基-2-甲苯(0.030mL,0.290mmol)起始，使用NMP(1mL)代替甲苯作為溶劑。

通過ER-886507所述的相似方法制備ER-886957(4.7mg,0.013mmol,45％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和2-甲基哌啶(25.7mg,0.263mmol)起始。

通過ER-886507所述的相似方法制備ER-886958(6.2mg,0.016mmol,57％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和2-乙基哌啶(29.3mg,0.263mmol)起始。

通過ER-886507所述的相似方法制備ER-887139(2.1mg,0.005mmol,18％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和(S)-2-三氟甲基吡咯烷(36.1mg,0.263mmol)起始。

通過ER-886507所述的相似方法制備ER-887252(2.6mg,0.006mmol,21％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和2-氨基-4-苯基吡啶(20mg,0.145mmol)起始。

通過ER-886507所述的相似方法制備ER-887258(4.2mg,0.010mmol,34％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和甲苯(0.5mL)中的N-苯基哌嗪(0.040mL,0.290mmol)起始。

通過ER-886507所述的相似方法制備ER-887259(3.2mg,0.009mmol,30％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和2,6-二甲基吡啶(30mg,0.290mmol)起始。

通過ER-886507所述的相似方法制備ER-887260(3.3mg,0.009mmol,30.1％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和(S,S)-2,5-二甲基哌嗪(29.6mg,0.263mmol)起始。

通過ER-886507所述的相似方法制備ER-887261(4.2mg,0.011mmol,39％收率)，其中以14(12mg,0.027mmol)和N-乙酰基哌嗪(40mg,0.274mmol)起始。

通過ER-886507所述的相似方法制備ER-887262(2.4mg,0.006mmol,22％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和4-(R)-羥基-2-(S)-羥甲基吡咯烷(30.4mg,0.263mmol)起始。

通過ER-886608所述的相似方法制備ER-887268(9.3mg,0.017mmol,10％收率)，其中使用甲苯(100mL)以14(50mg,0.114mmol)和(R)-叔丁基3-甲基哌嗪-1-甲酸酯(100mg,0.570mmol)起始。如以上Boc保護(hù)的ER-890963所述，需要Boc去保護(hù)。通過反相HPLC(Water's X-Bridge C18 19x 100mm柱，用具有0.05％TFA的10％–40％乙腈水溶液進(jìn)行洗脫)純化ER-887268，然后如ER-886608所述進(jìn)行中和。

通過ER-887268所述的相似方法制備ER-887269(6.2mg,0.025mmol,21.4％收率)，其中以14(51.8mg,0.118mmol)和(R)-叔丁基2-甲基哌嗪-1-甲酸酯(100mg,0.570mmol)起始。

通過ER-887268所述的相似方法制備ER-887270(12.2mg,0.033mmol,30％收率)，其中以14(50mg,0.114mmol)和(S)-叔丁基2-甲基哌嗪-1-甲酸酯(200mg,1.14mmol)起始。

通過ER-887268所述的相似方法制備ER-887271(2.3mg,0.006mmol,5.5％收率)，其中以14(48.2mg,0.110mmol)和(R,R)-叔丁基2,5-二甲基哌嗪-1-甲酸酯鹽酸鹽(100mg,0.399mmol)以及DIPEA(0.10mL,0.55mmol)起始。

通過ER-887268所述的相似方法制備ER-887272(3.2mg,0.008mmol,7.1％收率)，其中以14(52.7mg,0.120mmol)和(S,R)-叔丁基2,5-二甲基哌嗪-1-甲酸酯(100mg,0.467mmol)起始。

通過ER-890963所述的相似方法制備ER-890119(256.2mg,0.630mmol,58.6％收率)，其中以14(450mg,1.029mmol)和4-(氮雜環(huán)丁烷-3-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(314.2mg,1.302mmol)起始。還將三乙胺(0.172mL,1.23mmol)添加至反應(yīng)。使用二噁烷(2mL)代替DMA。需要用TFA對(duì)Boc基團(tuán)進(jìn)行去保護(hù)，然后如先前所述進(jìn)行最終產(chǎn)物的中和。

通過ER-890119所述的相似方法制備ER-892253(152.3mg,0.362mmol,4.0％總收率)，其中以14(4.0mg,9.1mmol)和(1-(氮雜環(huán)丁烷-3-基)哌啶-4-基)氨基甲酸叔丁酯(2.52g,9.9mmol)起始。

通過ER-890119所述的相似方法制備ER-888605(7.6mg,0.017mmol,5.0％收率)，其中以14(150mg,0.343mmol)和[1,4’-聯(lián)哌啶]-2-酮鹽酸鹽(82.5mg,0.377mmol)起始。不需要進(jìn)行Boc基團(tuán)去保護(hù)。

通過ER-890119所述的相似方法制備ER-888605(7.6mg,0.017mmol,5.0％收率)，其中以14(150mg,0.343mmol)和[1,4’-聯(lián)哌啶]-2-酮鹽酸鹽(82.5mg,0.377mmol)起始。不需要進(jìn)行Boc基團(tuán)去保護(hù)。

通過ER-890119所述的相似方法制備ER-890093(15.2mg,0.035mmol,45.4％收率)，其中以14(33.6mg,0.077mmol)和4-(哌啶-4-基)嗎啉(52mg,0.305mmol)起始。不需要進(jìn)行Boc基團(tuán)去保護(hù)。

通過ER-890119所述的相似方法制備ER-890104(569mg,1.06mmol,42.6％收率)，其中以14(1.08g,2.5mmol)和4-(哌啶-4-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(1.00g,3.7mmol)起始。如上所述進(jìn)行ER-890104(21mg,0.039mmol)的Boc基團(tuán)去保護(hù)，以得到ER-890106(12.4mg,0.029mmol,73.2％收率)。

通過ER-890119所述的相似方法制備ER-890105(65mg,0.122mmol,11.3％收率)，其中以14(1.08g,2.5mmol)和4-(哌啶-4-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(1.00g,3.7mmol)起始。還將DIPEA(0.65mL,3.7mmol)添加至反應(yīng)混合物。如上所述進(jìn)行ER-890105(60mg,0.112mmol)的Boc基團(tuán)去保護(hù)，以得到ER-890107(11.3mg,0.026mmol,23.2％收率)。

通過ER-886608所述的相似方法制備ER-890311(4.5mg,0.011mmol,31％收率)，其中以14(15mg,0.034mmol)和(S)-1-(吡咯烷-3-基)哌啶二鹽酸鹽(30mg,0.108mmol)起始，用乙腈(1mL)代替DMA。還將三乙胺(0.014mL,0.102mmol)添加至反應(yīng)。根據(jù)先前所述的方法產(chǎn)生產(chǎn)物的二鹽酸鹽。

通過ER-890311所述的相似方法制備ER-890342(41.3mg,0.101mmol,11％收率)，其中以14(150.2mg,0.916mmol)和4-(氮雜環(huán)丁烷-3-基)嗎啉(221.6mg,1.030mmol)起始。

通過ER-890311所述的相似方法制備ER-890343(25.2mg,0.062mmol,77.2％收率)，其中以14(35.2mg,0.080mmol)和1-(氮雜環(huán)丁烷-3-基)-4-甲基哌嗪(40.3mg,0.0201mmol)起始。

通過ER-890311所述的相似方法制備ER-890344(21.4mg,0.059mmol,73.8％收率)，其中以14(35.2mg,0.080mmol)和(S)-叔丁基3-甲基哌嗪-1-甲酸酯(28.2mg,0.201mmol)起始。在用TFA進(jìn)行Boc基團(tuán)的去保護(hù)之后進(jìn)行中和。

通過ER-890344所述的相似方法制備ER-890963(685.2mg,1.806mmol,86％)，其中以14(919mg,2.101mmol)和(S)-叔丁基2-乙基哌嗪-1-甲酸酯(500mg,2.333mmol)起始。根據(jù)先前所述的方法產(chǎn)生產(chǎn)物的二鹽酸鹽。

通過ER-890311所述的相似方法制備ER-891090(54.2mg,0.133mmol,46.8％收率)，其中以14(137.5mg,0.314mmol)和(S)-1,3’-二吡咯烷二鹽酸鹽(30mg,0.165mmol)起始。不需要進(jìn)行Boc基團(tuán)去保護(hù)。

通過ER-890311所述的相似方法制備ER-895204(35.2mg,0.084mmol,73.1％收率)，其中以14(50mg,0.114mmol)和N-乙基哌啶-4-甲酰胺(21.4mg,0.137mmol)起始。根據(jù)先前所述的方法產(chǎn)生產(chǎn)物的鹽酸鹽。

作為來自方案4的化合物15的修改實(shí)例的ER-887612的制備：

將化合物3(201mg,0.862mmol)和(R)-2-羥甲基嗎啉鹽酸鹽(132,0.856mmol)在NMP(3mL)中的混合物加熱至170℃持續(xù)16h。將完成的反應(yīng)物進(jìn)行冷卻，過濾，用MeOH(2mL)洗脫，然后通過HPLC使用C-18柱直接純化，其中用包含0.1％TFA的10％–100％乙腈水溶液洗脫。收集所需產(chǎn)物并且濃縮至干燥。將所得產(chǎn)物溶于MeOH(2mL)中，并且經(jīng)過堿性二氧化硅塞(Biotage,1g,SiCO₃)，用MeOH(5mL)洗脫，以得到(R)-5-(2-(羥甲基)嗎啉代)喹啉-8-甲腈或ER-886849(108mg,0.401mmol,46.9％收率)。

向ER-886849(101mg,0.375mmol)在DCM(2mL)中的經(jīng)攪拌的溶液添加對(duì)甲苯磺酰氯(78.5mg,0.412mmol)，然后添加DIPEA(0.13mL,0.746mmol)和DMAP(2.3mg,0.019mmol)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌2h，此后添加額外的對(duì)甲苯磺酰氯(78.7mg,0.413mmol)，然后在室溫下攪拌4h。在攪拌下將水(1.2mL)和DCM(5.9mL)添加至完成的反應(yīng)，然后分離各層。用鹽水(1.2mL)洗滌有機(jī)層，經(jīng)MgSO₄干燥，過濾并濃縮至干燥。將粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠(Biotage SP4,Interchim 25g，用庚烷中的20％-100％EtOAc梯度洗脫)純化，將所需部分進(jìn)行收集，在真空中濃縮并且干燥，以得到(R)-(4-(8-氰基喹啉-5-基)嗎啉-2-基)甲基4-甲基苯磺酸酯(85mg,0.201mmol,53.6％收率)。

將(R)-(4-(8-氰基喹啉-5-基)嗎啉-2-基)甲基4-甲苯-磺酸酯(27mg,0.064mmol)和2-氨基吡啶(90mg,0.956mmol)在NMP(1mL)中的溶液在150℃下微波處理15min。將冷卻的反應(yīng)物用NMP(3mL)進(jìn)行稀釋并且通過HPLC使用C-18直接純化，其中用包含0.1％TFA的10％–100％乙腈水溶液洗脫。收集所需產(chǎn)物并且濃縮至干燥。將所得產(chǎn)物溶于MeOH(2mL)，并且經(jīng)過堿性二氧化硅塞(Biotage,1g,SiCO₃)，用MeOH(5mL)洗脫，以得到ER-887612(16mg,0.046mmol,71.9％收率)。

以與ER-886849相似的方式制備ER-885211(4mg,0.016mmol,24.7％收率)，其中以化合物3(15mg,0.064mmol)和(R)-2-甲基嗎啉(22mg,0.160mmol)開始。將TEA(0.05mL,0.359mmol)添加至反應(yīng)。

化合物10的可選合成-方案5

化合物16：向化合物8(2.869g,7.06mmol)在冷卻至5-6℃的乙腈(14.4ml)中的經(jīng)攪拌的溶液添加TFA(0.163ml,2.12mmol)，然后添加NBS(1.385g,7.78mmol)。將反應(yīng)混合物攪拌1h，此后添加9％NaHCO₃(6.6g,7.1mmol)，然后添加亞硫酸鈉(Na₂SO₃；0.27g,2.1mmol)，并且然后攪拌5min。將混合物用水(5.7ml)和甲苯(29ml)稀釋，再攪拌5min，然后分離各層。用甲苯(14.4ml)萃取水層，此后用20％NaCl(7.20ml)洗滌合并的有機(jī)層，濃縮至約5ml，然后用MTBE(29ml)稀釋。添加2M NaOH(7.1ml)并且將所得的兩相混合物劇烈攪拌10min。分離有機(jī)層并且依次用20％NaCl(每次14ml)、水(5.7ml)洗滌兩次，濃縮至約5ml并且用甲苯(14.4ml)稀釋。將包含(2R)-2-((芐氧基)甲基)-6-(溴甲基)-4-((2-硝基苯基)-磺酰基)嗎啉16的所得溶液直接用于下一反應(yīng)。

化合物17：向16(約3.43g,7.06mmol，來自以上)在甲苯中的經(jīng)攪拌的溶液添加DBU(2.66ml,17.648mmol)，然后在100℃下加熱4h。將完成的反應(yīng)物冷卻至15℃，然后在攪拌下添加MTBE(60ml)和1M HCl(21.2ml)。分離各層，此后用MTBE(20ml)萃取水層。用水(10ml)、9wt％NaHCO₃水溶液(10g,10.713mmol)、20wt％NaCl(10ml)洗滌合并的有機(jī)層，然后濃縮至干燥。將所產(chǎn)生的帶有鹽的粗制黃色油狀物用DCM(10ml)稀釋，過濾并且濃縮以產(chǎn)生呈橙色油狀的粗制(R)-2-((芐氧基)甲基)-6-亞甲基-4-((2-硝基苯基)磺?；?嗎啉17(3.2g)。

化合物10：在0℃下向三乙基硅烷(1.69ml,10.6mmol)在DCM(4ml)中的經(jīng)攪拌的溶液添加TFA(2.72ml,35.3mmol)，然后冷卻至-15℃。添加DCM(4ml)中的粗制17(約2.86g,7.06mmol)，同時(shí)將溫度維持在-5℃，然后添加經(jīng)DCM(4ml)沖洗的殘余物。將所得的混合物在-10℃至-5℃攪拌1h，然后升溫至2℃-3℃再持續(xù)1h。將完成的反應(yīng)物冷卻至-10℃，傾入預(yù)先冷卻(2℃)的2M NaOH(21.2ml,42.4mmol)，用DCM(2ml)沖洗反應(yīng)器。用MTBE(50ml)萃取最終混合物以及用水(10ml)、20wt％NaCl(10ml)洗滌有機(jī)層，并且進(jìn)行濃縮以產(chǎn)生橙色的油狀物。將粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠(正庚烷/MTBE 1:2)純化，以在合并以及在真空中濃縮所需部分然后干燥之后，得到呈淡黃色固體狀的(2R,6R)-2-((芐氧基)甲基)-6-甲基-4-((2-硝基苯基)磺?；?嗎啉10(1.437g,3.54mmol,50％收率，由8經(jīng)3個(gè)步驟)。

化合物11的可選合成-方案6

化合物18和化合物19：向甘氨酸(85.86g,1.144mol)在1,4-二噁烷(660mL)中的經(jīng)攪拌的懸浮液添加1.0M NaOH水溶液(1144mL,1.114mol)，然后加熱至80℃，此后緩慢添加(2R)-芐基2-環(huán)氧丙基醚6(93.90g,0.5718mol)在1,4-二噁烷(94mL)中的溶液，同時(shí)將內(nèi)部溫度在2h內(nèi)維持在77-82℃。將完成的反應(yīng)混合物冷卻至18℃，然后添加二碳酸二叔丁酯(262.1g,1.201mol)，將溫度維持在18℃至21℃。將混合物在室溫下攪拌過夜，此后將完成的混合物用庚烷(2000mL)洗滌兩次。將水層用20wt％檸檬酸(270g)進(jìn)行酸化并且用EtOAc(2000mL和2x 1000mL)萃取三次。將合并的有機(jī)層用20wt％NaCl(每次460g)洗滌兩次，濃縮，溶于EtOAc(560mL)，過濾，濃縮并且用DCM(280mL)稀釋，以在溶液中產(chǎn)生(R)-2-((3-(芐氧基)-2-羥丙基)(叔丁氧基羰基)氨基)乙酸18。

在15℃下，向EDC(120.6g,0.6290mol)和DMAP(2.10g,0.0172mol)懸浮于DCM(380mL)中的經(jīng)攪拌的溶液在30min內(nèi)添加上述18的溶液，同時(shí)將溫度維持低于20℃。將反應(yīng)混合物在18-20℃攪拌3h，此后將其冷卻至10℃，然后在攪拌下用20wt％檸檬酸(820g)淬滅。分離各層并且用MTBE(1.4L)萃取水層。用飽和NaHCO₃(480g)水溶液、30％NaCl(470g)洗滌合并的有機(jī)層，并且進(jìn)行濃縮。因此將獲得的粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠(用4:1至3:1的正庚烷/EtOAc洗脫)純化，以在合并所需部分、在真空中濃縮和干燥后得到呈透明黃色油狀的(R)-叔丁基2-((芐氧基)甲基)-6-氧代嗎啉-4-甲酸酯19(96g,0.298mol,26.1％收率，在兩個(gè)步驟中)。

化合物22和化合物23：向19(134.29g,0.418mol)在冷卻至-75℃的THF(1100mL)中的經(jīng)攪拌的溶液在1h內(nèi)逐滴添加乙醚(334mL,0.501mol)中的1.5M MeLi-LiBr復(fù)合物，同時(shí)將溫度維持在<-65℃。將混合物冷卻至-75℃并且攪拌1.5h，此后將反應(yīng)用20wt％NH₄Cl(270g)水溶液在10min內(nèi)緩慢淬滅，同時(shí)將溫度維持在<-55℃。將混合物在1h內(nèi)升溫至0℃，分配于水(270g)與MTBE(1340mL)之間。用MTBE(1100mL)萃取水層，然后合并有機(jī)層并且用20wt％NaCl(270g)洗滌，以及濃縮至干燥。將殘余物溶于甲苯(1100mL)，過濾，濃縮，與甲苯(1100mL)共沸至干燥，并且然后溶于DCM(1200ml)。將混合物冷卻至-72℃并且添加三乙基硅烷(0.200L,1.25mol)，然后在45min內(nèi)添加三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基酯(151mL,0.836mol)，同時(shí)將溫度維持在<-68℃。將DCM(336mL,5.24mol)中的TFA(129mL,1.67mol)在20min內(nèi)添加至完成的反應(yīng)，同時(shí)將溫度維持在<-65℃。將混合物升溫至-10℃，然后在攪拌下添加飽和NaHCO₃(0.70kg)水溶液。分離各層并且將水層用DCM(每次940mL)萃取兩次。將合并的有機(jī)層用飽和NaHCO₃(0.70kg)水溶液洗滌，濃縮，溶于乙腈(400mL)，用二碳酸二叔丁酯(91.2g,0.418mol)在20-25℃進(jìn)行處理，并且攪拌1h。將完成的反應(yīng)物與甲苯(800ml)共沸至干燥，并且經(jīng)硅膠(用9:1至4:1的正庚烷/EtOAc洗脫)純化，以在合并所需部分、在真空中濃縮和干燥后得到呈白色固體狀的(2R,6R)-叔丁基2-((芐氧基)甲基)-6-甲基嗎啉-4-甲酸酯22(61.90g,0.193mol,46％收率，來自19)。通過硅膠柱色譜法可分離次要的立體異構(gòu)體(2R,6S)-叔丁基2-((芐氧基)甲基)-6-甲基嗎啉-4-甲酸酯23。

化合物11：在室溫下，向22(27mg,0.084mol)在DCM(0.60mL)中的經(jīng)攪拌的溶液添加TFA(0.30mL,0.0039mol)，然后攪拌30min。將完成的反應(yīng)物進(jìn)行濃縮，與甲苯(1.8mL x 2)共沸至干燥兩次，然后溶于DCM(3.0mL)。將有機(jī)溶液用飽和NaHCO₃(0.50g)水溶液洗滌，在真空中濃縮并且干燥以得到呈無色膜狀的(2R,6R)-2-((芐氧基)甲基)-6-甲基嗎啉11(19mg,100％收率)。

化合物11的第二可選合成-方案7

化合物23：將(2R)-芐基2-環(huán)氧丙基醚6(21.0g,0.128mol)在EtOH(100mL)中的溶液在室溫下緩慢添加至7.0M氨水在MeOH(100mL)和28％氫氧化銨水溶液(210mL)中的溶液。將反應(yīng)容器緊密封蓋并且在室溫下攪拌23h。將完成的反應(yīng)物在真空中濃縮，并且將粗產(chǎn)物與甲苯(100mL)共沸至干燥兩次，以得到包含約15％二聚物的呈蠟狀固體的(R)-1-氨基-3-(芐氧基)丙-2-醇23(23g)。粗產(chǎn)物未經(jīng)進(jìn)一步純化用于下一反應(yīng)。

化合物25：向23(12.0g,49.7mmol)在EtOH(15mL)中的溶液添加可商購的(S)-(-)-2-氯丙酸甲酯24(6.69g,54.6mol)。將混合物加熱至70℃并且攪拌14h，此后將完成的反應(yīng)物在真空中進(jìn)行濃縮。將粗產(chǎn)物用EtOAc(50mL)稀釋，用1N HCl(20mL)、鹽水(20mL)洗滌，然后將有機(jī)相經(jīng)無水Na₂SO₄干燥，過濾并且濃縮至干燥。經(jīng)硅膠(SNAP10g,庚烷/EtOAc＝5/1至1/5，然后僅EtOAc，TLC hep/EtOAc＝1/3,rf＝0.45)純化，在將所需的經(jīng)收集的部分在真空中濃縮并且干燥后得到無色的漿狀物(S)-N-((R)-3-(芐氧基)-2-羥丙基)-2-氯丙酰胺25(9.86g,36.2mmol,73％收率)。

化合物26：向60％氫化鈉(5.82g,0.0728mol)在冷卻至0℃的THF(440mL)中的經(jīng)攪拌的懸浮液在15min內(nèi)逐滴添加THF(100mL)中的25(9.89g,36.4mmol)。將反應(yīng)混合物在0℃下再攪拌30min，此后使其升溫至室溫持續(xù)1h。將完成的反應(yīng)物完全冷卻至0℃，此時(shí)緩慢添加異丙醇(100mL)。將粗制溶液用Dowex H⁺中和，然后過濾掉樹脂，用異丙醇洗滌兩次(每次20mL)并且將濾液濃縮至干燥。將粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠(SNAP 100g,hep/EtOAc＝1/1至僅EtOAc,TLC hep/EtOAc＝1/3,rf＝0.4)純化，以在將所需的收集的部分進(jìn)行收集、在真空中濃縮和干燥后得到(2R,6R)-6-((芐氧基)甲基)-2-甲基嗎啉-3-酮26(6.42g,27.3mmol,75％收率)。

化合物11：

向26(6.67g,28.3mmol)在THF(20mL)溶液中的經(jīng)攪拌的溶液在室溫下逐滴添加THF(40.0mL)中的1M氫化鋁鋰。將反應(yīng)在室溫下攪拌2.5h，此后將完成的反應(yīng)冷卻至0℃，然后緩慢地逐滴添加水(13mL)，然后添加1M NaOH水溶液(0.8mL)。將淬滅的反應(yīng)在室溫下攪拌，直到形成自由流動(dòng)的白色沉淀。將沉淀經(jīng)硅藻土545墊過濾并且用EtOAc、DCM和Et₂O(各自為10mL)洗滌。將濾液進(jìn)行濃縮并且經(jīng)硅膠(SNAP 100g,僅有DCM至DCM/MeOH＝97/3,TLCCHCl₃/MeOH＝9/1,rf_反式＝0.5,rf_順式＝0.4)純化。獲得所得的11的順式/反式非對(duì)映體混合物(4.42g,20.0mmol,70.6％收率)中的純11(0.93g,4.2mmol,15％收率)。

化合物12的可選制備-方案8

化合物28：向碳酸鈉(31g,0.37mol)在水(50ml)中的懸浮液添加1-氨基-3,3-二乙氧基丙烷(10.00mL,61.81mmol)在DCM(50mL)中的溶液，然后冷卻至0℃。在0℃下，在劇烈攪拌中添加苯磺酰氯(7.65mL,60.0mmol)，然后升溫至20℃并且持續(xù)攪拌2h，此后添加MTBE(150mL)。分離有機(jī)層，用1.0M HCl(50mL)、飽和NaHCO₃(50g)、水(50g)洗滌，濃縮并且與MTBE(150mL x 2)共沸至干燥兩次，以得到呈淡黃色透明油狀的N-(3,3-二乙氧基丙基)苯磺酰胺28(17.34g,60.34mmol,97％收率)。

化合物30：向2-氟-4-羥基苯甲腈29(15.00g,0.1094mol)在冷卻至0℃的DMF(45.0mL)中的經(jīng)攪拌的溶液添加碳酸鉀(37.8g,0.274mol)，然后在0-5℃攪拌30min。在<5℃下，將芐基溴(13.7mL,0.115mol)添加至反應(yīng)混合物，在5℃下攪拌1h，然后升溫至20℃并且再攪拌2.5h。將完成的反應(yīng)物分配于水(180ml)與MTBE(220mL)之間，分離各層并且將有機(jī)層用水(90mL)洗滌，濃縮并且與EtOAc(每次150mL)共沸至干燥兩次，以得到呈白色固體狀的4-(芐氧基)-2-氟苯甲腈30(24.64g,0.1084mol,99％收率)。

化合物32：在室溫下向28(13.28g,46.21mmol)在NMP(30.0mL)中的經(jīng)攪拌的溶液添加30(10.00g,44.01mmol)，然后添加Cs₂CO₃(21.5g,66.0mmol)。將所得的混合物在110℃下加熱16h，然后冷卻至室溫。將混合物分配于水(120g)與MTBE(120mL)之間，并且用MTBE(120mL)萃取水層。將合并的有機(jī)層用水(60g)洗滌，濃縮并且與EtOAc(每次100mL)共沸至干燥兩次，以產(chǎn)生呈褐色油狀的N-(5-(芐氧基)-2-氰基苯基)-N-(3,3-二乙氧基丙基)苯磺酰胺31。將粗產(chǎn)物在氫氣氣氛(氣球壓力)下用EtOAc(100mL)中的10wt％Pd-C(1.40g)進(jìn)行氫解3h，此后將經(jīng)吹掃的反應(yīng)混合物經(jīng)過硅藻土墊過濾，用EtOAc(100mL)沖洗并且濃縮。因此將獲得的粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠(用2:3的正庚烷/MTBE洗脫)純化，以得到呈黃色粘性油狀的N-(2-氰基-5-羥基苯基)-N-(3,3-二乙氧基丙基)苯-磺酰胺32(16.38g,40.50mmol,92％收率)。

化合物33：向32(5.45g,13.5mmol)在冷卻至0℃的THF(40mL)中的經(jīng)攪拌的溶液添加水(5.4mL)，然后添加TFA(11mL,0.14mol)。使所得的混合物升溫至20℃并且攪拌過夜。將完成的反應(yīng)物與甲苯(每次54mL)共沸至干燥兩次，以得到呈粘性油狀的N-(2-氰基-5-羥基苯基)-N-(3-氧代丙基)苯磺酰胺33(4.55g,13.8mmol,100％收率)。

化合物34：向33(1.64g,4.96mmol)在70℃下加熱的甲苯(29.5mL)和NMP(1.2mL)的混合物中的經(jīng)攪拌的懸浮液添加D-(+)-10-樟腦磺酸(1.15g,4.96mmol)，然后在100℃下加熱14h。將完成的反應(yīng)物冷卻至室溫，用EtOAc(60mL)稀釋，用水(6.3mL)洗滌，并且進(jìn)行濃縮以產(chǎn)生深褐色油狀物。將粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠(用1:1的正庚烷/EtOAc洗脫)純化，以得到呈黃色固體狀的5-羥基-1-(苯基磺?；?-1,2-二氫喹啉-8-甲腈34(685mg,2.19mmol,44％收率)。

化合物35和化合物12：向34(0.393g,1.26mmol)在DCM(3.0ml)中的經(jīng)攪拌的懸浮液添加2,6-二甲基吡啶(0.437ml,3.78mmol)，然后冷卻至1-2℃。添加三氟甲烷磺酸酐(0.275ml,1.64mmol)在DCM(1.0ml)中的溶液，同時(shí)將溫度維持在低于4℃。將反應(yīng)混合物在2-3℃攪拌1h，傾入預(yù)先冷卻(5℃)的MTBE(20ml)和1M HCl(6.3ml)的混合物中。將所得的、分離的有機(jī)層用9wt％NaHCO₃(3g)、20wt％NaCl(5g)洗滌，經(jīng)Na₂SO₄(2g)干燥1h，過濾并且進(jìn)行濃縮以產(chǎn)生呈黃色油狀的粗制8-氰基-1-(苯基磺酰基)-1,2-二氫喹啉-5-基三氟甲烷-磺酸酯35。將35溶于NMP(2.5ml)和DIPEA(1.75ml,10.1mmol)，然后將11(0.446g,2.02mmol)溶于其中，并且將所得的混合物在125℃下加熱過夜。將完成的反應(yīng)物冷卻至室溫并且分配于EtOAc(30ml)與水(10ml)之間。將有機(jī)層用水(10ml)洗滌，濃縮并且經(jīng)硅膠塞柱(用1:1的正庚烷/EtOAc洗脫)純化，以得到呈褐色固體狀的5-((2R,6R)-2-((芐氧基)甲基)-6-甲基嗎啉代)-喹啉-8-甲腈12(80.2mg,0.215mmol,17％收率)。

化合物36的合成-方案9：向13(10.97g,38.72mmol)在DCM(44ml)中的經(jīng)攪拌的懸浮液添加2,6-二甲基吡啶(5.38ml,46.5mmol)，然后冷卻至0℃。添加三氟甲烷磺酸酐(Tf₂O；6.84mL,40.7mmol)在DCM(22ml)中的溶液，同時(shí)將溫度維持在<5℃并且攪拌1h。將完成的反應(yīng)用飽和碳酸氫鈉(65g)淬滅，并且將混合物升溫至15℃。分離各層并且用DCM(55L)萃取水層。將合并的有機(jī)層用20wt％NaCl(33g)洗滌并且經(jīng)硅酸鎂載體(Florisil)(11g)攪拌1.5h，此后將混合物進(jìn)行過濾，用MTBE(55mL)洗脫并且濃縮。將黃褐色固體懸浮于DCM(11ml)中，用正庚烷(110ml)稀釋，過濾，用10:1的正庚烷/DCM(121ml)沖洗，并且在真空下干燥以得到呈淡黃褐色固體狀的((2R,6R)-4-(8-氰基喹啉-5-基)-6-甲基嗎啉-2-基)甲基三氟甲烷磺酸酯36(15.20g,36.6mmol,94％收率)。

使用方案9和方案17合成ER-887927：

方案17

向36(1.002g,2.412mmol)在乙腈(6.0mL)中的經(jīng)攪拌的懸浮液添加碳酸鉀(1.33g,9.65mmol)，然后添加可商購的1,4’-聯(lián)哌啶72(609mg,3.62mmol)。將反應(yīng)混合物在回流下加熱5h，此后將完成的反應(yīng)物冷卻至室溫，用水(12mL)稀釋并且進(jìn)行部分濃縮。添加正庚烷(10mL)和MTBE(10mL)，并且將混合物進(jìn)行部分濃縮，此時(shí)通過過濾收集由此形成的褐色固體，用以下沖洗：(1)水(15mL)和(2)正庚烷(15mL)，并且在真空下干燥過夜。將干燥的固體溶于正庚烷(10mL,0.2mol)，用乙腈(5.0mL,0.096mol)稀釋，然后用硅酸鎂載體(0.50g)在室溫下處理10min。將混合物進(jìn)行過濾，用乙腈(10mL)洗脫并且濃縮以產(chǎn)生黃褐色固體，所述固體用1:2的MTBE/正庚烷(15ml)磨碎，過濾，用1:3的MTBE/正庚烷(10ml)沖洗，并且在N₂/真空下干燥以產(chǎn)生呈淡黃褐色粉末狀的ER-887927(1.001g,2.31mmol,95％收率)。

通過ER-887927所述的相似方法制備ER-893881(15.2mg,0.037mmol,51.6％收率)，其中以36(30mg,0.072mmol)和(S)-1,3’-二吡咯烷二鹽酸鹽(20.5mg,0.144mmol)起始，使用TEA(0.020mL,0.141mmol)代替K₂CO₃。

通過ER-893881所述的相似方法制備ER-894483(30mg,0.079mmol,32.8％收率)，其中以36(100mg,0.241mmol)和(R)-3-甲基哌嗪-2-酮(54.9mg,0.481mmol)起始。

通過ER-893881所述的相似方法制備ER-894484(30mg,0.079mmol,32.8％收率)，其中以36(100mg,0.241mmol)和(S)-3-甲基哌嗪-2-酮(54.9mg,0.481mmol)起始。

通過ER-893881所述的相似方法制備ER-894504(30mg,0.076mmol,31.5％收率)，其中以36(100mg,0.241mmol)和(2S,5R)-2,5-二甲基哌嗪(54.9mg,0.481mmol)起始。

通過ER-893881所述的相似方法制備ER-894505(30mg,0.076mmol,31.5％收率)，其中以36(100mg,0.241mmol)和2,3-二甲基哌嗪(54.9mg，0.481mmol)起始。

通過ER-893881所述的相似方法制備ER-894655(140mg,0.309mmol,64.2％收率)，其中以36(200mg,0.482mmol)和2,2-二甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯(206mg,0.961mmol)起始。使用4N HCl二噁烷水解Boc保護(hù)的基團(tuán)，然后通過與甲苯共沸至干燥并且在真空下干燥分離所需產(chǎn)物。

通過ER-893881所述的相似方法制備ER-894151(1.066mg,3.16mmol,65.4％收率)，其中以36(2.0g,4.81mmol)和氮雜環(huán)丁烷-3-基氨基甲酸叔丁酯(0.995g,5.78mmol)起始。使用DCM(3mL)中的TFA(3mL)對(duì)Boc保護(hù)的中間體進(jìn)行去保護(hù)。使反應(yīng)攪拌30分鐘，此后將反應(yīng)物與甲苯(每次5mL)共沸三次濃縮至干燥。將殘余物用DCM(10mL)稀釋，用飽和NaHCO₃(5mL)、水(5mL)、鹽水(5mL)洗滌兩次，經(jīng)MgSO₄干燥，過濾，在真空中濃縮并且干燥以得到所需產(chǎn)物。

ER-890250：在-78℃下，向ER-887927(50mg,0.115mmol)在THF(1mL)中的冷卻的經(jīng)攪拌的溶液添加乙醚(0.15mL,0.24mmol)中的1.6M甲基鋰-溴化鋰復(fù)合物，由此使得淡黃色溶液變成亮紅色/橙色。將反應(yīng)混合物在-78℃下攪拌1.5h，此后用氫氧化銨水溶液(2mL)將其淬滅，然后緩慢升溫至室溫。將反應(yīng)物用DCM(5mL)萃取三次并且干燥合并的有機(jī)層，過濾并且濃縮至干燥。

將粗制中間體溶于丙酮(1mL)，然后將硝酸鈰銨(300mg,0.547mmol)水溶液(1.5mL)溶于其中。將反應(yīng)混合物攪拌30min，此后將反應(yīng)混合物濃縮成粗制固體。將固體懸浮于5mL丙酮中，攪拌5min，過濾并且將固體濾墊用丙酮(每次5mL)洗脫三次。將合并的濾液進(jìn)行濃縮，然后通過反相HPLC(X-Bridge C18 19x 100mm柱，使用包含0.1％甲酸的乙腈/水梯度)純化，將所需的部分進(jìn)行合并，濃縮，溶于MeOH(2mL)，經(jīng)過SiCO₃柱，用MeOH洗脫兩次，在真空中濃縮并且干燥以得到ER-890250(4.4mg,0.010mmol,8.5％收率)。

來自方案10的ER-884884的合成：

化合物37：向來自方案6的22(1.003g,3.121mmol)在EtOH(5mL)中的經(jīng)攪拌的溶液添加5％鈀碳(100mg)，然后用氫氣對(duì)燒瓶進(jìn)行幾次充氣。在維持氫氣氣氛(氣球壓力)下將反應(yīng)加熱至40℃并且攪拌過夜，此后將反應(yīng)物用氮?dú)獯祾邘状危瑫r(shí)在吹掃間隔用真空清掃(housevacuum)抽空系統(tǒng)。將完成的反應(yīng)物經(jīng)硅藻土545過濾，將濾墊用EtOH(每次5mL)洗滌兩次，然后在真空中濃縮并且干燥合并濾液的濃縮物。將粗產(chǎn)物(3R,5S)-叔丁基3-(羥甲基)-5-甲基哌啶-1-甲酸酯(0.720g,3.114mmol,99.8％收率)未經(jīng)進(jìn)一步純化用于下一步。

在室溫下向(3R,5S)-叔丁基3-(羥甲基)-5-甲基哌啶-1-甲酸酯(0.783g,3.385mmol)在DCM(5mL)中的經(jīng)攪拌的溶液添加對(duì)甲苯磺酰氯(0.968g,5.078mmol)，然后添加DMAP(40mg,0.33mmol)和DIPEA(1.18mL,6.77mmol)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌3h，此后添加水(5mL)，然后再攪拌15min。將所得的有機(jī)層用0.1N HCl(5mL)、鹽水(3mL)洗滌，經(jīng)MgSO₄干燥，過濾并濃縮至干燥。將粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠(Biotage，用3:1庚烷:EtOAc洗脫)純化，以得到(3S,5R)-叔丁基3-甲基-5-((甲苯磺酰氧基)甲基)哌啶-1-甲酸酯(0.8602g,2.232mmol,65.9％收率)。

在室溫下向(3S,5R)-叔丁基3-甲基-5-((甲苯磺酰氧基)甲基)哌啶-1-甲酸酯(0.860g，2.232mmol)在DMF(7mL)中的經(jīng)攪拌的溶液添加疊氮化鈉(0.218g,3.347mmol)，此后將反應(yīng)升溫至80℃并且再攪拌3h。將完成的反應(yīng)冷卻至室溫，用EtOAc(25mL)稀釋并且用水(每次5mL)洗滌三次。將所得的有機(jī)層經(jīng)無水Na₂SO₄干燥，過濾，濃縮，此后將粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠(Biotage，用庚烷中的0％至15％EtOAc梯度洗脫)純化，以在真空中濃縮所需合并的部分和干燥后，得到呈無色結(jié)晶固體的(2R,6R)-叔丁基2-(疊氮基甲基)-6-甲基嗎啉-4-甲酸酯37(0.545g,2.126mmol,95.3％收率)。

ER-884884：向37(0.545g,2.126mmol)在MeOH(5mL)中的經(jīng)攪拌的溶液添加5％鈀活性碳(250mg)，然后用氫氣對(duì)燒瓶進(jìn)行幾次充氣。在氫氣氣氛(氣球壓力)下將反應(yīng)維持在室溫并且攪拌12h，此后將反應(yīng)物用氮?dú)獯祾邘状危瑫r(shí)在吹掃間隔用真空清掃抽空系統(tǒng)。將完成的反應(yīng)物經(jīng)硅藻土545過濾，將濾墊用EtOH(每次2mL)洗滌兩次，然后在真空中濃縮并且干燥合并濾液的濃縮物。將粗產(chǎn)物(2S,6R)-叔丁基2-(氨基甲基)-6-甲基嗎啉-4-甲酸酯(0.489g,2.10mmol,99.9％收率)未經(jīng)進(jìn)一步純化用于下一步。

在室溫下向(2S,6R)-叔丁基2-(氨基甲基)-6-甲基嗎啉-4-甲酸酯(50.2mg,0.218mmol)在DCM(0.5mL)中的經(jīng)攪拌的溶液添加TFA(0.25mL,3.4mmol)。將反應(yīng)混合物攪拌1h，此后將其進(jìn)行濃縮，與甲苯(每次2mL)共沸至干燥兩次，并在真空中干燥。將粗制去保護(hù)的嗎啉在攪拌下溶于DMA(1mL)，然后將TEA(2mL)和化合物3(50mg,0.214mmol)溶于其中。將反應(yīng)混合物升溫至140℃并且攪拌1h，此后將完成的反應(yīng)物冷卻至室溫并且直接注入制備型反相HPLC柱(在過濾后)，以在真空下濃縮所需合并的部分并且干燥后得到ER-884884(12.1mg,0.043mmol,19.7％收率)。

方案10中的經(jīng)取代的化合物15或ER-879713：向ER-884884(30.2mg,0.107mmol)在DCM(0.5mL)中的經(jīng)攪拌的溶液添加TEA(30μL,0.20mmol)，然后添加2,2-二甲基丙酰氯(20μL,0.162mmol)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌3h，此后將完成的反應(yīng)物進(jìn)行濃縮，過濾并且經(jīng)由制備型反相HPLC(Water’s X-Bridge C18 19x 100mm柱；用包含0.05％TFA的乙腈水溶液的梯度洗脫)直接純化，以在真空下濃縮所需合并的部分并且干燥之后得到ER-879713(20.5mg,0.056mmol,52.3％收率)。

使用與ER-879713相似的方法獲得ER-886432(10.2mg,0.023mmol,52.7％收率)，其中以ER-884884(50mg,0.177mmol)和1-苯基環(huán)丁烷碳酰氯(8.5mg,0.044mmol)起始。

使用與ER-879713相似的方法獲得ER-886563(3.6mg,0.023mmol,20.3％收率)，其中以ER-884884(12.4mg,0.044mmol)和苯乙酰氯(0.007mL,0.053mmol)起始。

ER-888137：向ER-884884(30.2mg,0.107mmol)在NMP(0.5mL)中的經(jīng)攪拌的溶液添加2-氯-5-氟嘧啶(140mg,1.056mmol)。將反應(yīng)混合物在150℃下微波處理5min，此后將冷卻的反應(yīng)物經(jīng)C-18反相HPLC制備型柱純化，其中用10％-40％的乙腈水溶液梯度洗脫。將所需部分在真空下濃縮并且干燥以得到ER-888137(6.5mg,0.017mmol,9.7％收率)。

以與ER-888137相似的方式制備ER-888701(12.2mg,0.031mmol,17.7％收率)，其中以ER-884884(50mg,0.177mmol)和2-氯-5-乙基嘧啶(150mg,1.052mmol)起始。

以與ER-888137相似的方式制備ER-888896(3.0mg,0.008mmol,23.1％收率)，其中以ER-884884(10.1mg,0.036mmol)和2-氯吡嗪(30mg,0.261mmol)起始。

方案18：取代的化合物15的可選路線：

使用方案18的ER-879713或化合物76：

化合物73：向37(0.545g,2.126mmol)在MeOH(5mL)中的經(jīng)攪拌的溶液添加5％鈀活性碳(250mg)，然后用氫氣對(duì)燒瓶進(jìn)行幾次充氣。在氫氣氣氛(氣球壓力)下將反應(yīng)維持在室溫并且攪拌12h，此后將反應(yīng)物用氮?dú)獯祾邘状?，同時(shí)在吹掃間隔用真空清掃抽空系統(tǒng)。將完成的反應(yīng)物經(jīng)硅藻土545過濾，將濾墊用EtOH(每次2mL)洗滌兩次，然后在真空中濃縮并且干燥合并濾液的濃縮物。將粗產(chǎn)物(2S,6R)-叔丁基2-(氨基甲基)-6-甲基嗎啉-4-甲酸酯73(0.489g,2.10mmol,99.9％收率)未經(jīng)進(jìn)一步純化用于下一步。

化合物74：向73(50.2mg,0.218mmol)在DCM(0.5mL)中的經(jīng)攪拌的溶液添加TEA(36.5uL,0.268mmol)，然后添加2,2-二甲基丙酰氯(29.5uL,0.235mmol)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌1h，此后將完成的反應(yīng)物傾入水，用DCM(每次3mL)萃取三次并且將合并的有機(jī)層經(jīng)MgSO₄干燥，過濾，濃縮并且在真空下干燥以得到粗制的(2R,6S)-叔丁基2-甲基-6-(新戊酰氨基甲基)嗎啉-4-甲酸酯74(R＝tBu)。

ER-879713：向粗制的74在DCM(5mL)中的經(jīng)攪拌的溶液添加TFA(0.25mL,3.4mmol)，然后在室溫下攪拌1h。將完成的反應(yīng)物進(jìn)行濃縮并且與甲苯共沸兩次，然后在真空中干燥30min，此后將粗制的高級(jí)中間體75溶于DMA(1mL)，然后將TEA和化合物3(50mg,0.214mmol)溶于其中。將反應(yīng)混合物升溫至140℃并且攪拌1h，此后將完成的反應(yīng)物冷卻至室溫并且直接注入制備型反相HPLC柱(在過濾后)，以在真空下濃縮所需合并的部分并且干燥后得到76的實(shí)例或ER-879713(9.3mg,0.025mmol,11.6％收率,R＝tBu)。

使用與ER-879713相似的方法獲得ER-879689(4.3mg,0.013mmol,6.0％收率，R＝Me)，其中以73(50.2mg,0.218mmol，R＝Me)和3(50mg,0.215mmol)起始。

使用與ER-879713相似的方法獲得ER-886360(14.3mg,0.035mmol,15.8％％收率，R＝CH(Me)Ph)，其中以73(50.2mg,0.218mmol,R＝CH(Me)Ph)和3(50mg,0.215mmol)起始。

取代的化合物15的其它實(shí)例：

ER-888603：向37(58.1mg,0.227mmol)和環(huán)己基乙炔(0.026mL,0.200mmol)在叔丁醇(0.08mL)和水(0.07mL)中的經(jīng)攪拌的溶液添加碳酸氫鈉(2.5mg,0.030mmol)，然后添加硫酸銅(II)五水合物(2.5mg,0.010mmol)和抗壞血酸鈉(7.8mg,0.039mmol)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌14h，此后添加DCM(5mL)以及飽和碳酸氫鈉(5mL)，并且再攪拌10min。分離各層并且將水層用DCM(每次3mL)萃取兩次。將合并的有機(jī)層經(jīng)無水MgSO₄干燥，過濾并且濃縮至干燥。將粗制的Boc保護(hù)的中間體在攪拌下溶于DCM(3mL)，然后將TFA(0.8mL)溶于其中。將反應(yīng)在室溫下攪拌1h，此后將完成的反應(yīng)物進(jìn)行濃縮并且使用甲苯(2次，每次5mL)共沸至干燥。將粗產(chǎn)物經(jīng)由HPLC(Water’s X-Bridge C18 19x 100mm柱；用包含0.05％TFA的乙腈水溶液的梯度洗脫)純化，以得到(2R,6R)-2-((4-環(huán)己基-1H-1,2,3-三唑-1-基)甲基)-6-甲基嗎啉(8.9mg,0.034mmol,16.8％收率)。

向(2R,6R)-2-((4-環(huán)己基-1H-1,2,3-三唑-1-基)甲基)-6-甲基嗎啉(8.9mg,0.034mmol)在DMA(0.3mL)和TEA(0.005mL,0.036mmol)中的經(jīng)攪拌的溶液添加3(7.85mg,0.034mmol)。將混合物在150℃下微波處理30min，此后將冷卻的反應(yīng)物直接注入制備型C-18反相HPLC柱(Water's X-Bridge C18 19x 100mm柱；用包含0.05％TFA的10％-40％乙腈水溶液的梯度洗脫)。將所需收集的部分在真空中濃縮并且干燥，以得到ER-888603(3.3mg,0.008mmol,23.3％收率或3.9％總收率)。

以與ER-888603相似的方式制備ER-888604(5.2mg,0.013mmol,6.5％總收率)，其中以37(58.1mg,0.227mmol)、苯乙炔(0.022mL,0.200mmol)和3(7.85mg,0.034mmol)起始。

ER-889556：向ER-887268(140.3mg,0.384mmol)在水(1.5mL)中的經(jīng)攪拌的懸浮液添加甲醛(1mL)和甲酸(0.55mL)，此后將反應(yīng)混合物在110℃下微波處理1.5h。將完成的反應(yīng)物進(jìn)行冷卻并且直接注入制備型C-18反相HPLC柱，其中用包含0.1％TFA的10％-40％乙腈水溶液的梯度洗脫。將所需收集的部分進(jìn)行濃縮，溶于MeOH(5ml)，經(jīng)過SiCO₃塞，用MeOH(10mL)洗脫，在真空中濃縮并且干燥以得到ER-889556(75mg,0.197mmol,51.5％收率)。

以與ER-889556相似的方式制備ER-890114(75.9mg,0.170mmol,40.5％收率)，其中以ER-890112(182mg,0.420mmol)起始。

以與ER-889556相似的方式制備ER-890108(72.1mg,0.171mmol,40.7％收率)，其中以ER-890119(170.6mg,0.420mmol)起始。

以與ER-889556相似的方式制備ER-890345(43.5mg,0.115mmol,38％收率)，其中以ER-890344(110.2mg,0.302mmol)起始。

以與ER-889556相似的方式制備ER-890346(52.6mg,0.139mmol,73.3％收率)，其中以ER-887269(69mg,0.189mmol)起始。

以與ER-889556相似的方式制備ER-890831(85.2mg,0.225mmol,74.5％收率)，其中以ER-887270(110.2mg,0.302mmol)起始。

以與ER-889556相似的方式制備ER-890964(506.2mg,1.286mmol,71.2％收率)，其中以ER-890963(685.2mg,1.806mmol)起始。

以與ER-889556相似的方式制備ER-890186(10.2mg,0.023mmol,20.7％收率)，其中以ER-890107(48mg,0.111mmol)起始。

以與ER-889556相似的方式制備ER-890223(35mg,0.078mmol,42.9％收率)，其中以作為TFA鹽的ER-890106(100mg,0.182mmol)起始。

以與ER-889556相似的方式制備ER-894656(31.7mg,0.068mmol,61.5％收率)，其中以作為二鹽酸鹽的ER-894655(50mg,0.111mmol)起始。

ER-889728：向ER-888070(12.5mg,0.034mmol)在DCM(0.5mL)中的經(jīng)攪拌的溶液添加TEA(0.01mL,0.072mmol)，然后添加煙酰氯(10mg,0.071mmol)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌1h，此后用DCM(5mL)稀釋反應(yīng)物，用水(2mL)、鹽水(2mL)洗滌，經(jīng)MgSO₄干燥，過濾并且濃縮至干燥。將粗產(chǎn)物經(jīng)制備型C-18反相HPLC柱純化，其中用包含0.1％TFA的10％-25％乙腈水溶液的梯度洗脫。將所需收集的部分進(jìn)行濃縮，溶于MeOH(5ml)，經(jīng)過SiCO₃塞，用MeOH(10mL)洗脫，在真空中濃縮并且干燥以得到ER-889728(7.2mg,0.015mmol,45％收率)。

以與ER-889728相似的方式制備ER-889729(8.2mg,0.017mmol,51.3％收率)，其中以ER-888070(12.5mg,0.034mmol)和異煙酰氯(10mg,0.071mmol)起始。

以與ER-889728相似的方式制備ER-889734(8.6mg,0.018mmol,52.9％收率)，其中以ER-888070(12.5mg,0.034mmol)和皮考啉酰氯(10mg,0.071mmol)起始。

以與ER-889728相似的方式制備ER-889744(12mg,0.028mmol,80.8％收率)，其中以ER-888070(12.5mg,0.034mmol)和己酰氯(9mg,0.067mmol)起始。

以與ER-889728相似的方式制備ER-889745(8mg,0.018mmol,54％收率)，其中以ER-888070(12.5mg,0.034mmol)和異丁酰氯(7mg,0.066mmol)起始。

以與ER-889728相似的方式制備ER-889746(7.6mg,0.017mmol,50％收率)，其中以ER-888070(12.5mg,0.034mmol)和2,2-二甲基丙酰氯(8mg,0.066mmol)起始。

以與ER-889728相似的方式制備ER-890113(25.6mg,0.054mmol,66.7％收率)，其中以ER-890112(35.2mg,0.081mmol)和乙酸酐(0.093mL,0.984mmol)起始。

以與ER-889728相似的方式制備ER-890120(20.3mg,0.045mmol,54.2％收率)，其中以ER-890119(33.7mg,0.083mmol)和乙酸酐(0.012mL,0.127mmol)起始。

以與ER-889728相似的方式制備ER-890122(35.2mg,0.069mmol,43.1％收率)，其中以ER-890119(65.2mg,0.160mmol)和苯甲酰氯(0.037mL,0.318mmol)起始。

以與ER-889728相似的方式制備ER-890142(45.2mg,0.084mmol,53.1％收率)，其中以ER-890112(68.5mg,0.158mmol)和苯甲酰氯(0.037mL,0.318mmol)起始。

以與ER-889728相似的方式制備ER-890187(9.4mg,0.020mmol,18.0％收率)，其中以ER-890107(48mg,0.111mmol)和乙酸酐(0.125mL,1.3mmol)起始。

以與ER-889728相似的方式制備ER-890188(8.9mg,0.018mmol,16.0％收率)，其中以ER-890107(48mg,0.111mmol)和異丁酰氯(0.051mg,0.487mmol)起始。

以與ER-889728相似的方式制備ER-890189(10mg,0.019mmol,16.7％收率)，其中以ER-890107(48mg,0.111mmol)和苯甲酰氯(0.056mg,0.482mmol)起始。

以與ER-889728相似的方式制備ER-890190(6.5mg,0.014mmol,36.8％收率)，其中以ER-890119(15.6mg,0.038mmol)和異丁酰氯(0.006mL,0.058mmol)起始。

以與ER-889728相似的方式制備ER-890219(32.0mg,0.067mmol,91.8％收率)，其中以作為TFA鹽的ER-890106(40.2mg,0.073mmol)、TEA(0.20mL,1.43mmol)和乙酸酐(0.10mL,1.06mmol)起始。

以與ER-890219相似的方式制備ER-890221(28.2mg,0.056mmol,76.7％收率)，其中以作為TFA鹽的ER-890106(40.2mg,0.073mmol)和異丁酰氯(0.080mL,0.764mmol)起始。

以與ER-890219相似的方式制備ER-890222(30.1mg,0.056mmol,76.7％收率)，其中以作為TFA鹽的ER-890106(40.5mg,0.074mmol)和苯甲酰氯(0.20mL,1.723mmol)起始。

以與ER-889728相似的方式制備ER-892254(24.2mg,0.0.52mmol,67.5％收率)，其中以ER-892253(32.2mg,0.077mmol)和乙酸酐(0.015mL,0.151mmol)起始。將乙腈(0.5mL)添加至反應(yīng)混合物。

以與ER-889728相似的方式制備ER-892256(25.2mg,0.052mmol,41.9％收率)，其中以ER-890119(50.2mg,0.124mmol)和甲烷磺酰氯(0.011mL,0.142mmol)起始。

以與ER-889728相似的方式制備ER-893926(124.2mg,0.255mmol,51.7％收率)，其中以ER-888070(180.2mg,0.493mmol)和1,3-二甲基-1H-吡唑-4-碳酰氯(93.8mg,0.592mmol)起始。

以與ER-889728相似的方式制備ER-893927(45.2mg,0.0.83mmol,57.8％收率)，其中以ER-892253(60.5mg,0.144mmol)和1,3-二甲基-1H-吡唑-4-碳酰氯(27.4mg,0.173mmol)起始。

以與ER-889728相似的方式制備ER-893948(65.3mg,0.147mmol,29.9％收率)，其中以ER-888070(180.2mg,0.493mmol)和甲烷磺酰氯(68mL,0.593mmol)起始。

以與ER-889728相似的方式制備ER-894149(67.2mg,0.133mmol,80.6％收率)，其中以ER-888070(60.2mg,0.165mmol)和苯磺酰氯(0.023mL,0.180mmol)起始。

以與ER-889728相似的方式制備ER-894150(58.2mg,0.111mmol,69.9％收率)，其中以ER-888070(58.2mg,0.159mmol)和4-氟苯磺酰氯(0.025mL,0.188mmol)起始。

以與ER-889728相似的方式制備ER-894152(36.2mg,0.095mmol,63.6％收率)，其中以ER-894151(50.6mg,0.150mmol)和乙酸酐(0.014mL,0.135mmol)起始。

以與ER-889728相似的方式制備ER-894153(5.4mg,0.012mmol,7.4％收率)，其中以ER-894151(52.2mg,0.155mmol)和4-氟苯甲酰氯(25mg,0.158mmol)起始。

以與ER-889728相似的方式制備ER-894154(38.5mg,0.093mmol,62.4％收率)，其中以ER-894151(50.4mg,0.149mmol)和甲烷磺酰氯(0.012mL,0.146mmol)起始。

以與ER-889728相似的方式制備ER-894155(42.1mg,0.085mmol,57.1％收率)，其中以ER-894151(50.3mg,0.149mmol)和4-氟苯磺酰氯(29mg,0.149mmol)起始。

以與ER-889728相似的方式制備ER-894159(20.4mg,0.041mmol,27.4％收率)，其中以ER-894151(50.5mg,0.150mmol)和1,3-二甲基-1H-吡唑-4-磺酰氯(29mg,0.149mmol)起始。

以與ER-889728相似的方式制備ER-894160(47.2mg,0.0.90mmol,65.8％收率)，其中以ER-888070(50.1mg,0.137mmol)和1,3-二甲基-1H-吡唑-4-磺酰氯(27mg,0.139mmol)起始。

以與ER-889728相似的方式制備ER-894206(11.3mg,0.029mmol,19％收率)，其中以ER-894151(50.6mg,0.150mmol)和異丁酰氯(16mg,0.150mmol)起始。

以與ER-889728相似的方式制備ER-894594(215mg,0.487mmol,46.4％收率)，其中以ER-894151(354mg,1.049mmol)和苯甲酸酐(407mL,1.81mmol)起始。使用乙腈(2mL)代替DCM。

ER-890252的制備：向來自方案9的36(2.0g,4.8mmol)在乙腈(15mL)中的經(jīng)攪拌的溶液添加(R)-叔丁基吡咯烷-2-氨基甲酸酯(1.10g,5.9mmol)，然后添加TEA(1.6mL,11.5mmol)。將反應(yīng)在70℃下攪拌3h，此后將完成的反應(yīng)物濃縮成粗制漿狀物，用DCM(20mL)稀釋，用水(5mL)洗滌，干燥，過濾并且濃縮至干燥。將粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠(BiotageSP4,40+M，以在1:1的EtOAc:DCM中5％MeOH至1:1的EtOAc:DCM中10％MeOH的梯度經(jīng)過10個(gè)柱體積循環(huán)洗脫)純化。將包含產(chǎn)物的部分進(jìn)行合并，濃縮并且在真空下干燥以得到((R)-1-(((2S,6R)-4-(8-氰基喹啉-5-基)-6-甲基嗎啉-2-基)甲基)吡咯烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯(1.35g,3.0mmol,62％收率)。

向((R)-1-(((2S,6R)-4-(8-氰基喹啉-5-基)-6-甲基嗎啉-2-基)甲基)吡咯烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯(1.35g,3.0mmol)在DCM(10mL)中的經(jīng)攪拌的溶液添加TFA(8.1mL)。將反應(yīng)物在室溫下攪拌，此后將其進(jìn)行濃縮并且與甲苯(每次10mL)共沸三次至干燥，然后在真空下干燥以得到作為TFA鹽的粗制5-((2S,6R)-2-(((R)-3-氨基吡咯烷-1-基)甲基)-6-甲基嗎啉代)喹啉-8-甲腈(1.39g,3.0mmol,100％收率)。

以與ER-890222相似的方式制備ER-890252(120.3mg,0.306mmol,71.2％收率)，其中以作為TFA鹽的5-((2S,6R)-2-(((R)-3-氨基吡咯烷-1-基)甲基)-6-甲基嗎啉代)喹啉-8-甲腈(200mg,0.430mmol)和乙酸酐(0.80mL,8.46mmol)起始。

以與ER-890122相似的方式制備ER-890253(146.5mg,0.348mmol,80.8％收率)，其中以作為TFA鹽的5-((2S,6R)-2-(((R)-3-氨基吡咯烷-1-基)甲基)-6-甲基嗎啉代)喹啉-8-甲腈(200mg,0.430mmol)和異丁酰氯(0.50mL,4.77mmol)起始。

以與ER-890122相似的方式制備ER-894544(103.6mg,0.227mmol,52.9％收率)，其中以作為TFA鹽的5-((2S,6R)-2-(((R)-3-氨基吡咯烷-1-基)甲基)-6-甲基嗎啉代)喹啉-8-甲腈(200mg,0.430mmol)和苯甲酰氯(0.50mL,4.31mmol)起始。

以與ER-890222相似的方式制備ER-894546(96.7mg,0.214mmol,49.8％收率)，其中以作為TFA鹽的5-((2S,6R)-2-(((R)-3-氨基吡咯烷-1-基)甲基)-6-甲基嗎啉代)喹啉-8-甲腈(200mg,0.430mmol)和乙酸酐(0.80mL,8.46mmol)起始。以與5-((2S,6R)-2-(((R)-3-氨基吡咯烷-1-基)甲基)-6-甲基嗎啉代)喹啉-8-甲腈相似的方式制備5-((2S,6R)-2-(((S)-3-氨基吡咯烷-1-基)甲基)-6-甲基嗎啉代)喹啉-8-甲腈，其中在制備ER-890252的以上所述第一步中使用(S)-叔丁基吡咯烷-2-基氨基甲酸酯作為原料。

以與ER-894546相似的方式制備ER-894547(120.8mg,0.287mmol,66.7％收率)，其中以作為TFA鹽的5-((2S,6R)-2-(((S)-3-氨基吡咯烷-1-基)甲基)-6-甲基嗎啉代)喹啉-8-甲腈(200mg,0.430mmol)和異丁酸酐(0.70mL,4.22mmol)起始。

以與ER-894546相似的方式制備ER-894548(110.4mg,0.242mmol,56.4％收率)，其中以作為TFA鹽的5-((2S,6R)-2-(((S)-3-氨基吡咯烷-1-基)甲基)-6-甲基嗎啉代)喹啉-8-甲腈(200mg,0.430mmol)和苯甲酸酐(0.50g,2.21mmol)起始。

以與ER-889556相似的方式制備ER-894545(32mg,0.084mmol,19.6％收率)，其中以作為TFA鹽的5-((2S,6R)-2-(((R)-3-氨基吡咯烷-1-基)甲基)-6-甲基嗎啉代)喹啉-8-甲腈(200mg,0.430mmol)起始。

以與ER-889556相似的方式制備ER-894549(103.8mg,0.274mmol,63.6％收率)，其中以作為TFA鹽的5-((2S,6R)-2-(((S)-3-氨基吡咯烷-1-基)甲基)-6-甲基嗎啉代)喹啉-8-甲腈(200mg,0.430mmol)起始。

使用修改的方案7和方案4制備886355：向方案7中的(R)-1-氨基-3-(芐氧基)丙-2-醇、化合物22(8.0g,44.1mmol)在DMF(60mL)中的經(jīng)攪拌的溶液添加(S)-2-氯丁酸(5.0g,40.8mmol)，然后添加TEA(10.5g.103.8mmol)、DMAP(0.4g,3.3mmol)并且最后添加EDC(9.52g,49.7mmol)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌5d，此后將完成的反應(yīng)物濃縮成粗制漿狀物。經(jīng)硅膠(Biotage，用庚烷中的20％-100％EtOA的梯度洗脫)純化，然后收集所需部分，在真空中濃縮并且干燥，以得到(S)-N-((R)-3-(芐氧基)-2-羥丙基)-2-氯丁酰胺(683.5mg,2.392mmol,5.9％收率)。

向氫化鈉(203.1mg,5.1mmol，作為60％油狀分散體)在冷卻至0℃的THF(18mL)中的經(jīng)攪拌的懸浮液在5min內(nèi)逐滴添加THF(3.8mL)中的(S)-N-((R)-3-(芐氧基)-2-羥丙基)-2-氯丁酰胺(362.8mg,1.270mmol)，此后將反應(yīng)在0℃下攪拌30min，然后在室溫下攪拌5h。將完成的反應(yīng)通過緩慢添加IPA(1mL)來淬滅，然后添加H+形式的Dowex 50，直到觀察到中性pH成為酸性pH。將最終的懸浮液進(jìn)行過濾并且將固體用EtOAc沖洗兩次。將合并的濾液進(jìn)行濃縮并且將所得的粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠(Biotage,用1:1的EtOAc:庚烷洗脫)純化。將所需部分合并，在真空中濃縮并干燥以得到(2R,6R)-6-((芐氧基)甲基)-2-乙基嗎啉-3-酮(314mg,1.260mmol,99.2％收率)。

在室溫下，向(2R,6R)-6-((芐氧基)甲基)-2-乙基嗎啉-3-酮(362.2mg,1.453mmol)在THF(2mL)中的經(jīng)攪拌的溶液在2min內(nèi)逐滴添加THF中的1M氫化鋁鋰(2mL,2mmol)。將反應(yīng)在室溫下攪拌2.5h，此后將其冷卻至0℃，然后逐滴添加水(0.6mL)，然后添加1M氫氧化鈉水溶液(0.04mL)。將淬滅的反應(yīng)升溫至室溫，攪拌直到形成顆粒狀固體并且經(jīng)硅藻土545墊過濾，用EtOAc(5mL)、DCM(5mL)和乙醚(5mL)沖洗。將濾液進(jìn)行濃縮并且將所得的粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠(Biotage，用DCM中的5％–10％MeOH的梯度洗脫)純化，然后合并所需部分，在真空中濃縮并且干燥以得到(2R,6R)-2-((芐氧基)甲基)-6-乙基嗎啉(50.2mg,0.213mmol,14.6％收率)。

向(2R,6R)-2-((芐氧基)甲基)-6-乙基嗎啉(12.4mg,0.053mmol)和化合物3(10.2mg,0.044mmol)在DMA(2mL)中的經(jīng)攪拌的溶液添加DIPEA(0.015mL,0.086mmol)，然后在150℃下微波處理7h。將冷卻的完成的反應(yīng)直接注入C-18反相HPLC(Water’s X-Bridge C18,19x100mm柱，用具有0.1％甲酸的10％–90％乙腈水溶液的線性梯度洗脫)，并且濃縮所需的峰，然后在高真空下干燥以得到ER-886355(6.2mg 0.016mmol,36.4％收率)。

ER-887199的制備：將(2R,6R)-2-((芐氧基)甲基)-6-乙基嗎啉(552.2mg,2.347mmol)在MeOH(10mL)中的經(jīng)攪拌的溶液使用H-Qube氫化儀器用H₂氣體在1個(gè)大氣壓下經(jīng)10％Pd(OH)₂柱循環(huán)16h。將完成的反應(yīng)溶液進(jìn)行濃縮并且在真空中干燥以得到粗產(chǎn)物((2R,6R)-6-乙基嗎啉-2-基)甲醇(320mg,2.204mmol,93.9％收率)，其未經(jīng)進(jìn)一步純化用于下一步。

將1-甲基吡咯烷-2-酮(2ml)中的((2R,6R)-6-乙基嗎啉-2-基)甲醇(145.2mg,1.00mmol)和化合物3(266.4mg,1.143mmol)在180℃下微波處理15分鐘，此后將其冷卻至室溫并且直接注入C-18反相HPLC(Water’s X-Bridge C18,19x 100mm柱，用具有0.1％甲酸的10％–90％乙腈水溶液的線性梯度洗脫)，并且濃縮所需的峰，然后在高真空下干燥以得到ER-887199(92.3mg 0.313mmol,31.3％收率)。

使用方案11和方案19制備實(shí)例ER-899742

方案19

ER-895194或38：在0-5℃下向13(231.0g,815.3mmol)在DCM(3.93L)中的經(jīng)攪拌的溶液添加二乙酸碘苯(525g,1630.6mmol)，同時(shí)將溫度維持在<5℃。添加TEMPO(25.4g,162.8mmol)，然后添加水(151mL)，此后將所得的反應(yīng)混合物升溫至10℃，攪拌30分鐘，然后使其升溫至室溫并且攪拌15h。將完成的反應(yīng)物冷卻至<15℃，并且通過緩慢添加1.34L 10％(w/v)硫代硫酸鈉水溶液來淬滅，同時(shí)將反應(yīng)溫度維持≤15℃，然后在室溫下再攪拌45min。通過緩慢添加1M氫氧化鈉水溶液將淬滅的反應(yīng)的pH調(diào)節(jié)至pH 9，同時(shí)將溫度維持在≤25℃。分離攪拌的各層并且用水(560mL)洗滌有機(jī)層。將1-丁醇(2.31L)添加至合并的水層，此后將混合物冷卻至10-15℃，然后緩慢添加5M硫酸(231mL)，將溫度維持在≤25℃以獲得約pH 5。將所得的層進(jìn)行分離并且將水層用1-丁醇(2.31L)萃取3次，同時(shí)將水層的pH在萃取之間維持為約pH 5。將合并的水層進(jìn)行濃縮，同時(shí)升溫至50-55℃，此后將所得的黃色固體漿料經(jīng)過與正庚烷(每次693mL)共沸三次濃縮至1.5L的體積，然后添加DCM(2.31L)。將黃色固體懸浮液在室溫下攪拌1h，然后過濾，將濾墊用DCM(462mL)洗滌兩次。將收集的黃色濾餅在40℃下于真空中干燥過夜，然后懸浮于甲苯(1.16L)中，并且在45℃下于真空中濃縮至完全干燥以得到呈黃色固體狀的38或ER-895194(187g,629mmol,77％收率)。

向38(300mg,1.01mmol)在DCM(2mL)中的經(jīng)攪拌的溶液添加(3S,4R)-叔丁基3-氨基-4-氟吡咯烷-1-甲酸酯和(3R,4S)-叔丁基3-氨基-4-氟吡咯烷-1-甲酸酯77(205.3mg,1.005mmol)、HBTU(247mg,1.211mmol)和DIEA(0.70mL,4.04mmol)，然后在室溫下攪拌16h。發(fā)現(xiàn)其已完成并且濃縮至干燥，然后溶于EtOAc(20mL)，用水(10mL)、2N檸檬酸水溶液(10mL)、飽和NaHCO₃(10mL)和鹽水(10mL)洗滌1次。將合并的水層用EtOAc(每次10mL)萃取3次，此后經(jīng)MgSO₄干燥合并的有機(jī)部分，過濾并且濃縮至干燥。將粗產(chǎn)物經(jīng)25g Biotage硅膠柱純化，其用DCM(總200mL)中的0％-10％MeOH洗脫，以得到78和79的非對(duì)映體混合物。

使用適當(dāng)大小的手性技術(shù)的5μM Chiralpak IA柱分離78和79，其中用庚烷:EtOH:MeOH:DEA(70:15:15:0.1)溶劑系統(tǒng)進(jìn)行洗脫。在濃縮以及經(jīng)真空清掃產(chǎn)生干燥固體后獲得：作為第一洗脫部分的72(95mg,0.196mmol,19.5％收率)；以及作為第二洗脫部分的73(75mg,0.155mmol,15.4％收率)。

將78(95mg,0.196mmol)在攪拌下溶于二噁烷(17μL)，然后在室溫下，在3分鐘內(nèi)逐滴添加二噁烷中的4N HCl(0.49mL 1.97mmol,10當(dāng)量)。將反應(yīng)再攪拌4h，此后將完成的反應(yīng)物進(jìn)行濃縮并且使用甲苯(每次10mL)共沸3次至干燥，然后進(jìn)行高真空干燥以獲得作為HCl鹽的ER-899742-HCl(69mg,0.164mmol,84％收率)，其不需要進(jìn)一步純化。

ER-899742的絕對(duì)立體化學(xué)的間接測(cè)定

方案20

使用間接方法測(cè)定ER-899742的絕對(duì)立體化學(xué)，其中使用Tsuzuki等人在Tetrahedron Asymmetry 2001,12,2989l中所述的經(jīng)確認(rèn)的手性原料，以得到方案20中的手性化合物81。

向(3S,4S)-叔丁基3-(芐基氨基)-4-羥基吡咯烷-1-甲酸酯80(3.091g,10.57mmol)和咪唑(3.60g,52.9mmol)在DCM(185ml)中的經(jīng)攪拌的溶液添加三乙胺(4.42ml,31.7mmol)。將所得的混合物冷卻至1-2℃，然后在30min內(nèi)逐滴添加亞硫酰氯(1.16ml,15.9mmol)在DCM(46ml)中的溶液。將混合物在1-2℃下攪拌6h，升溫至室溫并且攪拌過夜，此后用水(46mL)淬滅反應(yīng)。將有機(jī)層進(jìn)行分離、濃縮以產(chǎn)生呈白色固體/泡沫狀的粗產(chǎn)物，將所述粗產(chǎn)物進(jìn)行硅膠柱色譜法(正庚烷/EtOAc2:1)以產(chǎn)生呈白色固體狀的(3S,6S)-叔丁基3-芐基四氫吡咯并[3,4-d][1,2,3]氧雜噻唑-5(3H)-甲酸酯2-氧化物(2.10g,6.21mmol,58.7％收率)。

向(3S,6S)-叔丁基3-芐基四氫吡咯并[3,4-d][1,2,3]氧雜噻唑-5(3H)-甲酸酯2-氧化物(2.10g,6.21mmol)在用冷卻至2-3℃的乙腈(10ml)和水(10ml)稀釋的1,2-二氯乙烷(10ml)中的經(jīng)攪拌的溶液添加氯化釕(III)水合物(14mg)，然后添加高碘酸鈉(1.39g,6.50mmol)。將所得的混合物在2-3℃下攪拌1h，在1h內(nèi)升溫至17-18℃，并且在該溫度下攪拌16h。添加20wt％Na₂SO₄(5g)，然后添加EtOAc(30ml)，此后將所得的混合物劇烈攪拌10min并且通過硅藻土墊(2g)過濾。分離有機(jī)層，用20wt％亞硫酸鈉(5g)、20wt％NaCl(5g)洗滌，并且進(jìn)行濃縮以產(chǎn)生淺紫色/灰色油狀物。將粗制油狀物經(jīng)過硅膠塞(10g)，用EtOAc(120ml)洗脫，并且濃縮至干燥以得到呈白色固體狀的(3S,6S)-叔丁基3-芐基四氫吡咯并[3,4-d][1,2,3]氧雜噻唑-5(3H)-甲酸酯2,2-二氧化物(1.54g,4.35mmol,70.0％收率)。

將(3S,6S)-叔丁基3-芐基四氫吡咯并[3,4-d][1,2,3]氧雜噻唑-5(3H)-甲酸酯2,2-二氧化物(20mg,0.056mmol)溶于TBAF(在THF中的1M溶液，1.0ml)并且在回流下加熱過夜，此后將反應(yīng)冷卻至室溫并且用HCl(1M溶液，2ml)酸化。在2h后，將混合物用NaHCO₃(9％水溶液，2.5g)中和并且用EtOAc(10ml)萃取。分離有機(jī)層，濃縮并且與額外的兩批進(jìn)行合并，其中每批使用100mg(每次0.282mmol)起始氧雜噻唑。將合并的粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱色譜法(正庚烷/EtOAc 1:1)純化，以經(jīng)由TLC(硅膠)得到呈淺棕色油狀以及極性較小的(3S,4S)-叔丁基3-(芐基氨基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸酯82(29mg,0.099mmol,15.9％收率)以及經(jīng)由TLC(硅膠)得到呈淺棕色油狀以及極性較大的(3S,4R)-叔丁基3-(芐基氨基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸酯81(20mg,0.068mmol,11.0％收率)。

將(3S,4R)-叔丁基3-(芐基氨基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸酯81(16mg,0.054mmol)用乙醇(3ml)中的10wt％Pd-C(10mg)進(jìn)行氫解。將完成的反應(yīng)混合物進(jìn)行過濾，濃縮并且與CDCl₃共沸以得到(3S,4R)-叔丁基3-氨基-4-氟吡咯烷-1-甲酸酯83(8.3mg,0.041mmol,75.9％收率)。

在40℃下，向(3S,4R)-叔丁基3-氨基-4-氟吡咯烷-1-甲酸酯和38或ER-895194(15mg,0.050mmol)在DMF(0.2ml)中的經(jīng)攪拌的溶液添加丙基磷酸酐(0.2g，50％溶液于EtOAc中)持續(xù)2h。將反應(yīng)混合物經(jīng)過硅膠塞(3g，用1:3的庚烷-EtOAc洗脫)，然后通過制備型TLC(正庚烷/EtOAc 1:4)進(jìn)一步純化，以產(chǎn)生呈黃色/綠色油狀的相應(yīng)的酰胺78(11.2mg,0.023mmol,56％收率，在兩個(gè)步驟中)。1H-NMR和HPLC與如之前所述的化合物78相匹配，由此間接確認(rèn)了ER-899742的絕對(duì)立體化學(xué)。

還通過X射線衍射確認(rèn)了ER-899742的絕對(duì)立體化學(xué)。結(jié)晶過程：將5.3mg ER-899742-01(批號(hào)為MC2-1130-120-1)溶于0.5mL IPA和0.3mL H₂O中。將包含溶液的小瓶封蓋并且在室溫下儲(chǔ)存一天。第二天，打開蓋子，并且在室溫下緩慢蒸發(fā)IPA持續(xù)一天。第三天，蓋上蓋子并且將小瓶在室溫下儲(chǔ)存2周，此后出現(xiàn)ER-899742-01的無色針狀晶體，從中選擇單晶用于X射線分析。X射線衍射分析：設(shè)備：R-AXIS RAPID II(RIGAKU)；X射線源：CuKa(l＝1.54187A)；溫度：297K；測(cè)量：沿著ω軸的振動(dòng)方法；晶體大小：0.1x 0.1x 0.4mm。用最終的R因子0.0606和Flack參數(shù)-0.01處理晶體結(jié)構(gòu)。ER-899742-01的結(jié)構(gòu)被確定為(2R,6R)-4-(8-氰基喹啉-5-基)-N-[(3S,4R)-4-氟吡咯烷-3-基]-6-甲基嗎啉-2-甲酰胺鹽酸鹽。參見圖8的ORTEP圖。

將(3S,4S)-叔丁基3-(芐基氨基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸酯82(24mg,0.082mmol)用乙醇(3ml)中的10wt％Pd-C(10mg)進(jìn)行氫解。將反應(yīng)混合物進(jìn)行過濾，濃縮并且與CHCl₃共沸至干燥以得到(3S,4S)-叔丁基3-氨基-4-氟吡咯烷-1-甲酸酯(16.6mg,0.081mmol,99.2％收率)，其未經(jīng)純化用于下一步。

將(3S,4S)-叔丁基3-氨基-4-氟吡咯烷-1-甲酸酯(12.5mg,0.061mmol)和38或ER-895194(18mg,0.061mmol)在DMF(0.2ml)中的經(jīng)攪拌的溶液用丙基磷酸酐(50％溶液于EtOAc中，0.2g)在40℃下處理2h。將反應(yīng)混合物經(jīng)過硅膠塞(3g,用1:3的庚烷-EtOAc洗脫)，然后通過制備型TLC(正庚烷/EtOAc 1:4)進(jìn)一步純化，以得到呈黃色/綠色油狀的(3S,4S)-叔丁基3-((2R,6R)-4-(8-氰基喹啉-5-基)-6-甲基嗎啉-2-甲酰氨基)-4-氟吡咯烷-1-甲酸酯85(14.2mg,0.029mmol,47％收率，在2個(gè)步驟中)。

使用與ER-899742-HCl相同當(dāng)量的試劑獲得ER-899745-HCL(62.3mg,0.148mmol,96％收率)，以化合物79(75mg,0.155mmol)起始。

以與ER-899742相似的方式制備ER-894550(5.3mg,0.016mmol,18.4％收率)，其中以38(25.9mg,0.087mmol)和乙胺鹽酸鹽(206mg,.962mmol)起始。使用DMF(0.5mL)代替DCM。將ER-894550通過反相HPLC(X-Bridge C18 19x 100mm柱；用包含0.1％甲酸的漸增乙腈水溶液的梯度洗脫)純化，然后合并所需部分，在真空中濃縮并且干燥。將產(chǎn)物部分進(jìn)行合并以及濃縮至干燥，然后在MeOH(1mL)中稀釋，經(jīng)過堿性硅膠塞(Biotage SiCO₃,1g，用MeOH(1mL)洗脫)，在真空中濃縮并且干燥。

以與ER-899742相似的方式制備ER-895473(103mg,0.261mmol,27.1％收率)，其中以38(286mg,0.962mmol)和(S)-叔丁基2-乙基哌嗪-1-甲酸酯(206mg,.962mmol)起始。使用DMF(3mL)替代DCM用于酰胺的形成反應(yīng)，并且將乙醚中的2.0M HCl(1.3mL,2.6mmol)用于Boc去保護(hù)過程，使用乙腈(1mL)作為溶劑。將ER-895473通過反相HPLC(X-Bridge C18 19x 100mm柱；用包含0.1％甲酸的漸增乙腈水溶液的梯度洗脫)純化。將產(chǎn)物部分進(jìn)行合并以及濃縮至干燥，然后在MeOH(1mL)中稀釋，經(jīng)過堿性硅膠塞(Biotage SiCO₃,1g，用MeOH(1mL)洗脫)，在真空中濃縮并且干燥。

以與ER-899742相似的方式制備ER-895474(6.3mg,0.015mmol,19.6％收率)，其中以38(22.5mg,0.076mmol)和(3,4-二氟苯基)甲胺(10.83mg,.076mmol)起始。不需要進(jìn)行Boc去保護(hù)。

以與ER-895473相似的方式制備ER-895475(16.2mg,0.044mmol,71.5％收率)，其中以38(18.3mg,0.062mmol)和(R)-叔丁基吡咯烷-3-基氨基甲酸酯(11.46mg,.062mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-895476(14.0mg,0.042mmol,28.8％收率)，其中以38(43.0mg,0.145mmol)和氮雜環(huán)丁烷鹽酸鹽(13.53mg,.145mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-895477(26.1mg,0.058mmol,32.1％收率)，其中以38(54.0mg,0.182mmol)和1,4’-聯(lián)哌啶(30.6mg,.182mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-895478(15.9mg,0.047mmol,29.0％收率)，其中以38(48.4mg,0.163mmol)和環(huán)丙胺(11.42μl,.163mmol)起始。

以與ER-895473相似的方式制備ER-895479(14.9mg,0.042mmol,23.7％收率)，其中以38(53.2mg,0.179mmol)和氮雜環(huán)丁烷-3-基氨基甲酸叔丁酯(30.8mg,.179mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-897922(15.1mg,0.041mmol,48.7％收率)，其中以38(25mg,0.084mmol)和1-氨基丁-2-醇(13.0mg,0.146mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-897923(13.9mg,0.038mmol,44.9％收率)，其中以38(25mg,0.084mmol)和2-乙氧基乙胺(13.0mg,0.146mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-897924(17.0mg,0.046mmol,54.9％收率)，其中以38(25mg,0.084mmol)和(R)-2-氨基丁-1-醇(14.0mg,0.157mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-897925(4.5mg,0.012mmol,14.5％收率)，其中以38(25mg,0.084mmol)和2-氨基丙烷-1,3-二醇(14.0mg,0.154mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-897926(7.6mg,0.021mmol,24.4％收率)，其中以38(25mg,0.084mmol)和3-氨基丙烷-1,2-二醇(15.0mg,0.165mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-897927(15.0mg,0.039mmol,46.9％收率)，其中以38(25mg,0.084mmol)和(R)-(四氫呋喃-2-基)甲胺(15.0mg,0.148mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-897928(14.9mg,0.039mmol,46.6％收率)，其中以38(25mg,0.084mmol)和(四氫呋喃-2-基)甲胺(16.0mg,0.158mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-897929(10.3mg,0.027mmol,32.0％收率)，其中以38(25mg,0.084mmol)和2-丙氧基乙胺(16.0mg,0.155mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-897930(12.8mg,0.033mmol,39.8％收率)，其中以38(25mg,0.084mmol)和(R)-2-氨基戊-1-醇(16.0mg,0.155mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-897931(11.1mg,0.029mmol,34.5％收率)，其中以38(25mg,0.084mmol)和2-異丙氧基乙胺(15.0mg,0.145mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-897932(10.0mg,0.026mmol,31.1％收率)，其中以38(25mg,0.084mmol)和1-甲氧基丁-2-胺(0.0160g,0.155mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-897933(9.0mg,0.021mmol,24.6％收率)，其中以38(25mg,0.084mmol)和2-氨基-1-(2-氟苯基)乙醇(23.0mg,0.148mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-897934(13.3mg,0.035mmol,41.1％收率)，其中以38(25mg,0.084mmol)和(S)-2-氨基-3-甲基丁-1-醇(15.0mg,0.145mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-897935(15.7mg,0.041mmol,48.6％收率)，其中以38(25mg,0.084mmol)和2,2-二甲氧基乙胺(15.0mg,0.143mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-897936(10.4mg,0.027mmol,32.2％收率)，其中以38(25mg,0.084mmol)和2-(2-氨基乙氧基)乙醇(16.0mg,0.152mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-897937(12.1mg,0.031mmol,36.5％收率)，其中以38(25mg,0.084mmol)和(1S,2S)-2-氨基環(huán)己醇(23.0mg,0.200mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-897938(8.5mg,0.022mmol,25.6％收率)，其中以38(25mg,0.084mmol)和2-氨基環(huán)己醇(17.0mg,0.148mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-897939(10.1mg,0.025mmol,30.3％收率)，其中以38(25mg,0.084mmol)和2-氨基己-1-醇(18.3mg,0.156mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-897940(10.3mg,0.026mmol,30.9％收率)，其中以38(25mg,0.084mmol)和(S)-2-氨基-3,3-二甲基丁-1-醇(19.0mg,0.162mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-897941(14.0mg,0.035mmol,42.0％收率)，其中以38(25mg,0.084mmol)和(S)-2-氨基己-1-醇(19.0mg,0.162mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-897942(9.9mg,0.025mmol,29.7％收率)，其中以38(25mg,0.084mmol)和(2S,3S)-2-氨基-3-甲基戊-1-醇(18.0mg,0.154mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-897943(11.1mg,0.028mmol,33.3％收率)，其中以38(25mg,0.084mmol)和(S)-2-氨基-4-甲基戊-1-醇(18.0mg,0.154mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-897944(10.9mg,0.027mmol,32.7％收率)，其中以38(25mg,0.084mmol)和(R)-2-氨基-4-甲基戊-1-醇(18.0mg,0.154mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-897945(13.2mg,0.032mmol,38.3％收率)，其中以38(25mg,0.084mmol)和(4-甲基嗎啉-2-基)甲胺(20.0mg,0.154mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-897946(16.1mg,0.035mmol,42.0％收率)，其中以38(25mg,0.084mmol)和(S)-2-氨基-4-(甲硫基)丁-1-醇(20.0mg,0.148mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-897947(12.0mg,0.029mmol,34.3％收率)，其中以38(25mg,0.084mmol)和2-苯氧基乙胺(21.0mg,0.153mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-897948(12.0mg,0.028mmol,33.1％收率)，其中以38(25mg,0.084mmol)和(S)-2-氨基-3-苯基丙-1-醇(24.0mg,0.159mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-897949(11.7mg,0.027mmol,32.3％收率)，其中以38(25mg,0.084mmol)和2-苯氧基丙-1-胺(29.0mg,0.192mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-897950(11.7mg,0.027mmol,32.3％收率)，其中以38(25mg,0.084mmol)和1-氨基-3-苯基丙-2-醇(23.0mg,0.152mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-897952(14.0mg,0.032mmol,38.6％收率)，其中以38(25mg,0.084mmol)和2-(吡啶-3-基氧基)丙-1-胺(24.0mg,0.158mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-897955(8.2mg,0.019mmol,22.5％收率)，其中以38(25mg,0.084mmol)和2-(4-氟苯氧基)乙胺(23.0mg,0.148mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-897956(11.2mg,0.026mmol,26％收率)，其中以38(25mg,0.084mmol)和2-氨基-1-(3-氟苯基)乙醇(24.0mg,0.155mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-897957(9.8mg,0.022mmol,26.7％收率)，其中以38(25mg,0.084mmol)和(S)-2-氨基-3-環(huán)己基丙-1-醇(30.0mg,0.191mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-897958(13.6mg,0.031mmol,36.5％收率)，其中以38(25mg,0.084mmol)和異色滿-1-基甲胺(24.0mg,0.147mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-897960(13.0mg,0.029mmol,34.6％收率)，其中以38(25mg,0.084mmol)和1-氨基-3-苯氧基丙-2-醇(25.0mg,0.150mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-897961(9.7mg,0.022mmol,25.8％收率)，其中以38(25mg,0.084mmol)和4-((1S,2R)-2-氨基-1-羥丙基)苯酚(32.0mg,0.191mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-897962(17.8mg,0.040mmol,47.4％收率)，其中以38(25mg,0.084mmol)和(1S,2S)-2-氨基-1-苯基丙烷-1,3-二醇(26.0mg,0.155mmol)起始。

以與ER-895473相似的方式制備ER-897963(3.1mg,0.007mmol,8.4％收率)，其中以38(25mg,0.084mmol)和4-(3-氨基-2-羥丙基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(40.0mg,0.154mmol)起始。

以與ER-895473相似的方式制備ER-897964(12.7mg,0.036mmol,21.5％收率)，其中以38(25mg,0.084mmol)和3-氨基氮雜環(huán)丁烷-1-甲酸叔丁酯(27.0mg,0.157mmol)起始。

以與ER-895473相似的方式制備ER-897965(0.4mg,0.001mmol,1.3％收率)，其中以38(25mg,0.084mmol)和(S)-叔丁基3-氨基吡咯烷-1-甲酸酯(29.0mg,0.156mmol)起始。

以與ER-895473相似的方式制備ER-897966(0.4mg,0.001mmol,1.3％收率)，其中以38(25mg,0.084mmol)和(R)-叔丁基3-氨基吡咯烷-1-甲酸酯(29.0mg,0.156mmol)起始。

以與ER-895473相似的方式制備ER-897967(0.3mg,0.001mmol,0.9％收率)，其中以38(25mg,0.084mmol)和(S)-叔丁基3-氨基哌啶-1-甲酸酯(30.0mg,0.150mmol)起始。

以與ER-895473相似的方式制備ER-897968(0.4mg,0.001mmol,1.3％收率)，其中以38(25mg,0.084mmol)和(R)-叔丁基3-氨基哌啶-1-甲酸酯(30.0mg,0.150mmol)起始。

以與ER-895473相似的方式制備ER-897969(0.2mg,0.001mmol,0.6％收率)，其中以38(25mg,0.084mmol)和(S)-叔丁基2-(氨基甲基)吡咯烷-1-甲酸酯(30.0mg,0.150mmol)起始。

以與ER-895473相似的方式制備ER-897970(3.4mg,0.008mmol,9.4％收率)，其中以38(25mg,0.084mmol)和(2-氨基乙基)(芐基)氨基甲酸叔丁酯(38.0mg,0.152mmol)起始。

以與ER-895473相似的方式制備ER-898560(11.2mg,0.030mmol,30.9％收率)，其中以38(28.8mg,0.097mmol)和吡啶-2-胺(9.12mg,.097mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-898561(12.8mg,0.033mmol,44.6％收率)，其中以38(22.1mg,0.074mmol)和6-甲基吡啶-2-胺(8.04mg,.074mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-898562(7.4mg,0.020mmol,18.7％收率)，其中以38(31.2mg,0.105mmol)和5-甲基異噁唑-3-胺(10.30mg,.105mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-898563(6.5mg,0.017mmol,16.7％收率)，其中以38(30.7mg,0.103mmol)和2,2,2-三氟乙胺鹽酸鹽(13.99mg,.103mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-898564(1.4mg,0.004mmol,3.8％收率)，其中以38(30mg,0.101mmol)和2,2-二氟乙胺(8.18mg,.101mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-898565(3.0mg,0.008mmol,7.5％收率)，其中以38(30.2mg,0.102mmol)和3,3,3-二氟丙-1-胺(11.49mg,.102mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-898566(14.6mg,0.037mmol,20.4％收率)，其中以38(53.7mg,0.181mmol)和N2,N2,2-三甲基丙烷-1,2-二胺(20.99mg,.181mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-898914(31.6mg,0.092mmol,28.8％收率)，其中以38(95.2mg,0.320mmol)和2-氟乙胺鹽酸鹽(31.9mg,.32mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-898915(19.1mg,0.054mmol,19.3％收率)，其中以38(82.3mg,0.277mmol)和3-氟丙-1-胺鹽酸鹽(31.4mg,.277mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-898916(14.6mg,0.037mmol,21.5％收率)，其中以38(51.4mg,0.173mmol)和(R)-1,1,1-三氟丙-2-胺(20mg,.177mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-898917(27.6mg,0.066mmol,20.4％收率)，其中以38(95.7mg,0.322mmol)和(R)-1,1,1-三氟-3-甲基丁-2-胺(45.4mg,.322mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-898918(15.0mg,0.038mmol,19.3％收率)，其中以38(59.2mg,0.199mmol)和1,3-二甲基-1H-吡唑-5-胺(22.13mg,.199mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-898919(13.1mg,0.035mmol,10.5％收率)，其中以38(98.1mg,0.33mmol)和1-甲基-1H-吡唑-5-胺(32.0mg,.33mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-898920(20.1mg,0.060mmol,21.4％收率)，其中以38(83.3mg,0.280mmol)和2-氨基乙腈鹽酸鹽(25.9mg,.28mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-898921(11.4mg,0.032mmol,12.8％收率)，其中以38(73.1mg,0.246mmol)和環(huán)丙烷甲腈鹽酸鹽(25.5mg,.246mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-898922(25.4mg,0.067mmol,33.7％收率)，其中以38(59.0mg,0.198mmol)和1,2,4-噻二唑-5-胺(20.07mg,.198mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-898923(12.6mg,0.032mmol,16.5％收率)，其中以38(57.6mg,0.194mmol)和3-甲基-1,2,4-噻二唑-5-胺(22.31mg,.194mmol)起始。

以與ER-899742-HCl相似的方式制備ER-899017-HCl(328mg,0.769mmol,65.3％收率)，其中以38(350mg,1.177mmol)和2,6-二氮雜螺[3.4]辛烷-6-甲酸叔丁酯(250mg,1.177mmol)起始。

以與ER-899742-HCl相似的方式制備ER-899019-HCl(26mg,0.059mmol,58.2％收率)，其中以38(30mg,0.101mmol)和4-(氨基甲基)-4-氟哌啶-1-甲酸叔丁酯(23.4mg,.101mmol)起始。

以與ER-899742-HCl相似的方式制備ER-899020-HCl(25mg,0.062mmol,61.4％收率)，其中以38(30mg,0.101mmol)、3-(氨基甲基)氮雜環(huán)丁烷-1-甲酸叔丁酯(18.8mg,.101mmol)起始。

以與ER-899742-HCl相似的方式制備ER-899023-HCl(25.5mg,0.060mmol,59.4％收率)，其中以38(30mg,0.101mmol)和1,6-二氮雜螺[3.4]辛烷-6-甲酸叔丁酯(21.4mg,.101mmol)起始。

以與ER-899742-HCl相似的方式制備ER-899024-HCl(30.1mg,0.068mmol,67.5％收率)，其中以38(30mg,0.101mmol)和1,7-二氮雜螺[4.4]壬烷-1-甲酸叔丁酯(22.8mg,.101mmol)起始。

以與ER-899742-HCl相似的方式制備ER-899025-HCl(32.1mg,0.077mmol,76％收率)，其中以38(30mg,0.101mmol)和4-氨基-1-甲基-1H-吡唑-3-甲酰胺(14.1mg,.101mmol)起始。不需要進(jìn)行Boc去保護(hù)。

以與ER-899742-HCl相似的方式制備ER-899031-HCl(30.1mg,0.079mmol,78％收率)，其中以38(30mg,0.101mmol)和(3-甲基氧雜環(huán)丁烷-3-基)甲胺(10.2mg,.101mmol)起始。不需要進(jìn)行Boc去保護(hù)。

以與ER-899742-HCl相似的方式制備ER-899032-HCl(28.7mg,0.079mmol,78％收率)，其中以38(30mg,0.101mmol)和2-氧代-6-氮雜螺[3.3]庚烷(10.0mg,.101mmol)起始。不需要進(jìn)行Boc去保護(hù)。

以與ER-899742-HCl相似的方式制備ER-899033-HCl(32.8mg,0.093mmol,92％收率)，其中以38(30mg,0.101mmol)和氧雜環(huán)丁烷-3-胺(7.4mg,.101mmol)起始。不需要進(jìn)行Boc去保護(hù)。

以與ER-899742-HCl相似的方式制備ER-899034-HCl(26.4mg,0.067mmol,66.2％收率)，其中以38(30mg,0.101mmol)和氧雜環(huán)丁烷-3,3-二基二甲胺二鹽酸鹽(19.1mg,.101mmol)起始。不需要進(jìn)行Boc去保護(hù)。

以與ER-899742-HCl相似的方式制備ER-899035-HCl(25.9mg,0.071mmol,70.1％收率)，其中以38(30mg,0.101mmol)和氧雜環(huán)丁烷-2-基甲胺(8.8mg,.101mmol)起始。不需要進(jìn)行Boc去保護(hù)。

以與ER-899742-HCl相似的方式制備ER-899036-HCl(33.1mg,0.082mmol,82％收率)，其中以38(30mg,0.101mmol)和哌嗪-1-甲酸叔丁酯(18.8mg,.101mmol)起始。

以與ER-899742-HCl相似的方式制備ER-899191-HCl(30.7mg,0.081mmol,80％收率)，其中以38(30mg,0.101mmol)和氮雜環(huán)丁烷-3-甲酰胺(10.1mg,.101mmol)起始。不需要進(jìn)行Boc去保護(hù)。

以與ER-899742-HCl相似的方式制備ER-899192-HCl(34.4mg,0.078mmol,77％收率)，其中以38(30mg,0.101mmol)和2,7-二氮雜螺[4.4]壬烷-2-甲酸叔丁酯(22.8mg,.101mmol)起始。

以與ER-899742-HCl相似的方式制備ER-899193-HCl(38.1mg,0.081mmol,80％收率)，其中以38(30mg,0.101mmol)和3,9-二氮雜螺[5.5]十一烷-3-甲酸叔丁酯(25.7mg,.101mmol)起始。

以與ER-899742-HCl相似的方式制備ER-899196-HCl(23.7mg,0.057mmol,56.4％收率)，其中以38(30mg,0.101mmol)和4-氨基煙酰胺(13.84mg,.101mmol)起始。不需要進(jìn)行Boc去保護(hù)。

以與ER-899742-HCl相似的方式制備ER-899282-HCl(29.6mg,0.079mmol,79％收率)，其中以38(30mg,0.101mmol)和吡啶-4-胺(9.5mg,.101mmol)起始。不需要進(jìn)行Boc去保護(hù)。

以與ER-899742-HCl相似的方式制備ER-899283-HCl(31.1mg,0.083mmol,83％收率)，其中以38(30mg,0.101mmol)和吡啶-3-胺(9.5mg,.101mmol)起始。不需要進(jìn)行Boc去保護(hù)。

以與ER-899742-HCl相似的方式制備ER-899285-HCl(28.5mg,0.059mmol,58.6％收率)，其中以38(30mg,0.101mmol)和4-(4-氨基-1H-吡唑-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(26.9mg,.101mmol)起始。

以與ER-899742-HCl相似的方式制備ER-899286-HCl(31.7mg,0.070mmol,69.2％收率)，其中以38(30mg,0.101mmol)和3-(4-氨基-1H-吡唑-1-基)氮雜環(huán)丁烷-1-甲酸叔丁酯(24.0mg,.101mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-899287(29.7mg,0.079mmol,78％收率)，其中以38(30mg,0.101mmol)和(1H-吡唑-5-基)甲胺(9.80mg,.101mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-899288(20.7mg,0.057mmol,56.6％收率)，其中以38(30mg,0.101mmol)和1H-吡唑-4-胺(8.38mg,.101mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-899289(35.5mg,0.078mmol,77％收率)，其中以38(30mg,0.101mmol)和(3-(三氟甲基)吡啶-2-基)甲胺(17.77mg,.101mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-899290(15.0mg,0.034mmol,33.9％收率)，其中以38(30mg,0.101mmol)和1-(吡啶-2-基)乙胺(12.33mg,.101mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-899291(26.1mg,0.067mmol,66.7％收率)，其中以38(30mg,0.101mmol)和吡啶-2-基甲胺(10.91mg,.101mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-899292(31.0mg,0.077.2mmol,76.4％收率)，其中以38(30mg,0.101mmol)和(6-甲基吡啶-2-基)甲胺(12.3mg,.101mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-899293(32.0mg,0.079mmol,77.7％收率)，其中以38(30mg,0.101mmol)和(1-甲基哌啶-2-基)甲胺(12.9mg,.101mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-899294(32.2mg,0.080mmol,79％收率)，其中以38(30mg,0.101mmol)和(3-甲基吡啶-2-基)甲胺(12.3mg,.101mmol)起始。

以與ER-895473相似的方式制備ER-899334(51.3mg,0.140mmol,11.7％收率)，其中以38(357.2mg,1.201mmol)和(R)-叔丁基2-(氨基甲基)吡咯烷-1-甲酸酯(224mg,1.201mmol)起始。

以與ER-899742-HCl相似的方式制備ER-899414-HCl(31.1mg,0.075mmol,74.1％收率)，其中以38(30mg,0.101mmol)和(R)-叔丁基2-(氨基甲基)吡咯烷-1-甲酸酯(20.2mg,.101mmol)起始。

以與ER-899742-HCl相似的方式制備ER-899415-HCl(30.5mg,0.071mmol,70.3％收率)，其中以38(30mg,0.101mmol)和(S)-叔丁基2-(氨基甲基)哌啶-1-甲酸酯(21.6mg,.101mmol)起始。

以與ER-899742-HCl相似的方式制備ER-899416-HCl(24.2mg,0.055mmol,54.3％收率)，其中以38(30mg,0.101mmol)和3-氨基-8-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(22.84mg,.101mmol)起始。

以與ER-899742-HCl相似的方式制備ER-899417-HCl(32.8mg,0.076mmol,76％收率)，其中以38(30mg,0.101mmol)和4-氨基氮雜環(huán)庚烷-1-甲酸叔丁酯(21.62mg,.101mmol)起始。

以與ER-899742-HCl相似的方式制備ER-899418-HCl(29.6mg,0.072mmol,70.9％收率)，其中以38(30mg,0.101mmol)和(1R,5S,6S)-叔丁基6-氨基-3-氮雜雙環(huán)[3.1.0]己烷-3-甲酸酯(20.0mg,.101mmol)起始。

以與ER-899742-HCl相似的方式制備ER-899476-HCl(31.0mg,0.068mmol,67.4％收率)或ER-899742和ER-899745的非對(duì)映體混合物，其中以38(30mg,0.101mmol)以及(3R,4S)-叔丁基3-氨基-4-氟吡咯烷-1-甲酸酯和(3S,4R)-叔丁基3-氨基-4-氟吡咯烷-1-甲酸酯(20.6mg,.101mmol)的1:1混合物起始。

以與ER-899742-HCl相似的方式制備作為非對(duì)映體混合物的ER-899477-HCl(25.5mg,0.059mmol,58.2％收率)，其中以38(30mg,0.101mmol)以及(3R,4S)-叔丁基3-氨基-4-氟哌啶-1-甲酸酯和(3S,4R)-叔丁基3-氨基-4-氟哌啶-1-甲酸酯(22.02mg,.101mmol)的1:1混合物起始。

以與ER-899742-HCl相似的方式制備ER-899479-HCl(30.5mg,0.071mmol,70.6％收率)，其中以38(30mg,0.101mmol)和6-氨基-2-氮雜螺[3.3]庚烷-2-甲酸叔丁酯(21.42mg,.101mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-897383(14.2mg,0.017mmol,14.1％收率)，其中以38(35.2mg,0.118mmol)和2-氨基乙醇(10.9mg,0.178mmol)起始。使用DMF(1mL)代替DMAC。

以與ER-897383相似的方式制備ER-897385(14.2mg,0.017mmol,14.1％收率)，其中以38(35mg,0.118mmol)和2-甲氧基乙胺(13.7mg,0.178mmol)起始。

以與ER-897383相似的方式制備ER-897445(87mg,0.245mmol,72.9％總收率)，其中以38(100mg,0.336mmol)和(R)-2-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)丙-1-胺(158mg,0.505mmol)起始，然后使用DCM(1.1mL)中的含1M TBAF的THF(0.43mL,0.43mmol)，在室溫下攪拌1h去除叔丁基二苯基甲硅烷基保護(hù)的基團(tuán)。將所需的產(chǎn)物經(jīng)硅膠(用庚烷中的80％–100％EtOAc洗脫)純化。

以與ER-897445相似的方式制備ER-897446(67mg,0.189mmol,75％總收率)，其中以38(75mg,0.252mmol)和(S)-1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)丙-2-胺(103mg,0.329mmol)起始。

以與ER-897445相似的方式制備ER-897447(78mg,0.220mmol,65.5％總收率)，其中以38(100mg,0.336mmol)和(R)-1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)丙-2-胺(158mg,0.505mmol)起始。

以與ER-897445相似的方式制備ER-897827(48.2mg,0.131mmol,64.9％總收率)，其中以38(60mg,0.202mmol)和(S)-1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)丁-2-胺(90mg,0.303mmol)起始。

以與ER-897445相似的方式制備ER-897828(49.4mg,0.129mmol,64％總收率)，其中以38(60mg,0.202mmol)和(S)-1-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)-3-甲基丁-2-胺(103mg,0.303mmol)起始。

以與ER-897445相似的方式制備ER-897829(65.2mg,0.157mmol,77.7％總收率)，其中以38(60mg,0.202mmol)和(S)-2-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)-1-苯基乙胺(114mg,0.303mmol)起始。

以與ER-897445相似的方式制備ER-897830(60.2mg,0.145mmol,71.8％總收率)，其中以38(60mg,0.202mmol)和(R)-2-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)-1-苯基乙胺(114mg,0.303mmol)起始。

以與ER-895474相似的方式制備ER-899722(79mg,0.215mmol,25.6％收率)，其中以38(250mg,0.841mmol)和2-甲基丙烷-1,2-二胺(0.09mL,0.841mmol)起始。使用DCM(2mL)代替DMAC。

以與ER-899722相似的方式制備ER-899295(27.5mg,0.0.71mmol,70.4％收率)，其中以38(30mg,0.101mmol)和3-氨基-1H-吡唑-4-甲腈(10.9mg,0.101mmol)起始。

ER-898946：將38(50mg,0.168mmol)、HATU(128mg,0.336mmol)和DIEA(0.176ml,1.009mmol)溶于DCM:DMF(5mL:2mL)，然后將4-氨基哌啶-1-甲酸叔丁酯(67.4mg,0.336mmol)溶于其中。將所得的反應(yīng)混合物在室溫下攪拌16h，此后添加額外的HATU(128mg,0.336mmol)和4-氨基哌啶-1-甲酸叔丁酯(67.4mg,0.336mmol)，然后再攪拌3h。將完成的反應(yīng)濃縮至干燥并且將粗產(chǎn)物通過色譜法(25g硅膠)純化，用DCM中的10％乙腈洗脫，以產(chǎn)生純的Boc保護(hù)的產(chǎn)物。將Boc保護(hù)的產(chǎn)物溶于DCM(4ml)/TFA(0.5ml)并且在室溫下攪拌3h，此后在減壓下去除溶劑，將殘余物溶于MeOH(10mL)并且添加0.3g MP-碳酸鹽(pH>7)。將所得的懸浮液在室溫下攪拌30min，此后過濾聚合物微球，用MeOH(10mL)洗滌并且濃縮溶劑，以及在高真空下干燥以產(chǎn)生ER-898946(12mg,0.027mmol,16.0％收率)。

以與ER-898946相似的方式制備ER-898694-2HCl(67mg,0.155mmol,46.1％收率)，其中以38(100mg,0.336mmol)和(S)-叔丁基2-(氨基甲基)嗎啉-4-甲酸酯(95mg,.437mmol)起始，然后添加二噁烷(31μL)中的3N HCl以在濃縮以及在高真空下干燥后得到二鹽酸鹽。

制備ER-899742和ER-899745的可選方法：向38(2.91g,9.79mmol和TEA(1.706ml,12.24mmol)在DCM(50.0ml)中的經(jīng)攪拌的溶液添加77(2.000g,9.792mmol)和HOBT(2.65g,19.59mmol)。將反應(yīng)混合物冷卻至0℃，然后分批添加EDC(3.75g,19.59mmol)，此后將混合物升溫至40℃并且攪拌3h。添加DCM(50mL)，分離各層，此后用飽和氯化銨(20mL)、飽和NaHCO₃(20mL)、鹽水(20mL)洗滌有機(jī)層，經(jīng)Na₂SO₄干燥，過濾并且濃縮至干燥。將粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠(BiotageSP4，用10％MeOH:DCM洗脫)純化。如以上所述分離非對(duì)映體以獲得78(1.65g,3.41mmol,34.8％收率)和79(1.49g,3.08mmol,31.5％收率)。

將78(470mg,0.97mmol)溶于DCM(5.0mL)的攪拌溶液中，然后添加TFA(2.5mL,32.45mmol)，此后將反應(yīng)升溫至49℃并且攪拌2h。將完成的反應(yīng)與甲苯(每次2mL)共沸三次至干燥，然后在真空中干燥以得到呈橙色固體狀的ER-899742-TFA(543mg,0.97mmol,100％收率-所述產(chǎn)物包含1.5摩爾TFA：1摩爾ER-899742(通過質(zhì)譜))。

通過將TFA鹽溶于MeOH并且添加Amberlite IRA 400氫氧化物形式以及攪拌10min或一旦獲得中性pH，就可以獲得ER-899742游離堿。將所得的懸浮液進(jìn)行過濾，用等體積的MeOH洗滌兩次，并將合并的濾液濃縮成膏狀物。將膏狀物與甲苯共沸兩次以得到游離堿形式的ER-899742(定量收率)。然后可以如上所述產(chǎn)生HCl鹽形式。

可以通過用異丙醇中的5.5N HCL處理，以在室溫下攪拌2h，然后與甲苯共沸3次至干燥以及在高真空下干燥后，由78直接獲得ER-899742-HCl鹽，得到通過質(zhì)譜分析證明的1.5摩爾HCl：1摩爾ER-899742的所需產(chǎn)物(定量收率)。

ER-899464-HCl：向38(50g,168.2mmol)在DMF(250mL)中的經(jīng)攪拌的溶液添加TEA(29.3mL,210.2mmol)，然后添加4-氨基-1-甲基哌啶(28.8g,252.3mmol)和HOBT(45.4g,336.4mmol)。將反應(yīng)混合物冷卻至0℃，然后分批添加EDC(64.5g,336.4mmol)。將反應(yīng)混合物升溫至40℃并且再攪拌6h。將完成的反應(yīng)物在攪拌下緩慢傾入包含水(1.5L)的燒瓶，此后添加DCM(1.5L)，再攪拌10min。將兩層進(jìn)行分離并且將水層用DCM(每次600mL)萃取三次。將合并的有機(jī)層濃縮成DMF溶液，然后在真空中于50℃下進(jìn)行濃縮。將所得的黃色漿料用乙醚(1L)稀釋并且攪拌15min，此后通過過濾收集固體，然后用乙醚(0.5L)沖洗濾墊并且在真空中干燥以得到ER-899464(44.9g,114mmol,67.9％收率)。通過將ER-899464(22.8g,57.9mmol)溶于10體積異丙醇和1體積水，然后添加異丙醇中的1當(dāng)量5.5N HCl以得到白色沉淀來獲得HCl鹽。將固體進(jìn)行過濾并且用異丙醇(2體積)洗滌，然后在真空中干燥以得到ER-899464.HCl(20.3g,47.2mmol,81.5％)。

以與ER-899464相似的方式制備ER-899477(78mg,0.196mmol,58.3％收率)，其中以38(100mg,0.336mmol)和(3S,4R)-叔丁基3-氨基-4-氟哌啶-1-甲酸酯(220mg,1.009mmol)起始。

以與ER-899464相似的方式制備ER-897968(475mg,1.252mmol,37.2％收率)，其中以38(1.00g,3.364mmol)和(R)-叔丁基3-氨基哌啶-1-甲酸酯(2.021g,10.091mmol)起始。

以與ER-899464相似的方式制備ER-899018(370mg,0.975mmol,58.0％收率)，其中以38(500mg,1.682mmol)和(氮雜環(huán)丁烷-3-基甲基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(500mg,2.497mmol)起始。

以與ER-899464相似的方式制備ER-899819(62mg,0.158mmol,31.3％收率)，其中以38(150mg,0.505mmol)和3-氨基氮雜環(huán)庚烷-1-甲酸叔丁酯(324mg,1.514mmol)起始。

以與ER-899464-HCl相似的方式制備ER-899416-HCl(53mg,0.120mmol,35.7％收率)，其中以38(100mg,0.336mmol)和(1R,3S,5S)-叔丁基3-氨基-8-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛烷-8-甲酸酯(76mg,.336mmol)起始。

以與ER-899464-HCl相似的方式制備ER-899417-HCl(56mg,0.130mmol,38.7％收率)，其中以38(100mg,0.336mmol)和4-氨基氮雜環(huán)庚烷-1-甲酸叔丁酯(144mg,.673mmol)起始。

以與ER-899464-HCl相似的方式制備ER-899285-HCl(52mg,0.108mmol,32.1％收率)，其中以38(100mg,0.336mmol)和4-(4-氨基-1H-吡唑-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(179mg,.673mmol)起始。

以與ER-899464-HCl相似的方式制備ER-899021-HCl(62mg,0.140mmol,41.7％收率)，其中以38(100mg,0.336mmol)和2,6-二氮雜螺[3.5]壬烷-6-甲酸叔丁酯(152mg,.673mmol)起始。

以與ER-899464-HCl相似的方式制備ER-899619-HCl(36mg,0.084mmol,％收率)，其中以38(100mg,0.336mmol)和(S)-叔丁基3-(甲基氨基)哌啶-1-甲酸酯(216mg,1.009mmol)起始。

以與ER-899464-HCl相似的方式制備ER-899616-HCl(21mg,0.049mmol,％收率)，其中以38(100mg,0.336mmol)和(R)-叔丁基3-(甲基氨基)哌啶-1-甲酸酯(216mg,1.009mmol)起始。

以與ER-899464-HCl相似的方式制備ER-898566-HCl(272mg,0.630mmol,37.5％收率)，其中以38(500mg,1.682mmol)和N2,N2,2-三甲基丙烷-1,2-二胺(586mg,5.045mmol)起始。

以與ER-899464-HCl相似的方式制備ER-899618-HCl(4.8mg,0.011mmol,3.2％收率)，其中以38(500mg,1.682mmol)和4-氨基吡啶酰胺(138mg,1.009mmol)起始。

以與ER-899464相似的方式制備ER-899477(78mg,0.196mmol,58.3％收率，作為非對(duì)映體混合物)，其中以38(100mg,0.336mmol)以及(3S,4R)-叔丁基3-氨基-4-氟哌啶-1-甲酸酯和(3R,4S)-叔丁基3-氨基-4-氟哌啶-1-甲酸酯(220mg,1.009mmol)的外消旋混合物起始。

ER-895415作為方案11中化合物41的實(shí)例：在0℃下，向38(1.10g,3.70mmol)在DCM(5mL)中的經(jīng)攪拌的溶液在2min內(nèi)逐滴添加乙二酰氯(1.0mL,11.42mmol)。使得反應(yīng)混合物升溫至室溫并且攪拌1h，此后將反應(yīng)物在真空中濃縮并且干燥。將干燥的漿狀物冷卻至0℃，然后在攪拌下緩慢添加MeOH(5mL)。將完成的反應(yīng)物濃縮至干燥，用DCM(10mL)稀釋，用飽和亞硫酸鈉(3mL)、鹽水(3mL)洗滌，然后經(jīng)Na₂SO₄干燥，過濾并且濃縮至干燥。將粗產(chǎn)物經(jīng)過硅膠(用庚烷中的0％至50％EtOAc梯度洗脫)純化，以在合并所需部分、在真空中濃縮和干燥之后得到ER-895415(894mg,2.81mmol,76％收率)。

根據(jù)方案21制備實(shí)例ER-899332：

方案21

將ER-899472-HCl(49.8mg,.119mmol)和多聚甲醛(8.90mg,.297mmol)在DCM(0.5mL)中的溶液在室溫下攪拌1h。添加三乙酰氧基硼氫化鈉(62.8mg,.297mmol)并且將所得的溶液在室溫下攪拌2天。在去除溶劑之后，將粗產(chǎn)物在二氧化硅(在DCM中的15％MeOH)上進(jìn)行層析以產(chǎn)生ER-899332(8.16mg,0.021mmol,18.3％收率)。

以與ER-899332相似的方式制備ER-899457(50mg,0.117mmol,97％收率)，其中以ER-899336(50mg,0.122mmol)起始。

ER-899836：將ER-899477(76mg,.191mmol)在37％甲醛水溶液(0.5g,16.652mmol)和甲酸(0.5ml,13.036mmol)中的經(jīng)攪拌的溶液升溫至80℃持續(xù)3h，此后將完成的反應(yīng)冷卻至室溫。將混合物與甲苯(每次2mL)共沸四次至干燥，并且將所得的殘余物溶于MeOH(5mL)，然后添加Amberlite IRA400氫氧化物形式(2g)并且攪拌10min。在攪拌下添加額外的Amberlite IRA400直到獲得中性pH，此后將懸浮液進(jìn)行過濾，濃縮以及與甲苯(每次2mL)共沸兩次。然后，將粗制材料經(jīng)過硅膠(Biotage SNAP Ultra,25g,用DCM中的1％-40％MeOH洗脫)純化，以在合并所需部分、在真空中濃縮以及干燥后得到ER-899836(55mg,0.134mmol,69.9％收率)。

將ER-899836(50mg,0.124mmol)溶于乙腈(1mL)，然后添加乙醚中的2M HCl(0.062ml,0.124mmol)并且在室溫下攪拌30min。將所得的橙色溶液濃縮至干燥并且置于高真空下過夜，以得到定量收率的ER-899836-HCl。

以與ER-899836-HCl相似的方式制備ER-899688-HCl(381mg,0.886mmol,88.4％收率)，其中以ER-897968(600mg,1.58mmol)起始。

以與ER-899836-HCl相似的方式制備ER-899820-HCl(45mg,0.110mmol,69.9％收率)，其中以ER-899819(62mg,0.158mmol)起始。

以與ER-899836相似的方式相似地制備ER-899337(35.6mg,0.087mmol,24％收率)，其中以作為游離堿的ER-897968(142mg,0.361mmol)起始。

以與ER-899836相似的方式相似地制備ER-899835(29mg,0.071mmol,81％收率)，其中以作為游離堿的ER-899718(34mg,0.086mmol)起始。

以與ER-899836相似的方式相似地制備ER-899837(35.6mg,0.087mmol,24.2％收率)，其中以作為游離堿的ER-899417(142mg,0.361mmol)起始。

以與ER-899836相似的方式制備ER-898707甲酸鹽(17mg,0.0.36mmol,78％收率)，其中以維持作為甲酸鹽代替轉(zhuǎn)化為如上HCl鹽的ER-898694(20mg,0.046mmol)起始。

通過方案11中的一般結(jié)構(gòu)39或41描述的其它實(shí)例

ER-895472：在-15℃下向38(22.7mg,.076mmol)和TEA(12.8μl,.092mmol)在THF中的冷卻溶液添加氯甲酸乙酯(8.1μl,.084mmol)。在攪拌1.5h后，添加氫氧化銨(6.0μl,.153mmol)，此后在-10℃下再持續(xù)攪拌2h。使反應(yīng)升溫至室溫并且再攪拌2h。通過添加飽和NaHCO₃(5mL)淬滅完成的反應(yīng)，然后將水相用EtOAc(每次5mL)萃取3次。將合并的有機(jī)層經(jīng)無水Na₂SO₄干燥，過濾并且濃縮以產(chǎn)生淡黃色油狀物。將粗產(chǎn)物使用反相HPLC C-18(Water’s X-Bridge C1819x 100mm柱；使用包含0.1％甲酸的乙腈/水的梯度)純化，以得到ER-895472(6.2mg,0.021mmol,27.5％收率)。

ER-899122：在0℃下，向38(80mg,.24mmol)和4-甲基嗎啉(32μl,.288mmol)在THF(4mL)中的冷卻溶液添加氯甲酸異丙酯(38μl,.084mmol)。在攪拌30min后，添加四氫-吡喃-4-基胺(29.1mg,.288mmol)，此后在-10℃下再持續(xù)攪拌2h。使反應(yīng)升溫至室溫并且再攪拌16h。通過添加飽和NaHCO₃(5mL)淬滅完成的反應(yīng)，然后將水相用EtOAc(每次5mL)萃取3次。將合并的有機(jī)層經(jīng)無水Na₂SO₄干燥，過濾并且濃縮以產(chǎn)生淡黃色油狀物。將粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠(25g)純化，用庚烷中的80％–100％EtOAc的線性梯度洗脫，以在濃縮所需部分至干燥并且將產(chǎn)物置于高真空下后得到ER-899122(40mg,0.100mmol,41.7％收率)。

以與ER-899122相似的方式制備ER-899121(40mg,0.104mmol,43.3％收率)，其中以38(80mg,0.24mmol)和3-氨基甲基-氧雜環(huán)丁烷(25.06mg,.288mmol)起始。

以與ER-899122相似的方式制備ER-899123(40mg,0.109mmol,45.5％收率)，其中以38(80mg,0.24mmol)和3-氨基四氫呋喃(25.06mg,.288mmol)起始。

以與ER-899122相似的方式制備ER-899140(20mg,0.051mmol,21.3％收率)，其中以38(80mg,0.24mmol)和(2-氨基乙基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(50.1mg,.288mmol)起始，之后使用TFA去除Boc基團(tuán)，用如所述的MP碳酸鹽中和。

以與ER-899122相似的方式制備ER-899151(15mg,0.035mmol,14.6％收率)和ER-899152(15mg,0.035mmol,14.6％收率)，其中以38(80mg,0.24mmol)和作為立體異構(gòu)體的混合物的3-氨基-1,1,1-三氟-2-丙醇(37.1mg,.288mmol)起始。使用ER-899122所述的色譜法分離兩種產(chǎn)物。將立體中心任意地指定并且尚未明確確定。

以與ER-899122相似的方式制備ER-899153(32mg,0.083mmol,34.4％收率)，其中以38(80mg,0.24mmol)和甘氨酸甲酯鹽酸鹽(36.1mg,.288mmol)起始。

以與ER-899122相似的方式制備ER-899154(16mg,0.041mmol,17.3％收率)，其中以38(80mg,0.24mmol)和二甲基乙二胺(31.6μl,.288mmol)起始。

以與ER-899122相似的方式制備ER-899159(14mg,0.033mmol,13.8％收率)和ER-899160(13mg,0.031mmol,12.8％收率)，其中以38(80mg,0.24mmol)和作為立體異構(gòu)體的混合物的4-氨基-1,1,1-三氟丁-2-醇鹽酸鹽(51.6mg,.288mmol)起始。使用ER-899122所述的色譜法分離兩種產(chǎn)物。將立體中心任意地指定并且尚未明確確定。

以與ER-899122相似的方式制備ER-899161(13mg,0.031mmol,12.9％收率)，其中以38(80mg,0.24mmol)和作為非對(duì)映體混合物的4,4,4-三氟丁烷-1,3-二胺二鹽酸鹽(61.9mg,.288mmol)起始。

通過將ER-899153(24mg,0.65mmol)溶于MeOH(2mL)和水(0.5mL)，然后添加氫氧化鋰(3.12mg,13.0mmol)來制備ER-899152(9mg,0.024mmol,37.0％收率)。將反應(yīng)在室溫下攪拌16h，此后將完成的反應(yīng)用3N HCl酸化至pH 3，然后用EtOAc(每次10mL)萃取3次，合并有機(jī)層，經(jīng)無水Na₂SO₄干燥，過濾并且濃縮至干燥。將粗產(chǎn)物經(jīng)C-18反相HPLC柱純化，其中用具有0.1％甲酸的10％–90％乙腈水溶液的線性梯度洗脫并且濃縮所需峰，然后在高真空下干燥。

以與ER-899140相似的方式制備ER-899278(20mg,0.051mmol,33.8％收率)，其中以38(50mg,0.15mmol)和(R)-叔丁基2-(氨基甲基)嗎啉-4-甲酸酯(48.6mg,.225mmol)起始。

以與ER-899140相似的方式制備ER-899366(70mg,0.171mmol,42.4％收率)，其中以38(120mg,0.404mmol)和(2S,6R)-叔丁基2-(氨基甲基)-6-甲基嗎啉-4-甲酸酯(112mg,.484mmol)起始。

以與ER-899140相似的方式制備ER-899367(40mg,0.102mmol,38％收率)，其中以38(80mg,0.269mmol)和六氫吡咯并[3,4-c]吡咯-2(1H)-甲酸叔丁酯(68.5mg,.373mmol)起始。

以與ER-899122相似的方式制備ER-899459(30mg,0.074mmol,31.3％收率)，其中以38(70mg,0.235mmol)和N,N-二甲基哌啶-4-胺(36.2mg,.283mmol)起始。

以與ER-899122相似的方式制備ER-899464(20mg,0.051mmol,18.9％收率)，其中以38(80mg,0.269mmol)和1-甲基哌啶-4-胺(36.9mg,.323mmol)起始。

以與ER-899140相似的方式制備ER-899588(40mg,0.105mmol,44.8％收率)，其中以38(70mg,0.235mmol)和哌啶-4-基氨基甲酸叔丁酯(56.6mg,.283mmol)起始。

以與ER-899140相似的方式制備ER-899608(40mg,0.102mmol,37.8％收率)，其中以38(70mg,0.235mmol)和(4-甲基哌啶-4-基)氨基甲酸叔丁酯(63.4mg,.296mmol)起始。

以與ER-899122相似的方式制備ER-899680(40mg,0.098mmol,19.2％收率)，其中以38(100mg,0.336mmol)和1-乙基哌啶-3-胺(43.1mg,.336mmol)起始。

以與ER-899122相似的方式制備ER-899431(53mg,0.103mmol,51.3％收率)，其中以38(99mg,0.333mmol)和甲胺(在THF中為2M)(1.50mL,3.00mmol)起始。

以與ER-899122相似的方式制備ER-899626(29mg,0.071mmol,35.3％收率)，其中以38(60mg,0.202mmol)和4-氨基-1-乙基哌啶(25.9mg,.202mmol)起始。

以與ER-899140相似的方式制備ER-899718(32mg,0.081mmol,40.1％收率)，其中以38(60mg,0.202mmol)和4-氨基-4-甲基哌啶-1-甲酸叔丁酯(47.6mg,.222mmol)起始。

其它實(shí)例：方案11中的一般結(jié)構(gòu)39的調(diào)整：

方案22

ER-899333-HCl：向38(58.2mg,.196mmol)和HBTU(89mg,.235mmol)在DCM(1.94mL)中的經(jīng)攪拌的溶液添加DIEA(137μl,.783mmol)，然后添加(3R,4S)-叔丁基3-氨基-4-氟哌啶-1-甲酸酯(42.7mg,.196mmol)。將反應(yīng)攪拌過夜，此后將完成的反應(yīng)物進(jìn)行濃縮并且用EtOAc(10mL)稀釋。將有機(jī)溶液用2N檸檬酸水溶液、飽和NaHCO₃洗滌，經(jīng)無水Na₂SO₄干燥，過濾并且濃縮至干燥。將粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠(50g，用庚烷中的40％-100％EtOAc洗脫，20個(gè)柱體積)純化，以得到呈淺黃色固體狀的86(58.5mg,0.118mmol,56.2％收率)。

向86(58.8mg,.118mmol)和碘甲烷(7.39μL,.118mmol)在冷卻至0℃的DMF(1mL)中的經(jīng)攪拌的溶液添加NaH(5.20mg,.13mmol，油狀分散體)。將反應(yīng)升溫至室溫并且攪拌3.5h。將完成的反應(yīng)用冰/水浴冷卻，并且通過緩慢添加飽和氯化銨(5mL)進(jìn)行淬滅，隨后添加水(5mL)，以及用EtOAc(每次10mL)萃取兩次。將合并的有機(jī)相經(jīng)無水Na₂SO₄干燥，過濾并且濃縮至干燥。將粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠(25g，用庚烷中的EtOAc的40％-100％梯度洗脫，20個(gè)柱體積)純化，以得到呈淺黃色固體狀的87(42.9mg,0.084mmol,71.0％)。

向87(42.9mg,.084mmol)在EtOAc(1mL)中的經(jīng)攪拌的溶液添加1,4-二噁烷中的4.0N HCl(0.419mL,1.677mmol)，然后在室溫下攪拌1h，此后將完成的反應(yīng)物在真空中濃縮和干燥以得到ER-89933-HCL(23.4mg,0.054mmol,62.3％)。

方案23

ER-8999335：向38(357.2mg,1.201mmol)和HBTU(547mg,1.442mmol)在DCM(10mL)中的經(jīng)攪拌的溶液添加DIEA(0.84mL,4.806mmol)和(氮雜環(huán)丁烷-3-基甲基)氨基甲酸叔丁酯(224mg,1.201mmol)。將反應(yīng)混合物攪拌3h，此后將完成的反應(yīng)物進(jìn)行濃縮，溶于EtOAc(25mL)并且用2N檸檬酸水溶液(20mL)、飽和NaHCO₃(20mL)洗滌，并且經(jīng)無水Na₂SO₄干燥，過濾并且濃縮至干燥。將粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠(40g，用50％-100％EtOAc/庚烷洗脫，20個(gè)柱體積)純化，以得到呈淺黃色固體狀的88(181.6mg,0.390mmol,32.5％收率)。

在0℃下，向88(52.6mg,.113mmol)和碘乙烷(10.50μL,.13mmol)在DMF(1.0mL,12.915mmol)中的經(jīng)攪拌的溶液添加60％氫化鈉(5.87mg,.147mmol)，此后使得反應(yīng)升溫至室溫并且攪拌6h。將完成的反應(yīng)冷卻至0℃，并且通過緩慢添加飽和NH₄Cl(5mL)進(jìn)行淬滅，然后用水(5mL)稀釋并且用EtOAc(每次10mL)萃取兩次。將合并的有機(jī)相經(jīng)無水Na₂SO₄干燥，過濾并且濃縮至干燥。將粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠(25g，用庚烷中的70-100％EtOAc洗脫，20個(gè)柱體積)純化，以得到用于下一步的Boc保護(hù)的中間體。通過將中間體溶于EtOAc(1mL)以及添加TFA(0.5mL)，然后攪拌1h而去除Boc。將完成的反應(yīng)物濃縮至干燥，溶于DCM(10mL)。用飽和NaHCO₃洗滌2次，經(jīng)無水Na₂SO₄干燥，過濾，濃縮并且在高真空下干燥，以得到呈淡黃色固體狀的ER-899335(4.1mg,0.010mmol,9.3％)。

方案24

ER-899336：在0℃下，向ER-899334(35.4mg,.097mmol)和碘甲烷(0.013mL,.213mmol)在DMF(1mL)中的經(jīng)攪拌的溶液添加60％氫化鈉(9.69mg,.242mmol)，此后將反應(yīng)物升溫至室溫并且攪拌過夜。將完成的反應(yīng)冷卻至0℃，并且通過緩慢添加飽和NH₄Cl(5mL)進(jìn)行淬滅，然后用水(5mL)稀釋并且用EtOAc(每次10mL)萃取兩次。將合并的有機(jī)相經(jīng)無水Na₂SO₄干燥，過濾并且濃縮至干燥。將粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠(25g，用庚烷中的70％–100％EtOAc洗脫，20個(gè)柱體積)純化，以在收集所需材料、濃縮以及置于高真空下后得到ER-899336(5.2mg,0.013mmol,13.6％收率)。

方案25

ER-899481：向ER-898946(60mg,.158mmol)在乙腈(10mL)中的經(jīng)攪拌的溶液添加K₂CO₃(87mg,.632mmol)和2-溴乙酰胺(43.6mg,.316mmol)。將反應(yīng)混合物升溫至60℃并且攪拌16h，此后將完成的反應(yīng)物進(jìn)行過濾。將所得的溶液進(jìn)行濃縮，并且將粗產(chǎn)物經(jīng)C-18HPLC柱(用具有0.1％甲酸的10％–50％乙腈水溶液洗脫)純化，以在收集所需材料、濃縮以及置于高真空后得到ER-899481(43mg,0.099mmol,62.3％收率)。

作為方案12中化合物42的實(shí)例的ER-885612：在0℃下，向13(25mg,0.088mmol)在DMF(0.5mL)中的冷卻的、經(jīng)攪拌的溶液添加NaH(3.5mg,0.088mmol,60％油狀分散體)，然后添加碘甲烷(16.5μL,0.265mmol)。將反應(yīng)再攪拌20min，此后緩慢添加水(1mL)。將淬滅的反應(yīng)用DCM(每次2mL)萃取兩次，經(jīng)MgSO₄干燥，過濾并且濃縮至干燥。經(jīng)反相制備型HPLC柱(X-Bridge C18 19x 100mm柱；用包含0.05％TFA的0％-50％乙腈水溶液洗脫)純化，以在合并所需收集的部分、在真空中濃縮以及干燥后得到ER-885612(16.9mg,0.057mmol,64.6％收率)。

以與ER-885612相似的方式制備ER-885807(15.2mg,0.049mmol,55.7％收率)，其中以13(25mg,0.088mmol)和碘乙烷(20.6mg,.132mmol)起始。

以與ER-885612相似的方式制備ER-885808(8.2mg,0.025mmol,28.6％收率)，其中以13(25mg,0.088mmol)和異丙基碘(22.5mg,.132mmol)起始。

以與ER-885612相似的方式制備ER-885892(3.1mg,0.009mmol,10.4％收率)，其中以13(25mg,0.088mmol)和1-碘-2-甲基丙烷(15.2uL,.132mmol)起始。

以與ER-885612相似的方式制備ER-885929(17.5mg,0.048mmol,54.6％收率)，其中以13(25mg,0.088mmol)和1-碘己烷(37.4mg,.176mmol)起始。

以與ER-885612相似的方式制備ER-885930(7.9mg,0.021mmol,23.7％收率)，其中以13(25mg,0.088mmol)和環(huán)己基甲基溴(31.3mg,.177mmol)起始。

以與ER-885612相似的方式制備ER-895324(35.2mg,0.098mmol,54.7％收率)，其中以13(50.6mg,0.179mmol)和2-溴吡啶(20.4μL,.214mmol)起始。使用THF(1mL)代替DMF。

以與ER-893324相似的方式制備ER-895325(54.2mg,0.150mmol,83.8％收率)，其中以13(50.6mg,0.179mmol)和2-溴嘧啶(57mg,.359mmol)起始。

以與ER-893324相似的方式制備ER-894552(5mg,0.014mmol,19.2收率)，其中以13(20.4mg,0.072mmol)和2-氯吡嗪(8.3mg,.0.072mmol)起始。

ER-886137：在干燥的微波反應(yīng)容器中添加DMSO(0.3mL)中的碳酸銫(172.5mg,0.529mmol)、碘化亞銅(I)(33.6mg,0.176mmol)、1,1’-聯(lián)萘-2,2’-二胺(50.2mg,0.177mmol)、2-碘-1,3-二甲基苯(123mg,0.53mmol)，然后添加13(50mg,0.177mmol)。將反應(yīng)混合物在110℃下微波處理12h，此后將混合物直接注入反相制備型HPLC柱(Water’sX-Bridge C18 19x 100mm柱；使用包含0.05％TFA的0％-50％乙腈水溶液的梯度)用于洗脫純化，以得到粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物經(jīng)過硅膠(Biotage，用庚烷中的25％EtOAc至100％EtOAc的梯度洗脫)純化，以在合并所需收集的部分、在真空中濃縮和干燥之后得到ER-886137(12.1mg,0.031mmol,17.6％收率)。

ER-886514：向14(10.5mg,0.024mmol)和碳酸鉀(30mg,0.217mmol)在甲苯(1mL)中的經(jīng)攪拌的懸浮液添加苯酚(24.4mg,0.259mmol)。將反應(yīng)混合物在150℃下微波處理5h，此后將粗制混合物過濾并且直接注入反相制備型HPLC柱(Water’s X-Bridge C18 19x 100mm柱；使用包含0.05％TFA的0％-50％乙腈水溶液的梯度)，以在合并所需收集的部分、在真空中濃縮和干燥之后得到ER-886514(4.5mg,0.013mmol,54.1％收率)。

以與ER-886514相似的方式制備ER-886515(3.2mg,0.009mmol,37.6％收率)，其中以14(10.6mg,0.024mmol)和3-甲基苯酚(28.1mg,0.260mmol)起始。

以與ER-886514相似的方式制備ER-886516(4.7mg,0.013mmol,52.4％收率)，其中以14(10.6mg,0.024mmol)和4-甲基苯酚(28.1mg,0.260mmol)起始。

以與ER-886514相似的方式制備ER-886605(7.9mg,0.020mmol,85.1％收率)，其中以14(10.3mg,0.024mmol)和3,4-二氟苯酚(20mg,0.154mmol)起始。在此制備中，使用1-甲基吡咯烷酮(1mL)代替甲苯。

以與ER-886605相似的方式制備ER-886606(7.2mg,0.019mmol,81.2％收率)，其中以14(10.3mg,0.024mmol)和3-氟苯酚(13.2mg,0.118mmol)起始。

以與ER-886605相似的方式制備ER-886624(5.1mg,0.014mmol,59％收率)，其中以14(10mg,0.023mmol)和2-氟苯酚(10mg,0.089mmol)起始。

以與ER-886605相似的方式制備ER-886786(8.2mg,0.022mmol,76.9％收率)，其中以14(12.5mg,0.029mmol)和2-甲基苯酚(28.1mg,0.260mmol)起始。

使用化合物13或ER-885493作為原料的其它實(shí)例：

ER-885621：在N₂氣氛下，向雙(2-甲氧基乙基)氨基三氟化硫(24.4μL,0.132mmol)在冷卻至-78℃的DCM(0.1mL)中的經(jīng)攪拌的溶液添加DCM(0.1mL)中的13(25mg,0.088mmol)。使得反應(yīng)混合物升溫至-50℃并且攪拌0.5h，升溫至0℃并且攪拌1.5h。將反應(yīng)混合物升溫至5℃并且攪拌2h，此后逐滴添加飽和NaHCO₃水溶液，直到達(dá)到pH 10。分離各層并且將有機(jī)層用水(1mL)洗滌兩次，經(jīng)MgSO₄干燥，過濾并濃縮至干燥。經(jīng)反相制備型HPLC柱純化，其中用0％-50％乙腈水溶液洗脫，以在合并所需收集的部分、在真空中濃縮并且干燥后得到ER-885621(12.5mg,0.044mmol,49.8％收率)。

ER-885906：將13(85.5mg,0.302mmol)在亞硫酰氯(2mL)中的經(jīng)攪拌的溶液升溫至85℃持續(xù)24h，此后去除過量的亞硫酰氯并且將粗產(chǎn)物經(jīng)反相制備型HPLC純化，其中用0％-50％乙腈水溶液洗脫，在合并所需收集的部分、在真空中濃縮并且干燥后得到ER-885906(4.3mg,0.014mmol,4.7％收率)。

作為方案13中的化合物44的實(shí)例的ER-886431和ER-886480的制備

化合物43或ER-886250：在0℃下于氮?dú)鈿夥罩?，?3(200mg,0.706mmol)在DCM(5mL)和吡啶(0.114mL,1.4mmol)中的經(jīng)攪拌的溶液添加戴斯馬丁氧化劑(Dess-Martin periodinane)(359mg,0.846mmol)，此后將反應(yīng)物升溫至室溫并且攪拌1h。發(fā)現(xiàn)反應(yīng)進(jìn)行的不完全，因此添加額外的戴斯馬丁氧化劑(359mg,0.846mmol)和吡啶(0.114mL,1.4mmol)，然后再攪拌30min。將完成的反應(yīng)物傾入具有10％硫代硫酸鈉水溶液(2mL)的飽和NaHCO₃水溶液(4mL)中。將混合物攪拌30min，此后將混合物用DCM(每次4mL)萃取三次。用鹽水(4mL)洗滌合并的有機(jī)層，經(jīng)Na₂SO₄干燥，過濾并且濃縮。將粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠(Biotage SP4,25g，用庚烷中的10％至100％EtOAc洗脫)純化，以在合并所需部分、在真空中濃縮和干燥之后，得到呈黃色漿狀物的5-((2R,6R)-2-甲?；?6-甲基嗎啉代)喹啉-8-甲腈43或ER-886250(110mg,0.391mmol,55.4％收率)。

在0℃下，在氮?dú)鈿夥罩邢?3(25mg,0.089mmol)在THF(0.5mL)中的經(jīng)攪拌的溶液在2min內(nèi)逐滴添加THF中的1M乙烯基溴化鎂(0.098mL,0.098mmol)。將反應(yīng)在0℃下攪拌2h，此后緩慢添加飽和氯化銨(0.5mL)，然后添加水(0.25mL)。將淬滅的反應(yīng)升溫至室溫，再攪拌10min，并且用EtOAc(每次2mL)萃取兩次。用鹽水(1mL)洗滌合并的有機(jī)層，經(jīng)Na₂SO₄干燥，過濾并且濃縮。將粗產(chǎn)物在制備型TLC板(Merck Silica Gel 60F254,2 20x 20cm板，用EtOAc洗脫)上純化，以在所需部分與硅膠分離洗脫、在真空中濃縮以及干燥后，得到呈黃色漿狀物的ER-886431(3mg,0.010mmol,11.2％收率,Rf＝0.75,EtOAc)和ER-886480(3mg,0.0.10mmol,11.2％收率,Rf＝0.80.EtOAc)。任意指定兩種實(shí)例的游離的醇官能團(tuán)的立體化學(xué)。

以與ER-886431和ER-886480相似的方式制備ER-886530(11mg,0.032mmol,36.4％收率，Rf＝0.80,EtOAc)和ER-886531(3mg,0.0.10mmol,11.2％收率，Rf＝0.75,EtOAc)，其中以43(25mg,0.089mmol)和THF中的2M丁基氯化鎂(0.131mL,0.262mmol)起始。將粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠(Biotage SP4,25g，用庚烷中的20％–100％EtOAc洗脫)純化。任意指定兩種實(shí)例的游離的醇官能團(tuán)的立體化學(xué)。

以與ER-886530和ER-886531相似的方式制備ER-886532(4mg,0.011mmol,6.3％收率，Rf＝0.80,EtOAc)和ER-886533(4mg,0.011mmol,6.3％收率，Rf＝0.75,EtOAc)，其中以43(49mg,0.174mmol)和THF中的1.3M環(huán)己基氯化鎂(0.20mL,0.260mmol)起始。任意指定兩種實(shí)例的游離的醇官能團(tuán)的立體化學(xué)。

以與ER-886530和ER-886531相似的方式制備ER-886567(3.6mg,0.009mmol,5.3％收率，Rf＝0.80,EtOAc)和ER-886568(8.6mg,0.022mmol,12.8％收率，Rf＝0.75,EtOAc)，其中以43(49mg,0.174mmol)和THF中的1M苯乙基氯化鎂(0.26mL,0.260mmol)起始。任意指定兩種實(shí)例的游離的醇官能團(tuán)的立體化學(xué)。

以與ER-886530和ER-886531相似的方式制備ER-886520(26mg,0.084mmol,49.1％收率，Rf＝0.80,EtOAc)，其中以43(48mg,0.171mmol)和THF中的2M乙基氯化鎂(0.128mL,0.256mmol)起始。將非對(duì)映體混合物用于額外的研究。

經(jīng)由方案26的ER-886564和ER-886565

方案26

向22(2.51g,7.8mmol)在EtOH(40mL)中的經(jīng)攪拌的溶液添加50％水中的10％鈀活性碳(1.66g)，然后用氫氣對(duì)燒瓶進(jìn)行幾次充氣。在氫氣氣氛(氣球壓力)下將反應(yīng)維持在40℃并且攪拌16h，此后將反應(yīng)物用氮?dú)獯祾邘状?，同時(shí)在吹掃間隔用真空清掃抽空系統(tǒng)。將完成的反應(yīng)物經(jīng)硅藻土545過濾，將濾墊用EtOH(每次85mL)洗滌兩次，然后在真空中濃縮并且干燥合并濾液的濃縮物。將粗產(chǎn)物(2R,6R)-叔丁基2-(羥甲基)-6-甲基嗎啉-4-甲酸酯89(1.56g,6.7mmol,86.5％收率)未經(jīng)進(jìn)一步純化用于下一步。

在0℃下，在氮?dú)鈿夥罩邢?9(1.501g,6.5mmol)在DCM(30mL)和吡啶(1.05mL,13.0mmol)中的經(jīng)攪拌的溶液添加戴斯馬丁氧化劑(3.3g,7.8mmol)，此后將反應(yīng)物升溫至室溫并且攪拌1h。發(fā)現(xiàn)反應(yīng)進(jìn)行的不完全，因此添加額外的戴斯馬丁氧化劑(1.4g,3.3mmol)和吡啶(0.52mL,6.4mmol)，然后再攪拌2h。將完成的反應(yīng)物傾入具有10％硫代硫酸鈉水溶液(18mL)的飽和NaHCO₃水溶液(37mL)中。將混合物攪拌30min，此后將混合物用DCM(每次40mL)萃取三次。用鹽水(37mL)洗滌合并的有機(jī)層，經(jīng)Na₂SO₄干燥，過濾并且濃縮。將粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠(Biotage 40+S,40g，用庚烷中的10％-100％EtOAc洗脫)純化，以在合并所需部分、在真空中濃縮和干燥之后，得到呈無色漿狀物的(2R,6R)-叔丁基2-甲?；?6-甲基嗎啉-4-甲酸酯90(1.285g,5.6mmol,86.2％收率)。

在0℃下，在氮?dú)鈿夥罩邢?0(208mg,0.907mmol)在THF(5mL)中的經(jīng)攪拌的溶液在2min內(nèi)逐滴添加THF中的1M芐基溴化鎂(2.3mL,2.3mmol)。將反應(yīng)在0℃下攪拌2.5h，此后緩慢添加飽和氯化銨(4.8mL)，然后添加水(2.5mL)。將淬滅的反應(yīng)升溫至室溫，再攪拌10min，并且用EtOAc(每次20mL)萃取兩次。用鹽水(9.5mL)洗滌合并的有機(jī)層，經(jīng)Na₂SO₄干燥，過濾并濃縮。將粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠(BiotageSP4,25g，用庚烷中的25％–100％EtOAc洗脫)純化，以在合并所需部分、在真空中濃縮并且干燥后得到呈無色油狀的(2R,6R)-叔丁基2-((R,S)-1-羥基-2-苯基乙基)-6-甲基嗎啉-4-甲酸酯91(172mg,0.539mmol,59.4％收率，R＝-CH₂C₆H₅)。

向91(172mg,0.539mmol)在DCM(1.2mL)中的經(jīng)攪拌的溶液添加TFA(1.2mL)。將反應(yīng)物在室溫下攪拌30min，此后將完成的反應(yīng)物用甲苯(4.6mL)稀釋，濃縮并且與甲苯(每次4.6mL)共沸兩次至干燥以進(jìn)行干燥，以得到未經(jīng)進(jìn)一步純化作為TFA鹽的1-((2R,6R)-6-甲基嗎啉-2-基)-2-苯基乙醇92(179mg,0.534mmol,99.0％收率，R＝-CH₂C₆H₅)。

將粗制的92(179mg,0.534mmol)溶于N-甲基吡咯烷酮(3mL)，然后將3(187mg,0.802mmol)和DIPEA(0.2mL,1.1mmol)溶于其中。將混合物在170℃下微波處理5h，此后將冷卻的混合物直接注入C-18反相制備型HPLC柱，其中用具有0.1％TFA的10％-60％乙腈水溶液洗脫。將兩種洗脫的部分分別濃縮至干燥，與MeOH(每次5mL)共沸兩次。將各個(gè)異構(gòu)體溶于MeOH(2mL)并且經(jīng)過硅膠(硅膠-CO₂)的堿性塞，其中用MeOH(每次2mL)洗脫兩次，然后在真空中濃縮和干燥以分別得到93或ER-886564(19mg,0.051mmol,9.5％收率，第一部分，R＝-CH₂C₆H₅)以及94或ER-886565(23mg,0.062mmol,11.5％收率，第二部分，R＝-CH₂C₆H₅)。任意指定醇位置的立體化學(xué)。

以與ER-886564和ER-886564相似的方式制備ER-895200(22.2mg,0.075mmol,32.1％收率，第一部分)和ER-895310(15.2mg,0.051mmol,21.8％收率，第二部分)，其中以3(54.6mg,0.234mmol)和1-((2R,6R)-6-甲基嗎啉-2-基)乙醇(68.2mg,0.470mmol)起始。任意指定醇位置的立體化學(xué)。

ER-895326：向ER-895200(17.9mg,0.060mmol)在THF(0.3mL)中的經(jīng)攪拌的溶液添加氫化鈉(4.8mg,0.120mmol,60％油狀分散體)，然后添加2-溴嘧啶(19mg,0.120mmol)。將反應(yīng)升溫至60℃并且攪拌30min，此后將其冷卻至室溫并且通過逐滴添加水(0.5mL)來緩慢淬滅。將混合物用DCM(每次3mL)萃取三次，并且用鹽水(3mL)洗滌合并的有機(jī)層，經(jīng)Na₂SO₄干燥，過濾并且濃縮至干燥。將粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠(Biotage，用庚烷中的0％–10％EtOAc的梯度洗脫)純化，以在收集所需的部分、在真空中濃縮和干燥之后得到ER-895326(20.3mg,0.054mmol,90.1％收率)。

以與ER-895326相似的方式制備ER-895327(6.4mg,0.017mmol,63％收率)，其中以ER-895310(7.9mg,0.027mmol)和2-溴嘧啶(8mg,0.0.50mmol)起始。

ER-895412：在-40℃下，向1.6M正丁基鋰在THF中的經(jīng)攪拌的溶液(1.36mL,2.18mmol)逐滴添加乙醚(2mL)中的2-溴吡啶(0.21mL,2.20mmol)，然后在-40℃下攪拌30min。在3min內(nèi)逐滴添加THF(2mL)中的90(500mg,2.18mmol)，此后將反應(yīng)混合物在-40℃下攪拌2h，并且然后在0℃下攪拌1h。將完成的反應(yīng)物用飽和氯化銨水溶液(2mL)緩慢淬滅，然后升溫至室溫，分離各層并且將水層用EtOAc(每次2mL)萃取兩次。用鹽水(2mL)洗滌合并的有機(jī)層，經(jīng)Na₂SO₄干燥，過濾并且濃縮至干燥。將粗產(chǎn)物首先經(jīng)過硅膠(Biotage，用庚烷中的30％EtOAc洗脫)純化，然后從3:1的DCM:MeOH中結(jié)晶以在過濾以及在真空中干燥后得到(2R,6R)-叔丁基2-((S)-羥基(吡啶-2-基)甲基)-6-甲基嗎啉-4-甲酸酯(150mg,0.486mmol,22.3％收率)。

向(2R,6R)-叔丁基2-((S)-羥基(吡啶-2-基)甲基)-6-甲基嗎啉-4-甲酸酯(150mg,0.486mmol)在DCM(5mL)中的經(jīng)攪拌的溶液添加TFA(1mL)，然后在室溫下攪拌1h。將完成的反應(yīng)物進(jìn)行濃縮并且與甲苯(每次5mL)共沸三次至干燥，然后用DCM(10ml)稀釋，用飽和NaHCO₃水溶液(2mL)、鹽水(2mL)洗滌兩次，經(jīng)MgSO₄干燥，過濾并且在真空中濃縮以及干燥，以得到粗制的(S)-((2R,6R)-6-甲基嗎啉-2-基)(吡啶-2-基)甲醇(97.8mg,0.469,96.4％收率)。

向(S)-((2R,6R)-6-甲基嗎啉-2-基)(吡啶-2-基)甲醇(97.8mg,0.469mmol)和化合物3(54.6mg,0.234mmol)在DMAC(1mL)中的經(jīng)攪拌的溶液添加TEA(0.132mL,0.947mmol)。將反應(yīng)在105℃下微波處理3h，此后將冷卻的反應(yīng)物經(jīng)反相制備型HPLC柱(Water’s X-Bridge C1819x 100mm柱；使用包含0.1％甲酸的0％-50％乙腈水溶液的梯度)直接純化，以在合并所需收集的部分、在真空中濃縮和干燥后得到ER-895296(15.2mg,0.042mmol,18.0％收率，R＝2-吡啶基)。

作為方案13中的化合物45的實(shí)例的ER-886625的制備

在0℃下，在氮?dú)鈿夥罩邢駿R-886520(19mg,0.061mmol)在DCM(0.5mL)和吡啶(0.010mL,0124mmol)中的經(jīng)攪拌的溶液添加戴斯馬丁氧化劑(31.1mg,0.073mmol)，此后將反應(yīng)升溫至室溫并且攪拌1h。發(fā)現(xiàn)反應(yīng)進(jìn)行的不完全，因此添加額外的戴斯馬丁氧化劑(31.1mg,0.073mmol)和吡啶(0.010mL,0124mmol)，然后再攪拌30min。將完成的反應(yīng)物傾入具有10％硫代硫酸鈉水溶液(0.2mL)的飽和NaHCO₃水溶液(0.4mL)中。將混合物攪拌30min，此后將混合物用DCM(每次0.3mL)萃取三次。用鹽水(0.35mL)洗滌合并的有機(jī)層，經(jīng)Na₂SO₄干燥，過濾并且濃縮。將粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠(Biotage SP4,25g，用庚烷中的10％-80％EtOAc洗脫)純化，以在合并所需部分、在真空中濃縮和干燥之后，得到呈黃色固體狀的45或ER-886625(7mg,0.023mmol,37.1％收率)。

以與ER-886625相似的方式制備ER-886626(10.8mg,0.030mmol,90.9％收率)，其中以ER-886532和ER-886533(12mg,0.033mmol)的混合物起始。

以與ER-886625相似的方式制備ER-886629(6.6mg,0.017mmol,81％收率)，其中以ER-886567和ER-886568(8mg,0.021mmol)的混合物起始。

ER-886912和ER-886913的制備：

在室溫下向ER-886568(124mg,0.32mmol)在DCM(1.3mL)中的經(jīng)攪拌的溶液添加甲磺酰氯(37μL,0.478mmol)，然后添加DMAP(7.8mg,0.064mmol)和DIPEA(0.17mL,0.959mmol)。將反應(yīng)在室溫下攪拌2h，此后添加水(1mL)和DCM(5mL)，然后再攪拌5min并且分離各層。用鹽水(1mL)洗滌有機(jī)層，經(jīng)Na₂SO₄干燥，過濾并且濃縮。將粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠(Biotage SP4,25g，用庚烷中的20％-100％EtOAc洗脫)純化，以在合并所需部分、在真空中濃縮和干燥之后，得到呈黃色固體狀的(R)-1-((2R,6R)-4-(8-氰基喹啉-5-基)-6-甲基嗎啉-2-基)-3-苯基丙基甲烷-磺酸酯(136mg,0.292mmol,93.5％收率)。

將(R)-1-((2R,6R)-4-(8-氰基喹啉-5-基)-6-甲基嗎啉-2-基)-3-苯基丙基甲磺酸鹽(38mg,0.082mmol)在NMP(2mL)和吡咯烷(0.10mL,1.21mmol)中的溶液在150℃下微波處理15min，然后冷卻，過濾并且直接注入C-18HPLC(Water’s X-Bridge C18 19x 100mm柱；使用包含0.05％TFA的0％-50％乙腈水溶液的梯度)。將ER-886912和ER-886913分別濃縮至干燥，溶于MeOH(3mL)并且經(jīng)碳酸鹽浸漬的硅膠柱(Biotage Isolute SPE,Si-CO₃,1g)洗脫，用MeOH(3mL)洗滌，在真空中濃縮以及干燥以得到作為第一洗脫峰的ER-886912(1.4mg,0.003mmol,3.9％收率)和作為第二洗脫的ER-886913(0.6mg,0.001mmol,1.5％收率)。任意指定兩種實(shí)例的胺的官能團(tuán)的立體化學(xué)。

ER-886131的制備：經(jīng)由方案27的方案7的修改：

方案27

將可商購的(S)-2-丙基環(huán)氧乙烷95(3.0g,34.8mmol,R＝乙基)在氫氧化銨(100mL)中的經(jīng)攪拌的溶液進(jìn)行密封并且攪拌24h，然后與甲苯(每次100mL)共沸三次至干燥。將粗制的無色產(chǎn)物(S)-1-氨基戊-2-醇96(R＝乙基)未經(jīng)純化用于下一反應(yīng)。

向粗制的96(0.987mg,9.57mmol)在EtOH(20mL)中的經(jīng)攪拌的溶液添加(S)-甲基2-氯丙酸酯97(1.568g,11.5mmol,R’＝甲基)，然后升溫至70℃并且攪拌24h。將完成的反應(yīng)物冷卻至室溫，濃縮至干燥并且將殘余物溶于EtOAc(20mL)。將有機(jī)溶液用1N HCl水溶液(每次5mL)、鹽水(5mL)洗滌三次，經(jīng)MgSO₄干燥，過濾并且濃縮至干燥。將粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠(Biotage，用庚烷中的20％–100％EtOAc的梯度洗脫)純化，以得到(S)-2-氯-N-((S)-2-羥基戊基)丙酰胺98(0.356g,1.839mmol,19.2％收率，R＝乙基；R’＝甲基)。

在0℃下向98(0.356g,1.839mmol)在THF(22mL)中的經(jīng)攪拌的溶液添加氫化鈉(294.2mg,7.277mmol,60％油狀分散體)。將反應(yīng)在0℃下攪拌30min，然后升溫至室溫并且再攪拌5h。將完成的反應(yīng)用IPA(1mL)緩慢淬滅，然后添加H+形式的Dowex 50，直到所示為中性pH。將懸浮液進(jìn)行過濾并且用IPA(每次5mL)洗滌兩次。將濾液進(jìn)行濃縮，然后經(jīng)硅膠(Biotage 25g，用EtOAc洗脫)純化。在收集所需部分、在真空中濃縮和干燥后，獲得順式與反式之比為2:1的(2S,6S)-2-甲基-6-丙基嗎啉-3-酮和(2R,6S)-2-甲基-6-丙基嗎啉-3-酮99(168.2mg,1.07mmol,58.2％收率，R＝乙基；R’＝甲基)的混合物。

在室溫下向99(168.2mg,1.07mmol)在THF(0.8mL)中的經(jīng)攪拌的溶液在2min內(nèi)逐滴添加1M四氫鋁酸鋰(1mL,1mmol)。將反應(yīng)再攪拌2.5h，此后將完成的反應(yīng)冷卻至0℃，然后添加水(0.43mL)和1M氫氧化鈉水溶液(0.03mL)，然后攪拌30min。將所得的沉淀經(jīng)硅藻土454過濾并且用EtOAc(2mL)、DCM(2mL)和乙醚(2mL)洗脫。將合并的濾液在真空中濃縮并且干燥，以得到粗制的(2R,S；6S)-2-甲基-6-丙基嗎啉100(R＝乙基；R’＝甲基)，其將直接用于下一反應(yīng)。

將粗制的100溶于NMP(150mL)，然后將3(150mg,0.636mmol)和DIPEA(0.2mL,1.1mmol)溶于其中。將混合物在145℃下微波處理7h，此后將冷卻的混合物直接注入C-18反相制備型HPLC柱，其中用具有0.1％TFA的10％-60％乙腈水溶液洗脫。將兩種洗脫的部分分別濃縮至干燥，與MeOH(每次5mL)共沸兩次。將各個(gè)異構(gòu)體溶于MeOH(2mL)并且經(jīng)過硅膠(硅膠-CO₂)的堿性塞，其中用MeOH(每次2mL)洗脫兩次，然后在真空中濃縮和干燥以分別得到ER-886131(101)(64.2mg,0.217mmol,34.2％收率，順式異構(gòu)體，R＝乙基，R’＝甲基)和ER-886132(102)(25.2mg,0.85mmol,13.4％收率，反式異構(gòu)體，R＝乙基；R’＝甲基)。

以與ER-886131相似的方式制備ER-886212(315.2mg,0.975mmol,8.5％總收率)，其中以可商購的(S)-1-氨基庚-2-醇90(3.08g,23.5mmol,R＝正丁基)和(S)-甲基2-氯丙酸酯97(1.568g,11.5mmol,R’＝甲基)起始。

使用方案28的101的可選實(shí)例：

方案28

ER-886211的制備：

在氮?dú)鈿夥障?，?-乙基環(huán)氧乙烷103(621mg,8.61mmol,R＝乙基)在DCM(60mL)中的經(jīng)攪拌的溶液添加芐胺(996mg,9.30mmol)，然后添加三氟甲磺酸鈧(341mg,0.693mmol)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌20h，此后將完成的反應(yīng)用飽和NaHCO₃(20mL)淬滅，用DCM(每次10mL)萃取三次，并且將合并的有機(jī)層經(jīng)MgSO₄干燥，過濾并且濃縮至干燥。將粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠(Biotage 25g，用比率為10:10:0.1的庚烷:EtOAc:TEA洗脫)純化，以在真空中濃縮合并的所需部分并且干燥后得到1,1’-(芐基脲二基)雙(丁-2-醇)104(658mg,2.628mmol,30.4％收率，R＝乙基)。

向104(584mg,2.323mmol)在水(0.3mL)中的經(jīng)攪拌的溶液在5min內(nèi)緩慢添加濃硫酸(2mL)，此后將反應(yīng)在150℃下加熱2h。將完成的反應(yīng)冷卻至室溫并且在攪拌下緩慢傾入飽和NaHCO₃(20mL)。將混合物用DCM(每次10mL)萃取兩次，并且用水(5mL)、鹽水(5mL)洗滌合并的有機(jī)層，經(jīng)MgSO₄干燥，過濾并且濃縮至干燥。將粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠(Biotage 25g，以比率為2:1的庚烷:EtOAc洗脫)純化，以在真空中分別濃縮合并的所需部分并且干燥后，得到(3S,5R)-1-芐基-3,5-二乙基哌啶105(234.2mg,1.003mmol,43.2％收率,R＝乙基)和(3R,5R)-1-芐基-3,5-二乙基哌啶106(190.2mg,0.815mmol,35.1％收率，R＝乙基)。

向105(107.1mg,0.462mmol)在MeOH(5mL)中的經(jīng)攪拌的溶液添加5％鈀活性碳(250mg)，然后用氫氣對(duì)燒瓶進(jìn)行幾次充氣。在氫氣氣氛(氣球壓力)下將反應(yīng)維持在室溫并且攪拌12h，此后將反應(yīng)物用氮?dú)獯祾邘状?，同時(shí)在吹掃間隔用真空清掃抽空系統(tǒng)。將完成的反應(yīng)物經(jīng)硅藻土545過濾，將濾墊用MeOH(每次2mL)洗滌兩次，然后在真空中濃縮并且干燥合并濾液的濃縮物。將粗產(chǎn)物(3S,5R)-3,5-二乙基哌啶107(0.066g,0.462mmol,99.9％收率，R＝乙基)未經(jīng)純化用于下一步。

向107(0.066g,0.462mmol,R＝乙基)在NMP(2mL)中的經(jīng)攪拌的溶液添加DIPEA(0.13mL,0.728mmol)和3(86.3mg,0.370mmol)。將反應(yīng)混合物在150℃下微波處理1h，此后將其經(jīng)反相制備型HPLC柱(Water’s X-Bridge C18 19x 100mm柱；使用包含0.05％TFA的0％-50％乙腈水溶液的梯度)直接純化，以在合并所需收集的部分、在真空中濃縮和干燥后得到101或ER-886211(45.2mg,0.153mmol,41.4％收率，R＝乙基)的類似物。

其它實(shí)例：

ER-885113：在室溫下，在氮?dú)鈿夥罩?，?-(二叔丁基膦基)聯(lián)苯基(20mg,0.067mmol)和三(二亞芐基丙酮)二鈀(0)(20mg,0.022mmol)在甲苯(0.8mL)中的經(jīng)攪拌的溶液添加可商購的5-溴-8-甲氧基喹啉(201mg,0.844mmol)、叔丁醇鈉(122mg,1.27mmol)和順式-2,6-二甲基嗎啉(125mg,1.085mmol)，然后添加甲苯(0.8mL)。將反應(yīng)混合物升溫至回流并且攪拌3h，此后將完成的反應(yīng)冷卻至室溫，然后添加水(5mL)。將所得的混合物用EtOAc(每次5mL)萃取兩次，并且用鹽水(2mL)洗滌合并的有機(jī)層，經(jīng)Na₂SO₄干燥，過濾并且濃縮至干燥。將粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠(Biotage SP4，25+S，用庚烷中的12％–100％EtOAc洗脫)純化兩次，以在收集所需的部分、在真空中濃縮和干燥之后得到ER-885113(49mg,0.180mmol,21.3％收率)。

以與ER-885113相似的方式制備ER-887960(13.7mg,0.049mmol,23.5％收率)，其中以5-溴-8-氯-1,7-萘啶(51mg,0.210mmol)和順式-2,6-二甲基嗎啉(31.4mg,0.273mmol)起始。

ER-886133和ER-886134：將(S)-2-((芐氧基)甲基)環(huán)氧乙烷(65g,0.396mol)和28％NH₄OH在水中的溶液在室溫下攪拌14h，此后將完成的反應(yīng)進(jìn)行濃縮并且與甲苯(每次150mL)共沸兩次，以獲得呈粗制白色固體狀的(S)-1-氨基-3-(芐氧基)丙-2-醇(70.6g,0.390mol,98％收率)。

向粗制的(S)-1-氨基-3-(芐氧基)丙-2-醇(54.4g,0.300mol)在乙醇(400mL)中的經(jīng)攪拌的溶液在30min內(nèi)逐滴添加(R)-(+)-2-氯丙酸甲酯(40.44g,0.330mol)。將反應(yīng)加熱至75℃并且攪拌16h，此后將完成的反應(yīng)物濃縮至干燥。將粗制混合物用EtOAc(200mL)稀釋，用1NHCl水溶液(100mL)、鹽水(100mL)洗滌，經(jīng)Na₂SO₄干燥，過濾并且濃縮至干燥。將粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠(Biotage，用庚烷中的30％–80％EtOAc的線性梯度洗脫)純化，以在合并所需部分、在真空中濃縮和干燥之后得到(R)-N-((R)-1-(芐氧基)丙-2-基)-2-氯丙酰胺(65.7g,0.239mol,79.7％收率)。

在0℃下向(R)-N-((R)-1-(芐氧基)丙-2-基)-2-氯丙酰胺(8.8g,0.032mol)在THF(440mL)中的冷卻的經(jīng)攪拌的溶液在10min內(nèi)分批添加NaH(5.181g,0.130mol，作為60％油狀分散體)。將反應(yīng)混合物在0℃下攪拌，然后使其緩慢升溫至室溫并且再攪拌6h。將完成的反應(yīng)用IPA(20mL)緩慢淬滅，然后添加Dowex 50(H+樹脂)(30g)，然后攪拌直到取得酸性pH。將淬滅的懸浮液進(jìn)行過濾，用EtOAc(50mL)洗滌并且濃縮至干燥。將粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠(200g，用庚烷中的30％-50％梯度的EtOAc洗脫)純化，以在合并所需部分、在真空中濃縮和干燥之后，得到(2S,6S)-6-((芐氧基)甲基)-2-甲基嗎啉-3-酮(6.12g,0.026mol,81.3％收率)。

在室溫下，在氮?dú)鈿夥罩邢?2S,6S)-6-((芐氧基)甲基)-2-甲基嗎啉-3-酮(6.12g,0.026mol)在THF(20mL)中的經(jīng)攪拌的溶液在15min內(nèi)逐滴添加THF(30mL,0.030mol)中的1M四氫鋁酸鹽。將反應(yīng)混合物攪拌2.5h，此后將其冷卻至0℃，然后緩慢添加水(13mL)，并且然后添加1N NaOH水溶液(0.9mL)。將淬滅的反應(yīng)進(jìn)行攪拌，直到沉淀變成顆粒狀，此后添加硅藻土545(10g)，然后經(jīng)硅藻土墊過濾并且用DCM(30mL)和乙醚(30mL)沖洗三次。將合并的濾液進(jìn)行濃縮并且經(jīng)硅膠(Biotage，用DCM中的0％–5％MeOH的梯度洗脫)純化，以在合并所需部分、在真空中濃縮和干燥之后得到(2S,6S)-2-((芐氧基)甲基)-6-甲基嗎啉(2.7g,0.012mol,46.2％收率)。

向(2S,6S)-2-((芐氧基)甲基)-6-甲基嗎啉(2.7g,0.012mol)在DCM(50mL)中的經(jīng)攪拌的溶液添加二碳酸二叔丁酯(6.807g,0.031mol)，然后添加TEA(4.35mL,0.031mol)和DMAP(100mg,0.82mmol)。將反應(yīng)在室溫下攪拌3h，此后用0.1N HCl(50mL)和鹽水(50mL)洗滌完成的反應(yīng)物。將有機(jī)相進(jìn)行濃縮，然后經(jīng)硅膠(Biotage，用庚烷中的10％–20梯度的EtOAc洗脫)純化，以在合并所需部分、在真空中濃縮和干燥之后獲得(2S,6S)-叔丁基2-((芐氧基)甲基)-6-甲基嗎啉-4-甲酸酯(3.68g,11.4mmol,95.4％收率)。

向(2S,6S)-叔丁基2-((芐氧基)甲基)-6-甲基嗎啉-4-甲酸酯(3.102g,9.7mmol)在乙醇(15mL)中的經(jīng)攪拌的溶液添加5％鈀碳(300mg)，然后抽真空并且用氫氣對(duì)反應(yīng)容器進(jìn)行三次充氣。在維持氫氣氣氛(氣球壓力)下將反應(yīng)加熱至40℃并且攪拌過夜，此后將反應(yīng)物用氮?dú)獯祾邘状?，同時(shí)在吹掃間隔用真空清掃抽空系統(tǒng)。將完成的反應(yīng)物經(jīng)硅藻土545過濾，將濾墊用乙醇(每次10mL)洗滌兩次，然后在真空中濃縮并且干燥合并濾液的濃縮物。將粗產(chǎn)物(2S,6S)-叔丁基2-(羥甲基)-6-甲基嗎啉-4-甲酸酯(2.15g,9.3mmol,95.8％收率)未經(jīng)進(jìn)一步純化用于下一步。

在室溫下向(2S,6S)-叔丁基2-(羥甲基)-6-甲基嗎啉-4-甲酸酯(200mg,0.865mmol)在DCM(5mL)中的經(jīng)攪拌的溶液添加TFA(0.5mL,6.7mmol)。將反應(yīng)混合物攪拌1h，此后將其進(jìn)行濃縮并且與甲苯(每次5mL)共沸兩次至干燥并且在真空中干燥。將粗制去保護(hù)的嗎啉在攪拌下溶于DMAC(1mL)，然后將DIPEA(0.23mL,1.3mmol)和化合物3(152.4mg,0.654mmol)溶于其中。將反應(yīng)混合物在140℃下微波處理并且攪拌3h，此后將完成的反應(yīng)冷卻至室溫，濃縮并且經(jīng)硅膠(Biotage，用庚烷中的30％–80％EtOAc洗脫)純化，以在真空中濃縮所需合并的部分以及干燥之后得到5-((2S,6S)-2-(羥甲基)-6-甲基嗎啉代)喹啉-8-甲腈或ER-885477(165.2mg,0.583mmol,89.2％收率)。

在-78℃下，在氮?dú)鈿夥罩?，向雙(2-甲氧基乙基)氨基三氟化硫(0.044mL,0.239mmol)在DCM(2mL)中的冷卻的經(jīng)攪拌的溶液在3min內(nèi)逐滴添加DCM(2mL)中的ER-885477(50.4mg,0.178mmol)。將反應(yīng)混合物升溫至-50℃并且攪拌30min，此后將其升溫至0℃并且攪拌1.5h。用逐滴添加飽和NaHCO₃直到觀察到堿性pH(～5mL)來緩慢淬滅完成的反應(yīng)。將混合物用DCM(10mL)稀釋，分離各層，此后將有機(jī)層用水(每次5mL)洗滌兩次，經(jīng)MgSO₄干燥，過濾并且濃縮。將粗產(chǎn)物經(jīng)反相HPLC柱(X-Bridge C18 19x 100mm柱；用具有0.1％甲酸的10％–90％乙腈水溶液的線性梯度洗脫)純化，并且濃縮所需峰，然后在高真空下干燥以得到ER-886133(35.2mg0.123mmol,69.3％收率)。

向ER-885477(25.2mg,0.089mmol)添加亞硫酰氯(2mL)，然后升溫至85℃并且攪拌24h。將完成的反應(yīng)與甲苯(每次5mL)共沸兩次而濃縮至干燥。將粗產(chǎn)物經(jīng)反相HPLC柱(X-Bridge C18 19x 100mm柱；用具有0.1％甲酸的10％–90％乙腈水溶液的線性梯度洗脫)純化，并且濃縮所需峰，然后在高真空下干燥以得到ER-886134(2.1mg0.007mmol,7.8％收率)。

使用方案14制備ER-889363：向3-丁烯胺鹽酸鹽62(5.45g,50.6mmol)在DCM(33mL)中的經(jīng)攪拌的懸浮液添加NaHCO₃(110g)，然后添加鄰硝基苯磺酰氯(13.5g,60.8mmol)。將所得的混合物在室溫下劇烈攪拌2h，此后添加苯肼鹽酸鹽(2.9g,20mmol)并且再持續(xù)攪拌1h。將完成的反應(yīng)混合物用MTBE(70mL)萃取，然后依次用20％檸檬酸水溶液(35mL)、水(35mL)洗滌并且濃縮。將所得的紫色固體(13.32g)溶于NMP(70mL)并且添加碳酸鉀(21g,0.15mol)，然后添加(R)-縮水甘油芐醚6(9.98g,60.8mmol)。將混合物加熱至50℃并且攪拌22h，此后將其用水(300mL)稀釋并且用MTBE(每次200mL)萃取兩次。將所有有機(jī)層進(jìn)行合并以及濃縮，以產(chǎn)生橙色油狀物，將其進(jìn)行硅膠柱色譜法(正庚烷/MTBE 1:1)以產(chǎn)生呈橙色油狀的64(7.90g,18.8mmol,37％收率，在2個(gè)步驟中)。

在室溫下向64(7.90g,18.8mmol)在DMAC(94.8mL)中的經(jīng)攪拌的溶液添加乙酸銅(II)(0.853g,4.70mmol)，然后添加PdCl₂(0.416g,2.35mmol)。在室溫下將所得的混合物在O₂(氣球)下攪拌16h，此后添加額外的PdCl₂(0.200g,1.13mmol)，以及將混合物加熱至40℃并且攪拌6h。將完成的反應(yīng)用吡啶(4.5mL,56mmol)淬滅，攪拌5min然后用MTBE(400mL)稀釋。用水(250mL)洗滌混合物，并且分離有機(jī)層，濃縮。將粗制黃色油狀物通過硅膠柱色譜法(正庚烷/MTBE 1:1)純化，以產(chǎn)生65(0.740g,1.77mmol,9.4％收率，31％收率(基于回收的物質(zhì)))。

在0℃下向65(1.480g,3.54mmol)在DCM(14.8mL)中的冷卻的經(jīng)攪拌的溶液添加三乙基硅烷(2.96mL,18.6mmol)，然后添加TFA(4.44mL,57.6mmol)。將反應(yīng)混合物在0℃攪拌1h，此后將混合物升溫至室溫并且再攪拌1h。將完成的反應(yīng)混合物與甲苯(每次60mL)共沸兩次，然后通過硅膠柱色譜法(正庚烷/MTBE 1:1)純化以產(chǎn)生呈黃色油狀的66(1.382g,3.29mmol,92％收率)。

向66(1.382g,3.29mmol)在DMF(8.3mL,0.11mol)中的經(jīng)攪拌的溶液添加碳酸鉀(1.45g,10.5mmol)，然后添加苯硫醇(0.360mL,3.50mmol)。將所得的混合物在40℃加熱持續(xù)2h，此后將完成的反應(yīng)用水(12mL)稀釋。添加二碳酸二叔丁酯(0.897g,4.11mmol)，然后在室溫下攪拌1h。將完成的反應(yīng)用水(29mL)稀釋并且用MTBE(每次40mL)萃取兩次，以及將合并的有機(jī)層進(jìn)行濃縮以產(chǎn)生黃色油狀物。將粗產(chǎn)物通過硅膠柱色譜法(正庚烷/MTBE 4:1)純化，以得到呈無色油狀的67(847mg,2.52mmol,77％收率)及其呈無色油狀的67的立體異構(gòu)體(8.3mg,0.25mmol,7.5％收率)。

在室溫下向67(0.847g,2.52mmol)在DCM(4.2mL)中的經(jīng)攪拌的溶液添加TFA(4.2mL,0.055mol)并且攪拌30min。將完成的反應(yīng)混合物進(jìn)行濃縮，與甲苯(20mL)共沸并且分配于飽和NaHCO₃(8.5mL)與DCM(20mL)之間。分離有機(jī)層，經(jīng)MgSO₄(2.0g)干燥，過濾并且濃縮至干燥。將粗制中間體溶于NMP(2.12mL)中，隨后將DIPEA(0.66mL,3.8mmol)溶于其中，然后將3(0.706g,3.03mmol)溶于其中。將所得的混合物加熱至140℃并且攪拌2h，此后將完成的反應(yīng)冷卻至室溫并且分配于EtOAc(40mL)與水(20mL)之間。將水層用EtOAc(20mL)萃取以及將合并的有機(jī)層用水(10ml)洗滌，并且進(jìn)行濃縮以產(chǎn)生呈褐色固體/油狀的粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠(用1:1的正庚烷/EtOAc洗脫)純化以產(chǎn)生所需中間體:3的4:1混合物(0.684mg)。

將粗制中間體混合物(0.684mg)懸浮于乙腈(6.0ml)，然后將三甲基碘硅烷(0.377mL,2.65mmol)懸浮于其中，然后加熱至60℃并且攪拌2h。將完成的反應(yīng)冷卻至40℃，然后添加水(3.0ml)，以及將反應(yīng)冷卻至室溫并且再攪拌1h。添加28％的氫氧化銨水溶液(1.0mL)并且將所得的混合物用EtOAc(每次20mL)萃取兩次，此后將合并的有機(jī)層進(jìn)行濃縮，然后經(jīng)硅膠(用100％EtOAc洗脫)純化以產(chǎn)生呈黃色固體狀的68或ER-889363(404mg,1.36mmol,53％收率)。

向ER-889363(355mg,1.194mmol)在DCM(4mL)中的經(jīng)攪拌的溶液添加對(duì)甲苯磺酰氯(350mg,1.836mmol)，然后添加DIPEA(0.32mL,1.837mmol)和DMAP(10mg,0.082mmol)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌16h，此后用水(2mL)和鹽水(2mL)洗滌完成的反應(yīng)物，然后經(jīng)Na₂SO₄干燥，過濾并且濃縮至干燥。將粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠(Biotage，SP4,25+M，用庚烷中的10％–60％EtOAc洗脫，經(jīng)20個(gè)柱體積)純化。將所需的部分進(jìn)行合并，在真空中濃縮并且干燥以得到((2R,7R)-4-(8-氰基喹啉-5-基)-7-甲基-1,4-氧雜氮雜環(huán)庚烷-2-基)甲基4-甲基苯磺酸酯(476.6mg,1.056mmol,88.4％收率)。

將((2R,7R)-4-(8-氰基喹啉-5-基)-7-甲基-1,4-氧雜氮雜環(huán)庚烷-2-基)甲基-4-甲基-苯磺酸酯(19.4mg,0.043mmol)和1,4’-聯(lián)哌啶(30mg,0.178mmol)溶于DMAC(0.5mL)，然后在150℃下微波處理10min。將冷卻的反應(yīng)物用乙腈(0.5mL)稀釋，過濾并且經(jīng)反相HPLC(XbridgeC18柱，用包含0.1％甲酸的10％–40％乙腈水溶液的梯度洗脫)純化。濃縮合并的所需部分，用MeOH(1ml)稀釋并且經(jīng)過堿性SiCO₃柱，用MeOH(2mL)洗脫，然后在真空中濃縮并且干燥以得到ER-889822(11mg,0.025mmol,57.2％收率)。

其它實(shí)例：

ER-890094：將(3-(溴甲基)苯基)硼酸(129.5mg,0.603mmol)和1,4’-聯(lián)哌啶(190mg,1.129mmol)在DMAC(1mL)中的溶液在150℃下微波處理10min，此后將反應(yīng)物進(jìn)行冷卻并且濃縮至干燥，以作為粗制的(3-([1,4’-聯(lián)哌啶]-1’-基甲基)苯基)硼酸用于下一步。

將包含3(44.5mg,0.191mmol)、粗制的(3-([1,4’-聯(lián)哌啶]-1’-基甲基)苯基)硼酸(86.5mg,0.286mmol)、乙酸鈀(II)(6mg,0.027mmol)、2-二環(huán)己基膦基-2’,6’-二甲氧基聯(lián)苯基(12mg,0.029mmol)以及1M碳酸鈉水溶液(0.029ml,0.029mmol)在EtOH(0.6mL)和甲苯(0.6mL)中的經(jīng)攪拌的溶液加熱至70℃持續(xù)16h。將完成的反應(yīng)物進(jìn)行冷卻，用DCM(10mL)稀釋，用水(3mL)洗滌，經(jīng)Na₂SO₄干燥，過濾并且濃縮至干燥。將粗產(chǎn)物用1:1的DMSO:乙腈(2mL)稀釋，并且通過HPLC(Xbridge C18，用包含0.1％甲酸的10％–40％乙腈水溶液洗脫)直接純化。收集所需產(chǎn)物并且濃縮至干燥。將所得產(chǎn)物溶于MeOH(2mL)，并且經(jīng)過堿性二氧化硅塞(Biotage,1g,SiCO₃)，用MeOH(5mL)洗脫，以在真空中濃縮和干燥后得到ER-890094(5mg,0.012mmol,6.3％收率)。

以與ER-890094相似的方式制備ER-890244(63.2mg,0.153mmol,27.3％總收率)，其中以(4-(溴甲基)苯基)硼酸(134.2mg,0.625mmol)和1,4’-聯(lián)哌啶(125mg,0.564mmol)起始。

ER-888200：將包含3(251mg,1.077mmol)、(3-甲酰基-5-甲基苯基)硼酸(350mg,2.135mmol)、雙(三苯基膦)氯化鈀(II)(150mg,0.214mmol)、氯化鋰(91mg,2.147mmol)、碳酸鈉(230mg,2.17mmol)和10％碳酸鈉水溶液(2.3ml)在DMF(11mL)中的經(jīng)攪拌的溶液加熱至90℃，持續(xù)3h。將冷卻的反應(yīng)物在攪拌下用EtOAc(48mL)和水(12mL)稀釋，然后通過硅藻土545(1.2g)過濾，用EtOAc(10ml)洗脫。將分離的水層用EtOAc(每次12mL)萃取兩次，并且用水(24mL)和鹽水(24mL)洗滌合并的有機(jī)層，然后經(jīng)Na₂SO₄干燥，過濾并且濃縮至干燥。將粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠(Biotage SP4,Interchim 25g，用庚烷中的20％–100％EtOAc洗脫)純化，此后將所需產(chǎn)物部分進(jìn)行合并，在真空中濃縮以及干燥以得到ER-888200(163mg,0.599mmol,55.6％收率)。

ER-888201：向ER-888200(21mg,0.077mmol)在冷卻至0℃的MeOH(2.1mL)中的經(jīng)攪拌的溶液添加四氫硼酸鈉(3.2mg,0.085mmol)。將反應(yīng)混合物攪拌1h，此后添加水(2.1mL)，將混合物濃縮至一半體積，然后用EtOAc(19mL)萃取。用鹽水(3.9mL)洗滌有機(jī)層，經(jīng)Na₂SO₄干燥，過濾并濃縮至干燥以得到ER-888201(17.4mg,0.63mmol,82.4％收率)。

ER-888644：向ER-888201(91mg,0.332mmol)在DCM(1.8mL)中的經(jīng)攪拌的溶液添加對(duì)甲苯磺酰氯(101mg,0.530mmol)，然后添加DMAP(2mg,0.016mmol)和DIPEA(1.8mL,1.03mmol)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌3h，此后添加額外的對(duì)甲苯磺酰氯(101mg,0.530mmol)，然后攪拌2h。將完成的反應(yīng)物在攪拌下用水(1mL)和DCM(5.2mL)稀釋。分離各層并且將有機(jī)層用鹽水(1mL)洗滌，經(jīng)Na₂SO₄干燥，過濾并濃縮至干燥。將粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠(Biotage SP4,Interchim 25g，用庚烷中的20％–100％EtOAc洗脫)，此后將所需產(chǎn)物部分進(jìn)行合并，在真空中濃縮以及干燥以得到ER-888644(63mg,0.212mmol,65％收率)。

ER-888645：將ER-888644(20mg,0.068mmol)和4-羥基哌啶(70mg,0.692mmol)在N-甲基吡咯烷酮(2mL)中的溶液在150℃下微波處理15min。將冷卻的反應(yīng)物用NMP(4mL)進(jìn)行稀釋并且通過HPLC使用C-18柱(Xbridge C18，用包含0.1％TFA的10％–40％乙腈水溶液洗脫)直接純化。收集所需產(chǎn)物并且濃縮至干燥。將所得的產(chǎn)物溶于MeOH(2mL)，并且經(jīng)過堿性二氧化硅塞(Biotage,1g,SiCO₃)，用MeOH(5mL)洗脫，以在真空中濃縮和干燥后得到ER-888645(19.9mg,0.056mmol,81.5％收率)。

以與ER-888645相似的方式制備ER-888646(17.9mg,0.047mmol,68.1％收率)，其中以ER-888644(20mg,0.068mmol)和4-二甲基氨基哌啶(87.6mg,0.683mmol)起始。

以與ER-888645相似的方式制備ER-888647(15.3mg,0.043mmol,62.8％收率)，其中以ER-888644(20mg,0.068mmol)和1-甲基哌嗪(68.4mg,0.683mmol)起始。

以與ER-888645相似的方式制備ER-889504(46mg,0.108mmol,62％收率)，其中以ER-888644(51mg,0.174mmol)和1,4’-聯(lián)哌啶(102mg,0.606mmol)起始。

一般篩選測(cè)定和藥理學(xué)策略

為了鑒定有效的和選擇性的TLR7/8化合物，故對(duì)全部人TLR4、TLR7和TLR9報(bào)告物系的基于細(xì)胞的組初步篩選類似物(更多細(xì)節(jié)參見“藥理學(xué)材料與方法”)。在原代人PBMC測(cè)定中，還測(cè)試了對(duì)TLR7有效的和選擇性的化合物子集對(duì)TLR8的活性(見以下表3)和對(duì)TLR7/8的效能(更多細(xì)節(jié)參見“藥理學(xué)材料與方法”)。將某些化合物推進(jìn)入短期體內(nèi)(STIV)測(cè)定，以測(cè)定對(duì)小鼠TLR7的劑量依賴性活性和作用持續(xù)時(shí)間(更多細(xì)節(jié)參見“藥理學(xué)材料與方法”)。然后評(píng)估所選擇的化合物對(duì)以下小鼠狼瘡疾病模型BXSB-Yaa、NZBxNZW和姥鮫烷DBA/1中的一種或多種的影響。

當(dāng)在細(xì)胞系或原代細(xì)胞上表達(dá)的這些受體受到合成的小分子(CL097,R848)或核酸(RNA)配體刺激時(shí)，本文中的實(shí)施方案報(bào)道的許多化合物顯示了對(duì)人TLR7和小鼠TLR7及人TLR8的納摩爾效能。相反地，本文的實(shí)施方案中所報(bào)道的大多數(shù)化合物對(duì)TLR9途徑是無活性的。

現(xiàn)有狼瘡SOC藥物包括諸如氯喹和羥氯喹(HCQ)的抗瘧藥物，其已經(jīng)顯示可在體外抑制TLR7/9活化。這可以至少部分地解釋這些藥物在控制狼瘡?fù)话l(fā)中的有效性。然而，本公開內(nèi)容的實(shí)施方案已經(jīng)顯示出提供更顯著有效的抑制。例如，發(fā)現(xiàn)化合物ER-899742(以上所示和討論的)對(duì)RNA-Ig TLR7/8刺激物的效能比HCQ對(duì)RNA-Ig TLR7/8刺激物的效能高約1000倍(IC₅₀＝0.0009μM,HCQ IC₅₀～1.5μM)。這表明ER-899742將提供比現(xiàn)有狼瘡治療更有效的TLR7/8途徑抑制。這通過以下表1中顯示的結(jié)果得以證實(shí)。

表1.化合物ER-899742相對(duì)于羥氯喹(Plaquenil)的效能和選擇性。

在體外藥理學(xué)中，如以下所述在HEK 293細(xì)胞系中使用克隆的TLR7和TLR8進(jìn)一步研究了ER-899742相對(duì)于羥氯喹的比較效能。還比較了對(duì)小鼠TLR7的效果。在讀取發(fā)光強(qiáng)度之前，將細(xì)胞用TLR7/8激動(dòng)劑CL097以預(yù)設(shè)的ED_70-80刺激過夜：對(duì)于HEK-hTLR7為3μg/ml，對(duì)于HEK-mTLR7為1.5μg/ml和對(duì)于HEK-hTLR8為12μg/ml。進(jìn)行三個(gè)測(cè)試并且使用Graphpad Prism 6非線性回歸曲線擬合測(cè)定IC50值。在表2中示出了單個(gè)測(cè)試結(jié)果及其平均值。數(shù)據(jù)表明在這個(gè)測(cè)定中，ER-899742在HEK/TLR7細(xì)胞系中具有0.024μM的平均IC50，在HEK/TLR8細(xì)胞系中具有0.0024μM的平均IC50。

表2.ER-899742相對(duì)于羥氯喹對(duì)TLR7和TLR8響應(yīng)的作用。

¹mTLR7、小鼠TLR7；hTLR7、人TLR7；hTLR8、人TLR8

表3.在HEK-293測(cè)定形式中所選化合物對(duì)人TLR8的效能(更多細(xì)節(jié)參見“材料與方法”)。

短期體內(nèi)(STIV)測(cè)定：為了體內(nèi)評(píng)估化合物對(duì)于小鼠TLR7的效能，利用了短期體內(nèi)(STIV)測(cè)定。簡(jiǎn)而言之，將化合物口服給藥于小鼠，然后在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)小鼠皮下注射激動(dòng)劑R848以刺激TLR7。然后在R848刺激之后，通過ELISA測(cè)量血漿IL-6水平以評(píng)估化合物效能和作用持續(xù)時(shí)間。重要的是，利用TLR7缺陷小鼠，在用R848進(jìn)行體外或體內(nèi)刺激之后，細(xì)胞因子的產(chǎn)生顯示出完全為TLR7依賴性的。因此，在STIV測(cè)定中，化合物的活性可以確信地歸因于對(duì)TLR7途徑的調(diào)節(jié)。ER-899742在300mg/kg的單一口服劑量完全抑制體內(nèi)R848/TLR7/IL-6途徑至少24小時(shí)(參見圖1A和圖1B)。在以下表4中示出了一組化合物的STIV測(cè)定效能的匯總。

表4.所選化合物的短期體內(nèi)(STIV)測(cè)定數(shù)據(jù)的匯總。

X＝小鼠無法耐受此劑量

*在12只小鼠中發(fā)現(xiàn)4只小鼠與化合物不相容

X＝小鼠無法耐受此劑量

小鼠狼瘡疾病模型。選擇兩種不同的狼瘡疾病模型(NZB/W和姥鮫烷)用于化合物POC評(píng)估，因?yàn)?1)NZB/W品系患有具有多基因病因?qū)W的自發(fā)性疾病，顯示出人狼瘡的許多標(biāo)志，例如DNA相關(guān)的自身反應(yīng)性、蛋白尿和免疫復(fù)合物介導(dǎo)的腎炎，以及(2)已經(jīng)報(bào)道了對(duì)于兩種疾病模型的陽性TLR7和/或TLR9靶標(biāo)驗(yàn)證結(jié)果。

在SLE疾病模型中對(duì)于ER-899742的關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)如下(參見圖2A-圖2C、圖3A-圖3E和圖7A-圖7G以及表7)：

1)以33mg/kg至300mg/kg的幾種劑量的ER-899742在NZB/W模型中提供了顯著的存活益處，這與腎小球腎炎的顯著降低的蛋白尿和組織學(xué)病癥相一致。

2)ER-899742在姥鮫烷模型中抑制多種自身抗體特異性，尤其強(qiáng)烈影響了RAN相關(guān)的反應(yīng)性例如抗-RiboP滴度。在這個(gè)模型中，全血中一些IFN調(diào)節(jié)基因的表達(dá)降低由ER-899742的治療造成。還在這個(gè)模型中觀察到ER-899742對(duì)關(guān)節(jié)炎的控制。

在SLE疾病模型中對(duì)于ER-899464的關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)如下(參見圖4-圖5)：

1)以33mg/kg至300mg/kg的幾種劑量的ER-899464在NZB/W模型中提供了顯著的存活益處，連同顯著降低的蛋白尿。

2)ER-899464在姥鮫烷模型中抑制多種自身抗體特異性，尤其強(qiáng)烈影響了RAN相關(guān)的反應(yīng)性例如抗-RiboP滴度。

藥理學(xué)材料與方法：

體外藥理學(xué)：

將HEK-293細(xì)胞(ATCC)設(shè)計(jì)成穩(wěn)定表達(dá)NF-κB轉(zhuǎn)錄因子可誘導(dǎo)的E-選擇素(ELAM-1)熒光素酶報(bào)告物，所述熒光素酶報(bào)告物來源于包含來自人E-選擇素基因(登記號(hào)NM_000450)的啟動(dòng)子的堿基對(duì)-2241bp至-254bp的質(zhì)粒pGL3(Promega)。隨后將這些細(xì)胞設(shè)計(jì)成穩(wěn)定地并分別地表達(dá)人TLR4、TLR7或TLR9全長(zhǎng)ORF cDNA。將人TLR4cDNA(登記號(hào)NM_138554)克隆至pcDNA 3.0表達(dá)載體(Invitrogen)中。還將TLR4轉(zhuǎn)染的細(xì)胞設(shè)計(jì)成表達(dá)人MD-2共受體[將MD-2cDNA(登記號(hào)NM_015364)克隆至pEF-BOS載體]，并且在培養(yǎng)基中補(bǔ)充10nM可溶的CD14(R&D Systems)以使LPS響應(yīng)性最優(yōu)化。將人TLR9cDNA(登記號(hào)NM_017442)克隆至pBluescript II KS載體(Agilent)中。從OriGene獲得人TLR7cDNA(登記號(hào)NM_016562)。穩(wěn)定表達(dá)人TLR8(登記號(hào)NM_138636)或小鼠TLR7(登記號(hào)NM_133211)的HEK-293細(xì)胞購自于InvivoGen，并且然后用pNiFty2(NF-κB)-熒光素酶報(bào)告物質(zhì)粒(InvivoGen)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。將在包含10％胎牛血清(FBS)的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)中密度為2.22×10⁵個(gè)細(xì)胞/ml的各個(gè)細(xì)胞類型接種至384孔板中，并且在37℃、5％CO₂下孵育2天。然后添加不同濃度的拮抗劑化合物。然后將細(xì)胞再孵育30分鐘，之后添加以下適當(dāng)?shù)腡LR激動(dòng)劑(顯示為最終濃度)：10ng/ml的脂多糖(LPS；Sigma)用于TLR4、3μg/ml的CL097(InvivoGen)用于人TLR7和人TLR8以及小鼠TLR7、以及0.6μM的CpG-2006-2A[序列：TCGTCGTTAAGTCGTTAAGTCGTT(SEQ ID NO:1)，具有硫代磷酸酯骨架，由Sigma-Aldrich合成]用于TLR9。然后將細(xì)胞孵育過夜，并且按照制造商建議的方案通過用(Promega)或Steadylite^TM(Perkin Elmer)試劑測(cè)量發(fā)光對(duì)NF-κB依賴性熒光素酶報(bào)告物活化進(jìn)行定量。

基于人PBMC細(xì)胞的測(cè)定。從新鮮抽取的肝素化(10USP單位/ml,Hospira,Lakeforest,IL)的健康供體的全血中通過密度梯度離心(1077,Sigma,Inc.,St.Louis,MO)分離人外周血單核細(xì)胞(PBMC)。簡(jiǎn)而言之，將25ml血液在50ml圓錐管中用15ml PBS(不含Ca²⁺、Mg²⁺)稀釋，并且使用脊椎穿刺針將12ml Histopaque置于下面。將管以1200rpm(350xg)離心45分鐘，并且從血沉棕黃層收集PBMC。然后將細(xì)胞在PBS中洗滌兩次，并且使紅細(xì)胞在室溫下通過在5ml氯化銨溶液(1X紅細(xì)胞裂解緩沖液，eBioscience)中懸浮5分鐘而裂解。在PBS中最終洗滌之后，將PBMC以2×10⁶個(gè)/ml的最終濃度重懸浮于具有L-谷氨酰胺(Invitrogen)并且補(bǔ)充25mM HEPES(Mediatech,Inc,Manassas VA)、10％胎牛血清(HyClone,Logan,UT)和青霉素-鏈霉素-谷氨酰胺(Mediatech)的RPMI-1640培養(yǎng)基中，并且以100μl/孔(2×10⁵個(gè)細(xì)胞/孔)接種于組織培養(yǎng)物處理過的96孔板(Falcon)中。

將溶解和連續(xù)稀釋于100％DMSO中的拮抗劑化合物以一式三份添加至細(xì)胞以獲得0.1％DMSO(v/v)的最終濃度。將溶解和連續(xù)稀釋于PBS中的羥氯喹(Acros Organics)以一式三份添加至細(xì)胞。將PBMC與拮抗劑化合物或HCQ在37℃、5％CO₂下孵育30分鐘，之后以每孔100μl完全培養(yǎng)基添加以下各種TLR激動(dòng)劑試劑(顯示為最終濃度)：1μM R848(瑞喹莫德；GLSynthesis,Worcester,MA)用于TLR7和TLR8，10ng/ml LPS(Sigma)用于TLR4，以及5μg/ml CpG-2216(InvivoGen)用于TLR9。為了制備模擬狼瘡患者中包含RNA的自身抗體免疫復(fù)合物的TLR7/8激動(dòng)劑，合成具有來自人U1snRNA莖環(huán)IV[(序列：GGGGGACUGCGU-UCGCGCUUUCCC(SEQ ID NO:2)，具有硫代磷酸酯骨架]的序列的26-mer RNA(Dharmacon,Inc.,Lafayette,CO)，其在之前已顯示為有效的TLR7和TLR8激動(dòng)劑。將這種RNA分子在無血清的RPMI中稀釋至2.5μM，并且以1:25的稀釋度或1μg/ml添加小鼠抗人單鏈DNA單克隆抗體(MAB3034,Millipore,Inc.,Billerica,MA)，其還與RNA交叉反應(yīng)。在添加至細(xì)胞之前，將產(chǎn)生的“RNA-Ig”刺激物在室溫下孵育15-30分鐘。將PBMC與各種TLR激動(dòng)劑在37℃、5％CO₂下孵育20小時(shí)。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，并且根據(jù)制造商(BD Biosciences,Inc.,San Diego,CA)建議的方案通過標(biāo)準(zhǔn)ELISA程序如所示來評(píng)估各種人細(xì)胞因子的水平。在表5中顯示了結(jié)果。在隨后的測(cè)定(表6)中，檢查了ER-899742阻斷各種TLR7/8配體刺激正常PBMC，而不阻斷TLR9的DNA介導(dǎo)的活化的能力。在該測(cè)定中，將細(xì)胞以1x 10⁵個(gè)細(xì)胞/孔以100μl接種于96孔板。

表5--所選化合物的PBMC測(cè)定數(shù)據(jù)的匯總

表6.ER-899742相對(duì)于羥氯喹在跨越多個(gè)配體的人PBMC中的IL-6和IFN-α的阻斷

¹NA，未顯示數(shù)據(jù)，因?yàn)橹档陀跈z測(cè)限，或者重復(fù)顯示高的變化性

基于小鼠脾細(xì)胞的測(cè)定。從通過CO₂安樂死的雌性BALB/c小鼠(Jackson Labs,Bar Harbor,ME)收獲脾臟。通過將脾臟經(jīng)過40μm尼龍細(xì)胞過濾器而獲得單細(xì)胞懸浮液。用50ml PBS(Mediatech,Inc.,Manassas,VA)對(duì)細(xì)胞洗滌兩次，并且將紅細(xì)胞在室溫下于5ml RBC裂解緩沖液(eBioscience,Inc.,San Diego,CA)中保持5分鐘進(jìn)行裂解。將細(xì)胞在PBS中再洗滌兩次，并且最終以2.5×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml重懸浮于補(bǔ)充的RPMI-1640中。將細(xì)胞以100μl/孔(2.5×10⁵個(gè)細(xì)胞/孔)接種于組織培養(yǎng)物處理過的96孔板中(Falcon)。將溶于100％DMSO中的連續(xù)稀釋的化合物以一式三份添加至細(xì)胞，以獲得0.1％DMSO的最終濃度。將細(xì)胞與化合物在37℃、5％CO₂下孵育30分鐘，然后添加100μl/孔的在完全培養(yǎng)基中的740nM R848(瑞喹莫德；GLSynthesis,Worcester,MA)至最終濃度為370nM R848。使細(xì)胞在37℃、5％CO₂下孵育20小時(shí)。收集培養(yǎng)上清液，并且根據(jù)制造商(BD Biosciences,Inc.,San Diego,CA)建議的方案通過標(biāo)準(zhǔn)ELISA方法評(píng)估IL-6的水平。數(shù)據(jù)示于以下表7中。

表7-小鼠脾細(xì)胞結(jié)果

體內(nèi)藥理學(xué)：

短期體內(nèi)(STIV)測(cè)定。通過灌胃口服200ul體積的在0.5％甲基纖維素水溶液(Sigma,St.Louis,MO)中配制的拮抗劑化合物對(duì)六周齡至八周齡的雌性BALB/c小鼠(Jackson Labs,Bar Harbor,ME)給藥。在之后的各時(shí)間點(diǎn)，向小鼠皮下(s.c.)注射100μl體積的15μg R848(瑞喹莫德；GLSynthesis,Worcester,MA)以刺激TLR7。通過心臟穿刺收集血漿，然后根據(jù)制造商(R&D Systems)建議的方案通過標(biāo)準(zhǔn)ELISA方法評(píng)估在TLR7刺激之后1.5小時(shí)的IL-6的水平。

小鼠狼瘡疾病模型品系。從Jackson Labs(Bar Harbor,ME)購買雌性NZBWF1/J小鼠，其顯示具有自發(fā)性狼瘡疾病。從Harlan Laboratories(Indianapolis,IN)購買雌性DBA/1小鼠，并且在指定鼠齡給予腹膜內(nèi)注射0.5ml姥鮫烷(2,6,10,14-四甲基十五烷；Sigma,St.Louis,MO)以化學(xué)誘導(dǎo)狼瘡疾病，或腹膜內(nèi)注射0.5ml PBS以產(chǎn)生鼠齡一致的未患病的對(duì)照小鼠。

在圖2A至圖2C示出了實(shí)施方案的進(jìn)一步測(cè)試，其顯示了在NZBxNZW品系(在下文中縮寫為NZBWF1/J或NZB/W)狼瘡疾病模型中對(duì)ER-899742的測(cè)試。接收5周齡的雌性NZBWF1/J小鼠，進(jìn)行基線取血，并且通過以下抗-dsDNA滴度監(jiān)控小鼠的疾病進(jìn)展。在27周齡時(shí)，將小鼠隨機(jī)分成具有相等中值的抗-dsDNA滴度的小組，并且在29周齡用單獨(dú)的媒介物(Veh；0.5％甲基纖維素)或者以33mg/kg、100mg/kg或300mg/kg每天一次口服(QD PO)治療。在治療17周后，在46周齡時(shí)，對(duì)小鼠取血并且測(cè)試抗-dsDNA滴度。在50周齡處死所有小鼠(21周的化合物治療)。圖2(A)顯示在50周齡結(jié)束之前(21周的治療后)，從各個(gè)小鼠收集尿液，并且測(cè)定各只動(dòng)物的尿白蛋白/肌酸酐比(UACR，蛋白尿)作為腎功能的間接量度。圖2(B)顯示了在本研究中對(duì)最高劑量組和最低劑量組所觀察到的死亡率的時(shí)間進(jìn)程。并未見到用化合物處理的死亡率。此外，在中劑量組中未觀察到死亡率(未示出)。圖2(C)顯示在給藥17周后，在46周齡時(shí)，治療對(duì)抗-dsDNA滴度的影響。未觀察到統(tǒng)計(jì)上的顯著效果。

在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，以盲法從圖2A至圖2C中測(cè)試的動(dòng)物收集腎臟，在10％福爾馬林中固定24小時(shí)，包埋在石蠟中，并且產(chǎn)生H&E染色切片用于組織病理學(xué)評(píng)估(0/1+級(jí)：WNL至最低；2級(jí)：中等；3級(jí)：中等至明顯；4級(jí)：嚴(yán)重)。結(jié)果示于表8中。

表8

通過ELISA評(píng)估自身抗體滴度。通過標(biāo)準(zhǔn)ELISA方法評(píng)價(jià)抗-dsDNA滴度、抗-Sm/nRNP滴度、抗-RiboP滴度和抗組蛋白滴度。簡(jiǎn)而言之，用100μl如下的含稀釋抗原的PBS(顯示最終濃度)對(duì)96孔EIA/RIA ELISA板(Corning)進(jìn)行涂覆，在室溫下保持90分鐘：10U/mlSm/nRNP復(fù)合物(Immunovision)、10μg/ml小牛胸腺dsDNA(Sigma)、5U/ml RiboP(Immunovision)和5μg/ml組蛋白(Immunovision)。將板用PBS/0.05％Tween20(洗滌緩沖液)進(jìn)行洗滌，并且用PBS/1％BSA(封閉緩沖液)在4℃封閉過夜。對(duì)板進(jìn)行洗滌，將在封閉緩沖液中稀釋的小鼠血漿樣品(根據(jù)模型和抗原，以1:25-1:10,000進(jìn)行稀釋)以每孔100μl體積添加至孔，并且將板在室溫下孵育90分鐘。然后對(duì)板進(jìn)行洗滌，將100μl以1:50,000稀釋于PBS/1％BSA/0.05％Tween中的抗小鼠-IgG-HRPO(Southern Biotech)添加至各個(gè)孔，并且將板在室溫下孵育90分鐘。對(duì)板進(jìn)行洗滌，并且將100μl來自O(shè)ptEIA TMB底物試劑盒(BD Biosciences)的底物組分的1:1混合物添加至孔。在室溫下孵育板，并且在充分顯色后，通過添加100μl 0.18M硫酸溶液使反應(yīng)停止。通過分光光度法在450nm對(duì)板進(jìn)行讀數(shù)。

蛋白尿的評(píng)估。從各只小鼠手動(dòng)收集尿，或通過每個(gè)代謝籠飼養(yǎng)1-2只小鼠18小時(shí)來收集尿，并且對(duì)各個(gè)動(dòng)物測(cè)定尿白蛋白/肌酸酐比(UACR)作為腎臟功能的間接量度(將UACR計(jì)算為每dL尿的白蛋白(mg)/肌酸酐(g)的比率)。使用抗小鼠白蛋白抗體組(Bethyl Labs)通過定制夾心ELISA方案測(cè)定尿樣中的白蛋白水平，其中該抗體組包括包被抗體和用于檢測(cè)的標(biāo)記有HRP綴合物的二級(jí)抗體。使用商購的肌酸酐測(cè)試盒(Cayman)測(cè)定肌酸酐水平。

腎炎的組織學(xué)評(píng)估。以盲法從各只小鼠收集腎臟，將腎臟固定在10％福爾馬林中24小時(shí)，包埋在石蠟中，并且產(chǎn)生H&E染色切片用于組織病理學(xué)評(píng)估。以下為腎炎疾病評(píng)分的特征：0級(jí)-正常限度；1級(jí)-帶狀毛細(xì)血管壁增厚；2級(jí)-細(xì)胞過多、細(xì)胞分裂、新月體形成；3級(jí)-參見2級(jí)，腎小球病變的嚴(yán)重程度和范圍增加(受累腎小球％)；4級(jí)-硬化；嚴(yán)重的腎小球疾病(非功能器官)。

評(píng)估全血中的干擾素基因表達(dá)。通過qPCR測(cè)量全血中IFN調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。簡(jiǎn)而言之，使小鼠安樂死，經(jīng)由腔靜脈收集血液，并且將100μl保藏在包含RNAlater(Ambion,Austin TX)的管中。使用Mouse RiboPure血液RNA分離試劑盒(Ambion)分離總的RNA。使用NanoDrop ND-1000分光光度計(jì)(Thermo Scientific,Waltham MA)測(cè)定RNA濃度。使用VILO^TM Master Mix(Life Technologies,Grand Island,NY)由100ng總RNA合成第一鏈cDNA。在逆轉(zhuǎn)錄之后，將cDNA用無核酸酶的水稀釋并且與Fast Advanced Master Mix(Applied Biosystems)混合。然后將混合物應(yīng)用于由Applied Biosystems制造的定制Low Density Array(TLDA)，并且在ABI 7900HT快速實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems)上進(jìn)行qPCR。使用RQ Manager 1.2.1(Applied Biosystems)收集原始數(shù)據(jù)并且使用GeneData Analyst 2.2軟件(GeneData)分析。

TLDA組包含多至45個(gè)選自以下表9的靶基因，和3個(gè)用于歸一化的管家基因?；谧儺愊禂?shù)，選擇管家基因Hprt1用于進(jìn)行歸一化。對(duì)靶基因測(cè)定相對(duì)量，并且將該相對(duì)量用于計(jì)算各只患病小鼠相對(duì)于僅接受腹膜內(nèi)注射PBS的未患病對(duì)照組的倍數(shù)變化。進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)學(xué)生t檢驗(yàn)以測(cè)定在未患病組(PBS治療)與媒介物治療的患病組(姥鮫烷治療)之間何種靶基因顯著增加，由此表示出疾病調(diào)節(jié)的基因組。對(duì)于圖7G，使用在具有缺省選項(xiàng)的包裝“堿基”中的p調(diào)節(jié)指令進(jìn)行錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)的修正。Holm,S.A simple sequentially rejective multiple test procedure.Scandinavian Journal of Statistics,1979.6(2):p.65–70。隨后以t檢驗(yàn)中所鑒定的所有疾病調(diào)節(jié)基因的中值倍數(shù)變化計(jì)算各只小鼠的“IFN評(píng)分”。

表9