專利名稱：：抑制mdv增殖的rna干擾靶點及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和預(yù)防獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一組針對MDV進行RNA干擾的靶點，以及根據(jù)這些靶序列獲得siRNA或反義RNA用于制備治療MDV的制劑。背榮技術(shù)馬立克氏病(Marek'sDisease,MD)是由馬立克氏病病毒(Marek'sDiseaseVirus，MDV〉引起的雞的一種高度傳染性的淋巴組織增生性疾病。MD在全世界廣泛流行，是當(dāng)前危害養(yǎng)雞業(yè)最為嚴重的傳染病之一，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。從MD的發(fā)展歷史和防制現(xiàn)狀來看，僅靠疫苗來控制MD是不夠的，諸如早期感染和病毒毒力進化等很多因素都可以引起免疫失敗。各國的MD專家和研究人員都在不懈地進行控制f^D新技術(shù)和新方法的研究和探討，以期更有效地對付流行病學(xué)不斷變化和毒力日益進化增強的MD。利用RNA干擾(RNAinterference,RNAi)技術(shù)為MD的防治提供了非常有效和及具前景的手段，利用RNA干擾技術(shù)可以快速獲得特異抑制MD病毒的短RNA分子藥物，同時也可獲得能用于藥物研究的特異的基因作用位點，這些特異的短RNA分子為控制MD的早期感染和毒力的進化提供了可能。RNA干擾是指生物中雙鏈RNA(Double-strandedRNA,dsRNA)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種特異的基因沉默(genesilencing)現(xiàn)象。RNAi廣泛存于線蟲、果蠅、真菌、植物和動物等生物體內(nèi)，是這些生物阻斷轉(zhuǎn)座子作用，抵御病毒感染的一種重要的保護機制，在進化上具有高度保守性。近幾年來RNAi的研究取得了很大進展，特別是dsRNA制備技術(shù)上的進步，使得RNAi這一技術(shù)迅速應(yīng)用到多個研究領(lǐng)域，加速了對基因功能、遺傳規(guī)律、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機理的研究，并已將這一技術(shù)應(yīng)用于癌癥和病毒性疾病的基因治療研究中。目前對RNAi作用的確切機制尚不清楚，一般認為，dsRNA由核酸內(nèi)切酶(RNaseIII，在果蠅RNaseIII被稱為dicer酶)切割成1923bp的小干擾RNA(smalIinterferenceRNA,siRNA，siRNA再與體內(nèi)一些酶(包括內(nèi)切酶、外切酶、螺旋酶)結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物RISC(RNAinducedsilencingcomplex,RISC)RISC再特異性地與mRNA的同源區(qū)結(jié)合,通過酶的作用使mRNA降解,使相關(guān)基因沉默(genesilence)。但這絲毫也不影響人們的研究熱情，多項研究表明，RNAi在抗病毒方面有效，RNAi正走上病毒病預(yù)防和控制的舞臺，有望成為未來控制病毒感染的強有力的工具。Gitlin等報道，將特異性siRNA提供給體外培養(yǎng)的人體細胞，發(fā)現(xiàn)siRNA象藥物一樣能進入細胞并有效地抗脊髓灰質(zhì)炎病毒的感染。Lee等將HIV、PNL43前病毒DNA與合成siRNA的載體共轉(zhuǎn)染到239細胞,發(fā)現(xiàn)HIV1DNA表達被明顯抑制，從而降低了HIV對哺乳動物細胞的感染率,他們還發(fā)現(xiàn)siRNA在細胞內(nèi)表達時，將產(chǎn)生抗HIV1再感染的免疫力。Novina等利用siRNA作用于HIV細胞內(nèi)受體GD4和病毒結(jié)構(gòu)Gag蛋白，降低了病毒進入細胞的能力，從而有效地抑制了HIV的感染。GeQ等報道，在細胞或雞胚上，利用RNAi技術(shù)耙向沉默流感病毒的mRNA，可以直接降低病毒mRNA在宿主細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄，從而有效地降低病毒的復(fù)制。另外，在抗皰疹病毒感染方面也取得了類似的進展。由于MD病毒也屬于皰疹病毒家族成員，都是DNA病毒，二者在細胞內(nèi)的復(fù)制十分相似。另一方面，在雞胚模型上應(yīng)用RNAi技術(shù)已獲得成功，說明雞胚，甚至雞體本身也存在RNAi機制。據(jù)此，我們認為，利用RNAi技術(shù)來沉默MD病毒編碼蛋白的mRNA，將會抑制MD病毒在宿主細胞內(nèi)的復(fù)制，從而降低甚至消除其對雞體的損傷。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為獲得針對MDV特異的RNAi作用靶點，利用這些靶點進行RNAi作用，可明顯抑制MDV的增殖，并可以此制備具抗MDV作用的藥物或制劑。本發(fā)明獲得的針對MDV特異的RNAi作用靶點，來源于首先通ii美國Ambicm公司提供的網(wǎng)上在線設(shè)計工具獲得針對MDV復(fù)制的靶點，再根據(jù)經(jīng)驗篩選和設(shè)計siRNA表達模板，構(gòu)建siRNA表達載體，最后轉(zhuǎn)染CEF細胞，通過蝕斑減少試驗獲得特異有效的靶點。本發(fā)明提出了篩選RNAi作用靶點序列的經(jīng)驗依據(jù)①尋找MDV基因組中23個堿基組成的AA(N19)TT或相似的基序。②選擇G/C含量在36X52X之間的基序。③BLAST選擇的靶序列，進行同源分析,排除siRNA非特異性地抑制雞體和其他病毒基因片段的可能。本發(fā)明提出了構(gòu)建和鑒定siNRA表達載體的簡便方法。合成單鏈目的基因片段，退火連接，磷酸化退火片段，與Psilencer2.1-U6neoSa/T7〃III線性化載體的連接，連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化與特異性siRNA表達載體的酶切鑒定，特別是在單鏈目的基因片段的3'端設(shè)計有I(GTCGAC)酶切位點，如果插入正確，就應(yīng)該能被I酶切，解決了由于插入的目標(biāo)序列較短，限制性酶切和常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳不便鑒定的問題，大大方便了重組子的酶切鑒定。本發(fā)明提出了判定特異性siRNA表達載體RNAi有效的方法。將特異性siRNA表達載體轉(zhuǎn)染CEF細胞，繼續(xù)培養(yǎng)8小時，每孔接種100PFUMDV1型超強毒，根據(jù)蝕斑形成抑制率判斷這些靶點對MDV增殖的抑制作用。本發(fā)明所述的靶序列如下AAACATGGACCATTTACCGAC，來源于MD病毒VP22蛋白的138位序列；AAACATAAATGGGGGAAAGCC，來源于MD病毒VP22蛋白的171位序列；AAGATCCTCCGGGAAGAAATG，來源于MD病毒VP22蛋白的424位序列；AAACTATTGGAAGAGTGTGGA，來源于MD病毒VP22蛋白的537位序列；AAGAGTCTGGATTATGCCAGG，來源于MD病毒VP22蛋白的547位序列；AAATCTGAACGTACAAGAGGC，來源于MD病毒VP22蛋白的606位序列；實驗證明，本發(fā)明靶點對MDV增殖具有很好的抑制作用，根據(jù)這些雜點獲得的siRNA或反義RNA可以單獨或以任何比例、任何組合方式與其他任何治療MD病毒感染的試劑配伍，或與其他任何治療方法配合，以應(yīng)用千MD病毒感染的預(yù)防和治療。本發(fā)明獲得的序列及其作用位點對MD病毒的診斷也具有一定意義，并具有潛在的應(yīng)用價值。附圖1為MDV基因組特異性siRNA表達載體的鑒定電泳圖，圖中1為用I限制性內(nèi)酶切酶切MDV基因組特異性siRNA表達載體所獲得的載體片段。2為MDV基因組特異性siRNA表達載體。3為DL15000DNAMarker(寶生物工程(大連)有限公司)。產(chǎn)品質(zhì)粒pSilencer2.1-U6neo是沒有I酶切位點的，而我們在插入序列里面設(shè)計了I的酶切位點，如果插入正確，就應(yīng)該能被^/I酶切。電泳分析結(jié)果提示，MDV基因組特異性siRNA表達載體構(gòu)建成功。具體實施方式下面結(jié)合不同siRNA抑制MD病毒感染CEF細胞的實驗對本發(fā)明做進一步詳細說明。1.實驗方法1.1siRNADNA模板設(shè)計根據(jù)實驗經(jīng)驗，利用生物軟件，依照GENEBANK發(fā)表的MDV(病毒株為Md5)的基因序列，設(shè)計并制備了6條siRNA,所靶向的基因為MDV病毒中表達病毒皮質(zhì)蛋白Vp22的UL49基因序列。最后采用NGBIGenBank(美國國立醫(yī)學(xué)圖書館和美國國立衛(wèi)生研究院編寫)提供的BLAST軟件,對選擇的靶序列進行同源分析,排除siRNA非特異性地抑制雞體和其他病毒基因片段的可能。pSilencer2.1-U6neovector具有U6啟動子，可轉(zhuǎn)錄siRNA。設(shè)計可克隆入pSilencer2.1-U6neovector的發(fā)卡狀siRNA,寡核苷酸形成雙鏈后，在5'端帶有5柳〃1(GATGG)酶切位點，在3'端帶有Sa/I(GTGGAC)和///"dl11(TTCGA)酶切位點，5'端開始為19個核苷酸的正義鏈，中間加入9個核苷酸TTCAAGAGA間隔以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，3'端加有轉(zhuǎn)錄終止信號TTTTTT。表1siRNADNA模板序列<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>1.2單鏈目的基因片段的退火連接用50(iL退火緩沖液(200國ol/LNaCL,20國ol/LTris,pH7.6)溶解合成的單鏈目的基因片段，各取2uL(1.32Pg/uL),加入到16uL退火緩沖液中，9fC水浴中5min,然后自然冷卻至室溫。1.3磷酸化退火片段與Psilencer2.1-U6neo5a/7〃IIII線性化載體的連接將磷酸化退火片段與Psilencer2.1-U6neo5aw〃I+〃///III線性化載體連接，連接體系為10XT4DNA連接酶緩沖液1(iL，Psilencer2.1-U6neo5a/w〃IIII線性化載體1HL，磷酸化退火片段1)aL，T4DNA連接酶1pL，補水至10pL，離心混合，室溫兩小時，4°C孵育過夜。1.4連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化與特異性siRNA表達載體的篩選鑒定在100liL感受態(tài)DH5a中加入5nL連接產(chǎn)物，混勻，冰浴30min，42。C熱激90sec，冰浴中加入900(aLLB培養(yǎng)基，37"C培養(yǎng)1h，取50nL涂布于Amp抗性LB平板，37。C培養(yǎng)過夜。隨機挑取3個菌落，接種于5mL含Amp的LB試管，37'C培養(yǎng)過夜。然后使用QIAGEN公司的質(zhì)粒小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒，最后進行5a/I酶切鑒定。酶切反應(yīng)體系為10XH1pL，提取質(zhì)粒8nL，SalI1nL,反應(yīng)體積為10|aL。37。C孵育2h，取10pL在1.5%的瓊脂糖凝膠上進行電泳。鑒定可表達UL49基因特異性siRNA的重組載體，標(biāo)記為pVP22siRNAs。1.5特異性siRNA表達載體pVP22siRNAs轉(zhuǎn)染CEF細胞并觀察其對MDV病毒增殖的抑制作用轉(zhuǎn)染前一天，將長勢良好的原代CEF單層細胞用胰酶消化，以每孔5X104個細胞接種到24孔細胞培養(yǎng)板中(培養(yǎng)液為含10%血清的DMEM),待細胞長至6080%左右時即可用作轉(zhuǎn)染。用不含血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋特異性siRNA表達載體pVP22siRNA至0.1ug/uL。吸取33uL稀釋好的pVP22siRNA和837.1nL不含血清的DMEM培養(yǎng)基，混均，再加入9.9uL轉(zhuǎn)染試劑TransFast(Promega)，輕輕混勻，渦旋并低速離心，室溫放置10tnin。將培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液吸出，用無血清的DMEM洗滌2次并吸干。再將上述制備的混合液加入到培養(yǎng)板中，每孔200yL。置37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h后加入1mL含3%血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)8小吋，吸棄細胞培養(yǎng)液，用PBS輕輕洗兩遍，接種MDV1型超強毒RB1B株，每孔100PFU，置37t:、5%G02培養(yǎng)箱中吸附30min，每孔加入含2%血清的DMEM1mL繼續(xù)培養(yǎng)5天，觀察蝕斑形成情況。2.實驗結(jié)果2.1特異性siRNA表達載體的鑒定從鑒定電泳圖(附圖1)可以看出，含siRNA表達盒的UL49基因特異性siRNA表達載體已成功構(gòu)建。2.2不同siRNA表達載體轉(zhuǎn)染CEF細胞對MDV增殖的抑制作用結(jié)果見表2。從表2可以看出，序列4對MDV增殖的抑制效果最好，蝕斑抑制率達97%，序列1、5對MDV增殖的抑制效果較好，蝕斑抑制率均超過80%,序列6對MDV的增殖具有中等程度的抑制效果，蝕斑抑制率達66.67%，而序列2、3對MDV增殖的抑制效果較弱，蝕斑抑制率均低于50%。表2不同siRNA表達載體轉(zhuǎn)染CEF細胞對MDV增殖的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>序列表<110〉上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所<120〉抑制MDV增殖的RNA干擾靶點及其應(yīng)角<130><160>42<170>PatentInversion3.1<210〉1<211>21<212>DNA<213><400>1aaacatggaccatttaccgac21<210〉2<211>21<212>DNA<213><400>2aaacataaatcggcgaaagcc21<210>3<211>21<212〉DNA<213〉<400〉3aagatcctccgcgaacaaatg21<210〉4<211>21<212>DNA<213〉<400>4aaactattggaagagtctgga21<210>5<211〉21<212〉DNA<213><400>5aagagtctggattatcccagg21<210>6<211>21<212>DNA<213〉<400>6aaatctgaacgtacaagacgc權(quán)利要求1、抑制MDV增殖的RNA干擾靶點，其特征在于，具有下述任意一個特異性序列序列15’-AAACATGGACCATTTACCGAC-3’序列25’-AAACATAAATCGGCGAAAGCC-3’序列35’-AAGATCCTCCGCGAACAAATG-3’序列45’-AAACTATTGGAAGAGTCTGGA-3’序列55’-AAGAGTCTGGATTATCCCAGG-3’序列65’-AAATCTGAACGTACAAGACGC-3’2、針對權(quán)利要求1所述抑制MDV增殖的RNA干擾靶點序列獲得的siRNA。3、權(quán)利要求1所述靶點序列在制備防治MDV病毒感染藥物中的應(yīng)用。4、權(quán)利要求2所述siRNA在制備防治MDV病毒感染藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和預(yù)防獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。公開了一組針對MDV進行RNA干擾的靶點，以及根據(jù)這些靶序列獲得siRNA或反義RNA用于制備治療MDV的制劑。本發(fā)明在根據(jù)現(xiàn)有成果進行初篩的基礎(chǔ)上，通過siRNA表達載體轉(zhuǎn)染細胞的方法篩選出了MDV基因組6個RNA干擾的靶點，其中4號靶點對MDV增殖的抑制率達97％。本發(fā)明涉及基因治療的作用位點可用于篩選防治MDV感染的新型藥物。文檔編號C07H21/02GK101148466SQ200610116150公開日2008年3月26日申請日期2006年9月18日優(yōu)先權(quán)日2006年9月18日發(fā)明者姚惠娟,樊生超,王秀花,繆德年申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所