本發(fā)明涉及重組蛋白，具體涉及SLAMF6蛋白的制備方法。

背景技術(shù)：

SLAMF6是一種單鏈膜蛋白，屬于免疫球蛋白超家族里的CD2亞家族。SLAMF6在所有的NK細(xì)胞、T細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞中都有表達(dá)。SLAMF6是一個(gè)同源二聚體，SLAMF6與SH2D1A、SHPs共同介導(dǎo)了酪氨酸的磷酸化過(guò)程。SLAMF6作為協(xié)同受體在NK細(xì)胞的活化過(guò)程發(fā)揮重要作用，SLAMF6同樣在淋巴增生患者來(lái)源的NK細(xì)胞中介導(dǎo)了抑制反應(yīng)，故通過(guò)重組表達(dá)該蛋白、在體外研究該蛋白的功能就顯得非常重要。

按照宿主細(xì)胞類型，可將基因表達(dá)系統(tǒng)大致分為原核、酵母、植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，通常情況下采用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白，該方法與其它系統(tǒng)相比簡(jiǎn)便快捷，成本較低。但是膜蛋白的原核表達(dá)絕大多數(shù)情況下表達(dá)出的蛋白為包涵體形式，而且復(fù)性困難，并且利用原核系統(tǒng)表達(dá)出的蛋白沒(méi)有糖基化過(guò)程，很難生產(chǎn)出具有生物學(xué)功能的重組蛋白，傳統(tǒng)的生產(chǎn)SLAMF6蛋白的方法為原核表達(dá)，表達(dá)差、復(fù)性困難，且純化得到的蛋白缺乏糖基化，不能滿足需求。

與其它系統(tǒng)相比，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)在于能夠指導(dǎo)蛋白質(zhì)的正確折疊，提供復(fù)雜的N型糖基化和準(zhǔn)確的O型糖基化等多種翻譯后加工功能，因而表達(dá)產(chǎn)物在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面最接近于天然的高等生物蛋白質(zhì)分子。如今，哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)已成為多種基因工程藥物的生產(chǎn)平臺(tái)，如抗體、生長(zhǎng)因子、凝血因子、疫苗等。

有鑒于上述的缺陷，本設(shè)計(jì)人，積極加以研究創(chuàng)新，以期創(chuàng)設(shè)一種SLAMF6蛋白的制備方法，使其更具有產(chǎn)業(yè)上的利用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種表達(dá)量高且具有完全生物學(xué)活性的SLAMF6蛋白的制備方法。

本發(fā)明的SLAMF6蛋白的制備方法，包括將SLAMF6蛋白中基因進(jìn)行序列優(yōu)化的步驟。

進(jìn)一步的，SLAMF6蛋白的制備方法包括以下步驟：

(1)對(duì)SLAMF6蛋白中基因進(jìn)行序列優(yōu)化，獲得最適真核系統(tǒng)表達(dá)的序列，所述SLAMF6蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，編碼SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的DNA分子具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

(2)通過(guò)真核抗性篩選，得到穩(wěn)定高效表達(dá)SLAMF6蛋白的細(xì)胞株，真核抗性篩選方法為通過(guò)逐步改變真核抗生素的濃度，得到高表達(dá)的混合克隆；

(3)對(duì)細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)，優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)工藝，得到細(xì)胞株分泌物SLAMF6蛋白，提高重組蛋白的分泌和表達(dá)；細(xì)胞液在溫度37℃、濕度≥70％、CO₂濃度8％、轉(zhuǎn)速110rmp的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72h，然后轉(zhuǎn)移至溫度34℃、濕度≥70％、CO₂濃度8％、轉(zhuǎn)速110rmp的低溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，在培養(yǎng)72h和120h時(shí)分別取細(xì)胞液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)及計(jì)算細(xì)胞存活率，然后將葡萄糖溶液(SIGMA，儲(chǔ)液濃度200mg/L)加入細(xì)胞液內(nèi)，其濃度為1mg/L。

(4)通過(guò)對(duì)純化流程控制，得到高純度的蛋白，具體方法為通過(guò)提高柱效和柱子體積，提高SLAMF6蛋白的收率和縮短純化時(shí)間，1L細(xì)胞上清液中加11.688g固體NaCl至濃度為0.2mol/L，分離上清液，采用離心方法分離，在離心機(jī)轉(zhuǎn)速為12000rpm條件下，離心20min，分離出的上清液用0.22μm濾器過(guò)濾除菌、除雜質(zhì)，使樣品充分澄清；

選用GE品牌Ni Sepharose 6Fast Flow(FF)column，規(guī)格26mm*20mm，連接上AKTA Purification，正確運(yùn)行系統(tǒng)，使用5CV(倍柱體積)的0.2mol/L的NaOH沖洗層析系統(tǒng)，浸泡3h進(jìn)行內(nèi)毒素滅活，然后用至少10CV去熱源水沖洗層析系統(tǒng)至中性；使用5CV的控?zé)嵩?.2mol/L的NiSO₄充分沖洗層析系統(tǒng)，以活化層析介質(zhì)，然后用5CV去熱源水沖洗層析系統(tǒng)將游離的NiSO4沖洗干凈；使用5CV平衡Buff 1充分沖洗層析系統(tǒng)，然后將預(yù)處理后的樣品以5ml/min的流速進(jìn)行上樣，上樣完成后再用5CV平衡Buff 1充分沖洗層析系統(tǒng)；使用3CV平衡Buff 1和洗脫Buff 1，采用步級(jí)洗脫方式(分三步：E20、E50、E500)純化目標(biāo)蛋白。

取泳道4和泳道5合并，進(jìn)行分子篩精細(xì)純化，選用GE品牌Superdex 200，規(guī)格26mm*600mm，連接上AKTA Purification，正確運(yùn)行系統(tǒng)，使用3CV的控?zé)嵩此浞譀_洗層析系統(tǒng)，將層析系統(tǒng)沖洗干凈；使用3CV平衡緩沖液充分沖洗層析系統(tǒng)，然后將捕獲回收的樣品以2ml/min的流速進(jìn)行上樣，上樣完成后再用3CV平衡緩沖液洗脫，根據(jù)純化圖譜接收樣品餾分。

進(jìn)一步的，步驟(2)中，所述的高表達(dá)且含有真核篩選抗性的載體是具有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的真核表達(dá)載體。

進(jìn)一步的，所述真核抗生素為G418、Zerocin、潮霉素、Puro和hygro中的一種，優(yōu)選G418。

進(jìn)一步的，穩(wěn)定高效表達(dá)SLAMF6蛋白的所述細(xì)胞株為HEK293細(xì)胞、CHO-DG44、RAJI和JURKAT中的一種，HEK293細(xì)胞中優(yōu)選293A、293F。

本發(fā)明的一種SLAMF6蛋白，所述SLAMF6蛋白具有完全的生物學(xué)活性，純度大于95％，細(xì)菌內(nèi)毒素小于1EU/μg。

借由上述方案，本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明采用真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)SLAMF6蛋白，提供了獲得SLAMF6蛋白細(xì)胞株的方法，制備的SLAMF6蛋白具有很好的生物學(xué)活性，蛋白純度達(dá)到95％以上，能很好的滿足后續(xù)的研發(fā)需求；SLAMF6蛋白往往具有糖基化現(xiàn)象，根據(jù)該蛋白的特性，采用人HEK293細(xì)胞表達(dá)SLAMF6蛋白，更易獲得具有生物活性的蛋白，通過(guò)真核表達(dá)載體上的抗性基因，利用合適的G418濃度進(jìn)行抗性篩選，最終獲得了表達(dá)SLAMF6蛋白的細(xì)胞株；本發(fā)明采用哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)，通過(guò)對(duì)載體改造，用工程細(xì)胞HEK 293(人胚胎腎細(xì)胞)篩選出分泌表達(dá)該蛋白的細(xì)胞株，通過(guò)本發(fā)明制備SLAMF6蛋白，解決了原核表達(dá)SLAMF6蛋白表達(dá)差的問(wèn)題，通過(guò)分泌表達(dá)克服了復(fù)性困難的的問(wèn)題，同時(shí)人的細(xì)胞表達(dá)人的重組蛋白，具有更準(zhǔn)確的糖基化，滿足了研發(fā)需求；通過(guò)對(duì)現(xiàn)有的真核表達(dá)載體進(jìn)行改造，獲得高表達(dá)且具有抗性的表達(dá)載體，將SLAMF6蛋白基因克隆到改造的真核表達(dá)載體上，通過(guò)抗性篩選，獲得高表達(dá)SLAMF6蛋白的細(xì)胞株，通過(guò)改變培養(yǎng)條件，優(yōu)化純化流程，最終得到具有完全生物學(xué)活性的高純度SLAMF6蛋白，克服了原核表達(dá)該蛋白表達(dá)質(zhì)量差，無(wú)法糖基化的缺陷。

上述說(shuō)明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段，并可依照說(shuō)明書的內(nèi)容予以實(shí)施，以下以本發(fā)明的較佳實(shí)施例并配合附圖詳細(xì)說(shuō)明如后。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例一中SLAMF6蛋白純化電泳圖；

圖2是本發(fā)明實(shí)施例一中最終純化得到SLAMF6蛋白的電泳圖；

圖3是本發(fā)明實(shí)施例一中得到的SLAMF6蛋白活性測(cè)定數(shù)據(jù)圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。

以下列舉具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，應(yīng)理解，實(shí)施例并非用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法及未說(shuō)明配方的試劑均為按照常規(guī)條件或者制造商建議的條件進(jìn)行或配置。

實(shí)施例一

1、對(duì)SLAMF6蛋白序列進(jìn)行序列優(yōu)化，如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，獲得最適真核系統(tǒng)表達(dá)的序列。

2、通過(guò)真核抗性篩選，得到穩(wěn)定高效表達(dá)SLAMF6蛋白的細(xì)胞株，真核抗性篩選方法為通過(guò)逐步改變真核抗生素的濃度，得到高表達(dá)的混合克隆；

(1)G418最適濃度的確定，將狀態(tài)良好的293F細(xì)胞以0.5*10⁶個(gè)/ml進(jìn)行稀釋后加入96孔板內(nèi)，每個(gè)孔加入100μl細(xì)胞稀釋液，共加24個(gè)孔，將G418粉末(生工生物工程有限公司)配置成濃度為100mg/ml的儲(chǔ)液，96孔板內(nèi)分別加入G418，G418添加濃度為0、50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml、250μg/ml、300μg/ml、350μg/ml、400μg/ml、450μg/ml、500μg/ml、550μg/ml這12個(gè)濃度梯度，并做好平行對(duì)照，每日觀察細(xì)胞狀態(tài)，對(duì)比不同G418濃度的細(xì)胞狀態(tài)與陰性細(xì)胞狀態(tài)之間的差別，14天后，濃度梯度為400μg/ml的孔內(nèi)細(xì)胞死亡率達(dá)50％，可確定對(duì)于該批細(xì)胞，G418的篩選濃度為400μg/ml，篩選時(shí)間為14天；

(2)將狀態(tài)良好、適于轉(zhuǎn)染的293F細(xì)胞稀釋到1.0-1.2*10⁶個(gè)/ml，共20ml，取兩個(gè)滅菌后的1.5ml EP管，在管內(nèi)分別加入600μl的293Freestyle培養(yǎng)基(GIBCO公司)，取質(zhì)粒20μg加入其中一個(gè)EP管內(nèi)，標(biāo)記為質(zhì)?；旌衔?；取60μg聚醚酰亞胺(PEI)(廠商polysciences，濃度1mg/ml)加入另一個(gè)EP管內(nèi)，標(biāo)記為PEI混合物，兩個(gè)EP管分別混勻后靜置5min，將PEI混合液加入質(zhì)?；旌弦褐校靹蚝箪o置20min，在靜置的過(guò)程中可輕輕晃動(dòng)EP管使混合更加充分，標(biāo)記為轉(zhuǎn)染混合物；將轉(zhuǎn)染混合物勻速均勻的滴加入待轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)，邊滴加邊成圓周運(yùn)動(dòng)晃動(dòng)待轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞瓶，將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞放入溫度37℃、濕度≥70％、CO₂濃度8％、轉(zhuǎn)速110rmp的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；

(3)轉(zhuǎn)染過(guò)后的細(xì)胞液在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48小時(shí)后取樣進(jìn)行記數(shù)，計(jì)算細(xì)胞成活率以及觀察細(xì)胞狀態(tài)。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞液稀釋到0.5*10⁶個(gè)/ml，并分裝成4瓶，分別加入300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml的G418、以及不添加G418的陰性，每隔48小時(shí)分別取樣進(jìn)行計(jì)數(shù)傳代，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞存活率及觀察細(xì)胞狀態(tài)，以0.5*10⁶個(gè)/ml的密度進(jìn)行傳代，傳代過(guò)程中需要進(jìn)行換液，取所需體積母液放入15ml滅菌離心管中，以900-1100r/min的速度進(jìn)行離心，離心后去掉上清液加入293Freestyle培養(yǎng)基(GIBCO公司)，并加入對(duì)應(yīng)濃度的G418，在篩選過(guò)程中如果出現(xiàn)細(xì)胞存活率很低，狀態(tài)較差的情況，可將G418濃度降低100μg/ml進(jìn)行篩選。

3、細(xì)胞株放大培養(yǎng)及培養(yǎng)條件的優(yōu)化；

14天后，穩(wěn)定細(xì)胞株篩選完畢，將篩選完畢的穩(wěn)定細(xì)胞株進(jìn)行放大，放大過(guò)程中保持G418濃度，放大后及時(shí)將篩選完畢的細(xì)胞株進(jìn)行凍存，將穩(wěn)定細(xì)胞株放到所需的體積。將放大后的穩(wěn)定細(xì)胞株的細(xì)胞液在溫度37℃、濕度≥70％、CO₂濃度8％、轉(zhuǎn)速110rmp的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移至溫度34℃、濕度≥70％、CO₂濃度8％、轉(zhuǎn)速 110rmp的低溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，在培養(yǎng)第72h和120h時(shí)取細(xì)胞液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)及計(jì)算細(xì)胞存活率，然后加入配置好的葡萄糖溶液(SIGMA，儲(chǔ)液濃度200mg/L)加入細(xì)胞液內(nèi)，工作濃度為1mg/L；細(xì)胞液培養(yǎng)至7天時(shí)，取樣進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)及計(jì)算存活率，將細(xì)胞液以3500r/min的速度進(jìn)行離心，取上清液進(jìn)行純化。

4、純化；

(1)1L細(xì)胞上清液中加入11.688g固體NaCl至濃度為0.2mol/L，12000rpm下離心20min，取上清，離心上清液用0.22μm濾器過(guò)濾除菌、除雜質(zhì)，使樣品充分澄清；

(2)Ni Sepharose 6Fast Flow(FF)column捕獲，選用GE品牌Ni Sepharose 6Fast Flow(FF)column，規(guī)格26mm*20mm，連接上AKTA Purification，正確運(yùn)行系統(tǒng)；使用5CV的0.2mol/L NaOH沖洗層析系統(tǒng)，浸泡3h進(jìn)行內(nèi)毒素滅活，然后用至少10CV去熱源水沖洗層析系統(tǒng)至中性；使用5CV的控?zé)嵩?.2mol/L NiSO4充分沖洗層析系統(tǒng)，以活化層析介質(zhì)，然后用5CV去熱源水沖洗層析系統(tǒng)將游離的NiSO4沖洗干凈；使用5CV平衡溶液 1(20mmol/L聚丁烯(PB)、200mmol/L NaCl溶于水，pH 7.4)充分沖洗層析系統(tǒng)，然后將預(yù)處理后的樣品以5ml/min的流速進(jìn)行上樣，上樣完成后再用5CV平衡溶液1充分沖洗層析系統(tǒng)；使用3CV平衡溶液1和洗脫溶液1(20mmol/LPB、200mmol/LNaCl、500mmol/LImidazole溶于水，pH7.4)，采用步級(jí)洗脫方式(分三步：E20、E50、E500)純化目標(biāo)蛋白，結(jié)果如圖1所示，泳道1：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道2：上樣；泳道3：流穿；泳道4：20mmol/L咪唑洗脫；泳道5：50mmol/L咪唑洗脫；泳道6：500mmol/L咪唑洗脫；泳道7：500mmol/L咪唑洗脫；

(3)取泳道4和泳道5，合并后進(jìn)行分子篩精細(xì)純化，Superdex200精細(xì)純化，選用GE品牌Superdex 200，規(guī)格26mm*600mm，連接上AKTA Purification，正確運(yùn)行系統(tǒng)；使用3CV的控?zé)嵩此浞譀_洗層析系統(tǒng)，將層析系統(tǒng)沖洗干凈；使用3CV平衡緩沖液充分沖洗層析系統(tǒng)，然后將捕獲回收的樣品以2ml/min的流速進(jìn)行上樣，上樣完成后再用3CV平衡緩沖液洗脫；根據(jù)純化圖譜接收樣品餾分；合并餾分，100倍透析至保存體系(保存溶液:20mmol/L PB、150mmol/L NaCl溶于水，pH7.4)，純化出的蛋白樣品純度達(dá)95％以上，如圖2所示，泳道1：還原；泳道2：非還原；泳道3：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)。

對(duì)上述得到的SLAMF6蛋白活性測(cè)定：

PBMC細(xì)胞(近岸蛋白)計(jì)數(shù)，用GT-T551培養(yǎng)基(10％FBS)購(gòu)于北京同立海源生物公司，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為10*106/ml，向24孔板中加入100μl細(xì)胞液。將稀釋好的樣品加入到24孔板中，最后用GT-T551培養(yǎng)基(10％FBS)將體積補(bǔ)到500μl，37℃，培養(yǎng)3天。收集細(xì)胞，850rpm×5min，用GT-T551培養(yǎng)基(10％FBS)調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×106/ml。包板，用Anti-CD3(近岸蛋白)包板，濃度為5μg/ml，100μl/孔，37℃,培養(yǎng)2h。用PBS(1×)洗板2次，加入第3步處理好的細(xì)胞，100μl/孔。37℃過(guò)夜孵育。收集上清液，用ELISA試劑盒(博士德生物公司)檢測(cè)IFN-γ的量。經(jīng)測(cè)定，SLAMF6蛋白具有很好的生物學(xué)活性，如圖3所示，泳道1：SLAMF6處理的細(xì)胞；泳道2：非SLAMF6處理的細(xì)胞。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，并不用于限制本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和變型，這些改進(jìn)和變型也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。