專利名稱：硒代木瓜蛋白酶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化學(xué)領(lǐng)域，特別涉及制備具有高谷胱甘肽過氧化物酶活性的人工酶的方法。
背景技術(shù)：
谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)是生物體內(nèi)重要的含硒酶。由于它具有優(yōu)良的抗氧化性，對治療和預(yù)防克山病、心血管病、炎癥及癌癥等具有很大潛力。但由于該酶不穩(wěn)定、來源有限，大分子量會引起人體免疫反應(yīng)等缺點(diǎn)，極大限制了此酶醫(yī)藥學(xué)方面的開發(fā)及應(yīng)用，因此，對此酶的模擬越來越受到重視。
跟本發(fā)明最相接近的技術(shù)是，Hilvert小組做的硒化枯草桿菌蛋白酶，該硒化枯草桿菌蛋白酶是具有GPx活力的半合成的含硒酶。制備方法是以枯草桿菌蛋白酶、對甲苯基磺酰氟(PMSF)、硒氫化鈉(NaHSe)為原料，經(jīng)活化-硒化-后處理過程制得硒化枯草桿菌蛋白酶。具體的是，將5.5μmol、150mg的枯草桿菌蛋白酶溶于50mM哌嗪(PIPES)與10mM氯化鈣(CaCl2)的4.5mL溶液中，使之保持PH值為7.0，加入含150μL、20mg/mL對甲苯基磺酰氟(PMSF)的乙腈溶液，在25℃溫度下反應(yīng)1小時，得到的磺化酶由凝膠過濾柱葡聚糖G-25分離，用50mM PIPES和10mM CaCl2PH值7.0洗脫；蛋白峰溶于10mL，與等體積1M的NaHSe溶液混合，在惰性氣體保護(hù)下40℃保溫36小時；得到的蛋白由Sephadex G-25分離。
背景技術(shù)：
的工藝仍不夠簡單，所制得的硒化枯草桿菌蛋白酶的GPx活力遠(yuǎn)低于天然酶。

發(fā)明內(nèi)容
我們選用半胱氨酸蛋白酶家族中的代表-木瓜蛋白酶(Papain)作為蛋白骨架來制備GPx模擬物。達(dá)到制備工藝簡單，制備出穩(wěn)定性和水溶性好、活力高的GPx模擬物的目的。
木瓜蛋白酶的晶體結(jié)構(gòu)、酶學(xué)性質(zhì)、作用機(jī)制都已有較詳盡的研究。它由分子量為23350的一條肽鏈組成?；钚圆课坏?5位半胱氨酸和158位組氨酸對催化至關(guān)重要。它的底物專一性較差，主要有蛋白水解酶和脂酶活性等，本身不具有過氧化物酶活性。本發(fā)明的原理是利用木瓜蛋白酶活性部位催化機(jī)制與GPx的相似性及其底物結(jié)合部位對GSH的親合力，對木瓜蛋白酶底物結(jié)合部位進(jìn)行化學(xué)修飾，引入GPx的活性氨基酸—硒代半胱氨酸，從而使其具有高GPx活力。
本發(fā)明的硒代木瓜蛋白酶的合成是以木瓜蛋白酶和硒氫化鈉(NaHSe)為原料，工藝步驟分為硒化和后處理兩步。所說的硒化，是用磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解木瓜蛋白酶，再加入過量的硒氫化鈉，氮?dú)獗Ｗo(hù)下硒化15～55小時。硒化的溫度范圍為20℃-45℃。所說的后處理，是硒化后取出凍干，干粉用磷酸鹽緩沖液溶解，離心除硒后，經(jīng)除鹽，收集蛋白峰，凍干，即得硒代木瓜蛋白酶。
上述的磷酸鹽緩沖液(PBS)的濃度范圍是10～100mM(mmol/L)、PH值5.0～9.0?？刂莆瘻囟群蜁r間是必要的，溫度低于20℃，時間低于15小時，硒化效果不好，高于45℃，高于55小時，都能使酶變性嚴(yán)重，收率太低。當(dāng)用50mM pH7.0PBS溶解酶，35-40℃硒化36-40小時時，硒化效果更好。
為了得到含硒量不同，其GPx活力也不同的產(chǎn)品，可以在硒化之前，先進(jìn)行活化處理。即用磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解木瓜蛋白酶，加入對甲苯基磺酰氟(PMSF)的乙腈溶液，對木瓜蛋白酶進(jìn)行活化。PMSF分兩次加入，兩次之間間隔10～40分鐘。PMSF的用量可從0到酶摩爾數(shù)的100倍不等。在15～40℃溫度下活化1～4小時。當(dāng)PMSF的用量為0時，即表示不經(jīng)過活化處理過程。
本發(fā)明具有如下特點(diǎn)1.木瓜蛋白酶作為原料穩(wěn)定、易得、成本低、分離提純簡單方便，適用于工業(yè)生產(chǎn)。
2.硒代木瓜蛋白酶制備方法簡單、步驟少，可擴(kuò)大生產(chǎn)。
3.硒代木瓜蛋白酶模型的GPx活力高于已有文獻(xiàn)報道的大分子GPx模擬物，且高于天然兔肝GPx數(shù)倍。
4.硒代木瓜蛋白酶穩(wěn)定性好，具有優(yōu)良的抗氧化性，具有藥用潛力及工業(yè)應(yīng)用價值，如化妝品工業(yè)等。


圖1是硒代木瓜蛋白酶對線粒體膨脹度的影響具體實施方式
實施例1硒氫化鈉的制備將81mg NaBH4溶解于裝有1mL水的小瓶中，再將79mg硒粉緩慢加到NaBH4的溶液，此刻看到水中有大量氣體冒出，在室溫下反應(yīng)5分鐘。然后蓋上一插入針頭的膠蓋，直到反應(yīng)沒有氣體溢出，取下針頭，密封，用時用針吸出。反應(yīng)方程式為由于NaBH4與H+反應(yīng)，有少量H2Se氣體產(chǎn)生。為防止中毒，反應(yīng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。
實施例2硒代木瓜蛋白酶的制備木瓜蛋白酶(2mg)溶于2mL 50mM PBS，pH7.0，用注射器加入實施例1制備的200μL 1M的NaHSe溶液，氮?dú)獗Ｗo(hù)下40℃保溫36小時，然后取出凍干，干粉用10mM PBS(pH7.0)溶解，離心除硒后，經(jīng)Sephadex G-25除鹽，收集蛋白峰，凍干，即得硒代木瓜蛋白酶。得到的硒代木瓜蛋白酶比活可達(dá)44770.3U/μmol。
實施例3硒代木瓜蛋白酶的制備(經(jīng)活化再硒化)木瓜蛋白酶(2mg)溶于2mL 50mM PBS，pH7.0，50μL PMSF(20mg/mL乙腈溶液)分兩次隔30分鐘加入上述緩沖液，室溫保溫3小時，然后通高純氮約20分鐘以排除氧氣。用注射器加入實施例1制備的200μL 1M的NaHSe溶液，氮?dú)獗Ｗo(hù)下30℃保溫36小時。此后的后處理過程同實施例2。得到的硒代木瓜蛋白酶比活可達(dá)54018.7U/μmol。
實施例4硒代木瓜蛋白酶的GPX活力根據(jù)Wilson方法測量了硒化前和硒化后酶的GPX活力[4]。反應(yīng)在37℃，反應(yīng)體系為500μL，含50mM PBS，pH7.0、1mM EDTA、1mMNaN3、1mM GSH、1U GSH還原酶和10-50nM酶。反應(yīng)預(yù)保溫7分鐘，加0.25mM NADPH再保溫3分鐘，然后加入0.5mM氫過氧化物啟動反應(yīng)。在340nm處監(jiān)測NADPH被氧化時吸光度值的降低。以緩沖液代替人工酶為空白以消除非酶促反應(yīng)。GPX活力單位定義為37℃每分鐘每消耗1微摩爾NADPH所需的人工酶的量。酶活力表示為每摩爾酶模擬物的活力單位數(shù)(U/μmol)。硒代枯草桿菌蛋白酶對芳香巰基化合物具有特異親和性，因而對于芳香巰基化合物表現(xiàn)出較高的催化活性，而對GPX天然底物GSH只表現(xiàn)出很低的活性。而硒代木瓜蛋白酶的GPx活力遠(yuǎn)高于硒化枯草桿菌蛋白酶，從表一中可以看出它甚至比天然兔肝GPx活力還高好幾倍。
表一酶 底物 比活(U/μmol)木瓜蛋白酶 H2O20硒代木瓜蛋白酶 H2O254018.7天然兔肝GPx H2O25780實施例5硒代木瓜蛋白酶的生物學(xué)效應(yīng)主要測定GPX模擬物對心肌線粒體抗氧化損傷的保護(hù)作用。
從新鮮牛心中提取線粒體，線粒體濃度用考馬斯亮蘭法確定，標(biāo)準(zhǔn)蛋白為牛血清白蛋白。
在pH7.4的磷酸鉀緩沖液中，含有0.125M KCl、1mM MgCl2、5mM谷氨酸鹽、線粒體(0.5mg/ml)、1μM GSH及GPX模擬物，于37℃保溫。加入終濃度為0.5mM Vc和12.5μM FeSO4后開始振蕩，并記時，分別于不同時間取出測膨脹度。不含模擬物的為損傷組，相同條件下只含線粒體不含模擬物、Vc和FeSO4的作為空白對照組。
線粒體膜受損傷后其形態(tài)發(fā)生變化，于520nm波長測其渾濁度變化。橫坐標(biāo)為時間，縱坐標(biāo)為光密度。光密度下降表示線粒體膨脹度增加。圖1中(■▲●)分別表示空白對照組、損傷組、含硒代木瓜蛋白酶的實驗組的線粒體膨脹度隨時間的增加。由圖可見，實驗組曲線下降趨勢明顯小于損傷組，說明硒代木瓜蛋白酶可以大大抑制線粒體膨脹，明顯減輕線粒體損傷，具有抗氧化活性，是一種很好的GPx模擬物。
權(quán)利要求
1.一種硒代木瓜蛋白酶的制備方法，是以硒氫化鈉為原料，工藝步驟為硒化和后處理兩步；其特征在于，原料還有木瓜蛋白酶；所說的硒化，是用磷酸鹽緩沖液溶解木瓜蛋白酶，再加入過量的硒氫化鈉，氮?dú)獗Ｗo(hù)下硒化15～55小時，硒化的溫度范圍為20℃-45℃；所說的后處理，是硒化后取出凍干，干粉用磷酸鹽緩沖液溶解，離心除硒后，經(jīng)除鹽，收集蛋白峰，凍干，得硒代木瓜蛋白酶。
2.按照權(quán)利要求1所述的硒代木瓜蛋白酶的制備方法，其特征在于，在硒化之前，先進(jìn)行活化處理；用磷酸鹽緩沖液溶解木瓜蛋白酶，加入對甲苯基磺酰氟的乙腈溶液，對木瓜蛋白酶進(jìn)行活化；對甲苯基磺酰氟分兩次加入，兩次之間間隔10～40分鐘.。
3.按照權(quán)利要求1或2所述的硒代木瓜蛋白酶的制備方法，其特征在于，硒氫化鈉的制備過程是將NaBH4溶解于裝有水的小瓶中，再將硒粉緩慢加到NaBH4的溶液，在室溫下反應(yīng)5分鐘；然后蓋上一插入針頭的膠蓋，直到反應(yīng)沒有氣體溢出，取下針頭，密封。
全文摘要
本發(fā)明的硒代木瓜蛋白酶的制備方法屬于生物化學(xué)領(lǐng)域，特別涉及制備具有高谷胱甘肽過氧化物酶活性的人工酶的方法。以木瓜蛋白酶、硒氫化鈉為原料，工藝步驟分為硒化和后處理兩步。所說的硒化，是用磷酸鹽緩沖液溶解木瓜蛋白酶，再加入過量的硒氫化鈉，氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn)行硒化；所說的后處理，是硒化后凍干，干粉用磷酸鹽緩沖液溶解，離心除硒后，經(jīng)除鹽，收集蛋白峰，凍干得硒代木瓜蛋白酶。硒化前可以進(jìn)行活化處理。本發(fā)明具有如下特點(diǎn)制備方法簡單、步驟少；原料穩(wěn)定、易得、成本低、分離提純簡單方便；制得的產(chǎn)物穩(wěn)定性好，具有優(yōu)良的抗氧化性，谷胱甘肽過氧化物酶活力高，適用于工業(yè)生產(chǎn)，具有藥用潛力及工業(yè)應(yīng)用價值。
文檔編號C12N9/08GK1431301SQ0311083
公開日2003年7月23日 申請日期2003年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月10日
發(fā)明者俞慧君, 羅貴民, 劉俊秋, 任曉君, 沈家驄 申請人:吉林大學(xué)