本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種紫花苜蓿MsPDS沉默體系。

背景技術(shù)：

病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)是植物體中天然存在的一種抵御外源核酸入侵的防御系統(tǒng)，正常情況下保護(hù)植物免受病毒的侵染。植物的這種防御機制可被病毒RNA激活，屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象。如果在病毒載體中插入目標(biāo)片段，侵染寄主植物后，植物會表現(xiàn)出目標(biāo)基因功能喪失或表達(dá)水平下降的表型。利用這種機制，可以確定基因功能。這種技術(shù)是一種簡單、快速、高通量的分析已知序列基因功能的方法。

類胡蘿卜素是一種由異戊二烯組成的萜類化合物，在動植物中都有重要的生理功能和生物活性。類胡蘿卜素在光合作用中起著至關(guān)重要的作用，它們是光能的吸收與傳遞和光反應(yīng)中心的重要結(jié)構(gòu)成分。類胡蘿卜素既是重要的輔助色素，幫助葉綠素接收光能，它們在高溫、強光下還能通過葉黃素循環(huán)，以非輻射的方式耗散PSII的過剩能量，保護(hù)反應(yīng)中心、天線色素蛋白復(fù)合物、Chl等免受破壞。其數(shù)量的變化必將給光合作用帶來影響。而PDS(八氫番茄紅素脫氫酶)基因是影響胡蘿卜素合成通路上的關(guān)鍵基因，具有保護(hù)葉綠素免受漂白的作用。若PDS基因發(fā)生沉默，其mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著降低，會導(dǎo)致類胡蘿卜素合成途徑被阻斷，從而使被侵染的植物新生葉片表現(xiàn)出白化效應(yīng)，可以直接用肉眼觀察，常被作為各種病毒VIGS體系的指示基因，來驗證VIGS體系在植物中沉默成功。

紫花苜蓿(Medicago sativa L.)素有“牧草之王”的美稱，是世界上利用最早、栽培最廣的一種優(yōu)良的豆科牧草，在我國西北干旱半干旱地區(qū)的畜牧業(yè)發(fā)展和生態(tài)環(huán)境建設(shè)中發(fā)揮著極其重要的作用，研究紫花苜?？共?，抗旱，耐寒等抗逆基因?qū)τ谧匣ㄜ俎５倪z傳改良，高效育種具備重要意義。目前在紫花苜蓿中使用的轉(zhuǎn)基因方法鑒定基因功能耗時較長，耗費較大，缺乏一種快速，高效的鑒定體系。在國際上，尚未有利用VIGS體系鑒定紫花苜?；蚬δ艿膱蟮?。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，實現(xiàn)簡單、快速、高通量分析、鑒定紫花苜蓿MsPDS基因，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

1、鑒定紫花苜蓿MsPDS基因的VIGS沉默體系；

2、紫花苜蓿MsPDS基因的VIGS沉默體系的構(gòu)建方法；

3、鑒定紫花苜蓿MsPDS基因的方法。

為實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，本發(fā)明第一方面提供的一種鑒定紫花苜蓿MsPDS的VIGS沉默體系，具有如SEQ ID NO.1所示的基因序列。

為實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，本發(fā)明第二方面提供的一種構(gòu)建第一方面所述的沉默體系的方法，包括：

利用添加了Spe I酶切位點和Pst I酶切位點的特異性引物進(jìn)行紫花苜蓿cDNA片段PCR擴增，純化后得到cDNA片段；

利用VIGS病毒載體構(gòu)建具有紫花苜蓿MsPDS基因的重組質(zhì)粒，經(jīng)驗證成功后，得到具有如SEQ ID NO.1所示的基因序列的沉默體系。

其中，所述特異性引物由以下步驟得到：

根據(jù)蒺藜苜蓿MtrPDS基因設(shè)計擴增引物；

利用提取的紫花苜蓿RNA得到紫花苜蓿cDNA為模板，依次進(jìn)行使用擴增引物PCR擴增、RACE處理、與T載體連接，得到如SEQ NO.2、SEQ NO.3、SEQ NO.4所示的紫花苜蓿PDS基因的三種剪接體序列；

將得到的剪接體序列通過與蒺藜苜蓿MtrPDS基因序列比對找到保守區(qū)域，根據(jù)保守區(qū)域基因序列設(shè)計得到特異性引物。

特別是，所述RACE處理時設(shè)計的RACE引物序列為：

5’RACE-PDS：GACAAGCCAGCCAGTCCTGCACCAGC

3’RACE-PDS：AGAAGCATGGTTCTAAGATGGCCTT。

特別是，所述擴增引物包括：

第一擴增引物：MsPDS 1F:GGCAAATTGGGCCAAAAACC

MsPDS 1R:CACCGCCCAAGGACTGAATA

第二擴增引物：MsPDS 2F:CAGGACTGGCTGGTTTGTCAA

MsPDS 2R:ACCTGTACAATAGCCTGTGCA

尤其是，所述添加了Spe I酶切位點和Pst I酶切位點的特異性引物為：

pMsPDS 1F:GGACTAGTGGCAAATTGGGCCAAAAACC；

pMsPDS 1R:AACTGCAGCACCGCCCAAGGACTGAATA。

特別是，所述VIGS病毒載體為豌豆早褐病毒。

為實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，本發(fā)明第三方面提供的一種鑒定紫花苜蓿MsPDS基因的方法，其尤其使用了第一方面所述的沉默體系。

其中，第三方面提供的鑒定紫花苜蓿MsPDS基因的方法包括：

將沉默體系的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)PCR鑒定陽性后，注射到已展開兩片子葉的植株上；

將所述植株采用水培方式進(jìn)行培養(yǎng)后，對植株進(jìn)行表型觀察及檢測。

尤其是，所述將植株采用水培方式進(jìn)行培養(yǎng)還包括23℃條件下光照培養(yǎng)16h，19℃條件下黑暗培養(yǎng)8h。

其中，將所述植株采用水培方式進(jìn)行培養(yǎng)僅需26天。

有益效果：

1、本發(fā)明在本領(lǐng)域中首次實現(xiàn)了紫花苜蓿MsPDS基因沉默體系的構(gòu)建，獲得了具有使紫花苜蓿MsPDS基因沉默的沉默體系。

2、本發(fā)明使用添加了Spe I酶切位點和Pst I酶切位點的特異性引物成功利用蒺藜苜蓿的MtrPDS基因來克隆紫花苜蓿MsPDS基因，并利用豌豆早褐病毒成功構(gòu)建紫花苜蓿MsPDS基因沉默體系，通過對植株RNA進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，利用豌豆早褐病毒構(gòu)建的沉默體系確實在植株內(nèi)進(jìn)行了繁殖傳播，如圖4所示，注射了菌液的植株都可以檢測到病毒條帶，可見本發(fā)明構(gòu)建的沉默體系可以在植株內(nèi)發(fā)生繁殖傳播。

3、本發(fā)明構(gòu)建的沉默體系侵染植株26天后，植株便開始出現(xiàn)了漂泊癥狀，白化現(xiàn)象沿葉脈向四周蔓延，可見其效果顯著，沉默作用明顯，可見，沉默體系不但在植株發(fā)生了繁殖傳播，而且使植株的PDS基因表達(dá)水平下降，葉綠素被漂白。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例1制備的紫花苜蓿MsPDS基因三種剪接體的序列圖譜示意圖；

圖2是本發(fā)明實施例1構(gòu)建的紫花苜蓿的pCAPE Ms PDS沉默載體結(jié)構(gòu)示意圖；

圖3是本發(fā)明實施例2將沉默載體侵染蒺藜苜蓿后出現(xiàn)的表型形狀，其中A、B為試驗組植株，C為對照組植株；

圖4是本發(fā)明實施例2檢測侵染植株內(nèi)的病毒表達(dá)結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖5是本發(fā)明實施例2采用qRT-PCR檢測pCAPE病毒表達(dá)的MsPDS片段的表達(dá)量結(jié)果；

圖6是本發(fā)明實施例2采用qRT-PCR檢測蒺藜苜蓿Mtr PDS沉默效果。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明所講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。

本發(fā)明所用的試劑及儀器如無特別說明，均為市售產(chǎn)品，其中，本發(fā)明使用的質(zhì)粒由丹麥奧胡斯大學(xué)提供。

實施例1沉默體系的構(gòu)建

1、紫花苜蓿MsPDS基因的克隆

現(xiàn)有技術(shù)中并沒有公開紫花苜?；蚪M，更沒有涉及紫花苜蓿MsPDS基因序列的相關(guān)資料報道，因此本發(fā)明利用蒺藜苜蓿MtrPDS基因來克隆紫花苜蓿MsPDS基因，具體操作方法如下：

1.1設(shè)計引物

根據(jù)蒺藜苜蓿MtrPDS基因mRNA序列(NCBI登錄號：XM_003601686，XM_003601688)設(shè)計兩對特異引物，分別為：

MsPDS 1F:GGCAAATTGGGCCAAAAACC

MsPDS 1R:CACCGCCCAAGGACTGAATA

MsPDS 2F:CAGGACTGGCTGGTTTGTCAA

MsPDS 2R:ACCTGTACAATAGCCTGTGCA。

1.2基因克隆

使用Takara試劑盒提取紫花苜蓿RNA，提取步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行，并按照Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反轉(zhuǎn)錄引物使用混合引物。以紫花苜蓿cDNA為模板，利用MsPDS 1F/1R為引物進(jìn)行PCR擴增，測序得到982bp的片段，利用MsPDS 2F/2R為引物PCR擴增，測序得到1291bp的片段，其中，PCR酶使用天根公司生產(chǎn)的Tiangen master mix，PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，34個循環(huán)；72℃復(fù)性5min；4℃保存。分析得到兩個PCR片段并拼接得到紫花苜蓿PDS基因大部分的編碼區(qū)序列1604bp。

由于紫花苜蓿PDS基因的全長未拿到，進(jìn)一步使Takara公司生產(chǎn)的RACE試劑盒RACE 5’/3’Kit User Manual來繼續(xù)擴增片段，方法參照試劑盒說明書，設(shè)計的RACE引物序列如下：

5‘RACE-PDS：GACAAGCCAGCCAGTCCTGCACCAGC

3'RACE-PDS-1：AGAAGCATGGTTCTAAGATGGCCTT

RACE產(chǎn)物連接T載體后測序，其中5’RACE產(chǎn)物存在一種，3’RACE存在兩種，再結(jié)合之前得到的編碼區(qū)序列，分析認(rèn)為紫花苜蓿PDS基因應(yīng)該存在三種剪接體，分別命名為MsPDS 1，MsPDS 2，MsPDS 3，序列如Seq NO 1，全長2007bp，Seq NO 2，全長1446bp，Seq NO 3，全長1756bp，序列圖譜示意圖見圖1。

將得到的剪接體序列與蒺藜苜蓿MtrPDS基因序列比對找到保守區(qū)域，發(fā)現(xiàn)下述引物即可作為保守區(qū)域的特異性引物：

MsPDS 1F:GGCAAATTGGGCCAAAAACC

MsPDS 1R:CACCGCCCAAGGACTGAATA。

2沉默體系的構(gòu)建

2.1目的基因的獲得

在步驟1.1設(shè)計的MsPDS 1F/1R引物上添加酶切位點，具體是在MsPDS 1F上添加Spe I酶切位點，在MsPDS 1R上添加Pst I酶切位點，添加后得到引物如下所示：

pMsPDS 1F:GG ACTAGTGGCAAATTGGGCCAAAAACC；

pMsPDS 1R:AACTGCAGCACCGCCCAAGGACTGAATA。

以步驟2.1反轉(zhuǎn)錄得到的紫花苜蓿cDNA為模板，使用加入酶切位點的pMsPDS 1F/1R為引物進(jìn)行PCR擴增得到PCR產(chǎn)物，約1000bp左右片段，其中，PCR酶使用天根公司生產(chǎn)的Tiangen master mix，PCR反應(yīng)程序為：94℃，3min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，90s，34個循環(huán)；72℃，5min；4℃，∞。使用Takara PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化回收PCR產(chǎn)物，得到紫花苜蓿基因片段，即目的基因，純化方法參照試劑盒說明書。

2.2重組質(zhì)粒

本發(fā)明使用的VIGS病毒載體為豌豆早褐病毒，該病毒為RNA病毒，具有兩條RNA鏈，RNA1和RNA2，分別構(gòu)建在兩個質(zhì)粒上：pCAPE-1和pCAPE-2，用于沉默的片段構(gòu)建在RNA2鏈上，原有質(zhì)粒為pCAPE-PsPDS，一般將PsPDS片段切下來，再將要研究的基因片段連接上去。具體實施方法如下：

使用NEB公司生產(chǎn)的酶切酶Spe I，Pst I同時對步驟2.1.1獲得的目的基因產(chǎn)物和質(zhì)粒pCAPE-PsPDS進(jìn)行雙酶切，酶切體系50uL，酶切溫度37℃，時間30min，對目的基因酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化處理，對質(zhì)粒使用Takara膠回收試劑盒切膠回收載體片段，方法參照試劑盒說明書。

然后使用NEB T4快速連接酶連接載體和基因片段，方法參照試劑盒說明書，反應(yīng)體系：20uL，連接溫度25℃，連接時間10min，得到連接產(chǎn)物。取5uL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(DH5α，天根公司)，菌液PCR鑒定陽性克隆后，提取質(zhì)粒測序驗證，得到連接成功的重組質(zhì)粒，并命名為pCAPE-MsPDS，得到沉默體系，如圖2所示。

實施例2紫花苜蓿MsPDS基因的鑒定

1、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

將實施例1制備的沉默體系，即實施例1中步驟2.2構(gòu)建的重組質(zhì)粒pCAPE-MsPDS和pCAPE-1各lμg分別加入到0.1mL農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min，使重組質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞中，再將其放入液氮中速凍1min，立即37℃水浴5min，使細(xì)胞融化，再向細(xì)胞中加800μL無抗生素的液體LB液體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)2～3h，轉(zhuǎn)速為150r/min。然后在4000r/min轉(zhuǎn)速條件下離心1min，棄去上清，使其重新懸浮于100μLLB培養(yǎng)基中，得到質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌菌液。取100μL菌液均勻地涂于含50mg/L卡那霉素(kana，Sigma)和50mg/L利福平(rif，Sigma)的抗性LB平板上，28℃培養(yǎng)2天，挑取單菌落接種到1mL相應(yīng)抗性液體LB中，28℃震蕩培養(yǎng)過夜，對其進(jìn)行PCR鑒定陽性克隆菌液后，得到GV3101-pCAPE MsPDS農(nóng)桿菌菌液，及GV3101-pCAPE 1農(nóng)桿菌菌液，將其直接接種至新鮮LB中，準(zhǔn)備侵染。

2、侵染植株

2.1材料準(zhǔn)備

取干凈培養(yǎng)皿，鋪上濾紙，用蒸餾水潤濕，撒上若干打磨過的蒺藜苜蓿種子，放置于光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為：光照16h,24℃，黑暗8h，20℃。發(fā)芽后7天，等兩片子葉完全展開后，可用于侵染實驗。

2.2侵染菌液準(zhǔn)備

將農(nóng)桿菌菌液GV3101-pCAPE MsPDS和GV3101-pCAPE MsPDS接種至50～100mL，50mg/L卡那霉素，25mg/L利福平LB液體培養(yǎng)基里，28℃，過夜培養(yǎng)。離心收集菌體后，去除上清液，分別使用含200uM乙酰丁香酮，10mMMES和10mM MgCl₂的重懸液重懸菌體至OD＝1.0左右，28℃，避光靜置3h以上。

2.3菌液注射植株

將GV3101-pCAPE 1和GV3101-pCAPE MsPDS重懸液都按體積比1：1混合。先用1mL注射器針頭在蒺藜苜蓿幼苗子葉背面輕輕劃線，再用去掉針頭的1mL注射器，將GV3101-pCAPE 1和GV3101-pCAPE MsPDS混合液注射入子葉內(nèi)，設(shè)為實驗組，僅注射不含菌液的重懸液設(shè)為對照組。將注射后的植株使用水培方式培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為光照16h,23℃，黑暗8h，19℃，濕度70％，定期更換培養(yǎng)液。

3、表型觀察及檢測

3.1注射菌液26天后，蒺藜苜蓿實驗組開始出現(xiàn)了漂白癥狀，白化現(xiàn)象沿葉脈向四周蔓延，說明沉默載體開始發(fā)揮作用，如圖3A和3B所示，而對照組沒有任何變化如圖3C所示，沒有出現(xiàn)白化現(xiàn)象。

3.2病毒檢測

取對照組葉片，編為CK組，取實驗組白化葉片編為W(White)組，每組設(shè)3個重復(fù)，使用Takara RNA提取試劑盒分別提取CK組與W組葉片的RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，方法參照試劑盒說明書，反轉(zhuǎn)錄引物使用混合引物。設(shè)計特異引物用于PCR檢測病毒，引物如下：

pCAPE 1F:GTGTTGTCAAACGTGGCTGG

pCAPE 1R:CCGACTTCATCTCAGCGTGT

PCR反應(yīng)程序：94℃，3min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，30s，34cycles；72℃，5min；4℃，∞。

檢測結(jié)果如圖4，沒有注射菌液的CK1～3都沒有檢測到病毒條帶，注射了菌液的W1～3都能檢測到病毒條帶，說明該病毒載體確實在蒺藜苜蓿實驗組里進(jìn)行了繁殖傳播。

3.3病毒載體沉默效果檢測

為了檢測病毒載體的沉默效果，采用熒光定量的實驗來檢測，設(shè)計兩對引物qPDS 1F/1R，qPDS 2F/2R，qPDS 1F/1R設(shè)計在病毒表達(dá)MsPDS片段上，用于檢測病毒表達(dá)基因片段的表達(dá)量，也反映了病毒的具體積累量，qPDS 2F/2R用于檢測蒺藜苜蓿PDS的表達(dá)量，來反映病毒載體的沉默效果，內(nèi)參使用actin 2，引物序列如下：

qPDS 1F：GGGCATTCCTGAACGGGTAA

qPDS 1R：CACCGCCCAAGGACTGAATA

qPDS 2F：TACTAACTAATGGGAAGGTG

qPDS 2R:TCTGGAAATAAGGAACCC

actin F：GATGCTGAGGATATTCAACCCC

actin R：CCATGACACCAGTATGACGAGG

熒光定量儀器為7500，酶為Takara公司的GreenⅡ。

檢測結(jié)果如圖5和圖6所示，由圖5可以看出蒺藜實驗組病毒表達(dá)的MsPDS片段的表達(dá)量是對照組的幾十倍，也反映了病毒在實驗組葉片里得到了大量的積累，由圖6可以看出蒺藜苜蓿實驗組的MtrPDS基因的表達(dá)量相對于對照組顯著降低，表明蒺藜MtrPDS的表達(dá)被抑制，結(jié)合蒺藜苜蓿實驗組的表型，說明本實驗里克隆的紫花苜蓿MsPDS基因是正確的，本體系確實可以用于鑒定紫花苜蓿的基因功能。

盡管上述對本發(fā)明做了詳細(xì)說明，但不限于此，本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明的原理進(jìn)行修改，因此，凡按照本發(fā)明的原理進(jìn)行的各種修改都應(yīng)當(dāng)理解為落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。