本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種過表達(dá)zeb2基因質(zhì)粒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

急性腎損傷(acutekidneyinjury，aki)是臨床各科室最常見的急危重癥之一，可由多種原因引起，有關(guān)aki的發(fā)生機(jī)制一直是腎臟病領(lǐng)域關(guān)注的重要科學(xué)問題。目前認(rèn)為，aki也是一種炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的疾病，但缺血再灌注啟動(dòng)腎組織炎癥反應(yīng)的機(jī)制尚不完全清楚。從輕微血肌酐升高到嚴(yán)重?zé)o尿性aki，aki程度和臨床表現(xiàn)不一而足，aki與患者病死率、慢性腎臟病(ckd)的發(fā)生以及維持性透析率密切相關(guān)。流行病調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，aki發(fā)病率逐年增高，已由1988年的610例(每百萬人)增加至2009年的2888例(每百萬人)，在普通住院患者中aki發(fā)病率為3％-5％，而在icu中更高達(dá)30％-50％；同時(shí)對于aki的預(yù)后及轉(zhuǎn)歸較以往有了更加深入的認(rèn)識。因此，如何防治aki的發(fā)生、發(fā)展以及尋找有效的治療aki的手段和藥物顯得尤為重要。

基因工程，又稱為基因重組技術(shù)，是二十世紀(jì)七十年代發(fā)展起來的在體外對dna進(jìn)行操作的一門技術(shù)，廣泛用于疾病基礎(chǔ)研究、基因治療、基因免疫、基因疫苗等。其三要素分別為：酶、目的基因、載體。而真核表達(dá)載體是基因工程中用于構(gòu)建真核基因表達(dá)系統(tǒng)的一種載體，近幾十年來，各國學(xué)者圍繞真核表達(dá)載體進(jìn)行了各種疾病、基因等相關(guān)研究，在基因工程方面做了大量工作，為醫(yī)學(xué)科學(xué)研究開辟了嶄新途徑。

zeb2又叫zfhx1b、sip1等，屬于鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子中的e盒結(jié)合鋅指蛋白(zincfingere-boxbindinghomeobox)家族的成員，是胚胎發(fā)育中必需的轉(zhuǎn)錄因子，首次關(guān)于zeb2的報(bào)道是在非洲爪蟾的胚胎中發(fā)現(xiàn)了zeb2的mrna。zeb2基因定位于染色體2q22.3上，由zfhx1b基因所編碼，包含9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子，cds區(qū)為3645bp。zeb2由1215個(gè)氨基酸殘基組成，其分子量大約為136kd，包含2個(gè)鋅指簇(zincfingercluster)和連接這兩個(gè)鋅指簇的可變序列。n端和c端中的每一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)都能夠獨(dú)立結(jié)合目的基因的受調(diào)節(jié)區(qū)域中的5’-cacct序列。zeb2屬于轉(zhuǎn)錄因子，最初的研究認(rèn)為定位于核內(nèi)，最近的研究表明，在胞漿及胞核中均有表達(dá)。它參與細(xì)胞生長、分化、凋亡、胚胎發(fā)育及炎癥反應(yīng)等多種生命活動(dòng)的調(diào)控。

人源zeb2基因已在genbank注冊，注冊號bc-127102.1，定位于2q22.3，全長3912bp，其中cds序列3645bp，編碼1215個(gè)氨基酸。人源zeb2基因的組織表達(dá)譜分析顯示：該基因在人的許多腫瘤(胃癌、乳腺癌、鼻咽癌等)細(xì)胞以及肥大細(xì)胞中均有表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)，zeb2基因在大鼠腹腔巨噬細(xì)胞，人單核細(xì)胞thp-1中也有表達(dá)。

因此，為了進(jìn)一步研究zeb2基因功能，目前急需一種有助于zeb2基因功能研究，并且為其對炎癥在aki病程中的作用提供研究基礎(chǔ)的有用分子生物學(xué)工具。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種有助于zeb2基因功能研究，并且為其對炎癥在aki病程中的作用提供研究基礎(chǔ)的過表達(dá)zeb2基因質(zhì)粒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種過表達(dá)zeb2基因質(zhì)粒，由zeb2基因cds序列與pegfp-c2真核表達(dá)載體的重組構(gòu)建而成；其核苷酸如序列表seqidno:1，位于zeb2基因的第134-3778位；氨基酸序列如序列表seqidno:2所示。

一種構(gòu)建上述過表達(dá)zeb2基因質(zhì)粒的方法，包括如下步驟：

(1)裂解hk-2細(xì)胞，提取rna進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到zeb2cdna；

(2)pcr擴(kuò)增出人工zeb2基因的cds序列片段；

(3)zeb2基因的cds序列片段的純化；

(4)對所獲得的基因片段和pegfp-c2真核表達(dá)載體進(jìn)行bamhi和xbai雙酶切，并進(jìn)行連接；

(5)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌tg1中，并挑去陽性克隆進(jìn)行培養(yǎng)，然后抽提質(zhì)粒。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一，所述步驟(1)中提取rna后，對其進(jìn)行變性處理，具體步驟為：將rna在65℃中放置5-10min后，轉(zhuǎn)移至冰水中放置。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一，所述步驟(1)中逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)依照rtmastermix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的產(chǎn)品說明書進(jìn)行，逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系包括：5×rtmastermix、rna、nuclease-freewater；具體步驟如下：

(1)配制反應(yīng)體系：5×rtmastermix2μl+rna2μl+nuclease-freewater6μl；

(2)將上述反應(yīng)體系放置37℃，并作用15min；

(3)將上述反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移至50℃，并作用5min；

(4)將上述反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移至98℃，并作用5min；

(5)將上述反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移至4℃，冷卻后凍存，即得到cdna。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一，所述步驟(2)中pcr擴(kuò)增cds序列片段時(shí)所需的上、下游引物序列如下：

上游引物：zeb2-f:5’-ggggtaccccatgaagcagccgatcat-3’

下游引物：zeb2-r:5’-gctctagagctcacatgccatcttcc-3’。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一，所述步驟(2)中pcr擴(kuò)增反應(yīng)根據(jù)primestarmax擴(kuò)增酶產(chǎn)品說明書進(jìn)行，pcr的反應(yīng)體系包括：2×primestarmax、cdna樣品、上下游引物、高純水；具體步驟如下：

(1)配制反應(yīng)體系：2×primestarmax25μl+cdna1μl+引物各1μl+高純水22μl；

(2)將上述反應(yīng)體系輕輕混勻后放入pcr儀器，設(shè)置如下程序運(yùn)行；

(3)將上述pcr產(chǎn)物進(jìn)行1.2％瓊脂糖凝膠電泳；

(4)觀察結(jié)果并回收目的dna片段。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一，所述步驟(4)中zeb2的pcr產(chǎn)物和pegfp-c2載體進(jìn)行bamhi和xbai的雙酶切反應(yīng)依照限制性內(nèi)切酶產(chǎn)品說明書進(jìn)行，酶切體系如下：bamhi限制性內(nèi)切酶、xbai限制性內(nèi)切酶、10×buffertango、zeb2的pcr產(chǎn)物或pegfp-c2載體；具體步驟如下：

(1)配制反應(yīng)體系：10×buffertango2μl+bamhi和xbai各0.5μl+zeb2的pcr產(chǎn)物或和pegfp-c2載體各7μl；

(2)將上述反應(yīng)體系放置37℃水浴鍋中，并作用4-6h；

(3)將上述酶切產(chǎn)物進(jìn)行1-1.2％瓊脂糖凝膠電泳；

(4)觀察結(jié)果并回收目的dna片段。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一，所述步驟(4)中連接方法具體如下：

(1)配制去磷酸化體系10μl：ciap1μl、10×ciap緩沖液1μl、pegfp-c2載體8μl，對載體進(jìn)行去磷酸化處理；

(2)配制連接體系10μl：ciap去磷酸化后pegfp-c2載體0.5μl、10×t4dna連接酶緩沖液1μl、t4dna連接酶1μl、pcr酶切純化產(chǎn)物7.5μl；

(3)將上述反應(yīng)體系置于0.5ml的離心管中混勻，16℃水浴過夜。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一，所述步驟(5)中連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌tg1中的具體步驟如下：

(1)取出儲存于﹣80℃的tg1感受態(tài)細(xì)胞，冰浴解凍后加入10μl連接產(chǎn)物，混勻，冰上靜置30min；

(2)42℃熱休克90s，迅速取出置冰上3min；

(3)加入500μllb培養(yǎng)液，37℃、250rpm振蕩培養(yǎng)45min；

(4)取出約100μl轉(zhuǎn)化液涂于帶有相應(yīng)抗性的lb固體培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)8-12h。

一種使用上述過表達(dá)zeb2基因質(zhì)粒的應(yīng)用，將所述過表達(dá)zeb2基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入人hk-2細(xì)胞系中，抑制人hk-2細(xì)胞中炎癥因子的分泌。

本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于：

(1)有助于研究zeb2基因功能，并且為研究其對炎癥在aki病程中的作用提供了有用分子生物學(xué)工具；

(2)運(yùn)用基因重組技術(shù)，針對zeb2基因，構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pegfp-c2-zeb2，并將其轉(zhuǎn)染至人hk-2細(xì)胞株中，研究zeb2過表達(dá)對hk-2細(xì)胞中炎癥因子表達(dá)的影響，為進(jìn)一步研究zeb2的功能，以及aki的基因治療奠定了基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1是實(shí)施例1中的一種過表達(dá)zeb2基因質(zhì)粒的真核表達(dá)載體pegfp-c2的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2是實(shí)施例2中的一種過表達(dá)zeb2基因質(zhì)粒的構(gòu)建方法的真核重組載體pegfp-c2-zeb2的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖3是實(shí)施例2中的一種過表達(dá)zeb2基因質(zhì)粒的構(gòu)建方法的真核重組載體pegfp-c2-zeb2的酶切鑒定圖譜；

圖4是實(shí)施例3中的一種過表達(dá)zeb2基因質(zhì)粒的表達(dá)過程中真核重組載體pegfp-c2-zeb2在hek293t細(xì)胞中的表達(dá)情況圖；

圖5是實(shí)施例4中的一種過表達(dá)zeb2基因質(zhì)粒的應(yīng)用的轉(zhuǎn)染組的hk-2細(xì)胞炎癥因子(il-6、tnf-α)mrna表達(dá)水平的情況圖；

圖6是實(shí)施例4中的一種過表達(dá)zeb2基因質(zhì)粒的應(yīng)用的轉(zhuǎn)染組的hk-2細(xì)胞炎癥因子(il-6、tnf-α)蛋白表達(dá)水平的情況圖。

具體實(shí)施方式

下面對本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。

實(shí)施例1

本實(shí)施例的一種過表達(dá)zeb2基因質(zhì)粒，由zeb2基因cds序列與pegfp-c2真核表達(dá)載體的重組構(gòu)建而成；其核苷酸如序列表seqidno:1，位于zeb2基因的第134-3778位；氨基酸序列如序列表seqidno:2所示；此外，pegfp-c2真核表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)如圖1所示。

實(shí)施例2

本實(shí)施例的一種過表達(dá)zeb2基因質(zhì)粒的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

1、zeb2cdna的提取

(1)取出細(xì)胞培養(yǎng)皿棄凈培養(yǎng)基，用1ml的pbs緩沖液清洗培養(yǎng)的hk-2細(xì)胞的細(xì)胞面(2-3次)；

(2)加入1ml的trizol裂解細(xì)胞10min，用移液器輕輕混勻細(xì)胞后將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，顛倒混勻后室溫靜置5min；

(3)加入trizol的1/5量的三氯甲烷(4℃預(yù)冷)，劇烈混勻后室溫靜置5min，高速低溫離心15min(4℃，12000r/min)；

(4)將0.4ml上層液體轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻后靜置60min(-20℃)，高速低溫離心15min(4℃，12000r/min)后棄上清；

(5)加入1ml75％的乙醇溶液后振蕩混勻，高速低溫離心5min(4℃，12000r/min)后棄上清，并干燥5min；

(6)加入20μl無酶水溶解沉淀后，用于逆轉(zhuǎn)錄，也可凍存于-80度；

(7)rna的變性

將抽提好的rna進(jìn)行變性，變性步驟如下：將rna在65℃中放置5min后，迅速轉(zhuǎn)移至冰水中放置2min。

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系(10μl)如下：

工藝步驟包括：

①將上述反應(yīng)體系放置37℃，并作用15min；

②將上述反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移至50℃，并作用5min；

③將上述反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移至98℃，并作用5min；

④將上述反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移至4℃，冷卻后凍存，即得到cdna。

2、zeb2基因的克隆

(1)根據(jù)zeb2的cds序列，設(shè)計(jì)上下游引物，引物序列分別如下：

zeb2-f:5’-ggggtaccccatgaagcagccgatcat-3’(含bamhi酶切位點(diǎn))

zeb2-r:5’-gctctagagctcacatgccatcttcc-3’(含xbai酶切位點(diǎn))

(2)pcr過程中所用的酶優(yōu)選為takara公司的primestarmax高保真酶，其反應(yīng)體系和反應(yīng)程序如下：

反應(yīng)體系(50μl)：

將上述反應(yīng)體系混勻后放入pcr儀器，設(shè)置如下程序運(yùn)行：

(3)將上述pcr產(chǎn)物進(jìn)行1.2％瓊脂糖凝膠電泳；

(4)觀察結(jié)果并回收目的dna片段；

將pcr產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，通過與dnamarker的對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在3645bp出得到一條帶，大小與zeb2目的片段(包括酶切位點(diǎn))的大小基本一致，表明成功擴(kuò)增出人zeb2基因的cds序列。

3、zeb2目的片段的純化

純化所用的試劑盒優(yōu)選為愛思進(jìn)公司的膠回收試劑盒，純化步驟如下：

(1)在紫外燈下切下含有目的dna的瓊脂糖凝膠，用濾紙吸盡凝膠表面液體并切碎。計(jì)算凝膠重量，每100mg等于100μl體積；

(2)加入3個(gè)凝膠體積的bufferde-a，混合均勻后于75℃加熱(低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠于40℃加熱)，間斷混合(每2～3min)，直至凝膠塊完全熔化；

(3)加0.5個(gè)bufferde-a體積的bufferde-b，混合均勻。當(dāng)分離的dna片段小于400bp時(shí)，需再加入1個(gè)凝膠體積的異丙醇；

(4)吸取步驟3中的混合液，轉(zhuǎn)移到dna制備管(置于2ml離心管)中，12,000rpm離心1min。棄濾液；

(5)將制備管置回2ml離心管，加500μlbufferw1，12,000rpm離心30s，棄濾液；

(6)將制備管置回2ml離心管，加700μlbufferw2，12,000rpm離心30s，棄濾液；以同樣的方法再用700μlbufferw2洗滌一次12,000rpm離心1min；

(7)將制備管置回2ml離心管中，12,000rpm離心1min；

(8)將制備管置于潔凈的1.5ml離心管中，在制備膜中央加30μleluent或去離子水，室溫靜置1min。12000rpm離心1min洗脫dna。

4、pcr產(chǎn)物和真核表達(dá)載體的雙酶切

對zeb2的pcr產(chǎn)物和pegfp-c2載體進(jìn)行bamhi和xbai的雙酶切，酶切體系和方法如下：

酶切體系(10μl)：

酶切方法：將以上反應(yīng)體系置于0.5ml的離心管中混勻，37℃水浴6h(溫度和時(shí)間的選擇依據(jù)內(nèi)切酶的說明書而定)，1.2％瓊脂糖凝膠電泳后迅速觀察結(jié)果并回收目的dna片段，避免紫外長期照射。

5、酶切產(chǎn)物的連接

對zeb2和pegfp-c2的雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，連接所用的酶優(yōu)選為t4連接酶；在連接之前，為避免載體的自身環(huán)化，故對載體進(jìn)行去磷酸化處理；

去磷酸化體系(10μl)：ciap1μl、10×ciap緩沖液1μl、pegfp-c2載體8μl；

連接體系(10μl)：ciap去磷酸化后的pegfp-c2載體0.5μl、10×t4dna連接酶緩沖液1μl、t4dna連接酶1μl、pcr酶切純化產(chǎn)物7.5μl；

連接方法：將上述反應(yīng)體系置于0.5ml的離心管中混勻，16℃水浴過夜。

6、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)化所用的大腸桿菌感受態(tài)為：tg1，轉(zhuǎn)化步驟如下：

(1)取出儲存于﹣80℃的tg1感受態(tài)細(xì)胞，冰浴解凍后加入10μl連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰上靜置30min；

(2)42℃熱休克90s(不要搖晃)，迅速取出置冰上3min；

(3)加入500μllb培養(yǎng)液，37℃、250rpm振蕩培養(yǎng)45min；

(4)取出約100μl轉(zhuǎn)化液涂于帶有相應(yīng)抗性的lb固體培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)12h。

7、質(zhì)粒的小量抽提

挑去8個(gè)陽性克隆加入含有2mllb培養(yǎng)基(氨芐抗性)的離心管中，37℃、250rpm振蕩培養(yǎng)12h，然后對菌液進(jìn)行質(zhì)粒抽提，所用的試劑盒為愛思進(jìn)公司的質(zhì)粒小量抽提試劑盒，抽提步驟如下：

(1)用滅菌牙簽挑取細(xì)菌的單克隆，放入盛2ml含有相應(yīng)抗生素的lb培養(yǎng)液的15ml離心管中，37℃、250rpm振蕩培養(yǎng)12h；

(2)將約1ml菌液轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，4℃、12,000rpm離心1min，上清；

(3)加250μlbuffers1懸浮細(xì)菌沉淀，懸浮需均勻，不應(yīng)留有小的菌塊；

(4)加250μlbuffers2，溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)6次使菌體充分裂解，直至形成透亮的溶液；

(5)加350μlbuffers3，溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)混合8次，12,000rpm離心10min；

(6)吸取步驟5中的離心上清并轉(zhuǎn)移到制備管(置于2ml離心管中)，12000rpm離心1min，棄濾液；

(7)將制備管置回離心管，加500μlbufferw1，12,000rpm離心1min，棄濾液；

(8)將制備管置回離心管，加700μlbufferw2，12,000rpm離心1min，棄濾液；以同樣的方法再用700μlbufferw2洗滌一次。棄濾液；

(9)將制備管置回2ml離心管中，12,000rpm離心1min；

(10)將制備管移入新的1.5ml離心管中，在制備管膜中央加80μl無菌水，室溫靜置1min，12,000rpm離心1min，棄制備管；

(11)樣品置-20℃?zhèn)溆?，圖2為真核重組載體pegfp-c2-zeb2的結(jié)構(gòu)示意圖。

8、對質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和送測序

對抽提好的質(zhì)粒進(jìn)行bamhi和xbai的雙酶切鑒定，酶切體系和方法如下：

酶切體系(10μl)：

酶切方法：將上述反應(yīng)體系置于0.5ml的離心管中混勻，37℃酶切6h后，瓊脂糖凝膠電泳、紫外分光儀觀察、凝膠成像儀拍照保存，并將酶切鑒定正確的質(zhì)粒送生工生物公司測序；其中，真核重組載體pegfp-c2-zeb2的酶切鑒定圖譜見圖3，其中標(biāo)示1為pegfp-c2雙酶切，標(biāo)示2為zeb2的pcr產(chǎn)物，標(biāo)示3為pegfp-c2-zeb2雙酶切；

將測序結(jié)果通過blast比對，發(fā)現(xiàn)與gencbank中公布的序列一致，目的基因片段長度實(shí)為3645bp。

實(shí)施例3

一種過表達(dá)zeb2基因質(zhì)粒的表達(dá)，根據(jù)實(shí)施例2得到過表達(dá)zeb2基因質(zhì)粒后，對其進(jìn)行表達(dá)，具體步驟如下：

1、細(xì)胞培養(yǎng)

本發(fā)明所需培養(yǎng)的細(xì)胞為：hek、293t、thp-1、大鼠腹腔巨噬細(xì)胞、hk-2細(xì)胞，首先復(fù)蘇細(xì)胞，并用含有體積比為10％胎牛血清的dmem高糖培養(yǎng)基于37℃、5％co2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，并及時(shí)換液和傳代。

(1)細(xì)胞復(fù)蘇：將液氮內(nèi)凍存的細(xì)胞取出，迅速浸入37℃的溫水中并輕輕搖晃至完全融化(復(fù)溫時(shí)間應(yīng)控制在兩分鐘以內(nèi))，迅速轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液至離心管中并加入5ml培養(yǎng)基，低速離心(1000r/min，2min)后棄盡上清，加入5ml培養(yǎng)基輕輕懸浮細(xì)胞后接種至培養(yǎng)皿中開始培養(yǎng)；

(2)細(xì)胞換液：輕輕棄去舊的細(xì)胞培養(yǎng)基，pbs溫和清洗后加入新鮮的完全培養(yǎng)基(含有10％胎牛血清的高糖dmem)繼續(xù)培養(yǎng)(注：pbs和新鮮的培養(yǎng)基需要37℃預(yù)熱)；

(3)細(xì)胞傳代：在細(xì)胞中加入1ml的胰酶后置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行消化，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，及時(shí)加入完全培養(yǎng)基終止消化，轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液至離心管中低速離心(1000r/min，2min)后棄上清，用pbs洗滌一次后加入0.2ml培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞并重新接種至培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)；

(4)細(xì)胞凍存：將傳代過程中的細(xì)胞懸液低速離心(1000r/min，2min)后棄上清，加入1ml細(xì)胞凍存液(配方見)輕輕懸浮細(xì)胞后分裝至細(xì)胞凍存管中進(jìn)行分級凍存，即4℃0.5-1h、-20℃1-2h、-80℃約24h、液氮凍存。

2、質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染(脂質(zhì)體法)

(1)用250μl的opti-mem稀釋5μl的脂質(zhì)體和總量約為2μg的dna，溫和混勻，室溫靜置5min；

(2)將上述步驟中的兩種溶液溫和混勻，室溫靜置20min，以形成dna-脂質(zhì)體復(fù)合物；

(3)棄去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，加入1mlopti-mem轉(zhuǎn)染液，將(2)中的dna-脂質(zhì)體復(fù)合物緩慢滴加到培養(yǎng)皿中，輕輕搖晃培養(yǎng)皿混勻；

(4)37℃、5％co2培養(yǎng)6h后，用預(yù)溫的pbs清洗一次，換新鮮的完全培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)約24h。

3、免疫印記

(1)總蛋白提?。弘x心收集細(xì)胞，用pbs清洗2-3次后，加入0.5ml細(xì)胞裂解液，冰上裂解10min，然后高速冷凍離心10min，收集0.4ml上清液，加入上樣緩沖液，沸水浴5min，放置冰上待電泳；

(2)安裝制膠板并檢漏，首先配制10％分離膠，用1ml異丙醇壓線，待充分凝固后(約1h)，配制濃縮膠，插入所需梳子，待充分凝固后使用；

(3)安裝電泳系統(tǒng)，在電泳槽中加入500ml電泳緩沖液，將10μl樣品加入上樣孔后開始電泳(80v電泳0.5h+100v電泳1.5h)；

(4)電泳結(jié)束后，切下sds-page膠，應(yīng)用三明治方式(從下往上依次是濾紙+膠+pvdf膜+濾紙)進(jìn)行濕轉(zhuǎn)；

(5)安裝電轉(zhuǎn)系統(tǒng)，在電轉(zhuǎn)槽中加入500ml預(yù)冷的電轉(zhuǎn)緩沖液，并將整個(gè)電轉(zhuǎn)槽放入冰水中，開始電轉(zhuǎn)(100v電轉(zhuǎn)2h)；

(6)電轉(zhuǎn)結(jié)束后，輕輕取下pvdf膜，用麗春紅染色鑒定轉(zhuǎn)膜是否成功，轉(zhuǎn)膜成功后，用tbst洗去麗春紅，室溫封閉至少1h；

(7)封閉完之后，用tbst洗膜(3次，5min)后，加入一抗溶液4℃孵育過夜；

(8)次日，用tbst洗膜(3次，10min)后，加入二抗溶液室溫孵育2h。然后用tbst洗膜(3次，20min)；

(9)用ecl發(fā)光劑檢測pvdf上的條帶，并用x射線膠片暗室顯影。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，真核重組表達(dá)載體pegfp-c2-zeb2在真核細(xì)胞內(nèi)能夠正常表達(dá)，為后續(xù)的研究奠定了基礎(chǔ)；圖4為真核重組載體pegfp-c2-zeb2在hek293t細(xì)胞中的表達(dá)情況圖，圖中，標(biāo)示1為未轉(zhuǎn)染的293t細(xì)胞裂解液，標(biāo)示2為轉(zhuǎn)染pegfp-c2-zeb2的293t細(xì)胞裂解液。

實(shí)施例4

一種過表達(dá)zeb2基因質(zhì)粒的應(yīng)用，將所述過表達(dá)zeb2基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入人hk-2細(xì)胞系中，研究過表達(dá)zeb2基因?qū)θ薶k-2細(xì)胞株炎癥因子(il-6、tnf-α)分泌的影響；具體步驟如下：

1、將對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行傳代，得到細(xì)胞懸液，并以適當(dāng)密度(約1×108·l-1)將細(xì)胞接種到6孔板中，培養(yǎng)約24h，待到細(xì)胞密度為80％左右，進(jìn)行pegfp-c2-zeb2的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染一段時(shí)間后收集細(xì)胞懸液；

2、根據(jù)制造商的說明書，使用trizol試劑的將總rna從培養(yǎng)hk-2細(xì)胞中分離，總rna用無rnase的水洗脫，并儲存在-80℃；

3、使用轉(zhuǎn)錄子第一鏈cdna合成試劑盒合成cdna，并使用具有sybr-greenmastermix的檢測系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)pcr，從invitrogen獲得q-pcr引物，樣品一式兩份，每次測量重復(fù)至少三次，q-pcr結(jié)果如圖5所示；

圖5a的qrt-pcr的分析表明：pegfp-c2-zeb2的轉(zhuǎn)染上調(diào)了zeb2的表達(dá)；圖5b的qrt-pcr的分析表明：pegfp-c2-zeb2的轉(zhuǎn)染下調(diào)了tnf-α和il-6的表達(dá)(*p<0.05和**，p<0.01vs正常組；#p<0.05和##p<0.01vs空白質(zhì)粒組)；

綜合以上結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的炎癥因子(il-6、tnf-α)mrna水平相比，轉(zhuǎn)染了pegfp-c2-zeb2組的hk-2細(xì)胞中炎癥因子il-6和tnf-αmrna的表達(dá)均有明顯降低，且差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)；說明過表達(dá)zeb2基因能夠明顯降低炎癥因子(il-6、tnf-α)mrna水平，從而抑制炎癥反應(yīng)。

另外，提取總蛋白并檢測濃度，進(jìn)行凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)硝酸纖維膜后，用5％脫脂牛奶封閉60min，加入1：200稀釋的zeb2兔抗、1：1000稀釋的il-6、tnf-α和1∶1000稀釋的beta-actin內(nèi)參一抗后，4℃孵育過夜，用tbst漂洗3次，加入相應(yīng)濃度的二抗，室溫下放置60min，tbst漂洗3次，加入eclplus，暗視條件下顯影，用quantityone軟件對蛋白條帶分析，westernblot結(jié)果如圖6所示；

圖6a的westernblot的分析表明：pegfp-c2-zeb2的轉(zhuǎn)染上調(diào)了zeb2的表達(dá)；圖6b的westernblot的分析表明，pegfp-c2-zeb2的轉(zhuǎn)染下調(diào)了tnf-α和il-6的表達(dá)(*p<0.05和**p<0.01與正常組相比；#p<0.05和##p<0.01與vector組相比)；

綜合以上結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的炎癥因子(il-6、tnf-α)蛋白水平相比，轉(zhuǎn)染了pegfp-c2-zeb2組的細(xì)胞的炎癥因子(il-6、tnf-α)蛋白均有明顯降低，且差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)；說明過表達(dá)zeb2基因能夠明顯降低炎癥因子(il-6、tnf-α)蛋白水平，從而抑制炎癥反應(yīng)。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>安徽醫(yī)科大學(xué)

<120>一種過表達(dá)zeb2基因質(zhì)粒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

<130>2017

<160>1

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>3645

<212>dna

<213>human

<400>1

atgaagcagccgatcatggcggatggcccccggtgcaagaggcgcaaacaagccaatccc60

aggaggaaaaacgtggtgaactatgacaatgtagtggacacaggttctgaaacagatgag120

gaagacaagcttcatattgctgaggatgacggtattgccaaccctctggaccaggagacg180

agtccagctagtgtgcccaaccatgagtcctccccacacgtgagccaagctctgttgcca240

agagaggaagaggaagatgaaataagggagggtggagtggaacacccctggcacaacaac300

gagattctacaagcctctgtagatggtccagaagaaatgaaggaagactatgacactatg360

gggccagaagccacgatccagaccgcaattaacaatggtacagtgaagaatgcaaattgc420

acatcagattttgaggaatactttgccaaaagaaaactggaggaacgcgatggtcatgca480

gtcagcatcgaggagtaccttcagcgcagtgacacagccattatttacccagaagcccct540

gaggagctgtctcgccttggcacgccagaggccaatgggcaagaagaaaatgacctgcca600

cctggaactccagatgcttttgcccaactgctgacctgcccctactgcgaccggggctac660

aagcgcttgacatcactgaaggagcacatcaagtaccgccacgagaagaatgaagagaac720

ttttcctgccctctctgtagctacacgtttgcctaccgcacccagctcgagcggcatatg780

gtgacacacaagccagggacagatcagcaccaaatgctaacccaaggagcaggtaatcgc840

aagttcaaatgcacagagtgtggcaaggccttcaaatataaacaccatctgaaagaacac900

ctgcgaattcacagtggtgaaaaaccttacgagtgcccaaactgcaagaaacgtttctcc960

cattctggttcctacagttcgcacatcagcagcaagaaatgtattggtttaatctctgta1020

aatggccgaatgagaaacaatatcaagacgggttcttcccctaattctgtttcttcttct1080

cctactaattcagccattacccagttaagaaacaagttggagaatggaaaaccacttagt1140

atgtctgaacagacaggcttacttaaaattaaaacagaaccactagacttcaatgactat1200

aaagttcttatggctacacacgggtttagtggcactagtccctttatgaatggtgggctt1260

ggagccaccagccctttaggagttcatccatctgctcagagtccaatgcagcacttaggt1320

gtagggatggaagcccctttacttgggtttcccaccatgaatagtaatttaagtgaggta1380

caaaaggttctacagattgtggacaatactgtttccaggcaaaaaatggactgcaaggct1440

gaagaaatttcaaagttgaaaggttatcacatgaaggatccatgctctcaacctgaggaa1500

caaggagttacttctcctaatattccgcctgtcggtcttccggtagtgagtcataatggt1560

gccactaaaagtattattgactatacgttggaaaaagtcaatgaagccaaagcttgcctc1620

cagagcttgactactgactcaaggagacagatcagtaatataaagaaagagaagctacgt1680

actttaatagatttggtcactgatgacaaaatgattgagaaccacaacatatccactcca1740

ttttcatgccagttctgtaaagaaagttttcctggccccatccctttgcatcagcatgaa1800

cgttacctttgtaagatgaatgaagagatcaaggcggtcctgcagcctcatgaaaacata1860

gtccccaacaaagccggagtttttgttgataataaagccctcctcttgtcatctgtactt1920

tctgagaaaggaatgacaagccccatcaacccatacaaggaccacatgtctgtactcaaa1980

gcatactatgctatgaacatggagcccaactccgatgaactgctgaaaatttccattgct2040

gtgggccttcctcaggaatttgtgaaggaatggtttgaacaacgaaaagtctaccagtac2100

tcaaattccaggtccccatccctggaaagaagctccaagccgttagctcccaacagtaac2160

cctcccacaaaagactctttattacccaggtctcctgtaaaacctatggactccataaca2220

tcaccatctatagcagaactccacaacagtgttacgaattgtgatcctcctctcaggcta2280

acaaaaccttcccattttaccaatattaaaccagttgaaaaattggaccactccaggagt2340

aatactccttctcccttaaatctttcctccacatcttctaaaaactcccacagtagttca2400

tacactccaaacagcttctcttctgaggagctccaggctgagcctttagacttgtcatta2460

ccaaaacaaatgaaagaacccaaaagtattatagccacaaagaacaaaacaaaagctagt2520

agcatcagtttagatcataacagtgtttcttcctcatctgaaaactcagatgagcctctg2580

aacttgacttttatcaagaaggaattttcaaattcaaataatctggacaacaaaagcact2640

aacccagtgttcagcatgaacccatttagtgccaaacctttatacacagctcttccacct2700

caaagcgcatttccccctgctactttcatgccaccagtccagaccagtattcctgggcta2760

cgaccatacccaggactggatcagatgagcttcctaccacatatggcctacacctaccca2820

actggagcagctacttttgctgatatgcagcaaaggagaaagtaccagcggaaacaagga2880

tttcagggagaattgcttgatggagcacaagactacatgtcaggcctagatgatatgaca2940

gactccgactcctgtctgtctcgcaaaaagatcaagaagacagagagtggcatgtatgca3000

tgtgacttatgtgacaagacattccagaaaagcagttcccttctgcgacataaatacgaa3060

cacacaggaaaaagaccacatcagtgtcagatttgtaagaaagcgtttaaacacaagcac3120

caccttatcgagcactcaaggcttcactcgggcgagaagccctatcagtgtgataaatgt3180

ggcaagcgcttctcacactcgggctcgtactcgcagcacatgaatcacaggtattcctac3240

tgcaagcgggaggcggaggagcgggaagcggcggagcgcgaggcgcgcgagaaagggcac3300

ttggaacccaccgagctgctgatgaaccgggcttacttgcagagcattacccctcagggg3360

tactctgactcggaggagagggagagtatgccgagggatggcgagagcgagaaggagcac3420

gagaaagaaggcgaggatggctacgggaagctgggcagacaggatggcgacgaggagttc3480

gaggaggaagaggaagaaagtgaaaataaaagtatggatacggatcccgaaacgatacga3540

gatgaagaagagactggagatcactccatggacgatagttcggaggatgggaaaatggaa3600

accaaatcagaccacgaggaagacaatatggaagatggcatgtaa3645

<210>2

<211>1214

<212>prt

<213>human

<400>2

metlysglnproilemetalaaspglyproargcyslysargarglys

151015

glnalaasnproargarglysasnvalvalasntyraspasnvalval

202530

aspthrglysergluthraspglugluasplysleuhisilealaglu

354045

aspaspglyilealaasnproleuaspglngluthrserproalaser

505560

valproasnhisgluserserprohisvalserglnalaleuleupro

65707580

argglugluglugluaspgluilearggluglyglyvalgluhispro

859095

trphisasnasngluileleuglnalaservalaspglyprogluglu

100105110

metlysgluasptyraspthrmetglyproglualathrileglnthr

115120125

alaileasnasnglythrvallysasnalaasncysthrseraspphe

130135140

gluglutyrphealalysarglysleuglugluargaspglyhisala

145150155160

valserilegluglutyrleuglnargseraspthralaileiletyr

165170175

proglualaproglugluleuserargleuglythrproglualaasn

180185190

glyglnglugluasnaspleuproproglythrproaspalapheala

195200205

glnleuleuthrcysprotyrcysaspargglytyrlysargleuthr

210215220

serleulysgluhisilelystyrarghisglulysasnglugluasn

225230235240

phesercysproleucyssertyrthrphealatyrargthrglnleu

245250255

gluarghismetvalthrhislysproglythraspglnhisglnmet

260265270

leuthrglnglyalaglyasnarglysphelyscysthrglucysgly

275280285

lysalaphelystyrlyshishisleulysgluhisleuargilehis

290295300

serglyglulysprotyrglucysproasncyslyslysargpheser

305310315320

hisserglysertyrserserhisileserserlyslyscysilegly

325330335

leuileservalasnglyargmetargasnasnilelysthrglyser

340345350

serproasnservalserserserprothrasnseralailethrgln

355360365

leuargasnlysleugluasnglylysproleusermetserglugln

370375380

thrglyleuleulysilelysthrgluproleuasppheasnasptyr

385390395400

lysvalleumetalathrhisglypheserglythrserprophemet

405410415

asnglyglyleuglyalathrserproleuglyvalhisproserala

420425430

glnserprometglnhisleuglyvalglymetglualaproleuleu

435440445

glypheprothrmetasnserasnleusergluvalglnlysvalleu

450455460

glnilevalaspasnthrvalserargglnlysmetaspcyslysala

465470475480

glugluileserlysleulysglytyrhismetlysaspprocysser

485490495

glnproglugluglnglyvalthrserproasnileproprovalgly

500505510

leuprovalvalserhisasnglyalathrlysserileileasptyr

515520525

thrleuglulysvalasnglualalysalacysleuglnserleuthr

530535540

thraspserargargglnileserasnilelyslysglulysleuarg

545550555560

thrleuileaspleuvalthraspasplysmetilegluasnhisasn

565570575

ileserthrprophesercysglnphecyslysgluserpheprogly

580585590

proileproleuhisglnhisgluargtyrleucyslysmetasnglu

595600605

gluilelysalavalleuglnprohisgluasnilevalproasnlys

610615620

alaglyvalphevalaspasnlysalaleuleuleuserservalleu

625630635640

serglulysglymetthrserproileasnprotyrlysasphismet

645650655

servalleulysalatyrtyralametasnmetgluproasnserasp

660665670

gluleuleulysileserilealavalglyleuproglnglupheval

675680685

lysglutrpphegluglnarglysvaltyrglntyrserasnserarg

690695700

serproserleugluargserserlysproleualaproasnserasn

705710715720

proprothrlysaspserleuleuproargserprovallyspromet

725730735

aspserilethrserproserilealagluleuhisasnservalthr

740745750

asncysaspproproleuargleuthrlysproserhisphethrasn

755760765

ilelysprovalglulysleuasphisserargserasnthrproser

770775780

proleuasnleuserserthrserserlysasnserhisserserser

785790795800

tyrthrproasnserpheserserglugluleuglnalagluproleu

805810815

aspleuserleuprolysglnmetlysgluprolysserileileala

820825830

thrlysasnlysthrlysalaserserileserleuasphisasnser

835840845

valsersersersergluasnseraspgluproleuasnleuthrphe

850855860

ilelyslysglupheserasnserasnasnleuaspasnlysserthr

865870875880

asnprovalphesermetasnpropheseralalysproleutyrthr

885890895

alaleuproproglnseralapheproproalathrphemetpropro

900905910

valglnthrserileproglyleuargprotyrproglyleuaspgln

915920925

metserpheleuprohismetalatyrthrtyrprothrglyalaala

930935940

thrphealaaspmetglnglnargarglystyrglnarglysglngly

945950955960

pheglnglygluleuleuaspglyalaglnasptyrmetserglyleu

965970975

aspaspmetthraspseraspsercysleuserarglyslysilelys

980985990

lysthrgluserglymettyralacysaspleucysasplysthrphe

99510001005

glnlysserserserleuleuarghislystyrgluhisthrgly

101010151020

lysargprohisglncysglnilecyslyslysalaphelyshis

102510301035

lyshishisleuilegluhisserargleuhisserglyglulys

104010451050

protyrglncysasplyscysglylysargpheserhissergly

105510601065

sertyrserglnhismetasnhisargtyrsertyrcyslysarg

107010751080

glualaglugluargglualaalagluargglualaargglulys

108510901095

glyhisleugluprothrgluleuleumetasnargalatyrleu

110011051110

glnserilethrproglnglytyrseraspserglugluargglu

111511201125

sermetproargaspglygluserglulysgluhisglulysglu

113011351140

glygluaspglytyrglylysleuglyargglnaspglyaspglu

114511501155

gluphegluglugluglugluglusergluasnlyssermetasp

116011651170

thraspprogluthrileargaspgluglugluthrglyasphis

117511801185

sermetaspaspsersergluaspglylysmetgluthrlysser

119011951200

asphisglugluaspasnmetgluaspglymet

12051210