專利名稱：放射線劑量的生物檢測用報告質(zhì)粒及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基因質(zhì)粒及其構(gòu)建方法，即放射線劑量的生物檢測 用報告質(zhì)粒及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
電離輻射對健康的危害和輻射安全評估，各種條件下的急、慢性輻射損傷的分類、診斷 和治療等都需要了解和確定受照射的劑量。放射線劑量的生物檢測是利用生物材料如組織、 細胞、DNA、蛋白質(zhì)等在電離輻射后發(fā)生的、與輻射劑量存在的一定量一效關(guān)系的某個方面 的改變，利用這種可測、可記錄和分析的生物改變來度量輻射劑量的一類生物標(biāo)記物及分析 方法。與物理檢測相比，利用生物進行劑量檢測的最大優(yōu)勢是直接和忠實代表性。
目前進行放射線劑量的生物檢測的方法很多，常用的有放射線照射后DNA損傷而形 成的彗星尾與未受損的細胞表現(xiàn)的彗星核心之間的關(guān)系來研究預(yù)測放射線劑量的單細胞凝膠 電泳(慧星試驗)法(Berwick and Vineins, 2000):也有通過調(diào)查射線照射后的細胞所引起 的染色體的雙著絲粒、交換或易位等損傷指標(biāo)來估算放射線劑量的染色體畸變分析法 (Ballarini and Ottolenghi, 2003; Duran W W,， 2002; Camparoto " a〖.，2003 )，但這些方法的共 同缺點是存在操作復(fù)雜、檢測的成本較高、損傷觀察時人為因素較多、很難準確定量等缺點； 雖通過計算機等輔助手段的利用可以適當(dāng)提高其度量的精度，但這些方法只能對低劑量的放 射線進行檢測和度量，對于高劑量放射線的生物檢測和度量的方法目前還沒有。迫切需要有 一種使用方便、精確度高，同時又能對高劑量的放射線進行生物檢測的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是公開一種放射線劑量的生物檢測用報告質(zhì)粒以及這種生物測定用報告 質(zhì)粒的構(gòu)建方法。以及這種放射線劑量的生物檢測用報告質(zhì)粒的應(yīng)用。
本發(fā)明的這種放射線劑量的生物檢測用報告質(zhì)粒是以抗輻射菌一大腸桿菌間的穿梭載 體為基礎(chǔ)，與具有北美產(chǎn)螢火蟲(P/zorim^ ;^rafc)的寄主DNA由來的熒光素酶基因lux領(lǐng) 域的DNA片段重組，構(gòu)建成具有熒光素酶基因的抗輻射菌一大腸桿菌間穿梭載體報告質(zhì)粒。
具體構(gòu)建方法為以下步驟 (1)穿梭載體質(zhì)粒的構(gòu)建
用QIAfilter Plasmid kit (德國QIAGEN)從抗輻射菌De/"ococc^ rad/o/wg"a/M中提取質(zhì) 粒pUE30并進行Sphl酶切，用Sphl消化包含有大腸桿菌載體pUC19復(fù)制開始領(lǐng)域、大腸桿
菌中有活性的Amp抗性基因、抗輻射菌Z)e!力ococow ra&o^ra朋中有活性的氯霉素抗性基因 的質(zhì)粒pKatCAT，再與上述pUE30的Sphl消化物混合，用DNA連接酶連接，采用電穿孔法 將上述連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109株，從抗Amp的轉(zhuǎn)化株中選擇具有pUE30和pKatCAT連 接的質(zhì)粒的株，獲得穿梭載體質(zhì)粒。 (2)報告質(zhì)粒的構(gòu)建
在上述穿梭載體質(zhì)粒的Mfe I酶切位點插入熒光蛋白酶基因丄wc+，構(gòu)建成質(zhì)粒；設(shè)計包 含限制性內(nèi)切酶A^e I位點的DNA損傷修復(fù)基因wc A的啟動子的引物，PCR增幅DNA損 傷修復(fù)基因wcA的啟動子，將上述PCR產(chǎn)物順向插入上述質(zhì)粒的熒光蛋白基因丄wcf上游的 iV&I部位，由此形成測定用的報告質(zhì)粒。
所述DNA損傷修復(fù)基因A的啟動子的引物序列為
SEQ ID NO 1: ttgtcagctt cggtcagttg acat
SEQ ID NO 2: tggggtcctc ctgtgagtga
本發(fā)明放射線劑量的生物檢測用報告質(zhì)粒的應(yīng)用
將上述測定用的報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)化抗輻射菌的野生型Rl中，獲轉(zhuǎn)化體抗輻射菌，供Y-射線 照射。將轉(zhuǎn)化體抗輻射菌培養(yǎng)到穩(wěn)定期，用Y-射線進行照射，照射后再進行培養(yǎng)，以性狀轉(zhuǎn) 化體的發(fā)光量為依據(jù)，測定不同劑量Y-射線照射后的發(fā)光量。不同劑量射線照射后得到不同 的發(fā)光量。
本發(fā)明的優(yōu)點
本發(fā)明能解決現(xiàn)有技術(shù)放射線劑量生物檢測法的各種問題。如能夠提高劑量檢測的精 確度，已有的單細胞凝膠電泳(慧星試驗)法及染色體畸變分析法的操作復(fù)雜、檢測時人為 因素較多、很難準確定量；而本發(fā)明的報告質(zhì)粒根據(jù)熒光量的有無及熒光量的多少就能正確
進行定性和定量。其次，單細胞凝膠電泳(慧星試驗)法及染色體畸變分析法等只能對低劑
量的放射線進行定量，不能對高劑量的放射線進行定量；而本發(fā)明的報告質(zhì)粒除能對低劑量 的放射線進行定量外，對于高劑量的放射線也能進行定量。同時，本發(fā)明的報告質(zhì)粒在抗輻 射菌中具有高熒光素酶活性，可實時監(jiān)控重組轉(zhuǎn)化子的生育狀況等。 本發(fā)明的應(yīng)用前景
本發(fā)明的報告質(zhì)?？勺鳛楦?、低放射線劑量的生物檢測，可以廣泛應(yīng)用于核發(fā)電站等核 設(shè)施、醫(yī)院等放射線照射設(shè)施及其他具有放射源場所的檢測，也可應(yīng)用于環(huán)境中放射性物質(zhì) 的污染檢測，同時可作為一個生物感應(yīng)器來感應(yīng)多種DNA損傷劑。本發(fā)明的報告質(zhì)粒具有 熒光素酶基因，在實時監(jiān)控重組轉(zhuǎn)化子的生育、分布及對環(huán)境的影響等方面也非常有用。
具體實施例方式
以下根據(jù)實施例詳細介紹本發(fā)明，本發(fā)明沒有限定這些實施例。 (1)穿梭載體質(zhì)粒的構(gòu)建
從抗輻射菌(De/"ococcus racfo; wg"a"ce ATCC19172)中提取質(zhì)粒pUE30并進行Sphl酶 切；接著用Sphl消化包含有大腸桿菌載體pUC19復(fù)制開始領(lǐng)域、大腸桿菌中有活性的Amp 抗性基因、抗輻射菌rat//o^/raM Rl中有活性的氯霉素抗性基因的質(zhì)粒pKatCAT (Funayama等，Mutat. Res,, 435: 151-161, 1999)，再與上述pUE30的Sphl消化物混合，用 DNA連接酶連接。采用電穿孔法將上述連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109株。從抗Amp的轉(zhuǎn)化株 中選擇具有pUE30和pKatCAT連接的質(zhì)粒的株，得到穿梭載體質(zhì)粒。
(2) 報告質(zhì)粒的構(gòu)建
以抗輻射菌Z)e/wococa^ ra^'o^ra似的基因組DNA為模板，SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2所示的堿基序列(根據(jù)Meima等的論文自行設(shè)計，J. Bacteriol. 183: 3169-3175, 2001)合成 的DNA為引物，用Pfo Turbo DNA polymerase (Stratagene)進行PCR反應(yīng)，增幅Meima 等(J. Bacteriol. 183: 3169-3175， 2001)記載的在抗輻射菌De/"ococciw rado血rara中具有活 性的已知的groEL啟動子領(lǐng)域。然后用Ncol內(nèi)切酶消化含有熒光素酶基因的質(zhì)粒pSP-lux+ (Promega)，用T4 DNA polymerase (Takara)進行DNA斷片末端的平滑化。最后，將上述 的PCR產(chǎn)物與平滑化的pSP-lux+連接，得到pGroE-lux。
用HindIII消化上述質(zhì)粒，進行切斷末端的平滑化處理，再用EcoRV進行消化，得到 含有g(shù)roEL啟動子和熒光素酶基因的DNA斷片，將這一 DNA片斷插入步驟1所獲穿梭載體 質(zhì)粒的EcoRV部位，構(gòu)建具有熒光素酶基因的質(zhì)粒，用構(gòu)建的熒光素酶基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 Z)e&ococrasgram;fe，得到具有熒光素酶基因的菌株。
(3) 熒光素酶活性的測定
將上述得到的重組轉(zhuǎn)化子在TGY培養(yǎng)基中3(TC培養(yǎng)，然后進行不同劑量Y-射線照射， 再繼續(xù)培養(yǎng)，24 hr后將培養(yǎng)液10 |aL與等量的Bright-Glo Luciferase Assay Solution (Promega) 混合，1分鐘后用Lumi Imager (Roche Molecular Biochemicals)測定1分鐘間的化學(xué)發(fā)光活性。 由測定得知，不同劑量射線照射后菌體的發(fā)光量不同，照射劑量與發(fā)光量之間的相關(guān)系數(shù)達 0.892 (達極顯著水平)。 使用方法及其效果
將含有放射線劑量生物檢測用報告質(zhì)粒的抗輻射菌培養(yǎng)于玻璃容器內(nèi)，將該容器放在需 要測定的地方，被曝一定時間后取回容器，再在30。C條件下繼續(xù)培養(yǎng)24hr。取培養(yǎng)液10nL 與等量的Bright-Glo Luciferase Assay Solution(Promega)混合，1分鐘后用Lumi Imager (Roche MolecularBiochemicals)測定1分鐘間的化學(xué)發(fā)光活性。根據(jù)發(fā)光量的多少就可以估算被測地 的放射性劑量。
根據(jù)研究結(jié)果，在使用的0-2000 Gy的劑量范圍內(nèi)，不同劑量gamma-射線照射后菌體的 發(fā)光量與照射劑量之間的相關(guān)系數(shù)為0.892，達極顯著水平。
序列表
<110>浙江大學(xué)
<120>放射線劑量的生物檢測用報告質(zhì)粒及其構(gòu)建方法 <160> 2
<210> 1 <211> 24 <212> DNA <213>人工序列 <220>
<223> DNA損傷修復(fù)基因rec A的啟動子的引物序列 <400> 1
ttgtcagctt cggtcagttg acat 24
<210> 2 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <220>
<223> DNA損傷修復(fù)基因rec A的啟動子的引物序列 <400> 2
tggggtcctc ctgtgagtga 20
權(quán)利要求
1、放射線劑量的生物檢測用報告質(zhì)粒，其特征在于以抗輻射菌-大腸桿菌間的穿梭載體為基礎(chǔ)，與具有北美產(chǎn)螢火蟲(Photinuspyralis)的寄主DNA由來的熒光素酶基因luc領(lǐng)域的DNA片段重組，構(gòu)建成具有熒光素酶基因活性的抗輻射菌-大腸桿菌間的穿梭載體的報告質(zhì)粒。
2、 如權(quán)利要求1所述放射線劑量的生物檢測用報告質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于以下步驟:(1) 構(gòu)建穿梭載體質(zhì)粒用QIAfilter Plasmid kit從抗輻射菌De/"ococc附ra&opwg加ra中提取質(zhì)粒pUE30并進行 Sphl酶切，用SpM分別消化包含有大腸桿菌載體pUC19復(fù)制開始領(lǐng)域、大腸桿菌中有活性 的Amp抗性基因、抗輻射菌D""ococc^ ra&o^rara中有活性的氯霉素抗性基因的質(zhì)粒 pKatCAT，再與上述pUE30的SphI消化物混合，用DNA連接酶連接，采用電穿孔法將上述 連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109株，從抗Amp的轉(zhuǎn)化株中選擇具有pUE30和pKatCAT連接的 質(zhì)粒的株，獲得穿梭載體質(zhì)粒；(2) 構(gòu)建報告質(zhì)粒在上述穿梭載體質(zhì)粒的A^el酶切位點插入熒光蛋白酶基因Z"c+，構(gòu)建成質(zhì)粒；設(shè)計包 含限制性內(nèi)切酶AWe I位點的DNA損傷修復(fù)基因mc A的啟動子的引物，PCR增幅DNA損 傷修復(fù)基因wcA的啟動子，將上述PCR產(chǎn)物順向插入上述質(zhì)粒的熒光蛋白基因i:恥+上游的 iV&I部位，由此形成測定用的報告質(zhì)粒。
3、 如權(quán)利要求2所述放射線劑量的生物檢測用報告質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于所述DNA 損傷修復(fù)基因wc A的啟動子的引物序列為SEQ ID NO 1: ttgtcagctt cggtcagttg acat SEQ ID NO 2: tggggtcctc ctgtgagtga 。
全文摘要
放射線劑量的生物檢測用報告質(zhì)粒及其制備方法，以抗輻射菌-大腸桿菌間的穿梭載體為基礎(chǔ)，與具有北美產(chǎn)螢火蟲的寄主DNA由來的熒光素酶基因lux領(lǐng)域的DNA片段重組，構(gòu)建成具有熒光素酶基因活性的抗輻射菌-大腸桿菌間的穿梭載體的報告質(zhì)粒。將報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)化抗輻射菌的野生型R1中，獲轉(zhuǎn)化體抗輻射菌，供γ-射線照射。將轉(zhuǎn)化體抗輻射菌培養(yǎng)到穩(wěn)定期，用γ-射線照射后再培養(yǎng)，以性狀轉(zhuǎn)化體的發(fā)光量為依據(jù)，測定不同劑量γ-射線照射后的不同發(fā)光量。研究結(jié)果，在使用的0-2000Gy的劑量范圍內(nèi)，不同劑量γ-射線照射后菌體的發(fā)光量與照射劑量之間的相關(guān)系數(shù)為0.892，達極顯著水平。
文檔編號C12Q1/02GK101348822SQ20081006191
公開日2009年1月21日 申請日期2008年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月27日
發(fā)明者屠振力 申請人:浙江大學(xué)