體外復(fù)制的人線粒體dna質(zhì)粒及其構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種體外復(fù)制的人線粒體DNA重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒包含完整的人線粒體DNA和大腸桿菌復(fù)制子基因；大腸桿菌復(fù)制子基因插入人線粒體DNA的D-LOOP區(qū)。其構(gòu)建方法包括以下步驟：提取完整的人線粒體DNA；從pUC19質(zhì)粒中擴(kuò)增出大腸桿菌復(fù)制子基因、或擴(kuò)增出大腸桿菌復(fù)制子基因和抗性篩選基因，作為插入人線粒體DNA中的外源基因；以及同時(shí)酶切人線粒體DNA和外源基因，將酶切過(guò)的人線粒體DNA和外源基因經(jīng)去磷酸化處理后連接在一起，制得人線粒體DNA重組質(zhì)粒。本發(fā)明一方面可實(shí)現(xiàn)人線粒體在原核生物中的復(fù)制，另一方面由于插入的為非編碼區(qū)，不會(huì)對(duì)人線粒體DNA的編碼功能造成影響。
【專利說(shuō)明】體外復(fù)制的人線粒體DNA質(zhì)粒及其構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，并涉及真核生物的DNA在原核生物中的表達(dá)。更具體地，本發(fā)明涉及一種體外復(fù)制的人線粒體DNA質(zhì)粒及其構(gòu)建方法，該質(zhì)?？蓪?shí)現(xiàn)人線粒體DNA (mt-DNA)的完整復(fù)制。
【背景技術(shù)】
[0002]線粒體是一個(gè)對(duì)環(huán)境變化十分敏感的細(xì)胞器。在許多疾病狀態(tài)下，線粒體的結(jié)構(gòu)和功能都會(huì)發(fā)生相應(yīng)的改變，并成為疾病病理變化的一部分。另一方面，線粒體的異常也可能成為疾病發(fā)生的原因，這種以線粒體結(jié)構(gòu)或功能異常為主要病因的一大類疾病稱為線粒體病。
[0003]線粒體病中線粒體DNA (mt-DNA)的缺失、變異以及重復(fù)是致病的重要原因。線粒體基因組是一個(gè)環(huán)狀雙DNA，核酸序列和組成比較保守。人類的線粒體基因組由16569bp組成，其外環(huán)為重(H)鏈，內(nèi)環(huán)為輕(L)鏈；除一段非編碼區(qū)(D-1oop區(qū))外均為編碼區(qū)，共編碼13個(gè)多肽、22個(gè)tRNA和2個(gè)rRNA。D-1oop區(qū)是一大小約為100bp的調(diào)控區(qū)，其包含有重鏈復(fù)制起始點(diǎn)、保守序列節(jié)段、輕鏈啟動(dòng)子、重鏈啟動(dòng)子及終止結(jié)合序列等，幾乎所有與mt-DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯相關(guān)的調(diào)控序列都位于該區(qū)。D-1oop區(qū)為非編碼區(qū)，插入該區(qū)的外源基因不會(huì)對(duì)mt-DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯相關(guān)的調(diào)控序列以及編碼功能造成影響，也即不會(huì)影響到mt-DNA基因的功能。
[0004]通常情況下，基因治療是指將外源正?；?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償因基因缺陷和異常引起的疾病，以達(dá)到治療目的。這就需要兩方面的技術(shù)要求，一種是針對(duì)疾病制備某種外源基因(外源DNA)，其二則需要將這種外源DNA導(dǎo)入靶細(xì)胞中，替換異常DNA。隨著基因治療手段的發(fā)展，采用該方法治療由于DNA缺失、變異或重復(fù)等導(dǎo)致的線粒體病也成為本領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。但由于人線粒體DNA是典型的真核基因，現(xiàn)有技術(shù)中其功能性研究仍停留在真核水平，研究復(fù)雜程度較高，不利于實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)化的試驗(yàn)操作方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于，針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中人線粒體的功能性研究仍停留在真核水平而導(dǎo)致的研究復(fù)雜程度高的缺陷，提供人線粒體DNA重組質(zhì)粒及其構(gòu)建方法，通過(guò)該方法實(shí)現(xiàn)人線粒體DNA在原核生物內(nèi)的體外復(fù)制，降低研究復(fù)雜度。
[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題通過(guò)以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn):提供一種人線粒體DNA重組質(zhì)粒，所述重組質(zhì)粒包含完整的人線粒體DNA和大腸桿菌復(fù)制子基因；所述大腸桿菌復(fù)制子基因插入人線粒體DNA的D-LOOP區(qū)。
[0007]在上述人線粒體DNA重組質(zhì)粒中，所述重組質(zhì)粒還包含插入到人線粒體DNA的D-LOOP區(qū)、并連接在大腸桿菌復(fù)制子基因的C端的抗性篩選基因。
[0008]在上述人線粒體DNA重組質(zhì)粒中，所述抗性篩選基因具有多克隆位點(diǎn)，所述多克隆位點(diǎn)為Sal I位點(diǎn)、Bgl II位點(diǎn)和Not I位點(diǎn)的至少兩個(gè)。[0009]在上述人線粒體DNA重組質(zhì)粒中，所述大腸桿菌復(fù)制子基因的N端和所述抗性篩選基因的C端均包含Ale I位點(diǎn)。
[0010]在上述人線粒體DNA重組質(zhì)粒中，所述抗性篩選基因?yàn)榘逼S基因。
[0011]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種人線粒體DNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法，該方法包括以下步驟:
[0012]A、提取完整的人線粒體DNA ;
[0013]B、從pUC19質(zhì)粒中擴(kuò)增出大腸桿菌復(fù)制子基因、或擴(kuò)增出大腸桿菌復(fù)制子基因和抗性篩選基因，作為插入人線粒體DNA中的外源基因；以及
[0014]C、同時(shí)酶切人線粒體DNA和外源基因，將酶切過(guò)的人線粒體DNA和外源基因經(jīng)去磷酸化處理后連接在一起，制得所述人線粒體DNA重組質(zhì)粒。
[0015]在上述人線粒體DNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法中，所述步驟B包括: [0016]設(shè)計(jì)一對(duì)引物:
[0017]引物3:5’ -CAC ATC GGTG CGC GTT GCT GGC GTT TTT CCA-3’ ；
[0018]引物4?，-Ckk ATC GGTG GTCGAC ATC AGA TCT CAT GCGGCCGC ATG AGT ATT CAACAT TTC CGT-3，；
[0019]基于PCR方法，使用引物I和引物2從pUC19質(zhì)粒中擴(kuò)增出大腸桿菌復(fù)制子基因和抗性篩選基因。
[0020]在上述人線粒體DNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法中，擴(kuò)增出的所述大腸桿菌復(fù)制子基因的N端和所述抗性篩選基因的C端均包含Ale I位點(diǎn)；擴(kuò)增出的所述抗性篩選基因具有多克隆位點(diǎn)，所述多克隆位點(diǎn)為Sal I位點(diǎn)、Bgl II位點(diǎn)和Not I位點(diǎn)的至少兩個(gè)。
[0021]在上述人線粒體DNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法中，所述步驟B包括:
[0022]設(shè)計(jì)一對(duì)引物:
[0023]引物3:5，-CAC ATC GGTG CGC GTT GCT GGC GTT TTT CCA-3’ ；
[0024]引物5?，-Ckk ATC GGTG GTCGAC ATC AGA TCT CAT GCGGCCGC AGA TCA AAG GATCTT CTT GAG-3’ ；
[0025]基于PCR方法，使用引物3和引物5從pUC19質(zhì)粒中擴(kuò)增出大腸桿菌復(fù)制子基因。
[0026]在上述人線粒體DNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法中，在所述步驟C中，使用限制性內(nèi)切酶Ale I同時(shí)酶切人線粒體DNA和外源基因，將酶切過(guò)的人線粒體DNA和外源基因經(jīng)去磷酸化處理后用T4連接酶連接在一起。
[0027]實(shí)施本發(fā)明可以獲得以下有益效果:本發(fā)明在人線粒體DNA的非編碼區(qū)D-LOOP區(qū)插入大腸桿菌復(fù)制子基因，一方面可實(shí)現(xiàn)人線粒體在原核生物(例如大腸桿菌)中的復(fù)制，通過(guò)體外復(fù)制的方法獲得外源線粒體DNA，作為獲取人線粒體DNA的源頭；另一方面由于插入的為非編碼區(qū)，因此不會(huì)對(duì)人線粒體DNA的編碼功能造成影響。本發(fā)明的構(gòu)建方法操作簡(jiǎn)單、便于實(shí)施，由于構(gòu)建得到的重組質(zhì)粒適用于原核表達(dá)體系，可進(jìn)一步降低線粒體的研究復(fù)雜度。
[0028]優(yōu)選地，本發(fā)明同時(shí)在人線粒體DNA中插入大腸桿菌復(fù)制子基因和抗性篩選基因?？剐院Y選基因不僅可以起到初步篩選的作用，而且本發(fā)明在抗性篩選基因中引入了多克隆位點(diǎn)，便于后續(xù)通過(guò)酶切方式將線粒體中的基因片段克隆到該質(zhì)粒中?！緦＠綀D】

【附圖說(shuō)明】
[0029]以下將結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。附圖中:
[0030]圖1是提取到的完整的人線粒體DNA的電泳圖，其中標(biāo)號(hào)I表示λ -Hind III DNAmarker,標(biāo)號(hào)2表示完整的人線粒體DNA ；
[0031]圖2是利用引物擴(kuò)增后的人線粒體DNA片段的PCR鑒定示意圖，其中標(biāo)號(hào)I表示人線粒體DNA片段的PCR，標(biāo)號(hào)3表示DL2000DNA marker ；
[0032]圖3是從pUC19質(zhì)粒中擴(kuò)增得到的大腸桿菌復(fù)制子基因(oir)和氨芐基因(amp)的PCR鑒定示意圖，其中I表示DL2000DNA marker，標(biāo)號(hào)2和3分別表示大腸桿菌復(fù)制子基因(oir)和氨芐基因(amp)的PCR產(chǎn)物；
[0033]圖4是本發(fā)明構(gòu)建的人線粒體DNA重組質(zhì)粒的PCR鑒定示意圖，其中標(biāo)號(hào)1、2和3分別表示人線粒體DNA重組質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物，標(biāo)號(hào)4表示DL2000DNA marker ；以及
[0034]圖5是本發(fā)明構(gòu)建的人線粒體DNA重組質(zhì)粒經(jīng)酶切處理后的PCR鑒定示意圖，其中標(biāo)號(hào)I表不λ -Hind III DNA marker,標(biāo)號(hào)2表不DL2000DNAmarker,標(biāo)號(hào)3表不線粒體DNA重組質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物。
[0035]圖6是從pUC19質(zhì)粒中擴(kuò)增得到的大腸桿菌復(fù)制子基因(Oir)PCR鑒定示意圖，其中I表示DL2000DNA marker，標(biāo)號(hào)2分別表示大腸桿菌復(fù)制子基因(oir) PCR產(chǎn)物；
[0036]圖7是本發(fā)明構(gòu)建的人線粒體DNA重組質(zhì)粒經(jīng)酶切處理后的PCR鑒定示意圖，其中標(biāo)號(hào)I表示DL2000DNA marker，標(biāo)號(hào)2表示線粒體DNA重組質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物，標(biāo)號(hào)3表不 λ -EcoR I +Hind III DNA marker ?
【具體實(shí)施方式】
[0037]為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和效果更清楚明白，以下將結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)該理解的是，以下實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，而不對(duì)本發(fā)明做任何限制。
[0038]本發(fā)明提供了一種在體外獲得人線粒體DNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法。獲得的重組質(zhì)粒能在大腸桿菌中復(fù)制，并可復(fù)制得到完整的人線粒體DNA，不僅可實(shí)現(xiàn)人線粒體DNA的體外量化制備，而且將其研究水平擴(kuò)展到原核水平，降低了其研究復(fù)雜程度。具體構(gòu)建過(guò)程包括提取完整的人線粒體DNA、通過(guò)引物設(shè)計(jì)獲取后續(xù)插入線粒體DNA中的外源基因、以及構(gòu)建包含以上基因的重組質(zhì)粒。
[0039]一、提取完整的人線粒體DNA
[0040]完整的人線粒體DNA均可在美國(guó)國(guó)立生物信息中心(NCBI )、歐洲生物信息中;(ΕΒΙ)、法國(guó)免疫球蛋白基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)(MGT)等數(shù)據(jù)庫(kù)查詢中得到。本發(fā)明中則按照線粒體DNA的提取方法，從人新鮮血液提取所需的人線粒體DNA，具體過(guò)程如下:
[0041 ] 取人新鮮血液，加入4倍體積的細(xì)胞裂解液，振蕩混勻10分鐘，4°C條件下3000rmp離心10分鐘，取上清，4°C條件下15000rmp離心10分鐘，去上清，所得沉淀使用線粒體DNA提取試劑盒提取線粒體DNA。提取得到的線粒體DNA經(jīng)DNA電泳顯示大小約為16Kb (圖1所示)。對(duì)提取得到的線粒體DNA進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，設(shè)計(jì)以下引物:
[0042]引物1:5，-TTA TGT AGC TTA CCT CCT CAA-3，；
[0043]引物2:5’ -TGT CAG TTC AGT CTT TTA ATC-3，；[0044]取提取得到的線粒體DNA為模板，以引物I和引物2為上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，
反應(yīng)體系如下:
【權(quán)利要求】
1.一種人線粒體DNA重組質(zhì)粒，其特征在于，所述重組質(zhì)粒包含完整的人線粒體DNA和大腸桿菌復(fù)制子基因；所述大腸桿菌復(fù)制子基因插入人線粒體DNA的D-LOOP區(qū)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人線粒體DNA重組質(zhì)粒，其特征在于，所述重組質(zhì)粒還包含插入到人線粒體DNA的D-LOOP區(qū)、并連接在大腸桿菌復(fù)制子基因的C端的抗性篩選基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人線粒體DNA重組質(zhì)粒，其特征在于，所述抗性篩選基因具有多克隆位點(diǎn)，所述多克隆位點(diǎn)為Sal I位點(diǎn)、Bgl II位點(diǎn)和Not I位點(diǎn)的至少兩個(gè)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人線粒體DNA重組質(zhì)粒，其特征在于，所述大腸桿菌復(fù)制子基因的N端和所述抗性篩選基因的C端均包含Ale I位點(diǎn)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的人線粒體DNA重組質(zhì)粒，其特征在于，所述抗性篩選基因?yàn)榘逼S基因。
6.一種人線粒體DNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: A、提取完整的人線粒體DNA； B、從pUC19質(zhì)粒中擴(kuò)增出大腸桿菌復(fù)制子基因、或擴(kuò)增出大腸桿菌復(fù)制子基因和抗性篩選基因，作為插入人線粒體DNA中的外源基因；以及 C、同時(shí)酶切人線粒體DNA和外源基因，將酶切過(guò)的人線粒體DNA和外源基因經(jīng)去磷酸化處理后連接在一起，制得所述人線粒體DNA重組質(zhì)粒。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的人線粒體DNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟B包括: 設(shè)計(jì)一對(duì)引物:
引物 3:5，-CAC ATC GGTG CGC GTT GCT GGC GTT TTT CCA-3，；
引物4 ?，-Ckk ATC GGTG GTCGAC ATC AGA TCT CAT GCGGCCGC CAA AAG GCC AGC AAAAGG CCA-3’ ； 基于PCR方法，使用引物3和引物4從pUC19質(zhì)粒中擴(kuò)增出大腸桿菌復(fù)制子基因和抗性篩選基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的人線粒體DNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于，擴(kuò)增出的所述大腸桿菌復(fù)制子基因的N端和所述抗性篩選基因的C端均包含Ale I位點(diǎn)；擴(kuò)增出的所述抗性篩選基因具有多克隆位點(diǎn)，所述多克隆位點(diǎn)為Sal I位點(diǎn)、Bgl II位點(diǎn)和Not I位點(diǎn)的至少兩個(gè)。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的人線粒體DNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟B包括: 設(shè)計(jì)一對(duì)引物:
引物 3:5，-CAC ATC GGTG CGC GTT GCT GGC GTT TTT CCA-3’ ；
引物5:5，-CAA ATC GGTG GTCGAC ATC AGA TCT CAT GCGGCCGC AGA TCA AAG GAT CTTCTT GAG-3’ ； 基于PCR方法，使用引物3和引物5從pUC19質(zhì)粒中擴(kuò)增出大腸桿菌復(fù)制子基因。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的人線粒體DNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于，在所述步驟C中，使用限制性內(nèi)切酶Ale I同時(shí)酶切人線粒體DNA和外源基因，將酶切過(guò)的人線粒體DNA和外源基因經(jīng)去磷酸化處理后用T4連接酶連接在一起。
【文檔編號(hào)】C12N15/66GK104031929SQ201310128777
【公開(kāi)日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2013年4月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月6日
【發(fā)明者】易俊波 申請(qǐng)人:深圳大學(xué)