本發(fā)明屬于作物遺傳育種領(lǐng)域，具體涉及一種玉米自交系莖尖活體轉(zhuǎn)化方法。我們將玉米pifs基因在玉米自交系sl1303中進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的莖尖活體轉(zhuǎn)化，將含有除草劑篩選標(biāo)記的外源基因zmpif1和zmpif3轉(zhuǎn)入到玉米莖尖，通過除草劑草丁膦篩選獲得了陽性植株，并進(jìn)行pcr檢測，通過正交實(shí)驗(yàn)對轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行綜合研究，創(chuàng)建了適合玉米自交系sl1303農(nóng)桿菌介導(dǎo)的莖尖活體轉(zhuǎn)化的最優(yōu)方案。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的莖尖活體轉(zhuǎn)化與傳統(tǒng)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因方法相比，具有許多不可比擬的優(yōu)勢：成本低，操作簡便，不受季節(jié)、植物發(fā)育時期等因素的限制，有望發(fā)展為玉米轉(zhuǎn)基因的常規(guī)技術(shù)，為今后利用該方法進(jìn)行玉米的轉(zhuǎn)基因提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

背景技術(shù)：

1植物轉(zhuǎn)基因的方法

植物轉(zhuǎn)基因是利用重組dna技術(shù)將克隆到的優(yōu)良目的基因?qū)胫参锛?xì)胞或組織，并在其中進(jìn)行表達(dá)，從而獲得具新性狀的植物。這一技術(shù)繞過了物種生殖隔離的障礙，使基因交流的范圍擴(kuò)大到整個生物界，可將從細(xì)菌、病毒、動物、遠(yuǎn)緣植物甚至人工合成的基因?qū)胫参?魏松紅等，2002)。自1984年，世界第一例轉(zhuǎn)基因植物——煙草問世以來，轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生至今僅20多年時間，其研究和應(yīng)用得到了非常迅猛的發(fā)展，常規(guī)的植物轉(zhuǎn)基因方法已日趨成熟。大體可分為物理誘導(dǎo)dna直接插入法、化學(xué)誘導(dǎo)dna直接插入法以及載體轉(zhuǎn)化法三種轉(zhuǎn)化方法。

1.1物理誘導(dǎo)dna直接插入法

物理誘導(dǎo)dna直接插入法包括電激法、超聲波介導(dǎo)法、子房注射法、花粉管通道法和基因槍法等。1986年fromm等人首次成功用電激法轉(zhuǎn)化了玉米原生質(zhì)體(frommetal.,1986)。張宏等人利用超聲波法轉(zhuǎn)化玉米愈傷組織獲得轉(zhuǎn)基因植株(張宏等，1997)。1993年丁群星等用子房注射法把bt基因?qū)胗衩祝晒Λ@得了轉(zhuǎn)基因植株(丁群星等，1993)。

基因槍法是植物遺傳轉(zhuǎn)化比較常用的方法之一，基因槍法由美國cornell大學(xué)的sanford等研究提出(sanfordetal.,1987)。其原理是通過亞精胺、cacl2等試劑將dna包被在重金屬顆粒(如鎢粉、金粉等)上制成微彈，利用基因槍產(chǎn)生的高壓沖力將攜帶外源目的基因的微彈直接導(dǎo)入受體細(xì)胞，外源基因隨機(jī)整合到植物染色體中，從而實(shí)現(xiàn)外源基因在被轉(zhuǎn)化植物中的表達(dá)和穩(wěn)定遺傳(李寶山，2008)。1987年,klein等首次將基因槍法應(yīng)用于植物轉(zhuǎn)基因研究，并于1989年第一次使用基因槍法轉(zhuǎn)化玉米獲得成功(kleinetal.,1989)。

1.2化學(xué)誘導(dǎo)dna直接插入法

化學(xué)誘導(dǎo)dna直接插入法主要包括peg介導(dǎo)法和脂質(zhì)體介導(dǎo)法。peg介導(dǎo)法主要原理是化合物聚乙二醇、多聚l‐鳥氨酸、磷酸鈣及存在高ph值條件下誘導(dǎo)原生質(zhì)體攝取外源dna分子(劉俊等，2005)。peg介導(dǎo)法目前在玉米中得到了應(yīng)用(liangetal.,2014)。脂質(zhì)體介導(dǎo)法是通過植物原生質(zhì)體的吞噬或與細(xì)胞膜的融合作用把被脂質(zhì)體包裝成球狀的外源dna轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞中。脂質(zhì)體介導(dǎo)法一般應(yīng)用動物細(xì)胞轉(zhuǎn)化，植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的應(yīng)用還比較少。王瓞等人利用煙草研究過脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的最優(yōu)條件(王瓞等，1997)。脂質(zhì)體介導(dǎo)法和peg法都是以植物的原生質(zhì)體為受體材料，因此這兩種方法對于原生質(zhì)體再生困難的植物來說，受到了一定的限制。

1.3載體轉(zhuǎn)化法

載體轉(zhuǎn)化法主要有病毒介導(dǎo)法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法兩種。病毒介導(dǎo)法主要是以雙鏈dna病毒作為載體，去除有關(guān)的致病性基因，換上外源基因，體外包裝成有感染力的病毒顆粒，轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞原生質(zhì)體，并由此再生成整株植物，病毒介導(dǎo)法曾被用于油菜的轉(zhuǎn)化研究(王蘇燕等，1997)。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是一種天然的基因轉(zhuǎn)化方法。目前，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是玉米轉(zhuǎn)基因最常用的方法，本研究玉米中的轉(zhuǎn)化也是采用的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，因此將在下文作更為詳細(xì)的說明。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法與其他方法相比，具有轉(zhuǎn)化效率較高、插入外源dna片段大小明確、造成最小的dna重排、多拷貝整合現(xiàn)象較少、不易發(fā)生基因沉默、能夠?qū)氪笃蝑na、成本較小、操作簡便等幾大優(yōu)勢。

2農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的原理

農(nóng)桿菌是根瘤菌科(rhizobiaceae)農(nóng)桿菌屬(agrobacterium)細(xì)菌，用于植物轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌分為根瘤農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌。根瘤農(nóng)桿菌應(yīng)用更廣，根瘤農(nóng)桿菌中含有腫瘤誘導(dǎo)(ti)質(zhì)粒，ti質(zhì)粒上含有可轉(zhuǎn)移dna(t‐dna)區(qū)、毒性區(qū)(vir區(qū))以及冠廖堿代謝基因編碼區(qū)。t‐dna兩端是兩個25bp的重復(fù)序列，分別稱為左邊界和右邊界，兩個邊界序列之間是生長素和細(xì)胞分裂素合成基因以及冠瘦堿合成基因。vir區(qū)中也含有多個基因段，如vira、virb、virc、vird、vire、virg、virh等，每個基因段都含有多個基因。當(dāng)植物受到傷害時，分泌含有酚類化合物的汁液，這些酚類化合物一方面通過染色體毒性基因(chva、chvb等)介導(dǎo)的趨化性促使農(nóng)桿菌向植物受傷部位移動并附著于植物細(xì)胞表面；另一方面則被ti質(zhì)粒上由vira和virg組成的雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)識別，從而誘導(dǎo)其他vir基因的表達(dá)。vir基因編碼的vird2蛋白相當(dāng)于反式作用元件，能夠識別農(nóng)桿菌t‐dna兩端25bp序列，進(jìn)而將t‐dna以單鏈的形式切割下來，同時，vir基因編碼的vire2能夠與單鏈t‐dna結(jié)合，形成t‐復(fù)合物，在核定位序列的作用下，經(jīng)過宿主細(xì)胞t4ss轉(zhuǎn)運(yùn)體系進(jìn)入宿主細(xì)胞質(zhì)(juhasetal.,2008)。之后便是宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)過程，激活ti質(zhì)粒上處于反式位置上的一段t‐dna的轉(zhuǎn)移，并插入到植物基因組中，使其攜帶的目的基因在植物中得以表達(dá)。反應(yīng)過程主要包括以下幾步:(1)農(nóng)桿菌對植物傷口的識別與吸附；(2)virg的信號傳導(dǎo)及vir基因的誘導(dǎo)表達(dá)；(3)t‐dna復(fù)合物的形成并通過農(nóng)桿菌進(jìn)入植物細(xì)胞；(4)t‐dna復(fù)合物的成熟；(5)t‐dna整合進(jìn)植物基因組并進(jìn)行表達(dá)(gelvin，2010)。

3農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的發(fā)展歷史

發(fā)展一種成熟的方法用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化是一個非常復(fù)雜的任務(wù)，因?yàn)楸仨毩私庥绊憈‐dna傳遞到愈傷組織的所有因素，然后還要誘導(dǎo)愈傷組織再分化形成再生植株。植株再生后，還需要進(jìn)行進(jìn)一步的分析，以檢查t‐dna的結(jié)合及穩(wěn)定性，并獲得最終轉(zhuǎn)化效率參數(shù)。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法從1983年創(chuàng)建以來，在雙子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化中得到廣泛應(yīng)用，但玉米起初卻一直難以運(yùn)用這種方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。因?yàn)閱巫尤~植物并不是農(nóng)桿菌的天然宿主，portrykus曾認(rèn)為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物是不可能的(potrykus，1990，1991)。禾谷科作物如水稻、小麥、玉米都是單子葉植物，是人類重要的糧食作物，利用基因工程技術(shù)對這類植物進(jìn)行研究具有十分重要的價值。隨著對農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的原理進(jìn)行系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)農(nóng)桿菌對單子葉植物浸染的不敏感性，可能是因?yàn)閱巫尤~植物創(chuàng)傷后，在傷口附近往往發(fā)生木質(zhì)化或硬化，而且沒有明顯的細(xì)胞分裂發(fā)生，內(nèi)源信號分子相對不足，不能形成足量的誘導(dǎo)vir區(qū)基因表達(dá)的酚類化合物(amoahetal.,2001)。

1984年，hernalstenns等通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功轉(zhuǎn)化單子葉植物石刁柏的應(yīng)用報(bào)道，首次證實(shí)了根癌農(nóng)桿菌是可以轉(zhuǎn)化單子葉植物的，并為根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物的研究提供了理論依據(jù)和技術(shù)支撐，為近年來單子葉植物的轉(zhuǎn)化研究的不斷發(fā)展奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)(hernalsteensetal.,1984)。從20世紀(jì)90年代早期開始，研究者為了通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得能夠穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因玉米而進(jìn)行了許多努力。

第一株通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得的轉(zhuǎn)基因玉米誕生于1996年，ishida等在前人探索與研究的基礎(chǔ)上，利用農(nóng)桿菌lba4404轉(zhuǎn)化玉米自交系a188幼胚，獲得了轉(zhuǎn)基因玉米，且轉(zhuǎn)化率達(dá)5％‐30％，并且證明了外源基因的成功整合、表達(dá)以及穩(wěn)定遺傳(ishidaetal.,1996)。該研究在一定程度上充分證實(shí)了玉米通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的可行性，并為今后的研究提供了可靠的科學(xué)依據(jù)。

玉米等單子葉植物非農(nóng)桿菌天然宿主,遺傳轉(zhuǎn)化率低，即使獲得少量轉(zhuǎn)基因植株也因遺傳穩(wěn)定性差、基因表達(dá)水平低及嵌合體等問題而限制了對后代的選擇和利用。因此研究影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的因素，優(yōu)化轉(zhuǎn)化體系是用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化玉米工作的重點(diǎn)。

4玉米莖尖活體轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的莖尖活體轉(zhuǎn)化，是一種重要的遺傳轉(zhuǎn)化方法，這種方法操作簡單，不會因?yàn)橹参锝M織培養(yǎng)而產(chǎn)生體細(xì)胞變異，且不受季節(jié)限制，被大量地應(yīng)用于植物外源基因的轉(zhuǎn)化上。目前在棉花、水稻、高粱、玉米及小麥上均有以莖尖生長點(diǎn)為受體進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的大量報(bào)道。

玉米農(nóng)桿菌介導(dǎo)的莖尖活體轉(zhuǎn)化，2009年孫傳波等以玉米自交系鄭58的莖尖為受體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將抗草甘膦epsps基因轉(zhuǎn)入玉米莖尖，經(jīng)pcr檢測，7株轉(zhuǎn)化植株呈陽性，轉(zhuǎn)化率達(dá)7.14％，初步證明外源基因已經(jīng)整合到玉米基因組中(孫傳波等，2009)。2010年余桂容等對10種玉米自交系在莖尖轉(zhuǎn)化過程中最佳的芽生長時間、移栽成活率、除草劑篩選濃度進(jìn)行了研究，并且成功轉(zhuǎn)化4種玉米自交系(余桂容等，2010)。2011年梁廣東等以玉米自交系魯9801、k10芽尖為受體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，獲得了轉(zhuǎn)bcwrky1基因陽性植株(梁廣東等，2011)。2012年汪婷婷等研究了玉米自交系天塔五母和7922在莖尖轉(zhuǎn)化過程中最佳真空滲透和共培養(yǎng)時間并成功獲得轉(zhuǎn)基因植株(汪婷婷等，2012)。

玉米自交系sl1303是由是研究玉米耐鹽的理想材料，其莖尖活體轉(zhuǎn)化方法尚未有報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供一種玉米自交系sl1303莖尖活體轉(zhuǎn)化方法。

本發(fā)明公開了一種玉米自交系sl1303莖尖活體轉(zhuǎn)化方法，該方法是以玉米自交系sl1303為受體材料進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的莖尖活體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入外源基因，獲得轉(zhuǎn)基因玉米。

具體地，是以玉米自交系sl1303為受體材料的進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的莖尖活體轉(zhuǎn)化，將含有除草劑篩選標(biāo)記的外源基因轉(zhuǎn)入到玉米莖尖，通過濃度為50mg/l的除草劑草丁膦篩選獲得了抗性植株。

進(jìn)一步地，所述外源基因包括但不限于zmpif1和zmpif3。

作為優(yōu)選的方案，本發(fā)明中農(nóng)桿菌侵染時選用超毒農(nóng)桿菌菌株eha105，農(nóng)桿菌濃度od600值為0.6，乙酰丁香酮濃度為150μg/l時植株陽性率最高。

本發(fā)明方法與傳統(tǒng)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因方法相比，具有許多不可比擬的優(yōu)勢：成本低，操作簡便，不受季節(jié)、植物發(fā)育時期等因素的限制，而且當(dāng)代即可獲得轉(zhuǎn)基因的種子，t2代可獲得純合的轉(zhuǎn)基因株系，無需組培再生階段，對于保持主栽品種的生產(chǎn)力而改善其某一性狀具有特殊的優(yōu)勢，有望發(fā)展為玉米轉(zhuǎn)基因的常規(guī)技術(shù)，在提高玉米的品質(zhì)性狀和抗逆性能等方面的品種改良中發(fā)揮重要作用。

附圖說明

圖1同源重組法構(gòu)建p1011-v-bar-zmpif1和p1011-v-bar-zmpif3載體簡易流程。

圖2含p1011-v-bar-zmpif1和p1011-v-bar-zmpif3質(zhì)粒農(nóng)桿菌pcr結(jié)果。m：marker2504，泳道1-4：p1011-v-bar-zmpif1轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌，泳道6-9：p1011-v-bar-zmpif3轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌。

圖3含p1011-v-bar-zmpif1農(nóng)桿菌zmpif1測序a73375_s11_1411036154j：測序農(nóng)桿菌菌液的序列；zmpif1：zmpif1基因序列。

圖4含p1011-v-bar-zmpif3農(nóng)桿菌zmpif3測序。a73375_s01_1411029763j：測序農(nóng)桿菌菌液的序列；zmpif3：zmpif3基因序列。

圖5玉米莖尖活體轉(zhuǎn)化過程。a：種子萌發(fā)；b：莖尖剝離；c：真空侵染。

圖6農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米莖尖活體轉(zhuǎn)化草丁膦處理前后圖。a：草丁膦處理前；b：草丁膦處理后。

圖7轉(zhuǎn)基因玉米bar基因部分pcr鑒定結(jié)果。m：marker2501；-：sl1303；+：質(zhì)粒；h：超純水；1-20：編號為zmpif1-sl1303-1至zmpif1-sl1303-20再生植株。

圖8轉(zhuǎn)基因玉米bar基因部分pcr鑒定結(jié)果。m：marker2501；-：sl1303；+：質(zhì)粒；h：超純水；1-20：編號為zmpif3-sl1303-1至zmpif3-sl1303-20再生植株

具體實(shí)施方式

為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合具體參數(shù)、生物材料、附圖進(jìn)行具體說明，不應(yīng)理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的進(jìn)一步限定。

實(shí)施例1：實(shí)驗(yàn)材料

1植物材料

玉米自交系sl1303，該受體是對鹽敏感的玉米自交系材料(gaoy,luy,wum,liange,liy,zhangd,yinz,renx,daiy,dengd,chenj.abilitytoremovena⁺andretaink⁺correlateswithsalttoleranceintwomaizeinbredlinesseedlings.frontiersinplantscience,2016,7,1716)。

2菌株與質(zhì)粒

雙t超毒載體p1011-v-bar由本實(shí)驗(yàn)室陳云構(gòu)建(陳云，含virg基因雙t-dna表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化小麥的研究.揚(yáng)州大學(xué)碩士學(xué)位論文，2015)，大腸桿菌dh5α、根癌農(nóng)桿菌eha105、根癌農(nóng)桿菌lba4404原始菌株購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司，其感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存。

3實(shí)驗(yàn)試劑

bamhⅰ酶和t4dna連接酶購自newenglandbiolabs有限公司。同源重組酶ii購自南京諾唯贊生物科技有限公司。膠回收試劑盒、pcr純化試劑盒與質(zhì)粒提取試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。普通taq酶與taq-plus酶購自takara生物科技有限公司。lb培養(yǎng)基、草丁膦除草劑、氨芐青霉素和卡那霉素購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司。

4pcr引物

該方法應(yīng)用同源重組原理進(jìn)行連接，在同源重組中為了保證目的片段插入載體的方向，上、下游引物的5’端分別加入bamhⅰ及該酶切位點(diǎn)前后約15個堿基的載體序列。同源重組方法使用的引物為：zmpif1-f-ty、zmpif1-r-ty和zmpif3-f-ty、zmpif3-r-ty。根據(jù)bar基因的序列設(shè)計(jì)檢測引物bar-f-490和bar-r-490，引物序列見表1.1，引物合成由蘇州金唯智生物科技有限公司完成，序列測序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

表1.1引物序列

實(shí)施例2：同源重組法構(gòu)建玉米轉(zhuǎn)基因載體

1目的基因zmpif1、zmpif3的擴(kuò)增

以p19s-zmpif1和p19s-zmpif3為模板，用同源重組特異引物擴(kuò)增目的基因。擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為1746bp和1983bp，pcr反應(yīng)體系與反應(yīng)程序參照takarataq-plus酶的說明書，擴(kuò)增后的pcr反應(yīng)產(chǎn)物用1％的瓊脂糖電泳檢測，大小正確的條帶切膠回收-20℃保存。

2載體酶切

在同源重組構(gòu)建載體的方法中，用bamhⅰ限制性內(nèi)切酶對p1011-v-bar載體切割。酶切體系：1μlbamhⅰ，2μlbufferm，17μlp1011-v-bar，總體系為20μl。酶切體系置37℃反應(yīng)2h。酶切產(chǎn)物進(jìn)行dna純化。

3目的片段與表達(dá)載體同源重組

將zmpif1和zmpif3的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物同源重組入p1011-v-bar。同源重組反應(yīng)體系：2μlexnasetmii，4μl5×ceiibuffer，3.5μlp1011-v-bar，1μl目的片段，9.5μlddh2o，總體系為20μl。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞dh5α中，轉(zhuǎn)化菌涂布含卡那霉素的固體培養(yǎng)基平板進(jìn)行陽性克隆篩選并測序，獲得重組的表達(dá)載體，其構(gòu)建簡易流程如圖1。擴(kuò)搖測序正確的菌液并保存，獲得重組載體p1011-v-bar-zmpif1和p1011-v-bar-zmpif3，-20℃保存。

4制備感受態(tài)農(nóng)桿菌以及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

(1)取感受態(tài)農(nóng)桿菌細(xì)胞200μl，加入質(zhì)粒2-5μl；

(2)冰上10min；

(3)液氮10min；

(4)37℃，10min，300rpm(提前準(zhǔn)備)；

(5)加入800μllb液體培養(yǎng)基，28℃，3h，350rpm；

(6)6000rpm離心，吸去上清800μl，涂板；

(7)28℃，培養(yǎng)48h；

(8)挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，用zmpif1和zmpif3基因引物進(jìn)行pcr鑒定，鑒定為陽性的可直接用于玉米的轉(zhuǎn)化。

結(jié)果顯示轉(zhuǎn)p1011-v-bar-zmpif1的農(nóng)桿菌在1746bp左右的位置有明亮單一的條帶，轉(zhuǎn)p1011-v-bar-zmpif3的農(nóng)桿菌在1983bp左右的位置有明亮單一的條帶(圖2)，表明p1011-v-bar-zmpif1和p1011-v-bar-zmpif3載體構(gòu)建成功，并且已經(jīng)轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌eha105中。菌落pcr產(chǎn)物測序，測序引物為克隆引物，測序結(jié)果的序列比對正確(圖3和圖4)。

實(shí)施例3：草丁膦除草劑最適篩選濃度的選定

農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米莖尖活體轉(zhuǎn)化侵染及共培養(yǎng)完成后，需要對長至2-3葉期的玉米進(jìn)行草丁膦除草劑篩選處理，參照相關(guān)文獻(xiàn)，我們最初選用了200mg/l草丁膦除草劑對農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后的材料進(jìn)行篩選處理，結(jié)果造成了植株全部死亡的失敗案例。因此設(shè)計(jì)了實(shí)驗(yàn)來選定玉米自交系sl1303草丁膦除草劑的最適篩選濃度。

將草丁膦除草劑配成25、50、75mg/l三種不同濃度的水溶液，對2-3葉期的玉米自交系sl1303(90株)用不同濃度的草丁膦除草劑噴灑，以葉片掛液珠為準(zhǔn)，噴施蒸餾水作為對照，噴灑后觀察葉片變化及植株存活情況，每周統(tǒng)計(jì)存活株數(shù)，確定轉(zhuǎn)基因植株的最佳篩選濃度。

噴施除草劑三天后，植株停止生長，葉尖開始變黃；七天后，噴施高濃度除草劑的植株有一半已經(jīng)死亡，低濃度有部分死亡；十五天后噴施75mg/l草丁膦的植株全部死亡，噴施25及50mg/l草丁膦的植株死亡率分別為53.3％、92.2％(表3.1)，而對照組生長正常，由于剛侵染完的植株生命力弱，濃度過高可能會將部分成功轉(zhuǎn)化的植株殺死，因此選用50mg/l草丁膦作為玉米自交系sl1303轉(zhuǎn)基因植株的最適篩選濃度。

表3.1不同濃度草丁膦對sl1303幼苗死亡的影響

實(shí)施例4：通過正交實(shí)驗(yàn)對轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

關(guān)于莖尖活體轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)方案，我們查閱了大量已報(bào)道的相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)玉米莖尖活體轉(zhuǎn)化過程中由于受體基因型的不同，所采用農(nóng)桿菌的菌種、菌液濃度、乙酰丁香酮濃度、浸染及共培養(yǎng)條件等因素也都不相同，轉(zhuǎn)化效果也不相同，因此需要通過正交實(shí)驗(yàn)找出適合玉米自交系sl1303的最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件。

正交實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)因素包括：農(nóng)桿菌菌種、菌液濃度、乙酰丁香酮(as)濃度共3個因素，每個因素設(shè)2個水平(表4.1)，實(shí)驗(yàn)采用l4_2_3正交表，4個處理，每個處理設(shè)3次重復(fù)，每個重復(fù)轉(zhuǎn)化莖尖100個。除草劑篩選后，初步計(jì)算除草劑抗性率，確定玉米sl1303莖尖活體轉(zhuǎn)化的最適條件。

表4.1莖尖活體轉(zhuǎn)化的正交試驗(yàn)方案

試驗(yàn)共處理莖尖1200個，獲得成活植株503株，對轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行了抗性鑒定，初步篩選到抗性植株54株，平均轉(zhuǎn)化率為10.7％。選用超毒農(nóng)桿菌菌株eha105，農(nóng)桿菌濃度od600值為0.6，乙酰丁香酮濃度為150μg/l時抗性植株率最高，各處理抗性植株率結(jié)果列于表4.2。

表4.2莖尖活體轉(zhuǎn)化各處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)施例5：玉米莖尖活體轉(zhuǎn)化的方法

1滅菌和發(fā)芽

選擇籽粒飽滿整齊一致的sl1303自交系種子，放入250ml的三角瓶中加入1.5倍體積的25％次氯酸鈉消毒30min，完畢后用無菌水洗滌5次，在4℃條件下吸漲8h。準(zhǔn)備底部墊有濾紙的培養(yǎng)皿，提前滅菌，將消毒的種子胚面朝上整齊擺放在培養(yǎng)皿中，于28℃培養(yǎng)箱中發(fā)芽3天左右直至芽長為4cm左右的黃化苗用于轉(zhuǎn)化。

2侵染

在超凈工作臺上用無菌手術(shù)刀切掉黃化苗葉鞘，然后縱向損傷莖尖生長點(diǎn)，整齊擺放于無菌的培養(yǎng)皿中，在50kpa的負(fù)壓條件下進(jìn)行浸染，完畢后將莖尖用濾紙吸干，放回原萌發(fā)培養(yǎng)皿中，黑暗條件下共培養(yǎng)3‐4天，直到幼苗重新長出新葉。

3除草劑抗性篩選

轉(zhuǎn)化莖尖的幼苗移栽到土壤中，在3葉期對這些植株噴施50mg/l草丁膦溶液進(jìn)行除草劑抗性篩選，初步計(jì)算除草劑抗性率。

農(nóng)桿菌法介導(dǎo)zmpif1、zmpif3基因轉(zhuǎn)化玉米sl1303分別共侵染莖尖2400個，獲得草丁膦抗性植株數(shù)67和55株，草丁膦抗性率分別為5.37％和5.59％(表5.1)。農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米莖尖活體轉(zhuǎn)化過程見圖5，莖尖活體轉(zhuǎn)化后草丁膦處理效果見圖6。

表5.1玉米莖尖轉(zhuǎn)化zmpif1和zmpif3基因轉(zhuǎn)化結(jié)果

4轉(zhuǎn)基因植株的檢測

4.1轉(zhuǎn)基因玉米的dna提取

(1)取再生植株兩片幼嫩葉片(約0.1g)，剪碎裝入2ml的離心管中，置于液氮中冷卻，用筷子搗碎至粉末狀；

(2)離心管室溫稍放置，加入700μl的緩沖液a(buffera)，輕輕混勻后，65℃水浴20min(每5min上下顛倒混勻一次)；

(3)取出稍冷卻至室溫，加入等體積的酚/氯仿(各350μl)，上下顛倒，充分混勻抽提5min；

(4)12000rpm，離心10min，吸取上清到一新的離心管中；

(5)加等體積的氯仿(約750μl)，上下顛倒，充分混勻，抽提5min；

(6)12000rpm，離心10min，吸取上清到一新的離心管中；

(7)加0.7倍體積的異丙醇(約560μl)，混勻，室溫放置10min，可見絮狀沉淀；12000rpm，離心10min，棄去上清；

(8)加500μl的70％的乙醇洗滌兩次，每次2‐3min；室溫下晾干；

(9)加20μl的ter溶解，37℃溫浴45min；

(10)0.8％瓊脂糖電泳，調(diào)節(jié)其濃度；

(11)‐20℃保存。

4.2轉(zhuǎn)基因玉米的pcr檢測

根據(jù)載體t‐dna區(qū)的bar基因序列，通過軟件primerpremier5.0，設(shè)計(jì)引物bar‐f‐490、bar‐r‐490(表1.1)，產(chǎn)物大小490bp。pcr反應(yīng)體系與反應(yīng)程序參照takara普通taq酶的說明書。擴(kuò)增后pcr反應(yīng)產(chǎn)物用1％的瓊脂糖電泳檢測，目的片段與陽性對照相同的幼苗就是t0代陽性植株。

再生植株的pcr檢測結(jié)果如圖7、8所示，圖7為轉(zhuǎn)zmpif1基因玉米bar基因檢測結(jié)果，陰性對照水和sl1303中未擴(kuò)增出目的條帶，再生陽性植株在490bp的位置擴(kuò)增出與陽性對照p1011-v-bar-zmpif1質(zhì)粒中大小一致的條帶。圖8為轉(zhuǎn)zmpif3基因玉米bar基因的檢測結(jié)果，陰性對照水和sl1303中未擴(kuò)增出目的條帶，再生陽性植株在490bp的位置擴(kuò)增出與陽性對照p1011-v-bar-zmpif3質(zhì)粒中大小一致的條帶。農(nóng)桿菌法介導(dǎo)zmpif1、zmpif3基因轉(zhuǎn)化玉米sl1303，zmpif1pcr陽性植株數(shù)7株，轉(zhuǎn)化率0.56％。zmpif3pcr陽性植株數(shù)6株，轉(zhuǎn)化率0.61％(表5.1)。

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<110>揚(yáng)州大學(xué)

<120>一種玉米自交系莖尖活體轉(zhuǎn)化方法

<130>

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