本發(fā)明涉及分子生物學領域，更特別地，涉及一種黃嘌呤氧化酶基因、其編碼的黃嘌呤氧化酶及其應用，黃嘌呤氧化酶基因表達載體及表達菌株，以及一種氧化次黃嘌呤和黃嘌呤的方法。

背景技術：

黃嘌呤氧化酶(xanthineoxidase，簡稱xod，ec1.1.3.22)廣泛存在于各種生物體的組織和細胞中，是一類胞質復合酶，是生物有機體嘌呤代謝的關鍵酶，屬鉬酶家族。在o2存在下，xod以分子氧為直接電子受體，無需輔酶就能催化氧化反應。xod參與細胞幾乎所有生物化學過程，核苷酸在體內可先降解為核苷和磷酸，核苷在核苷酶的作用下分解為嘌呤堿基、嘧啶堿基和核糖。xod催化次黃嘌呤和黃嘌呤氧化生成尿酸并隨后代謝成尿素的反應式如下：

反應式中(1)表示黃嘌呤氧化酶，(2)表示尿酸氧化酶，(3)表示尿囊素酶，(4)表示尿囊酸酶

代謝過程中，還產生超氧化物或氧自由基等具有重要生理功能的物質，其與缺血性再灌注損傷、高尿酸血癥、痛風風濕性、肝炎、關節(jié)炎等疾病密切相關而倍受注目。

目前，xod已經被開發(fā)成為商業(yè)用酶且具有較高附加值，在臨床上可用于制備免疫抗體、腫瘤抑制劑及用于疾病的檢測診斷試劑，主要用于黃嘌呤、次黃嘌呤、次黃嘌呤核苷(肌苷)的檢測，及輔助檢測鳥嘌呤和鳥苷，也應用于測定5’-核苷磷酸化酶的活性，適用于肝膽腫瘤檢測。同時xod還被廣泛應用于血清無機磷的水平(高磷血癥)和超氧化物歧化酶sod活力的檢測上。因而，因此對黃嘌呤氧化酶xod的開發(fā)和研究，具有重要理論意義和廣闊的應用前景。

此外，魚體內的次黃嘌呤的含量隨著他它的腐爛度增加而增加，所以通過測定其體內次黃嘌呤的變化，可以確定魚的新鮮度。黃嘌呤氧化酶還可用于降解類胡蘿卜素制備煙用香料。

目前國內外所使用的黃嘌呤氧化酶，主要是從牛奶中獲取。由于其來源較為單一，生產成本較高，而且黃嘌呤氧化酶的含量和質量受不同地域、不同種類奶牛的影響，在應用上對其限制很大。

因此，需要一種新的黃嘌呤氧化酶基因和表達系統(tǒng)。

技術實現(xiàn)要素：

為解決以上問題，本發(fā)明提供了一種黃嘌呤氧化酶基因，其序列為seqidno:1或其同義突變體。

本發(fā)明還提供了一種黃嘌呤氧化酶的表達載體，其包含黃嘌呤氧化酶表達框，所述黃嘌呤氧化酶表達框由啟動子和連接于所述啟動子下游的黃嘌呤氧化酶基因組成，所述黃嘌呤氧化酶基因的序列為seqidno:1或其同義突變體。

在一個優(yōu)選實施方案中，所述啟動子為可誘導型啟動子。

本發(fā)明還提供了一種表達黃嘌呤氧化酶的重組菌株，其通過將上述黃嘌呤氧化酶基因的表達載體轉化至表達宿主中得到。

本發(fā)明還提供了一種黃嘌呤氧化酶，其由上述黃嘌呤氧化酶基因編碼。

本發(fā)明還提供了上述黃嘌呤氧化酶在制備用于檢測次黃嘌呤和/或黃嘌呤濃度的試劑中的應用。

本發(fā)明還提供了一種氧化溶液中次黃嘌呤和/或黃嘌呤的方法，其包括向所述溶液中添加上述黃嘌呤氧化酶的步驟。

在一個優(yōu)選地實施方案中，所述溶液的ph為6.0-9.0。

在另一個優(yōu)選地實施方案中，所述溶液的溫度為25-55℃。

在另一個優(yōu)選地實施方案中，所述溶液中不含金屬離子，或者含有mg²⁺、ca²⁺、mo⁶⁺、co²⁺或mn²⁺。

附圖說明

圖1為提取的yf06基因組的電泳圖；

圖2為以yf06基因組為模板，用引物1和2進行pcr擴增得到的pcr產物的電泳圖；

圖3為ecorⅰ和hindⅲ雙酶切檢測重組質粒pgemt-xodab-his的電泳圖；

圖4為ecorⅰ和hindⅲ雙酶切檢測重組質粒pvlt33-xodab-his的電泳圖；

圖5為xod純化圖，顯示蛋白洗脫峰時間；

圖6為paw340[pvlt33]和paw340[pvlt33-xodab-his]的粗酶液，純化收集的7、8、9號蛋白的sds-page電泳圖，泳道1,2,3是純化后收集的濃度較高的7、8、9號蛋白；泳道4是純化前的粗酶液；泳道5是對照paw340[pvlt33]；m是蛋白分子marker；

圖7為用bsa制作的濃度標準曲線圖；

圖8為ph-xod活力曲線；

圖9為在不同ph保持16h后的xod的酶活曲線；

圖10為在溫度-xod活力曲線；

圖11為在不同溫度下保持30min后的xod的酶活曲線；

圖12為xod催化黃嘌呤氧化的酶促反應動力學雙倒數(shù)作圖。

具體實施方式

以下結合實例對本發(fā)明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。

1.產xod菌株的篩選

采集多地不同啤酒生產企業(yè)的污水處理池活性污泥，充分混勻，分別取少量樣品于放于洗凈滅菌的三角燒瓶中，加入適量的無菌水，在搖床上震蕩培養(yǎng)2天，讓土樣中的菌體充分釋放，離心取上清，得到含有土樣中的微生物的母液。

取1ml母液加入至50ml選擇培養(yǎng)基中，于30℃下振蕩(180r/min)培養(yǎng)7天；然后連續(xù)傳代培養(yǎng)4次，取200μl培養(yǎng)液梯度稀釋后，涂布選擇培養(yǎng)基平板，于30℃培養(yǎng)7天；待單菌落長出，挑取單菌落至固體無機鹽選擇培養(yǎng)基中，于30℃恒溫培養(yǎng)，挑選水解圈較大的菌落，在篩選過程中得到一株節(jié)桿菌屬菌株yf06，做進一步鑒定。

2.從yf06中提取xod

1)將yf06接種于已經滅菌的1/4營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，170r/min，30℃，培養(yǎng)24h；

2)向四瓶分別裝有100ml的1/4營養(yǎng)培養(yǎng)基中分別添加1ml培養(yǎng)物，培養(yǎng)48h后，測其od600值為0.6-0.8，加入黃嘌呤誘導24h；

3)將上述400ml培養(yǎng)物于8000r/min離心10min，棄上清，得沉淀，將沉淀用15ml50mm的tris-hcl(ph7.5)懸浮，在0℃條件下，以超聲功率400w，超聲頻率2s間隔2s進行超聲波細胞破碎，全程時間為25min。破碎完成后，于0℃、12000rpm下離心15min離心，除去細胞碎片，即得細胞破碎液上清；

4)將所得上清于0℃下緩慢加入硫酸銨固體至飽和度為45％，邊加入邊攪拌，鹽析過夜，8000rpm離心15min，去上清，向沉淀中加入最小體積酶緩沖液tris-hci緩沖液(50mm，ph7.5)將其完全溶解，經測定，所得的溶液具有xod酶活性，可見菌株yf06的基因組中可能具有xod酶編碼基因。

3.從菌株yfo6分離xod酶編碼基因

用premega基因組提取試劑盒提取yf06基因組，取少量dna進行凝膠電泳檢測。結果如圖1所示，所提取的基因組較為完整。對于單一型的同種dna樣品來說，核酸染料的嵌入量與樣品溶液的dna含量成正比，由圖可得提取的dna亮度約為marker的3倍，由加入的marker的量，即可推算出dna的濃度。利用微量紫外分光光度計，測定dna濃度5ug/ml,dnaod260/od280的比值約為1.71，證明其純度較好。

下載ncbigenbank數(shù)據(jù)庫中xod大小亞基基因序列，用clustalw2進行多序列比對后在xod基因的上游及下游保守區(qū)利用primer5.0軟件設計能擴增xod的引物。引物對序列分別如seqidno:2和3所示。

引物1：5’-gaattccatgtggcccgcgctgaccgtcacc-3’(seqidno:2)；

引物2：5’-aagctttcagtggtggtggtggtggtggcccatcgggcccacggtgt-3’(seqidno:3)。

以yf06為模板，使用引物1和2進行pcr擴增，擴增產物用0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖2所示，可以看到在5000下方有一條明顯的條帶，與預期目的基因大小相符，測序后得知其序列如seqidno:1所示，為擴增產物xod編碼基因xodab，從該序列可看到，其中的gc含量達到75％以上。

4.構建重組表達質粒pvlt33-xodab-his

將pcr產物進行瓊脂糖凝膠電泳回收，將產物加a。加尾產物連接到pgemt-easy載體，轉入dh5α，涂布于含有氨芐青霉素的lb固體平板，37℃培養(yǎng)12h，隨機挑選轉化子接種于3ml液體lb培養(yǎng)基中，37℃，12h后用堿裂解法提取質粒，進行酶切鑒定轉化子。結果如圖3所示，pgemt-easy載體大小為2867bp，xodab基因大小為3597bp，可以看到酶切抽提的質粒后有兩個條帶，與載體pgemt-easy和基因xodab大小相吻合，因此，xodab成功克隆到了pgem-t載體上。送上海生工測序，將正確的重組質粒命名為pgemt-xodab。

將鑒定正確的轉化子涂平板，挑取單菌落接于lb(含氨芐青霉素)37℃培養(yǎng)12h，用試劑盒抽提質粒，雙酶切后凝膠電泳回收xodab基因片段。將回收的目的基因連接到ecori/hindiii雙酶切回收的pvlt33載體上，并轉化于大腸桿菌dh5α，涂布于固體lb(卡那霉素50μg/ml)平板，37℃，培養(yǎng)12h后隨機挑選單菌落接于5ml液體lb(卡那霉素，37℃，12h后用煮沸法抽質粒，用ecori、hindiii雙切鑒定轉化子。結果如圖4所示，pvlt33載體大小為9.7kb，xod基因xodab大小為3597bp，由圖可以看到酶切抽提的質粒后有兩個條帶，與載體pvlt33和基因xodab大小相吻合，因此，xodab成功克隆到了pvlt33載體上。

5.表達菌株的構建

將鑒定正確的轉化子涂平板，挑取單菌落用煮沸法提取質粒，將重組質粒轉入paw340，即得到表達菌株。

誘導后的菌液離心，超聲破碎，4℃，12000rpm離心15min,除去細胞碎片，即得細胞粗酶液。取細胞粗酶液測定酶活性，測得工程菌酶搖瓶發(fā)酵產量為1.52u/ml?？梢娝玫闹毓こ叹昴苡谢钚缘膞od。

6.黃嘌呤氧化酶的純化

將誘導表達的重組工程菌paw340[pvlt33-xodab-his]粗酶液加入咪唑(0.005m)和nacl(0.5m)過濾，用histrap鎳柱純化蛋白。在純化酶的收集過程中從溶液b的體積增加開始收集，每1ml收集一管。純化如圖5所示，由圖可以看出，5號到10號是出峰時間段，無雜峰出現(xiàn)。分別取paw340[pvlt33]和paw340[pvlt33-xodab-his]的粗酶液，以及純化收集的7、8、9號蛋白20μl，加入5×上樣緩沖液沸水煮10min后離心，取上清進行sds-page凝膠檢測，結果如圖6所示,泳道1,2,3是純化后收集的濃度較高的7、8、9號蛋白；泳道4是純化前的粗酶液；泳道5是對照paw340[pvlt33]；m是蛋白分子量marker。

收集后測定每管的活力，選擇活力較高的7、8、9號用超濾離心管7000rpm離心3min。純化后的酶液分兩管保存。

用bsa標準液在不同濃度下測定595nm處的吸光度，繪制標準曲線，如圖7所示，bsa標準品的濃度在10-50μg/ml的范圍內與a595成較好的線性關系，標準曲線方程為y＝0.012x+0.008，r²＝0.993，可用于蛋白濃度計算。根據(jù)標準曲線計算純化后的paw340[pvlt33-xodab-his]的蛋白樣品濃度為26μg/ml。

7.xod酶活性的測定

黃嘌呤氧化酶在催化黃嘌呤氧化的反應過程中，每氧化1mol黃嘌呤，將消耗1mol分子氧和水，產生1mol尿酸和1molh2o2。尿酸在293nm處有最大吸收峰?？赏ㄟ^檢測溶液在293nm處的吸光度來測定尿酸濃度，從而通過濃度變化確定xod酶活性。

將純酶液加入含有黃嘌呤的溶液中，用紫外分光光度計在293nm吸收處進行測量。每隔30s進行一次檢測，根據(jù)反應產物尿酸的紫外吸收情況來確定黃嘌呤氧化酶的活力。

1u酶活力定義為在一分鐘內產生1μmol尿酸所需的酶量為1u。酶活性測定實驗采用產品說明書上的測定酶活方法，具體使用試劑及步驟如下：

a.tris-hclbuffer,ph7.5：0.1m

b.sodiumhydroxidesolution：0.0025m

c.xanthinesolution：10mm

d.oxonicacidpotassiumsaltsolution：1mm

e.enzymediluent：50mmtris-hclbuffer,ph7.5

向紫外石英杯中加入2.24ml溶液a，80μl溶液c，80μl溶液d，輕輕吹勻，于37℃溫浴45min，向混合液中加入粗酶液，于紫外分光光度計中，測其在293nm處吸光度的變化值，每30秒記錄一次od293變化，記錄數(shù)據(jù)。

根據(jù)日本“toyoboenzymes”文獻中提供的酶活性的計算公式：

volumeactivity(u/ml)＝δod/min×2.0×df

weightactivity(u/mg)＝(u/ml)×1/c

其中，各符號或數(shù)字的含義如下：vt為總體積(2.5ml)；vs為樣品體積(0.1ml)；12.5為檢測條件下每毫摩爾尿酸的吸光系數(shù)(cm²/μm；1.0為光路長度(cm)；df為稀釋倍數(shù)；c為溶解酶濃度(mg/ml)。

1)ph對xod酶活力和穩(wěn)定性的影響

用不同ph(ph4.0-10.0)的緩沖液配制酶檢測液，按上述方法測定酶活力，確定xod最適反應ph值。將酶液用不同ph(ph4.0-11.0)的緩沖液稀釋，25℃保溫15h后，測定殘余酶活力。以在最適ph下xod的酶活性，制作ph與酶活力的曲線，考察xod的ph穩(wěn)定性。

37℃下，分別在ph4.0-10.0的緩沖液中測定xod的活力，結果如圖8所示，ph4.0時酶活性為0，隨著ph的增加，黃嘌呤氧化酶活性逐漸增加，在ph8.0時達到最大值。隨后開始降低，ph10.0時活性消失。因此，酶在ph6-9之間具有活力，并且酶的最適反應ph值為8.0。

在不同ph緩沖液中加入酶液，于25℃保溫16h后，測定殘余酶活力，結果如圖9所示，黃嘌呤氧化酶在ph4.0-5.0時沒有活性，隨后隨著ph的上升酶活力增加，ph8.0時酶達到最大值，由此可知道黃嘌呤氧化酶在ph8.0的tris-hcl緩沖液中穩(wěn)定性最好。

2)溫度對xod酶活力和穩(wěn)定性的影響

在ph7.5緩沖液中，按照上述方法測定不同溫度下酶活力，確定xod最適反應溫度。酶液在30℃、40℃、50℃、55℃、60℃和70℃下各保溫30min，迅速冷卻至室溫，測定殘余酶活力，制作溫度-酶活性曲線，結果如圖10所示，30-50℃，60-80℃之間，酶活性變化不明顯，在55℃時活性達到最高。

將酶液在不同溫度下保溫30min后測定酶活性變化情況，研究xod的熱穩(wěn)定性。結果如圖11所示，溫度對黃嘌呤氧化酶穩(wěn)定性有較大影響。在30-50℃下處理30min，酶活性基本沒有喪失，60℃處理30min后酶基本喪失活力。

3)xod的動力學常數(shù)測定

分別以0.08、0.16、0.2、0.32、0.4mm等不同濃度的黃嘌呤底物對xod酶活進行測定，觀察底物對酶促反應速度的影響。根據(jù)lineweaver-burk(雙倒數(shù)作圖法)如圖12，線性方程為(1/v)＝0.5091×(1/s)+7.6272，相關系數(shù)r²為0.9958，求得黃嘌呤氧化酶的米氏常數(shù)km＝0.06675mm，最大反應速度為vmax＝0.1303mm﹒min。

4)金屬離子對xod酶活性的影響

酶液中加入不同的金屬離子(終濃度為2mm/l)，25℃下保溫2h后測定殘余酶活性。以不添加金屬離子的酶液為對照，計算相對酶活。結果如表1所示，金屬離子mg²⁺、ca²⁺對黃嘌呤氧化酶活性有稍微的促進作用，co²⁺、mn²⁺、ba²⁺對酶活性均有一定的抑制作用。而在反應體系中加入ag⁺、hg²⁺、pb²⁺、zn²⁺、cu²⁺、fe²⁺、fe³⁺離子后均未測到酶活性，且看到明顯沉淀。分析原因認為，反應體系中黃嘌呤極難溶于水，用0.025m/l的naoh配制的黃嘌呤溶液，因此ag⁺、hg²⁺、pb²⁺、zn²⁺、cu²⁺、fe²⁺、fe³⁺等金屬離子均與oh^-反應產生沉淀。

表1不同金屬離子對酶活力的影響

序列表

<110>武漢輕工大學

<120>可用于臨床檢測的黃嘌呤氧化酶、其編碼基因及其應用

<130>1

<160>3

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>3596

<212>dna

<213>節(jié)桿菌

<400>1

atgtggcccgcgctgaccgtcaccgacgagggcctcgagatcgccgcgacgtgcaccgtc60

gccgagctgtgggcgttcgaggagagcgcgcaggccgcgcccgtgcgcgaccggtggcgc120

gcgctggacctcgtgcggccgtgctgcgacagcttcgtcgcgtcgttcaagatctggaac180

acgtcgaccgtcgggggcaacgtctgcacgtccctgccggccgggccgatgatctcgctc240

accgcggcgctcgacggggtcgcggaggtctgggggccgggcgggacccggcgggagcag300

cccgtcgtcgacctcgtcacgggcgaggtgcgcaacacgctcgcgcccggggagctcctg360

cgcgcgatccgcctgccggaccacgcgctgcgctcgcgcacggcgttccgccgcctgtcg420

ctgtcgaacctcgggcgctccggcgtgctgctcttggggcgggtcgacccgcccgacgcc480

gggggcgccttcgtcctcacggtcaccgcctcgacgcgccggcccgtgcagctccgtttc540

gcggcggacgcgctgcccaccgccgccgacctcgtcgccacgctcgacgccgcgatcccc600

gccgacctctaccacgacgacatccacgggctgcccgagtggcgccgggacatgacctac660

cgcctcggcgagcagatccgcgcggagctcgtcgacggcacgacctcggacggaggcctc720

cgatgacgacgacgcccgcctcgcacccggtcccgccggtgacgatcgacggtcgcacgg780

cacgcaccgagccccgcgcaggccagtgcctgcgcacctacctgcgcgagcagggcgcgc840

tcggcgtgaagaaggggtgcgacggcggcgactgcggcgcgtgcaccgtgcacgtcgacg900

gcgtcccggtgcactcgtgcgtctaccccgcgcggcgcgcggcgggccacgaggtgacga960

ccatcgaggggctcgcggcgacgtcgtgcccgggcggtgccgccggggacgagccggcgg1020

gcgcgtgcgaccacgacccccacggcccgcaggacgcgctgcacccggtgcagcagcagt1080

tcctcgacgcgcagggcttccagtgcgggttctgcaccgccgggatgatcatgaccgccg1140

cgacgttcgacgacgcgcagcgcgagaacctgccgcgcaacctcaagggcaacctgtgcc1200

gctgcacggggtaccgcgcgatcgaggacgcggtcctcgggcgcggcgacacgaccggga1260

ccgcgccgggcacgggcgagcgtgcgccgtcgggcggcgaccgggcctctacctcgccgg1320

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cgcccgcgacgcggttctcgaccgcgcagcacgagctgttcaccgacgaccccgacgaca1680

cgcggatcctcgacgacgtcgtgcggcacgtcggccagcgggtcgcggccgtcgtcgccg1740

agaccgtcgccgccgccgaggagggggtgcgccgggtccgcgtcgagtacgcgccgctgc1800

ccgccgtcgtcgacccggaggaggccatggccccgggggcgccgctcgtgcaccccgagc1860

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gcgagctcggcgacgtcgagcgcgggctcgcggaggccgacgtcgtgcacgaggccacgt1980

accgcacccaccgcgtgcagcacgccgcgctcgagacgcactgcgccgtcgcgtccctcg2040

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ggctgcggccggacggggtcgtggtggccgaggtcgggaccgccgagttcggcaacggca2940

cgacgaccgtccacgcgcagctcgtcgcgagcgcgctcgggcaggacgccgccgacgtcg3000

tcgtgcgacagtccgacaccgacctcgtcgagcacgacaccggggcgttcggctccaccg3060

gcacggtcgtcgcgggcaaggcgtcgctcgccgccgcgcaggacctggccgaggccgtgc3120

tcaaggtcgcggccggggtcgcgggcgccgcgcccggcgactgccggctcgtgcccggcg3180

gcgtcgactgcgccgggacggtgctgccgctgaccgacgtcgcgcgtgccgccgacgacg3240

ccgggatcgcgctcgtcgccgagggccgctggggcggcaccccgcgctcggtcgcgttca3300

acgtccacggcttccgcgtcgcggtgcaccgcgggacgggggagatccgcatcctccagt3360

ccgtccaggccgccgacgccggggaggtcgtcaacccgcgccagtgccgcggccaggtcg3420

agggcggcatcgcgcaggccctcggcgcggcgctctacgagaacgtggtggtcgacgaga3480

cgggccgcgtgacgaccgacatcttccgccagtaccacctgcccacgttcgcggacaccc3540

cgcgcagcgaggtgtacttcgcgcggacgtcggacaccgtgggcccgatgggctga3596

<210>2

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

gaattccatgtggcccgcgctgaccgtcacc31

<210>3

<211>47

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

aagctttcagtggtggtggtggtggtggcccatcgggcccacggtgt47