本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種剪接輔助因子atu2af65b在植物花期調(diào)控中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

開花是高等植物由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)換的一個(gè)重要生長(zhǎng)發(fā)育過程。影響植物開花的因素有很多，其中光照(光周期途徑)和溫度(春化途徑)是兩個(gè)主要的外部因素，赤霉素(ga途徑)和一些自主性因子(自主途徑)是主要的內(nèi)部因素，這些因素通過調(diào)控開花基因ft(floweringlocust)、fd(floweringlocusd)、soc1(suppressorofoverexpressionofconstans1)和fd(floweringlocusd)等多個(gè)基因的表達(dá)，在莖尖啟動(dòng)花發(fā)育過程，使莖尖分生組織向花(花絮)分生組織轉(zhuǎn)化，實(shí)現(xiàn)對(duì)植物開花時(shí)間的精確調(diào)控(fornaraetal.,2010；ribonietal.,2013；ribonietal.,2016)。

細(xì)胞核中的基因轉(zhuǎn)錄形成的pre-mrna需要將內(nèi)含子剪接后形成成熟的mrna，mrna轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)后翻譯形成蛋白質(zhì)起作用。內(nèi)含子的剪接通過剪接體以及多種剪接因子完成。剪接體由蛋白質(zhì)和rna組成的snrnp復(fù)合體u1、u2、u4、u5和u6等組成。哺乳動(dòng)物中剪接輔助因子u2af由u2af65和u2af35兩個(gè)亞基組成異二聚體，負(fù)責(zé)招募u2snrnp到內(nèi)含子的特定位點(diǎn)參與pre-mrna的剪接(shaoetal.,2014)。u2af65包含2個(gè)功能結(jié)構(gòu)域-rna結(jié)合結(jié)構(gòu)域(rrm)和n-端富含精氨酸/絲氨酸的rs結(jié)構(gòu)域。rs結(jié)構(gòu)域與premrna的分支點(diǎn)(branchpoint，bp)交叉連接參與pre-mrna剪接(valcárceletal.1996)。u2af65含有3個(gè)rrm結(jié)構(gòu)域，前2個(gè)rrm使u2af65與pre-mrna結(jié)合形成復(fù)合物，并協(xié)同作用招募u2復(fù)合體結(jié)合到pre-mrna的多聚嘧啶序列(polypyrimidinetrac，ppt)上游的分支位點(diǎn)；u2af65c-的第3個(gè)rrm具有特殊的結(jié)構(gòu)特征，主要參與蛋白質(zhì)之間的相互作用(kielkopfetal.2004)。u2af65與u2af35以復(fù)合體的形式起作用，但二者的功能并不完全相同，參與剪接的基因也各不相同(shaoetal.,2014)。u2af65和u2af35的突變導(dǎo)致不同的可變剪接事件(hastingsetal.2007)；u2af35突變能夠延遲hela細(xì)胞的生長(zhǎng)，但u2af65的突變不能引起lela細(xì)胞的生長(zhǎng)的遲緩。有實(shí)驗(yàn)表明u2af35是一個(gè)組成型剪接因子，可能參與所有pre-mrna內(nèi)含子的剪接(wuetal.1999)；而u2af65b僅參與某些特定基因的剪接。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，u2af65b并非參與每個(gè)內(nèi)含子ppt的結(jié)合，并且u2af65b的功能可以被其他蛋白代替(shaoetal.,2014)。最近的研究結(jié)果顯示u2af65的敲除并沒有引起大范圍的pre-mrna剪接缺陷，而只是引起部分基因的剪接發(fā)生變化，表明u2af65參與的pre-mrna的剪接具有非常高的特異性(hastingsetal.2007)。

目前，人們對(duì)植物的u2af了解較少?；蛐蛄斜葘?duì)顯示，擬南芥中存在2個(gè)u2af65的同源蛋白(atu2af65a和atu2af65b)和2個(gè)u2af35的同源蛋白(atu2af35a和atu2af35b)。atu2af35a和atu2af35b基因表達(dá)下調(diào)的突變體在長(zhǎng)日照和短日照條件下開花時(shí)間延遲，突變體的株型葉片形態(tài)、花型以及角果的形態(tài)都發(fā)生了變化(wangandbrendel,2006)。擬南芥剪接因子sf1與atu2af65a和atu2af65b都存在互作關(guān)系，該基因的突變體sf1在長(zhǎng)日照下花期提前，但突變體的植株長(zhǎng)的非常矮小(jiangetal.2014)，難以應(yīng)用。因此，有必要尋找僅影響植物開花時(shí)間而對(duì)其他生長(zhǎng)發(fā)育過程無影響的基因。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的發(fā)明人針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的情況，提供了一種剪接輔助因子atu2af65b在植物花期調(diào)控中的應(yīng)用，所述的剪接輔助因子atu2af65b來源于擬南芥，通過提高該基因表達(dá)水平可用于延遲植物開花，而降低該基因表達(dá)水平使一年生植物提早開花或多年生植物縮短童期，可應(yīng)用于基因工程改良植物的生長(zhǎng)進(jìn)程中。

本發(fā)明所述剪接輔助因子atu2af65b，其核苷酸序列如seqidno.1所示，所編碼的氨基酸序列如seqidno.2所示。

具體應(yīng)用是可以通過提高該基因表達(dá)水平用于延遲植物開花；也可以通過降低該基因表達(dá)水平使一年生植物提早開花或多年生植物縮短童期；但兩者均不影響植株其他方面的生長(zhǎng)發(fā)育。

可見本發(fā)明所提供的atu2af65b基因在植物花期控制中具有非常大的應(yīng)用價(jià)值，可用于解決育種工作中某些植物父、母本不同期開花而造成的雜交授粉的難題；用于多年生植物縮短童期，提早結(jié)果；也可用于花卉的花期調(diào)控，使花卉四季均衡生產(chǎn)和反季節(jié)供花，以解決花卉市場(chǎng)淡旺季矛盾。本發(fā)明為改良植物的生長(zhǎng)進(jìn)程、調(diào)控植物的花期提供了一種有效的技術(shù)手段，具有廣泛的應(yīng)用前景和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

附圖說明

圖1為擬南芥atu2af65b的2個(gè)突變體atu2af65b-1和atu2af65b-2中t-dna的插入位點(diǎn)、鑒定基因型的引物位置及突變體純合體鑒定結(jié)果；

圖2為突變體atu2af65b-1和atu2af65b-2中atu2af65b基因的表達(dá)結(jié)果；

圖3為野生型擬南芥中擴(kuò)增atu2af65b基因編碼區(qū)的結(jié)果；

圖4為atu2af65b同源重組到表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌后的pcr鑒定；

圖5為含有atu2af65b基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌gv3101后的pcr鑒定；

圖6為超表達(dá)atu2af65b轉(zhuǎn)基因擬南芥的pcr鑒定結(jié)果；

圖7為atu2af65b基因在野生型擬南芥莖尖的表達(dá)量遠(yuǎn)高于幼苗、花和種子；

圖8在ms培養(yǎng)基上生長(zhǎng)7天的野生型、atu2af65b-1和atu2af65b-2擬南芥幼苗；

圖9為移苗后在溫室(長(zhǎng)日照條件下)生長(zhǎng)3周的野生型、atu2af65b-1和atu2af65b-2擬南芥；

圖10為移苗后在溫室長(zhǎng)日照條件下生長(zhǎng)4周的野生型、atu2af65b-1和atu2af65b-2擬南芥植株；

圖11為移苗后在溫室長(zhǎng)日照條件下開始抽薹時(shí)野生型、atu2af65b-1和atu2af65b-2突變體的一個(gè)完整植株的葉片；

圖12為在長(zhǎng)日照條件下的野生型、atu2af65b-1和atu2af65b-2突變體的花和花序；

圖13為移苗后在溫室長(zhǎng)日照條件下生長(zhǎng)6周的野生型、atu2af65b-1和atu2af65b-2突變體植株；

圖14為在長(zhǎng)日照條件下的野生型、atu2af65b-1和atu2af65b-2突變體的角果；

圖15為移苗后在溫室短日照條件下生長(zhǎng)8周的野生型、atu2af65b-1和atu2af65b-2擬南芥；

圖16為移苗后在溫室短日照條件下生長(zhǎng)15周的野生型、atu2af65b-1和atu2af65b-2擬南芥；

圖17為長(zhǎng)日照下生長(zhǎng)2周的野生型、突變體atu2af65b-1與atu2af65b-2和超表達(dá)atu2af65b擬南芥的生長(zhǎng)情況；

圖18為長(zhǎng)日照下生長(zhǎng)4周的野生型、突變體atu2af65b-1與atu2af65b-2和超表達(dá)atu2af65b擬南芥抽薹情況；

圖19為長(zhǎng)日照下生長(zhǎng)5周的野生型、突變體atu2af65b-1與atu2af65b-2和超表達(dá)atu2af65b擬南芥抽薹、開花情況；

圖20為長(zhǎng)日照下野生型、突變體atu2af65b-1與atu2af65b-2和超表達(dá)atu2af65b植株開花時(shí)間和抽薹時(shí)葉片數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例中進(jìn)一步定義本發(fā)明，根據(jù)以上的描述和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對(duì)本發(fā)明作出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。除特殊注明外，本發(fā)明所采用的均為本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)；

下述實(shí)施例中所用的材料如下：

atu2af65b基因的t-dna插入突變體atu2af65b-1(wiscdslox321f12)和atu2af65b-2(salk_055049)是將野生型擬南芥中的atu2af65b基因通過t-dna插入進(jìn)行敲除突變得到的，其余基因沒有變化。這兩個(gè)突變體種子均購自abrc。擬南芥材料均為哥倫比亞生態(tài)型(col)。植物生長(zhǎng)條件：溫度20-22℃，光強(qiáng)為120μmolm-2s-1。長(zhǎng)日照為16h光照、8h暗期；短日照為8h光照、16h暗期。

實(shí)施例1atu2af65b基因的突變體atu2af65b-1和atu2af65b-2中純合體的鑒定

(1)取溫室生長(zhǎng)2周左右的擬南芥，從植株上剪取一至兩個(gè)葉片5-10mg放入離心管中，研磨后加400μl提取緩沖液(200mmtris-hclph7.5,250mmnacl,25mmedta,0.5％sds)，常規(guī)方法提取基因組dna。

(2)以基因組dna為模板，分別用引物lp和rp、lb和rp進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)擴(kuò)增。

pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：2×estaqmastermix10μl，上游引物lp1/lb1(20μmol/l)0.5μl，下游引物rp1(20μmol/l)0.5μl，模板1.0μl，加ddh2o至總體積為20μl。

pcr擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：首先95℃預(yù)變性5min；94℃變性30s、56℃退火30s、72℃延伸1min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min；

電泳檢測(cè)pcr結(jié)果，lp和rp引物擴(kuò)增不出來而lb和rp引物能擴(kuò)增出特異性條帶的植株為純合體；lp和rp引物以及l(fā)b和rp引物都能擴(kuò)增出特異性條帶的植株為雜合體。lb和rp引物擴(kuò)增不出來而lp和rp引物能擴(kuò)增出特異性條帶的植株為野生型。同時(shí)設(shè)置野生型擬南芥(wt)基因組dna為對(duì)照。

鑒定atu2af65b-1基因型的引物位置見圖1a，引物序列分別為：

上游引物lp1：5′-cgttcaacccagtagaagacc-3′；其核苷酸序列如seqidno.3所示，

下游引物rp1：5′-tggatgatgagttacgaaggc-3′；其核苷酸序列如seqidno.4所示，

上游引物lb1(p745)：5′-aacgtccgcaatgtgttattaagttgtc-3′，其核苷酸序列如seqidno.5所示，引物由上海生物工程有限公司合成。

結(jié)果如圖1b所示，m為dna分子量標(biāo)準(zhǔn)dl2000；野生型擬南芥基因組dna(樣品1，wt)為模板、lp1和rp1引物擴(kuò)增得到的產(chǎn)物長(zhǎng)度為1.1kb，lb1與rp1擴(kuò)增不出片段，說明所用引物以及pcr程序合適。用這兩對(duì)引物分別鑒定atu2af65b-16株(樣本2-7)突變體材料，如圖1b所示，2、3、7為雜合體，4為純合體；5、6為野生型。

鑒定atu2af65b-2基因型的引物位置見圖1a，引物序列分別是：

上游引物lp2：5′-tgggtcatgatctggattagg-3′；其核苷酸序列如seqidno.6所示，

下游引物rp2：5′-tattggccgcaagtctatacg-3′；其核苷酸序列如seqidno.7所示，

上游引物lb2(lbb1.3)：5′-attttgccgatttcggaac-3′，其核苷酸序列如seqidno.8所示；

如圖1c所示，m為dna分子量標(biāo)準(zhǔn)dl2000；以野生型擬南芥基因組dna(樣品8)為對(duì)照，用lp2和rp2引物擴(kuò)增得到1.2kb的片段，lb2與rp2擴(kuò)增不出片段，說明所用引物以及pcr程序合適。用這兩對(duì)引物分別鑒定atu2af65b-26株(樣本9-14)突變體，10為雜合體，其余均為純合體。

實(shí)施例2

在實(shí)施例1的基礎(chǔ)上對(duì)突變體atu2af65b-1和atu2af65b-2純合體中atu2af65b基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)

(1)取在ms培養(yǎng)基上生長(zhǎng)兩周的突變體純合體和野生型擬南芥植物各10mg，用總rna提取試劑盒(購自天根生化科技(北京)有限公司)分別提取野生型和突變體的總rna，方法參照說明書進(jìn)行。用反轉(zhuǎn)錄酶(北京全式金生物技術(shù)有限公司)將1ugrna反轉(zhuǎn)錄成cdna。

(2)以cdna為模板，用atu2af65b基因特異性引物，通過反轉(zhuǎn)錄pcr檢測(cè)野生型和突變體中atu2af65b轉(zhuǎn)錄本的量(按照天根生化科技(北京)有限公司的通用型一步法rt-pcr試劑盒說明書進(jìn)行)。引物序列為：

上游引物(atu2af65bf)：5′-atgatgagttacgaaggcaacggag-3′，其核苷酸序列如seqidno.9所示；

下游引物(atu2af65br)：5′-tcagtcttcgtagtcgccttgg-3′，其核苷酸序列如seqidno.10所示。

tubulin2基因?yàn)閮?nèi)參，引物序列為：

上游引物(tubulin2f)：5′-ggtatccaggtcggaaatgc-3′，其核苷酸序列如seqidno.11所示；

下游引物(tubulin2r)：5′-tcccgtagtcaacagaaagt-3′，其核苷酸序列如seqidno.12所示。(上海生物工程有限公司合成)

pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：2×estaqmastermix25μl，上游引物(20μmol/l)1μl，下游引物(20μmol/l)1μl，模板2.0μl，加ddh2o至總體積為50μl。

pcr擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：首先95℃預(yù)變性5min；94℃變性40s、58℃退火30s、72℃延伸1min，進(jìn)行28個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min；

電泳檢測(cè)rt-pcr結(jié)果。圖2結(jié)果顯示野生型擬南芥中有atu2af65b基因的轉(zhuǎn)錄本，但atu2af65b-1和atu2af65b-2中幾乎沒有atu2af65b轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。

實(shí)施例3

超表達(dá)atu2af65b載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

(1)以實(shí)施例2中野生型擬南芥的cdna為模板，用實(shí)施例2中相同atu2af65b基因特異性引物(atu2af65bf和atu2af65br)擴(kuò)增atu2af65b編碼區(qū)全長(zhǎng)。引物序列為：

上游引物(atu2af65bf)：5′-atgatgagttacgaaggcaacggag-3′，其核苷酸序列如seqidno.9所示；

下游引物(atu2af65br)：5′-tcagtcttcgtagtcgccttgg-3′，其核苷酸序列如seqidno.10所示；

pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：高保真dna聚合酶0.5μl，5×dna聚合酶緩沖液10μl，dntp1μl，上游引物(20μmol/l)1.5μl，下游引物(20μmol/l)μl，加ddh2o至總體積為50μl。pcr擴(kuò)增條件同實(shí)施例2。

電泳檢測(cè)pcr產(chǎn)物長(zhǎng)度，marker為dna分子量標(biāo)準(zhǔn)dl2000。圖3顯示pcr擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度為1.8kb左右，與atu2af65b編碼區(qū)實(shí)際長(zhǎng)度1770bp相近。

(2)將pcr產(chǎn)物用膠回收試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)進(jìn)行回收，方法參照說明書進(jìn)行。將回收的產(chǎn)物連接到gateway入門載體(pcr8/gw/topotacloningkit,invitrogen，方法參照說明書進(jìn)行)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(dh5α)后，經(jīng)50μg/ml壯觀霉素抗生素篩選，對(duì)陽性菌落測(cè)序(生工生物工程(上海)股份有限公司)。

用質(zhì)粒提取試劑盒(購自天根生化科技(北京)有限公司)提取測(cè)序正確的質(zhì)粒，通過lrclonase(購自invitrogen)將質(zhì)粒同源重組到pmdc43雙元表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞dh5α(天根生化科技(北京)有限公司)，方法參照說明書進(jìn)行。用50μg/ml卡那霉素抗生素篩選，提取陽性菌落質(zhì)粒(購自天根生化科技(北京)有限公司的質(zhì)粒提取試劑盒)，方法參照說明書進(jìn)行。利用載體上35s啟動(dòng)子序列的特異性上游引物(35sf)和atu2af65b特異性的下游引物(atu2af65br)進(jìn)行pcr鑒定，電泳檢測(cè)pcr產(chǎn)物長(zhǎng)度。所用引物序列分別為：

上游引物(35sf)：5′-gaaggtggctcctacaaatgcca-3′，其核苷酸序列如seqidno.13所示；

下游引物(atu2af65br)：5′-tcagtcttcgtagtcgccttgg-3′，其核苷酸序列如seqidno.10所示；

pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：2×estaqmastermix10μl，上游引物(20μmol/l)0.5μl，下游引物(20μmol/l)0.5μl，模板1.0μl，加ddh2o至總體積為20μl。pcr擴(kuò)增條件同實(shí)施例2。

圖4為電泳檢測(cè)結(jié)果，marker為dna分子量標(biāo)準(zhǔn)dl2000，1為空載體質(zhì)粒的陰性對(duì)照，2和3為轉(zhuǎn)化成功的陽性菌落的質(zhì)粒pcr結(jié)果，pcr產(chǎn)物長(zhǎng)度約為2.2kb，說明該基因被同源重組到表達(dá)載體并成功轉(zhuǎn)換入大腸桿菌。

(3)常規(guī)方法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株gv3101的感受態(tài)細(xì)胞。50μg/ml的卡那霉素和50μg/ml利福平篩選，提取菌落的質(zhì)粒(天根生化科技(北京)有限公司的質(zhì)粒提取試劑盒)，利用該實(shí)施例(2)相同的引物和pcr條件進(jìn)行pcr鑒定。圖5顯示電泳結(jié)果，marker為dna分子量標(biāo)準(zhǔn)dl2000，1-3為陽性菌落的質(zhì)粒pcr結(jié)果，4為大腸桿菌陽性菌落質(zhì)粒的pcr對(duì)照(陽性對(duì)照)，5為空載體質(zhì)粒的陰性對(duì)照，說明成功將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌。

(4)通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)擬南芥的常規(guī)方法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，每隔一周轉(zhuǎn)化一次，共轉(zhuǎn)化三次。收獲的種子在ms培養(yǎng)基上進(jìn)行抗生素篩選(50μg/ml卡那霉素)，將有抗性的植株移栽到營(yíng)養(yǎng)土中雜溫室培養(yǎng)。常規(guī)方法提取生長(zhǎng)3周左右擬南芥葉片的基因組dna為模板，用該實(shí)施例2相同的引物和pcr條件進(jìn)行pcr鑒定，電泳檢測(cè)pcr產(chǎn)物長(zhǎng)度。圖6中，marker為dna分子量標(biāo)準(zhǔn)dl2000，1為野生型擬南芥基因組的pcr結(jié)果(陰性對(duì)照)，2為表達(dá)載體質(zhì)粒的pcr結(jié)果(陽性對(duì)照)，3-8為6個(gè)具有抗生素抗性株系的pcr鑒定結(jié)果，說明這6個(gè)株系均為超表達(dá)atu2af65b的擬南芥。

實(shí)施例4

atu2af65b基因的表達(dá)模式檢測(cè)

(1)分別提取生長(zhǎng)2周的野生型擬南芥植株和莖尖、生長(zhǎng)6-8周的花和角果的總rna，分別取2ug的rna用反轉(zhuǎn)錄酶(北京全式金生物技術(shù)有限公司)將rna反轉(zhuǎn)錄成cdna。

(2)用同實(shí)施例2相同的引物(atu2af65b基因特異性引物：atu2af65bf和atu2af65br；內(nèi)參基因tubulin2特異性引物：tubulin2f和tubulin2r)和相同的pcr反應(yīng)體系以及反應(yīng)條件，通過反轉(zhuǎn)錄pcr檢測(cè)這幾種組織器官中atu2af65b的轉(zhuǎn)錄水平。引物序列為：

上游引物(atu2af65bf)：5′-atgatgagttacgaaggcaacggag-3′，其核苷酸序列如seqidno.9所示；

下游引物(atu2af65br)：5′-tcagtcttcgtagtcgccttgg-3′，其核苷酸序列如seqidno.10所示。

tubulin2基因?yàn)閮?nèi)參，引物序列為實(shí)施例2的tubulin2f和tubulin2f

上游引物(tubulin2f)：5′-ggtatccaggtcggaaatgc-3′，其核苷酸序列如seqidno.11所示；

下游引物(tubulin2r)：5′-tcccgtagtcaacagaaagt-3′，其核苷酸序列如seqidno.12所示；(上海生物工程有限公司合成)。

電泳檢測(cè)rt-pcr結(jié)果。結(jié)果如圖7所示，該基因在生長(zhǎng)2周的擬南芥的莖尖表達(dá)量遠(yuǎn)高于幼苗、花和角果，說明該基因的主要功能是參與花期調(diào)控。

實(shí)施例5

野生型擬南芥和突變體植株在長(zhǎng)日照下的生長(zhǎng)發(fā)育表型進(jìn)行觀察和統(tǒng)計(jì)(根據(jù)參考文獻(xiàn)，抽薹時(shí)花的發(fā)育已經(jīng)完成。本實(shí)施例中以抽薹時(shí)間為開花統(tǒng)計(jì)的參數(shù))

(1)首先，將野生型擬南芥(wt)和突變體純合體(atu2af65b-1，atu2af65b-2)種子播種于0.5ms固體培養(yǎng)基上，22℃、長(zhǎng)日照(16h光照/8h暗期)垂直培養(yǎng)1周左右。觀察植株生長(zhǎng)狀況。結(jié)果如圖8所示，突變體與野生型的植株的根長(zhǎng)無明顯差別。

(2)同時(shí)將野生型擬南芥和突變體atu2af65b的幼苗移栽到植物營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)中，每個(gè)營(yíng)養(yǎng)杯中移栽一株野生型擬南芥和一株突變體，設(shè)置100個(gè)重復(fù)。觀察在長(zhǎng)日照條件下(22℃)生長(zhǎng)的野生型擬南芥和突變體植株的葉片、葉片形態(tài)和葉色等的差異。圖9顯示溫室生長(zhǎng)3周左右的野生型擬南芥和突變體植株間葉片、葉片形態(tài)和葉色無明顯差異。

(3)觀察同一個(gè)營(yíng)養(yǎng)杯中生長(zhǎng)的野生型擬南芥和突變體atu2af65b植株抽薹時(shí)間的差異。溫室長(zhǎng)日照條件下生長(zhǎng)4周的突變體植株atu2af65b-1和atu2af65b-2都已經(jīng)抽薹，但同一個(gè)營(yíng)養(yǎng)杯中生長(zhǎng)的野生型擬南芥(箭頭)還沒有或剛開始抽薹(圖10a和b)。

對(duì)100個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示野生型擬南芥在22℃長(zhǎng)日照條件下葉片數(shù)量達(dá)13片時(shí)開始抽薹，突變體葉片數(shù)約為11片開始抽薹(圖10c)。野生型擬南芥需要生長(zhǎng)28天開始抽薹，突變體atu2af65b-1和atu2af65b-2各需要22天和21天開始抽薹(圖10d)。突變體抽薹時(shí)間比野生型提早6-7天，二者間差異顯著。

(4)將開始抽薹時(shí)的葉片從植株上剝離，觀察葉片形態(tài)和葉色，圖11顯示野生型擬南芥和突變體atu2af65b-1和atu2af65b-2除葉片數(shù)量有差異外，葉片形態(tài)等均無明顯差異。

(5)觀察同一個(gè)營(yíng)養(yǎng)杯中溫室生長(zhǎng)的盛花期的野生型擬南芥和突變體atu2af65b的花絮和花，均沒有明顯差異(圖12)。

(6)觀察溫室長(zhǎng)日照條件下生長(zhǎng)6周的野生型擬南芥和atu2af65b突變體。突變體atu2af65b-1和atu2af65b-2比野生型擬南芥提早進(jìn)入結(jié)果期(圖13)，角果形態(tài)無明顯差異(圖14)

實(shí)施例6

野生型擬南芥和突變體植株在短日照下生長(zhǎng)發(fā)育表型進(jìn)行觀察和統(tǒng)計(jì)，開花時(shí)間的統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)參照實(shí)施例5進(jìn)行。

(1)將移栽到植物培養(yǎng)基質(zhì)的野生型擬南芥和突變體atu2af65b的幼苗在短日照條件下(8h光照/16h暗期，22℃)培養(yǎng)。每個(gè)營(yíng)養(yǎng)杯中同樣種植一株野生型擬南芥和一株突變體，設(shè)置100個(gè)重復(fù)。觀察野生型擬南芥和突變體植株的葉片、葉片形態(tài)和葉色等的差異。圖15顯示生長(zhǎng)8周左右的野生型擬南芥和突變體植株間葉片、葉片形態(tài)和葉色沒有明顯差異。

(2)進(jìn)一步觀察短日照條件下野生型擬南芥和突變體atu2af65b植株抽薹時(shí)間的差異。生長(zhǎng)15周的突變體植株atu2af65b-1和atu2af65b-2都已經(jīng)抽薹，但同一個(gè)營(yíng)養(yǎng)杯中生長(zhǎng)的野生型擬南芥還都沒有抽薹(箭頭)(圖16a和b)。對(duì)100個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示野生型擬南芥在短日條件下抽薹時(shí)葉片數(shù)量約56片，突變體葉片數(shù)約為40片(圖16c)，突變體比野生型擬南芥少16個(gè)葉片，差異顯著。野生型擬南芥需要生長(zhǎng)115天開始抽薹，突變體atu2af65b-1和atu2af65b-2需要95天開始抽薹(圖16d)。突變體抽薹時(shí)間提早20天，與野生型擬南芥差異顯著。

實(shí)施例7

野生型擬南芥、突變體和超表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥植株在長(zhǎng)日照下生長(zhǎng)發(fā)育表型進(jìn)行觀察和統(tǒng)計(jì)，開花時(shí)間的統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)參照實(shí)施例5進(jìn)行。

(1)將野生型(wt)、突變體(atu2af65b-1和atu2af65b-2)和三個(gè)超表達(dá)株系(oe1、oe2和oe3)的幼苗種于同一容器中，在完全相同的條件下下生長(zhǎng)，并設(shè)計(jì)100個(gè)重復(fù)。觀察在長(zhǎng)日照條件下(22℃)植株生長(zhǎng)發(fā)育情況。圖17a和b顯示溫室生長(zhǎng)2周左右的野生型擬南芥、突變體植株和超表達(dá)植株間葉片大小、形態(tài)和葉色無明顯差異。但超表達(dá)株系oe1和oe2中atu2af65b基因的表達(dá)量明顯升高，oe3中atu2af65b基因的表達(dá)量與野生型相近(圖17c)。

(2)進(jìn)一步觀察這些植株抽薹時(shí)間的差異。溫室長(zhǎng)日照條件下生長(zhǎng)4周的突變體植株atu2af65b-1和atu2af65b-2都已經(jīng)開花并且結(jié)果，同一個(gè)營(yíng)養(yǎng)杯中生長(zhǎng)的野生型擬南芥抽薹并開始開花，但超表達(dá)株系僅oe3(其atu2af65b基因的表達(dá)量與野生型相近)抽薹開花(圖18，大箭頭)，oe1和oe2即將抽薹或剛抽薹(atu2af65b基因的表達(dá)量明顯比野生型高)(圖18，小箭頭)，結(jié)果說明atu2af65b基因的表達(dá)量與開花時(shí)間成負(fù)相關(guān)。

(3)溫室長(zhǎng)日照條件下生長(zhǎng)5周的超表達(dá)植株開始抽薹(圖19)。

(4)對(duì)100個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示野生型擬南芥在抽薹時(shí)葉片數(shù)量約14片，atu2af65b表達(dá)量明顯升高的oe1和oe2植株抽薹時(shí)葉片約17片(圖20a)。野生型擬南芥需要生長(zhǎng)28天左右開始抽薹，oe1和oe2植株植株生長(zhǎng)38天左右開始抽薹(圖20b)，超表達(dá)植株抽薹時(shí)間比野生型植株晚10天左右，差異顯著。

由上述結(jié)果分析表明，本發(fā)明所涉及的atu2af65b基因主要在莖尖表達(dá)，是一個(gè)新的植物特異性花期調(diào)控基因。提高atu2af65b基因的表達(dá)水平能延遲植物抽薹和開花；降低該基因的表達(dá)水平能使植物抽薹和開花時(shí)間提前，尤為重要的是上調(diào)和下調(diào)該基因的表達(dá)水平都不改變植物的生長(zhǎng)勢(shì)、株型、葉型和花型等性狀，為改良植物的生長(zhǎng)進(jìn)程、調(diào)控植物的花期提供了一種有效的技術(shù)手段，具有廣泛的應(yīng)用前景和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

<110>山東農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>一種剪接輔助因子atu2af65b在植物花期調(diào)控中的應(yīng)用

<160>13

<210>1

<211>1770

<212>dna

<213>擬南芥（arabidopsisthaliana(l.)）

<400>1

atgatgagttacgaaggcaacggagatggtgtcgctatctccaccgaaaaccacaacgag60

aactacatatctctagagagctcgccttttcatgaagactccaagtctcgagaatctcat120

gatcttaaaaaggattcttcgaaaatcagtgagaaagacaatgaaaatggacgtgataaa180

gacggaaacaaagatcgtgatcgtgagaaggatcgtgatagggagaagagcagagacaga240

gatagggagaaaagcagagatagagatagggatagggagagaagtaaggataggcaacga300

gaccgtcatcatagagatcgtcatagggaccgtagcagagaacgtagtgagaaaagagat360

gatttggatgatgatcatcatcgcagaagtcgagaccgtgataggaggaggtctcgcgat420

cgagacagagaggtgagacacaggcgacggtcacgctctcggtcaaggagccgctctgaa480

cgtaggtcaaggtcagaacatagacataagtctgaacatagatcacgctcacggtcgcga540

tcaaggtcaaagagcaagaggagaagtggatttgatatggcgcctcctgatatgttagct600

gctactgctgttgctgcagcaggccaggttcctagtgtgccaactactgctactattcca660

gggatgttctcaaacatgtttccaatggtccctggtcagcaactaggtgcgcttcctgta720

ctgccagttcaggcaatgactcaacaggcaactaggcatgctcggcgagtctatgttggt780

ggccttccaccaactgctaatgaacagtcggtgtcaacgttctttagccaagtgatgtcg840

gccattgggggaaacactgctgggccaggtgatgcggtggtcaatgtttatataaaccac900

gaaaagaagtttgcttttgtagagatgagatctgttgaggaggctagtaacgcaatggca960

ttagacggcattatattagagggagttcctgtaaaggtgaggaggccaactgactataac1020

ccgtctcttgctgcaactcttggtccgagccagcctaatcccaacctcaacttaggggct1080

gttggattgtcttcagggtctactggtgggcttgagggtcccgaccgcatttttgtgggc1140

ggacttccctattacttcacagaggtacagatcagggagctcttggagtcttttgggccc1200

ctaagaggtttcaacttggtcaaagacagggagactggaaattcgaagggatatgcattc1260

tgtgtttaccaagatccgtcagtaacagatattgcatgtgccgctctaaacgggattaag1320

atgggtgataagacacttacagttaggcgtgcaatccagggtgcaattcaacctaaaccc1380

gagcaagaagaagtcttactttatgcccaacaacagattgctttgcagaggcttatgttc1440

caaccaggaggtactcccaccaagattgtctgtttgactcaagtggttacagctgatgat1500

cttagagacgatgaagaatatgcagagataatggaggacatgcgacaagaaggtggaaaa1560

ttcggtaacttagtgaatgttgtgattccgaggcctaatccagatcatgacccaacacca1620

ggagttgggaaggttttcttagagtatgcggatgtggatggctcatcaaaggccagatcg1680

gggatgaatggaagaaaatttggaggaaaccaagtagtggctgtgtattaccccgaagac1740

aagtatgcccaaggcgactacgaagactga1770

<210>2

<211>589

<212>prt

<213>擬南芥（arabidopsisthaliana(l.)）

<400>2

metmetsertyrgluglyasnglyaspglyvalalaileserthr

151015

gluasnhisasngluasntyrileserleugluserserprophe

202530

hisgluaspserlysserarggluserhisaspleulyslysasp

354045

serserlysileserglulysaspasngluasnglyargasplys

505560

aspglyasnlysaspargaspargglulysaspargaspargglu

657075

lysserargaspargaspargglulysserargaspargasparg

808590

asparggluargserlysaspargglnargasparghishisarg

95100105

asparghisargaspargserarggluargserglulysargasp

110115120

aspleuaspaspasphishisargargserargaspargasparg

125130135

argargserargaspargasparggluvalarghisargargarg

140145150

serargserargserargserargsergluargargserargser

155160165

gluhisarghislyssergluhisargserargserargserarg

170175180

serargserlysserlysargargserglypheaspmetalapro

185190195

proaspmetleualaalathralavalalaalaalaglyglnval

200205210

proservalprothrthralathrileproglymetpheserasn

215220225

metpheprometvalproglyglnglnleuglyalaleuproval

230235240

leuprovalglnalametthrglnglnalathrarghisalaarg

245250255

argvaltyrvalglyglyleuproprothralaasngluglnser

260265270

valserthrphepheserglnvalmetseralaileglyglyasn

275280285

thralaglyproglyaspalavalvalasnvaltyrileasnhis

290295300

glulyslysphealaphevalglumetargservalglugluala

305310315

serasnalametalaleuaspglyileileleugluglyvalpro

320325330

vallysvalargargprothrasptyrasnproserleualaala

335340345

thrleuglyproserglnproasnproasnleuasnleuglyala

350355360

valglyleuserserglyserthrglyglyleugluglyproasp

365370375

argilephevalglyglyleuprotyrtyrphethrgluvalgln

380385390

ilearggluleuleugluserpheglyproleuargglypheasn

395400405

leuvallysasparggluthrglyasnserlysglytyralaphe

410415420

cysvaltyrglnaspproservalthraspilealacysalaala

425430435

leuasnglyilelysmetglyasplysthrleuthrvalargarg

440445450

alaileglnglyalaileglnprolysprogluglnglugluval

455460465

leuleutyralaglnglnglnilealaleuglnargleumetphe

470475480

glnproglyglythrprothrlysilevalcysleuthrglnval

485490495

valthralaaspaspleuargaspaspgluglutyralagluile

500505510

metgluaspmetargglngluglyglylyspheglyasnleuval

515520525

asnvalvalileproargproasnproasphisaspprothrpro

530535540

glyvalglylysvalpheleuglutyralaaspvalaspglyser

545550555

serlysalaargserglymetasnglyarglyspheglyglyasn

560565570

glnvalvalalavaltyrtyrprogluasplystyralaglngly

575580585

asptyrgluasp

589

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

cgttcaacccagtagaagacc21

<210>4

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

tggatgatgagttacgaaggc21

<210>5

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

aacgtccgcaatgtgttattaagttgtc28

<210>6

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

tgggtcatgatctggattagg21

<210>7

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

tattggccgcaagtctatacg21

<210>8

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

attttgccgatttcggaac19

<210>9

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

atgatgagttacgaaggcaacggag25

<210>10

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>10

tcagtcttcgtagtcgccttgg22

<210>11

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>11

ggtatccaggtcggaaatgc20

<210>12

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>12

tcccgtagtcaacagaaagt20

<210>13

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>13

gaaggtggctcctacaaatgcca23