本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，是一種能過(guò)表達(dá)c5orf39基因的真核重組質(zhì)粒，以及利用該重組過(guò)表達(dá)質(zhì)粒為研究c5orf39功能提供了良好工具，也為研究人視網(wǎng)膜新生血管及其他病理性新生血管中c5orf39基因的功能提供有效實(shí)驗(yàn)方法。

背景技術(shù)：

視網(wǎng)膜新生血管(retinal neovascularization,RNV)病變是眼部多種疾病的病理改變，包括早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、糖尿病視網(wǎng)膜病變、年齡相關(guān)性的黃斑變性和視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞等。RNV為病理性的異常血管，因其喪失正常的血管結(jié)構(gòu)和功能，一經(jīng)形成，即會(huì)產(chǎn)生出血、滲出、增生等嚴(yán)重并發(fā)癥，已成為世界范圍內(nèi)的致盲性疾病。目前臨床對(duì)于RNV的治療方法主要包括激光光凝、光動(dòng)力療法、經(jīng)瞳孔的溫?zé)岑煼ê屯饪剖中g(shù)干預(yù)等。這些方法可以挽救部分患者的視力，但由于它們只是去除了新生血管組織而沒(méi)有解決病理性新生血管發(fā)生的原因，因而大部分患者視力不能恢復(fù)到較好。探索新生血管的形成過(guò)程以尋求對(duì)其進(jìn)行靶向治療的方法，是眼底病患者及廣大學(xué)者共同的愿望。

基因工程，又稱基因重組技術(shù)，是二十世紀(jì)七十年代發(fā)展起來(lái)的在體外對(duì)DNA進(jìn)行操作的一門(mén)技術(shù)，廣泛用于疾病基礎(chǔ)研究、基因治療、基因免疫、基因疫苗等。其三要素分別為：酶、目的基因、載體。而真核表達(dá)載體是基因工程中用于構(gòu)建真核基因表達(dá)系統(tǒng)的一種載體，近幾十年來(lái)，各國(guó)學(xué)者圍繞真核表達(dá)載體進(jìn)行了各種疾病、基因等相關(guān)研究，在基因工程方面做了大量研究工作，為醫(yī)學(xué)科學(xué)研究開(kāi)辟了嶄新途徑。C5orf39基因編碼的蛋白C5ORF39，是一個(gè)193個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，被認(rèn)為是膜聯(lián)蛋白A2的受體，通過(guò)與膜聯(lián)蛋白A2結(jié)合來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移、增殖、粘附等，后來(lái)又發(fā)現(xiàn)C5ORF39可以獨(dú)立于膜聯(lián)蛋白A2參與多種人源細(xì)胞的凋亡與自噬，因此，我們猜測(cè)C5ORF39可能以一種更廣泛的方式參與細(xì)胞的活動(dòng)。

本發(fā)明應(yīng)用基因重組技術(shù)，針對(duì)c5orf39基因，構(gòu)建重組真核表達(dá)載體(Lenti-c5orf39)，并將其包裝慢病毒感染HREC、HUVEC等血管內(nèi)皮細(xì)胞，構(gòu)建穩(wěn)定感染c5orf39基因的細(xì)胞株，為研究c5orf39功能提供了良好工具，亦為進(jìn)一步研究c5orf39基因在視網(wǎng)膜新生血管中的生物學(xué)功能打下基礎(chǔ)，同時(shí)也為研究人其他部位病理性新生血管中c5orf39基因的功能提供有效實(shí)驗(yàn)方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種新型的真核重組質(zhì)粒及其制備方法，并證明所述重組質(zhì)粒為c5orf39功能研究提供了良好的實(shí)驗(yàn)工具，也為研究人眼底視網(wǎng)膜新生血管及其他部位異常新生血管中c5orf39基因的功能提供有效實(shí)驗(yàn)方法。

人c5orf39基因已在GenBank注冊(cè)，注冊(cè)號(hào)為NM-001014279.2，定位于5p12，全長(zhǎng)1280bp，編碼193個(gè)氨基酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本發(fā)明的第一方面，提供人c5orf39基因在制備抑制新生血管形成藥物中的應(yīng)用。

優(yōu)選的，所述的抑制新生血管形成藥物為抑制人眼底視網(wǎng)膜新生血管形成的藥物。

優(yōu)選的，所述的抑制新生血管形成藥物為抑制腫瘤新生血管形成的藥物。

本發(fā)明的第二方面，提供一種真核重組質(zhì)粒，所述的真核重組質(zhì)粒包含核苷酸序列SEQ ID NO.1所述的人c5orf39基因，所述的質(zhì)粒為lenti載體質(zhì)粒。

所述的真核重組質(zhì)粒的制備方法包括以下步驟：

a、通過(guò)PCR合成人的c5orf39基因片段；

b、將步驟a擴(kuò)增的核苷酸序列片段與真核質(zhì)粒連接，該插入片段的酶切位點(diǎn)分別為Xbar I和Sal I，再將所述的真核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)菌細(xì)胞中、涂板子、挑克隆、搖菌擴(kuò)增，使用堿裂解法抽提真核重組質(zhì)粒；

c、通過(guò)DNA測(cè)序篩選出正確插入的重組質(zhì)?？寺?。

本發(fā)明的第三方面，提供上述真核重組質(zhì)粒在制備抑制新生血管形成藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第四方面，提供一種重組慢病毒載體，所述的重組慢病毒載體包含核苷酸序列SEQ ID NO.1所述的人c5orf39基因。

所述的重組慢病毒載體的制備方法包括以下步驟：將上述真核重組質(zhì)粒與三種包裝質(zhì)粒MDL、REV、VSVG共轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞(293T)，在細(xì)胞上清液中收獲只有感染能力而無(wú)復(fù)制能力的重組慢病毒載體顆粒。

本發(fā)明的第五方面，提供上述重組慢病毒載體在制備抑制新生血管形成藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第六方面，提供一種抑制新生血管形成的藥物，所述的藥物包括上述真核重組質(zhì)粒或重組慢病毒載體。

本發(fā)明將所述的重組質(zhì)粒包裝慢病毒感染人的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后，重組質(zhì)粒作用于人c5orf39基因可抑制人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞及臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。因此，本發(fā)明有助于研究c5orf39基因功能，并且為研究c5orf39基因在人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞及其他部位異常新生血管中發(fā)病的作用機(jī)制提供了有用的分子生物學(xué)工具。

附圖說(shuō)明

圖1，2為本發(fā)明真核重組載體(Lenti^c5orf39)在人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞HREC和在人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC中表達(dá)的圖片。其中，圖1A為HREC細(xì)胞中c5orf39基因mRNA表達(dá)的統(tǒng)計(jì)圖，圖1B為HUVEC細(xì)胞中c5orf39基因mRNA表達(dá)的統(tǒng)計(jì)圖，圖2A為HREC細(xì)胞中C5ORF39蛋白表達(dá)圖，圖2B為HUVEC細(xì)胞中C5ORF39蛋白表達(dá)圖。

圖3為感染Lenti^c5orf39真核重組質(zhì)粒組，感染空載體的陰性對(duì)照組，未感染質(zhì)粒的空白對(duì)照組HREC和HUVEC細(xì)胞增殖統(tǒng)計(jì)圖。其中，圖3A為各組處于復(fù)制期的HREC細(xì)胞(藍(lán)色為DAPI染核，代表全部的細(xì)胞，紅色代表處于復(fù)制期的細(xì)胞)，圖3B為各組處于增殖期的HREC細(xì)胞的百分比統(tǒng)計(jì)圖，圖3C為各組處于復(fù)制期的HUVEC細(xì)胞，圖3D為各組處于增殖期的HUVEC細(xì)胞的百分比統(tǒng)計(jì)圖。

圖4為感染Lenti^c5orf39真核重組質(zhì)粒組，感染空載體的陰性對(duì)照組，未感染質(zhì)粒的空白對(duì)照組HREC和HUVEC細(xì)胞遷移圖。其中，圖4A為三個(gè)組HREC細(xì)胞遷移的代表性圖片，圖4B為三個(gè)組HUVEC細(xì)胞遷移的代表性圖片，圖4C為HREC細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)百分比的統(tǒng)計(jì)圖，圖4D為HUVEC細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)百分比的統(tǒng)計(jì)圖。

圖5為感染Lenti^c5orf39真核重組質(zhì)粒組，感染空載體的陰性對(duì)照組，未感染質(zhì)粒的空白對(duì)照組HREC和HUVEC細(xì)胞管腔形成圖。其中，圖5A為各組HREC管樣形成的代表性圖片，圖5B為為各組HREC管樣形成的代表性圖片，圖5C為HREC細(xì)胞管樣結(jié)構(gòu)數(shù)量的統(tǒng)計(jì)圖，圖5D為HUVEC細(xì)胞管樣結(jié)構(gòu)數(shù)量的統(tǒng)計(jì)圖。

圖6感染Lenti^c5orf39真核重組質(zhì)粒組，感染空載體的陰性對(duì)照組，未感染質(zhì)粒的空白對(duì)照組HREC和HUVEC細(xì)胞周期圖。其中，圖6A為流式細(xì)胞儀檢測(cè)HREC細(xì)胞細(xì)胞周期的分析結(jié)果圖，圖6B為HREC細(xì)胞處于各個(gè)期細(xì)胞數(shù)的統(tǒng)計(jì)圖，圖6C流式細(xì)胞儀檢測(cè)HUVEC細(xì)胞細(xì)胞周期的分析結(jié)果圖為，圖6D為HUVEC細(xì)胞處于各個(gè)期細(xì)胞數(shù)的統(tǒng)計(jì)圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式作詳細(xì)說(shuō)明。下述實(shí)施例中，凡未注明具體實(shí)施條件的，均可按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)條件；實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中的條件、按照制作廠商所建議的條件。

實(shí)施例1：構(gòu)建重組真核表達(dá)載體Lenti-c5orf39

1、c5orf39基因的克隆

根據(jù)Gene Bank的編碼序列，用primer premier 5軟件設(shè)計(jì)引物(c5orf39)，分別如下：

引物序列：

F-TCTAGAGCCGCCACCATGGAGCAACATTTTCTTGGC(SEQ ID NO.2)

R-GTCGACCTAAGGCTGCTTAGCTCCACAGATCCG(SEQ ID NO.3)

(PCR反應(yīng)中的PrimerSTAR HS保真酶由Takara公司提供)

反應(yīng)體系：50ul

PCR成功擴(kuò)增出人c5orf39基因編碼序列(CDS)，PCR產(chǎn)物電泳后在582bp出獲得擴(kuò)增產(chǎn)物條帶，與目的基因片段大小基本一致。

2、PCR產(chǎn)物電泳后純化回收，試劑盒為T(mén)IANGEN公司的PCR純化回收試劑盒，操作按說(shuō)明書(shū)。實(shí)驗(yàn)步驟為：

1)切取PCR產(chǎn)物所在位置凝膠，稱重，c5orf39基因?yàn)?.25g；

2)加入250ul binding buffer，55℃水浴溫至凝膠全部融化；

3)將2步所得的液體全部移入吸附柱，12000rpm離心1分鐘，棄濾過(guò)液；

4)加入500ul washing buffer于吸附柱中，12000rpm離心1分鐘，棄濾過(guò)液；

5)加入750ul washing buffer于吸附柱中，12000rpm離心1分鐘，棄濾過(guò)液；

6)吸附柱再次離心，12000rpm離心3分鐘，棄濾過(guò)液；

7)將吸附柱移入干凈1.5mlEP管中，加入45ul無(wú)核酶水于吸附柱中洗脫DNA；

8)12000rpm離心1分鐘，收集濾過(guò)液，即為純化的DNA溶液。

3、真核表達(dá)載體線性化與c5orf39基因連接

反應(yīng)條件：37℃水浴溫育2-3小時(shí)。

所述的Lenti-載體序列如SEQ ID NO.9所示，其中SalI和XbaI的酶切位點(diǎn)：XbaI T/CTAGA 1:4731，SalI G/TCGAC 1:5485。

酶切產(chǎn)物回收(試劑盒同PCR產(chǎn)物回收)，酶切后的載體和PCR產(chǎn)物用于下一步的連接反應(yīng)，連接反應(yīng)體系如下：

反應(yīng)體系10ul

反應(yīng)條件：16℃金屬浴溫育，過(guò)夜。

4、真核重組質(zhì)粒Lenti-c5orf39轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)步驟如下：

1)冰上化開(kāi)Top10感受態(tài)取20ul，

2)加入5u連接產(chǎn)物，快速輕彈混勻，靜置冰浴30min；

3)42℃水浴熱激30sec，輕輕拿出放在冰上2min；

4)加入等體積的無(wú)抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃，200rpm搖床活化1h；

5)取一半培養(yǎng)物涂布LB瓊脂平板(含Amp100ug/mL)，37℃敷箱培養(yǎng)過(guò)夜；

6)挑取單個(gè)克隆菌落搖菌。c50rf39挑取4個(gè)克隆，編號(hào)為1，2，3，4。分別進(jìn)行搖菌過(guò)夜，菌液12000rpm離心1min，棄上清，沉淀送檢進(jìn)行DNA測(cè)序分析(上海睿迪生物科技有限公司)。測(cè)序結(jié)果見(jiàn)SEQ ID NO.8，將本實(shí)驗(yàn)的測(cè)序結(jié)果通過(guò)BALST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與GeneBank中公布的序列一致，目的基因片段長(zhǎng)度實(shí)為582bp。測(cè)序正確的克隆進(jìn)行培養(yǎng)過(guò)夜提取質(zhì)粒備用(質(zhì)粒提取試劑盒，QIAGEN公司)。

實(shí)施例2：真核重組表達(dá)載體Lenti-c5orf39的活性鑒定

1.細(xì)胞培養(yǎng)

分別用5％的胎牛血清ECM培養(yǎng)基(Sciencell公司購(gòu)買)和10％DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco公司購(gòu)買)于37℃，5％CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞株和人胚腎細(xì)胞(293T)(HREC從Sciencell公司購(gòu)買，HUVEC、293T從ATCC購(gòu)買)至鋪滿培養(yǎng)瓶。

2.真核表達(dá)質(zhì)粒Lenti-c5orf39慢病毒包裝

2.1鋪滿培養(yǎng)瓶的293T細(xì)胞接種到10cm的皿，培養(yǎng)過(guò)夜，待皿里的293T細(xì)胞約90％-95％時(shí)，進(jìn)行慢病毒包裝。

2.2①將200ulLipofectamine2000與3mLOpti-MEM預(yù)混5分鐘；

2.3②將22.2ugMDL、16.65ugREV、16.65ugVSVG包裝質(zhì)粒分別與40ugLenti-c5orf39質(zhì)粒、40ugEGFP質(zhì)粒預(yù)混；

2.4③將預(yù)混好的①各取1.6mL加入293T細(xì)胞中，混勻，37℃，5％CO敷箱敷育20min；

2.5④10cm皿中培養(yǎng)過(guò)夜的293T細(xì)胞用Opti-MEM換液后，將③加入每個(gè)皿，皿蓋上注明目標(biāo)質(zhì)粒名稱、轉(zhuǎn)染量及時(shí)間；

2.6⑤6h后，用DMEM進(jìn)行換液；

2.7⑥從DMEM換液開(kāi)始算起，分別在24h、48h、72h收取細(xì)胞上清液(每次收取上清液后加入新的培養(yǎng)基)，12000rpm，離心10分鐘，上清液用病毒濃縮柱(Millipore公司購(gòu)買)將上清液濃縮為1mL，留作后續(xù)感染HREC及HUVEC備用。

實(shí)施例3：真核重組表達(dá)載體Lenti-c5orf39的活性鑒定

1.1)細(xì)胞培養(yǎng)同實(shí)施例2.1.細(xì)胞培養(yǎng)；

2)分別取培養(yǎng)瓶中1/4視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞HREC接種于6孔板的每一孔中；

3)待細(xì)胞貼壁后加入5ul預(yù)先包好的慢病毒，感染人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞HREC；

4)37℃，5％CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育；實(shí)驗(yàn)設(shè)置三個(gè)組：實(shí)驗(yàn)組(lenti-c5orf39)，陰性對(duì)照組(lenti-EGFP)，空白組(control)。

5)感染24h后，棄細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)原有的培養(yǎng)基，每孔各加入2.5mL含5％胎牛血清ECM培養(yǎng)基，放入37℃，5％CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育。48h后用含600ug/mLG418的ECM培養(yǎng)基，篩選14d，每隔3天換一次培養(yǎng)基。挑選單克隆細(xì)胞群維持G418抗性培養(yǎng)，G418的維持濃度為33ug/mL，得到穩(wěn)定感染的HREC細(xì)胞株。

人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC穩(wěn)定細(xì)胞株的構(gòu)建及篩選過(guò)程與上述一致。

2.總RNA的提取

1)取穩(wěn)定感染后的實(shí)驗(yàn)組(lenti-c5orf39)，陰性對(duì)照組(lenti-EGFP),空白組(control)加入TRIzol試劑(Sigma公司)500uL，然后轉(zhuǎn)移到1.5mLEP管中，室溫靜置5分鐘；

2)加入150ul的氯仿，上下顛倒搖勻5-10次左右，離心(提前打開(kāi)離心機(jī)預(yù)冷)15min，12500rpm，4℃；

3)將上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5mL EP管中，加入200uL的異丙醇上下顛倒混勻，室溫靜置10min，離心15min，12500rpm，4℃，棄上清，在管底部可見(jiàn)乳白色小沉淀物，即為RNA；

4)加入75％的乙醇，混合震蕩，離心10min，12000rpm，4℃，棄上清，通風(fēng)，室溫干燥5min，讓乙醇揮發(fā)，然后加入20uL質(zhì)量濃度為0.1％DEPC水溶解RNA，充分混勻；

5)酶標(biāo)儀檢測(cè)每個(gè)樣品的濃度，確保OD260/0D280的值在1.8-2.0之間，并且每個(gè)樣品的RNA均使用DNA酶進(jìn)行處理以去除基因組污染。

3.cDNA第一鏈的合成

反應(yīng)體系20uL：

5×Primescript RT Master Mix 4uL

mRNA 1ug

RNase Free dH₂O 補(bǔ)齊至20ul

(Primescript RT Master Mix Kit購(gòu)買于TaKaRa公司)

42℃，水浴，30min

4.熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)

4.1熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)

根據(jù)人(homo spaiens)c5orf39基因全長(zhǎng)cDNA的開(kāi)放閱讀框(Open reading Frame,ORF)序列，設(shè)計(jì)熒光定量PCR所需引物。所用軟件為Primer Preimer5.0及OLig6。保證PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度在150-250bp。引物設(shè)計(jì)好后，進(jìn)一步在NCBI上通過(guò)BLAST比對(duì)驗(yàn)證引物的特異性是否良好。采用人(homo spaiens)gapdh(脫氧核苷酸序列見(jiàn)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù))作為內(nèi)參，引物序列見(jiàn)下表。

表1定量PCR引物

4.2熒光定量PCR擴(kuò)增

采用SYBR GREEN染料法進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，并根據(jù)熒光定量PCR試劑盒操作說(shuō)明書(shū)(TaKaRa company)控制實(shí)驗(yàn)規(guī)范性。反應(yīng)體系為20uL：

然后放入eppendorf管在熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。分別檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組c5orf39基因的mRNA的表達(dá)水平。反應(yīng)完畢后對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞感染后，實(shí)驗(yàn)組中c5orf39基因相對(duì)表達(dá)水平明顯高于其它兩組，臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組c5orf39的表達(dá)同樣也高于其它兩組，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖1A,1B)。

實(shí)施例4：Western blot檢測(cè)c5orf39目的基因表達(dá)

1、總蛋白提取(在冰上操作)

穩(wěn)感細(xì)胞棄掉培養(yǎng)基，PBS洗一遍，根據(jù)細(xì)胞量加入適量的蛋白裂解液(HREC一瓶細(xì)胞加400u裂解液，HUVEC一瓶細(xì)胞加2mL裂解液)，于冰上左右搖床上裂解10-15min左右，收集裂解液于EP管中，離心15min，12000rpm，4℃，轉(zhuǎn)移上清至新的EP管中，-80℃保存。

2、BCA蛋白定量法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量

按照BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(Beyotime)制備蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)樣品數(shù)量，按50體積BCA試劑A加1體積試劑B(50:1)配置適量BCA工作液，充分混勻。BCA工作液室溫24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定；取1uL蛋白樣品到96孔板的樣品板中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)足到20uL；對(duì)照組加50uL去離子水；各孔加入200uL的BCA工作液，37℃放置30min，測(cè)定A570nmd處讀取A值；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的蛋白濃度。

3、十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳

樣品制備：經(jīng)過(guò)定量后的蛋白樣品按體積加入5×loading buffer，沸水浴煮15min分鐘左右，離心5min，12000rpm，-20℃保存。根據(jù)待檢測(cè)蛋白分子量的大小配置12.5％的凝膠。每孔加入40ug蛋白，以起始電壓50V電泳，待樣品電泳至分離膠，電壓調(diào)整為110V，繼續(xù)電泳約1.5h，溴酚藍(lán)剛跑出凝膠即終止電泳，取下凝膠后適當(dāng)裁剪后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。

4、轉(zhuǎn)膜

準(zhǔn)備配套的海綿、濾紙和PVDF膜，將PVDF膜置于甲醇中浸泡以活化膜，后將膜轉(zhuǎn)移至轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡。在轉(zhuǎn)膜儀上按照“黑膠白膜”，即轉(zhuǎn)膜儀黑色的一面放置凝膠，白色的一面放置PVDF膜，以海綿-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-海綿的順序裝好，排除氣泡，在轉(zhuǎn)膜緩沖液中280mA恒流轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間依據(jù)分子量的大小而不同(c5orf39基因蛋白是22KDa，轉(zhuǎn)膜時(shí)間1.5h)。

5、免疫反應(yīng)

轉(zhuǎn)膜完畢后，將膜放入封閉液(含5％脫脂奶粉的1×TBST(1×TBS，0.1％Tween20)溶液中，室溫下?lián)u床上封閉。2-2.5h后，用TBST液在搖床上洗膜3次，每次5min。抗體稀釋液稀釋的一抗4℃孵育過(guò)夜。第二天用1×TBST在搖床上洗膜3次，每次5min。孵育用5％的脫脂奶粉稀釋的二抗，室溫下孵育2h左右，用1×TBST在搖床上洗膜3次，每次5min。

6、曝光

在EP管中等體積混合ECL液的A液和B液，加到PVDF膜的正面。置于凝膠成像系統(tǒng)，曝光共10min，每30s收集照片一張。

7、凝膠圖像分析

目的蛋白及內(nèi)參照gapdh蛋白條帶用Quantity one analysis software(Bio-Rad，美國(guó))分析，測(cè)其吸光度值(optical density,OD)，取目的蛋白與內(nèi)參蛋白gapdh蛋白的吸光度的比值作為目的蛋白的相對(duì)含量。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：HREC細(xì)胞中C5ORF39蛋白的表達(dá)水平較其它兩組明顯升高，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，HUVEC細(xì)胞中C5ORF39蛋白的表達(dá)水平檢測(cè)也得到同樣的結(jié)果(見(jiàn)圖2A,2B)。

實(shí)施例5：感染c50rf39基因后對(duì)人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞株HREC與人臍靜脈血管內(nèi)皮胞株HUVEC的功能(包括增殖、遷移、管樣形成)影響

1.細(xì)胞增殖影響

穩(wěn)定感染后的人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組(lenti-c5orf39)，陰性對(duì)照組(lenti-EGFP)，空白組(control)HREC的細(xì)胞棄去培養(yǎng)基，PBS洗一遍，胰酶消化后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以每孔4000個(gè)細(xì)胞種于96孔板，48h后，進(jìn)行EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)(Cell-Light^TM EdU Apollo567in Vitro Kit在廣州銳博公司購(gòu)買)，實(shí)驗(yàn)步驟如下：

1.1EdU標(biāo)記

1)用ECM培養(yǎng)基按1000:1的比例EdU溶液(試劑A)，制備適量的50uMEdU培養(yǎng)基；

2)每孔加入100uL50uM EdU培養(yǎng)基孵育2h，棄去培養(yǎng)基；

3)PBS清洗細(xì)胞1-2次，每次5min。

1.2.細(xì)胞固定化

1)每孔加入50uL細(xì)胞固定液(4％多聚甲醛)，室溫孵育30min，棄固定液；

2)每孔加入50uL 2mg/Ml甘氨酸，脫色搖床孵育5min，棄甘氨酸溶液；

3)每孔加入100uLPBS，脫色搖床孵育5min，棄PBS；

4)(加強(qiáng))每孔加入100uL滲透劑(0.5％TrionX-100的PBS)脫色搖床孵育10min，PBS清洗一遍，5min；

1.3.Apollo染色

1)每孔加入100uL的1×Apollo染色反應(yīng)液(配液比例按照說(shuō)明書(shū)配置)，避光、室溫、脫色搖床孵育30min后，棄染色反應(yīng)液；

2)加入100uL滲透劑(0.5％TrionX-100的PBS)脫色搖床清洗2-3次，每次10min，棄滲透劑；

3)(加強(qiáng))每孔每次加入100uL甲醇清洗1-2次，每次5min，PBS清洗1次，每次5min。

1.4.DNA染色

1)用去離子水按100:1的比例稀釋試劑F，制備適量1×Hoechest3342反應(yīng)液，避光保存；

2)每孔加入100UL1×Hoechest3342反應(yīng)液，避光、室溫、脫色搖床孵育30min后，棄染色反應(yīng)液；

3)每孔每次加入100uLPBS，清洗1-3次；

4)每孔加入100uLPBS保存待用。

1.5實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：熒光顯微鏡觀察：視野中1×Hoechest3342反應(yīng)液染核顯示藍(lán)色，代表視野中所有的細(xì)胞，EdU染色顯示紅色，代表視野中處于增殖期的細(xì)胞。對(duì)視野中的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)、相對(duì)比(紅色細(xì)胞計(jì)數(shù)/藍(lán)色細(xì)胞計(jì)數(shù))計(jì)算得出：人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞增殖減慢，細(xì)胞數(shù)相較于陰性對(duì)照組、空白組HREC明顯減少；人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組的紅色細(xì)胞計(jì)數(shù)/藍(lán)色細(xì)胞計(jì)數(shù)比值明顯低于其他兩種，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明c5orf39基因能抑制人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮HREC細(xì)胞的增殖(見(jiàn)圖3A,3B)。

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC增殖實(shí)驗(yàn)操作同人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞HREC，實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞增殖減慢，細(xì)胞數(shù)相較于陰性對(duì)照組、空白組HUVEC明顯減少；人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組紅色細(xì)胞計(jì)數(shù)/藍(lán)色細(xì)胞計(jì)數(shù)比值明顯低于其他兩種，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明c5orf39基因能抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮HUVEC細(xì)胞的增殖(見(jiàn)圖3C,3D)。

2.細(xì)胞遷移影響

穩(wěn)定感染后的人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組、空白組HREC細(xì)胞進(jìn)行transwell小室(Corning Incorporated公司購(gòu)買)細(xì)胞遷移：

1)將胎牛血清為5％ECM培養(yǎng)基稀釋配成1％、2％ECM各2mL；

2)24孔板中取3個(gè)孔每孔加入500uL的2％ECM，隨后將trasnwell小室放入孔內(nèi)；

3)穩(wěn)定感染的實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組、空白組HREC的細(xì)胞一瓶棄去培養(yǎng)基，PBS洗一遍，胰酶消化取部分細(xì)胞用1％ECM稀釋，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，

4)將計(jì)數(shù)好的三組細(xì)胞均以35000個(gè)/孔加入小室，放入37℃，5％CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育；

5)14h左右，將24孔板內(nèi)的小室移到新孔，4％多聚甲醛固定30min；

6)PBS洗一遍，20％的結(jié)晶紫溶液染色2h；

7)PBS洗一遍，白光顯微鏡觀察三組穿移到小室另一側(cè)的細(xì)胞數(shù)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：白光顯微鏡觀察細(xì)胞呈結(jié)晶紫染色后的紫色，實(shí)驗(yàn)組的遷移細(xì)胞數(shù)明顯少于陰性對(duì)照組和空白組，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明c5orf39基因能抑制人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮HREC細(xì)胞的遷移(見(jiàn)圖4A,4C)。

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC增殖實(shí)驗(yàn)操作同人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞HREC，不同的是每組加入20000個(gè)/孔進(jìn)行細(xì)胞遷移，實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：白光顯微鏡觀察細(xì)胞呈紫色，實(shí)驗(yàn)組的遷移細(xì)胞數(shù)明顯少于陰性對(duì)照組和空白組，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明c5orf39基因能抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮HUVEC細(xì)胞的遷移(見(jiàn)圖4B,4D)。

3.管樣形成影響

穩(wěn)定感染后的人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照、空白組HREC的細(xì)胞進(jìn)行管樣形成實(shí)驗(yàn)：

1)150uL matrigel鋪48孔板3個(gè)(冰上操作)，4℃孵育30min，37℃，5％CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育30min；

2)實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組、空白組三組計(jì)數(shù)，以每孔30000個(gè)細(xì)胞加入48孔板，37℃，5％CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育2-4h；

3)輕輕棄去培養(yǎng)基，4％多聚甲醛固定30min；

4)加入自帶熒光的骨架蛋白抗體F-actin，左右搖床孵育30分鐘，PBS洗3遍，每次15分鐘；

5)每孔加入100uL1:10000稀釋的DAPI，左右搖床孵育20min；

6)PBS洗3遍，每次5min，每孔加入100uLPBS保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：熒光顯微鏡觀察：視野中DAPI染核呈藍(lán)色，F(xiàn)-actin染骨架蛋白呈紅色。對(duì)視野中細(xì)胞所成的管樣結(jié)構(gòu)進(jìn)行計(jì)數(shù)分析得：人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組相較于陰性對(duì)照組、空白組成管數(shù)量明顯減少，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，經(jīng)c5orf39基因處理后細(xì)胞多數(shù)不能形成完整的管樣結(jié)構(gòu)，表明c5orf39基因能夠抑制人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的管樣形成(見(jiàn)圖5A,5C)。

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC管樣形成實(shí)驗(yàn)操作同人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞HREC，不同的是每組加40000個(gè)/孔進(jìn)行管樣形成實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組HUVEC相較于陰性對(duì)照組、空白組成管數(shù)量明顯減少，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，經(jīng)c5orf39基因處理后細(xì)胞多數(shù)不能形成完整的管樣結(jié)構(gòu)，表明c5orf39基因能夠抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的管樣形成(見(jiàn)圖5B,5D)。

實(shí)施例6：感染c50rf39基因后對(duì)人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞株HREC與人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株HUVEC的細(xì)胞周期的影響

采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)：

1.穩(wěn)定感染后的人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組HREC、陰性對(duì)照組、空白組HREC細(xì)胞棄去培養(yǎng)基，PBS洗一遍，胰酶消化，5％ECM中和胰酶后取部分細(xì)胞于1.5mL EP管中；

2.4000rpm，10min，離心；

3.棄上清液，600uLPBS洗一遍；

4.4000rpm，10min，離心；

5.棄廢液，加入預(yù)冷的70％無(wú)水乙醇(先加300uLPBS，將細(xì)胞混勻，再加入700uL的無(wú)水乙醇)固定過(guò)夜；

6.隔天4000rpm，10min，離心；

7.棄廢液，根據(jù)細(xì)胞量加入適當(dāng)體積的PI(三箭生物購(gòu)買CY2001-P)染液，避光、室溫、左右搖床孵育30min后，流式細(xì)胞儀(Benkman Coulter,美國(guó))上機(jī)檢測(cè)。

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果分析：人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組相較于陰性對(duì)照組和空白組，G1的峰值不變，S期升高，G2期的峰值降低，從S期進(jìn)入G2期的細(xì)胞減少，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：c5orf39基因可以通過(guò)抑制人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞周期來(lái)減慢細(xì)胞的增殖(見(jiàn)圖6A,6B)。

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)操作同人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞HREC，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果分析：人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組相較于陰性對(duì)照組和空白組，G1的峰值不變，S期的峰值升高，G2期的峰值降低，細(xì)胞從S期進(jìn)入G2期的細(xì)胞減少，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：c5orf39基因可以通過(guò)抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞周期來(lái)減慢細(xì)胞的增殖(見(jiàn)圖6C,6D)。

以上已對(duì)本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實(shí)施例進(jìn)行了具體說(shuō)明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述實(shí)施例，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可做出種種的等同的變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請(qǐng)權(quán)利要求所限定的范圍內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海長(zhǎng)海醫(yī)院

<120> 一種過(guò)表達(dá)c5orf39基因質(zhì)粒構(gòu)建方法及其在新生血管形成中的應(yīng)用

<130> /

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 582

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

atggagcaac attttcttgg ctgtgtgaag cgggcttggg attccgcaga ggtggcgcca 60

gagccccagc ctccacctat tgtgagttca gaagatcgtg ggccgtggcc tcttcctttg 120

tatccagtac taggagagta ctcactggac agctgtgatt tgggactgct ttccagccct 180

tgctggcggc tgcccggagt ctactggcaa aacggactct ctcctggagt ccagagcacc 240

ttggaaccaa gtacagcgaa gcccactgag ttcagttggc cggggacaca gaagcagcaa 300

gaggcacccg tagaagaggt ggggcaggca gaggaacccg acagactcag gctccagcag 360

cttccctgga gcagtcctct ccatccctgg gacagacagc aggacaccga ggtctgtgac 420

agcgggtgcc ttttggaacg ccgccatcct cctgccctcc agccgtggcg ccacctcccg 480

ggtttctcag actgcctgga gtggattctt cgcgttggtt ttgccgcgtt ctctgtactc 540

tgggcgtgct gttcacggat ctgtggagct aagcagcctt ag 582

<210> 2

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tctagagccg ccaccatgga gcaacatttt cttggc 36

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtcgacctaa ggctgcttag ctccacagat ccg 33

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cggagtctac tggcaaaacg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gccttctgct gctatctaag 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

accacagtcc atgccatcac 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tccaccaccc tgttgctgta 20

<210> 8

<211> 991

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

actctagatg catgctcgag cggccgccag tgtgatggat atctgcagaa ttgcccttag 60

ccgccaccat ggagcaacat tttcttggct gtgtgaagcg ggcttgggat tccgcagagg 120

tggcgccaga gccccagcct ccacctattg tgagttcaga agatcgtggg ccgtggcctc 180

ttcctttgta tccagtacta ggagagtact cactggacag ctgtgatttg ggactgcttt 240

ccagcccttg ctggcggctg cccggagtct actggcaaaa cggactctct cctggagtcc 300

agagcacctt ggaaccaagt acagcgaagc ccactgagtt cagttggccg gggacacaga 360

agcagcaaga ggcacccgta gaagaggtgg ggcaggcaga ggaacccgac agactcaggc 420

tccagcagct tccctggagc agtcctctcc atccctggga cagacagcag gacaccgagg 480

tctgtgacag cgggtgcctt ttggaacgcc gccatcctcc tgccctccag ccgtggcgcc 540

acctcccggg tttctcagac tgcctggagt ggattcttcg cgttggtttt gccgcgttct 600

ctgtactctg ggcgtgctgt tcacggatct gtggagctaa gcagcctcac catcatcatc 660

atcattaggt cgacaatcaa cctctggatt acaaaatttg tgaaagattg actggtattc 720

ttaactatgt tgctcctttt acgctatgtg gatacgctgc tttaatgcct ttgtatcatg 780

ctattgcttc ccgtatggct ttcattttct cctccttgta taaatcctgg ttgctgtctc 840

tttatgagga gttgtggccc gtgtcaggca acgtggcgtg gtgtgcactg tgtttgctga 900

cgcaacccca ctggttgggc attgccacca cctgtcagct cctttccggg acttcgcttc 960

ccctccctat tgcacggcgg aactcatcgc g 991

<210> 9

<211> 7525

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac 60

attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa 120

aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat 180

tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc 240

agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga 300

gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg 360

cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc 420

agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag 480

taagagaatt atgcagtgct gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc 540

tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg 600

taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg 660

acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac 720

ttactctagc ttcccggcaa caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac 780

cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg 840

agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg 900

tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg 960

agataggtgc ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac 1020

tttagattga tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg 1080

ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg 1140

tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc 1200

aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc 1260

tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt 1320

agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc 1380

taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact 1440

caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac 1500

agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag 1560

aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg 1620

gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg 1680

tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga 1740

gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt 1800

ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct 1860

ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg 1920

aggaagcgga agagcgccca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt 1980

aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta 2040

atgtgagtta gctcactcat taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta 2100

tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt 2160

acgccaagcg cgcaattaac cctcactaaa gggaacaaaa gctggagctg caagcttaat 2220

gtagtcttat gcaatactct tgtagtcttg caacatggta acgatgagtt agcaacatgc 2280

cttacaagga gagaaaaagc accgtgcatg ccgattggtg gaagtaaggt ggtacgatcg 2340

tgccttatta ggaaggcaac agacgggtct gacatggatt ggacgaacca ctgaattgcc 2400

gcattgcaga gatattgtat ttaagtgcct agctcgatac aataaacggg tctctctggt 2460

tagaccagat ctgagcctgg gagctctctg gctaactagg gaacccactg cttaagcctc 2520

aataaagctt gccttgagtg cttcaagtag tgtgtgcccg tctgttgtgt gactctggta 2580

actagagatc cctcagaccc ttttagtcag tgtggaaaat ctctagcagt ggcgcccgaa 2640

cagggacctg aaagcgaaag ggaaaccaga gctctctcga cgcaggactc ggcttgctga 2700

agcgcgcacg gcaagaggcg aggggcggcg actggtgagt acgccaaaaa ttttgactag 2760

cggaggctag aaggagagag atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg ggagaattag 2820

atcgcgatgg gaaaaaattc ggttaaggcc agggggaaag aaaaaatata aattaaaaca 2880

tatagtatgg gcaagcaggg agctagaacg attcgcagtt aatcctggcc tgttagaaac 2940

atcagaaggc tgtagacaaa tactgggaca gctacaacca tcccttcaga caggatcaga 3000

agaacttaga tcattatata atacagtagc aaccctctat tgtgtgcatc aaaggataga 3060

gataaaagac accaaggaag ctttagacaa gatagaggaa gagcaaaaca aaagtaagac 3120

caccgcacag caagcggccg ctgatcttca gacctggagg aggagatatg agggacaatt 3180

ggagaagtga attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga gtagcaccca 3240

ccaaggcaaa gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata ggagctttgt 3300

tccttgggtt cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcctcaatg acgctgacgg 3360

tacaggccag acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg ctgagggcta 3420

ttgaggcgca acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag ctccaggcaa 3480

gaatcctggc tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt tggggttgct 3540

ctggaaaact catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt aataaatctc 3600

tggaacagat ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt aacaattaca 3660

caagcttaat acactcctta attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag aatgaacaag 3720

aattattgga attagataaa tgggcaagtt tgtggaattg gtttaacata acaaattggc 3780

tgtggtatat aaaattattc ataatgatag taggaggctt ggtaggttta agaatagttt 3840

ttgctgtact ttctatagtg aatagagtta ggcagggata ttcaccatta tcgtttcaga 3900

cccacctccc aaccccgagg ggacccgaca ggcccgaagg aatagaagaa gaaggtggag 3960

agagagacag agacagatcc attcgattag tgaacggatc tcgacggtta acttttaaaa 4020

gaaaaggggg gattgggggg tacagtgcag gggaaagaat agtagacata atagcaacag 4080

acatacaaac taaagaatta caaaaacaaa ttacaaaaat tcaaaatttt atcgataagc 4140

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cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt 4260

ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt 4320

gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca 4380

ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt 4440

catcgctatt accatggtga tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt 4500

tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca 4560

ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg taacaactcc gccccattga cgcaaatggg 4620

cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat aagcagagct cgtttagtga accgtcagat 4680

cgcctggaga cgccatccac gctgttttga cctccataga agacaccgac tctagaggat 4740

ccaccggtcg ccaccatggt gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc 4800

ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag 4860

ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc 4920

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cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag 5040

gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc 5100

gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc 5160

aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc 5220

gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc 5280

agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg 5340

ctgcccgaca accactacct gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag 5400

cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct cggcatggac 5460

gagctgtaca agtaaagcgg ccgcgtcgac aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa 5520

agattgactg gtattcttaa ctatgttgct ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta 5580

atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt atggctttca ttttctcctc cttgtataaa 5640

tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg 5700

tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc 5760

ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc 5820

cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg 5880

gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg 5940

acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg 6000

ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc 6060

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aggcagctgt agatcttagc cactttttaa aagaaaaggg gggactggaa gggctaattc 6180

actcccaacg aagacaagat ctgctttttg cttgtactgg gtctctctgg ttagaccaga 6240

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ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat 6540

ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct tatcatgtct 6600

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gatttataag ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa 7380

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caaaatatta acgtttacaa tttcc 7525