本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中一種MC3R基因敲除豬的制備方法。

背景技術(shù)：

黑素皮質(zhì)素受體(Melanocortin Receptors，MCRs)是位于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面的受體，屬于G-蛋白偶聯(lián)受體家族，迄今為止共發(fā)現(xiàn)五個(gè)成員。MCRs在黑素皮質(zhì)素(Melanocortin，MC)刺激下，通過(guò)結(jié)合激活型Gs蛋白來(lái)增加胞內(nèi)第二信使cAMP的濃度，啟動(dòng)胞內(nèi)信號(hào)通路。MCRs各成員間生理作用迥異，MC1R由皮膚黑色素細(xì)胞表達(dá)，在決定皮膚和頭發(fā)色素沉著上起著關(guān)鍵作用。MC2R在腎上腺皮質(zhì)中表達(dá)，調(diào)節(jié)腎上腺甾體合成和細(xì)胞增殖。MC5R分布廣泛，可能與外分泌功能有關(guān)。MC3R和MC4R被認(rèn)為參與機(jī)體能量平衡的調(diào)節(jié)。近年來(lái)MC4R相關(guān)研究較多，發(fā)現(xiàn)其通過(guò)介導(dǎo)瘦素蛋白(Leptin)來(lái)調(diào)控動(dòng)物采食和能量平衡。MC3R的研究相對(duì)較少，它是由319個(gè)氨基酸殘基組成，主要表達(dá)于下丘腦，屬于自身受體(autoreceptor)。研究證明MC3R參與機(jī)體能量代謝的調(diào)節(jié)，目前認(rèn)為MC3R可與其內(nèi)源性配體黑素皮質(zhì)素激素(melanocortin，MC)或刺鼠色蛋白(agouti protein)和agouti相關(guān)蛋白(agouti related protein，AGRP)相結(jié)合，從而抑制攝食，進(jìn)而導(dǎo)致血糖、胰島素和瘦素水平降低，從而減少體脂積累，降低體重。

通常建立基因敲除動(dòng)物模型，是通過(guò)基于同源重組的敲除載體來(lái)實(shí)現(xiàn)的。這種打靶載體構(gòu)建繁瑣，周期長(zhǎng)，費(fèi)用高，而且效率極低。而且mark基因刪除是個(gè)麻煩的問(wèn)題，即使mark-free后也會(huì)留下loxp或者flt的基因片段。

基于CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)，是繼鋅指核酸酶(Zinc-finger nucleases,ZFNs)和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(Transcription activa-tor-like effector nuclease,TALEN)后的第三代基因組編輯技術(shù)，是基于細(xì)菌的獲得性免疫系統(tǒng)改造而成。CRISPR/Cas9是基于細(xì)菌或古細(xì)菌規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)介導(dǎo)的獲得性免疫系統(tǒng)衍生而來(lái)的基因編輯技術(shù)。該技術(shù)通過(guò)RNA堿基互補(bǔ)配對(duì)識(shí)別DNA，指導(dǎo)Cas9核酸酶切割識(shí)別的雙鏈DNA，誘發(fā)同源重組(HDR，homologous directed repair)或非同源末端鏈接(NHEJ，non-homologous end-joining)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)目的DNA編輯。該技術(shù)的基本要求之一就是受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)單分子識(shí)別RNA(sgRNA,single guiding RNA)，該分子負(fù)責(zé)識(shí)別特異性的基因編輯位點(diǎn)。然后介導(dǎo)結(jié)合Cas9蛋白行使DNA酶切活性，在設(shè)計(jì)的位點(diǎn)引入DNA雙鏈斷裂損傷，通過(guò)胞內(nèi)的NHEJ或HDR修復(fù)途徑引入突變。因此，sgRNA的表達(dá)是該技術(shù)的重要組成部分。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是如何采用CRISPR/Cas9技術(shù)制備MC3R基因敲除細(xì)胞系和MC3R基因敲除豬。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明首先提供了敲除動(dòng)物細(xì)胞中MC3R基因的方法。

本發(fā)明所提供的敲除動(dòng)物細(xì)胞中MC3R基因的方法，所述方法采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行，所述CRISPR/Cas9系統(tǒng)中包含gRNA1的編碼基因和/或gRNA2的編碼基因，所述gRNA1識(shí)別MC3R基因的靶序列為靶序列1；所述gRNA2識(shí)別MC3R基因的靶序列為靶序列2；

所述靶序列1為如下A1)、A2)或A3)：

A1)序列表中序列1的核苷酸序列；

A2)與A1)限定的DNA序列具有75％或75％以上同一性的由A1)衍生的DNA序列；

A3)在嚴(yán)格條件下與A1)限定的DNA序列雜交的由A1)衍生的DNA序列；

所述靶序列2為如下B1)、B2)或B3)：

B1)序列表中序列2的核苷酸序列；

B2)與B1)限定的DNA序列具有75％或75％以上同一性的由B1)衍生的DNA序列；

B3)在嚴(yán)格條件下與B1)限定的DNA序列雜交的由B1)衍生的DNA序列。

這里使用的術(shù)語(yǔ)“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性?！巴恍浴卑ㄅc本發(fā)明的序列1或序列2的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用計(jì)算機(jī)軟件，兩個(gè)或多個(gè)序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來(lái)評(píng)價(jià)相關(guān)序列之間的同一性。

上述敲除動(dòng)物細(xì)胞中MC3R基因的方法中，所述嚴(yán)格條件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可為80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述敲除動(dòng)物細(xì)胞中MC3R基因的方法可包括向動(dòng)物細(xì)胞中導(dǎo)入所述gRNA1的編碼基因和/或所述gRNA2的編碼基因，得到敲除MC3R基因的動(dòng)物細(xì)胞。

上述敲除動(dòng)物細(xì)胞中MC3R基因的方法中，所述gRNA1的編碼基因可通過(guò)含有所述gRNA1的編碼基因的表達(dá)盒導(dǎo)入所述動(dòng)物細(xì)胞中。所述gRNA2的編碼基因可通過(guò)含有所述gRNA2的編碼基因的表達(dá)盒導(dǎo)入所述動(dòng)物細(xì)胞中。所述CRISPR/Cas9系統(tǒng)還包括Cas9的編碼基因，所述Cas9的編碼基因可通過(guò)含有所述Cas9的編碼基因的表達(dá)盒導(dǎo)入所述動(dòng)物細(xì)胞中。

所述gRNA1和所述Cas9的編碼基因可通過(guò)含有所述gRNA1的編碼基因的表達(dá)盒和所述Cas9的編碼基因的表達(dá)盒的表達(dá)載體導(dǎo)入所述動(dòng)物細(xì)胞中。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述表達(dá)載體為pX330-target1，pX330-target1為在pX330載體的BbsI的識(shí)別序列中插入所述gRNA1的靶序列(即所述靶序列1)得到的重組載體，pX330-target1可表達(dá)所述gRNA1和Cas9。

所述gRNA2和所述Cas9的編碼基因可通過(guò)含有所述gRNA2的編碼基因的表達(dá)盒和所述Cas9的編碼基因的表達(dá)盒的表達(dá)載體導(dǎo)入所述動(dòng)物細(xì)胞中。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述表達(dá)載體為pX330-target2，pX330-target2為在pX330載體的BbsI的識(shí)別序列中插入所述gRNA2的靶序列(即所述靶序列2)得到的重組載體，pX330-target2可表達(dá)所述gRNA2和Cas9。

上述敲除動(dòng)物細(xì)胞中MC3R基因的方法中，所述動(dòng)物細(xì)胞可為下述H1或H2：

H1、哺乳動(dòng)物細(xì)胞；

H2、豬細(xì)胞。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了下述任一產(chǎn)品：

P1、成套R(shí)NA，由所述gRNA1和所述gRNA2組成；

P2、成套基因，由所述gRNA1的編碼基因和所述gRNA2的編碼基因組成；

P3、成套表達(dá)盒，由含有所述gRNA1的編碼基因的表達(dá)盒和含有所述gRNA2的編碼基因的表達(dá)盒組成；

P4、成套載體，由含有所述gRNA1的編碼基因的重組載體和含有所述gRNA2的編碼基因的重組載體組成；

P5、含有所述gRNA1的編碼基因和所述gRNA2的編碼基因的重組載體；

P6、敲除MC3R基因的成套試劑，由P1-P5中的任一種和下述P6a-P6c中的任一種組成：

P6a、Cas9的編碼基因；

P6b、含有Cas9的編碼基因的表達(dá)盒；

P6c、含有Cas9的編碼基因的表達(dá)載體；

P7、敲除MC3R基因的重組載體，含有所述gRNA1的編碼基因、所述gRNA2的編碼基因以及Cas9的編碼基因。

上述產(chǎn)品可用于MC3R基因敲除動(dòng)物細(xì)胞或動(dòng)物模型。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了制備MC3R基因敲除動(dòng)物模型的方法。

本發(fā)明所提供的制備MC3R基因敲除動(dòng)物模型的方法，包括：利用所述敲除動(dòng)物細(xì)胞中MC3R基因的方法制備敲除MC3R基因的動(dòng)物細(xì)胞，利用所述敲除MC3R基因的動(dòng)物細(xì)胞制備MC3R基因敲除動(dòng)物模型。

上述制備MC3R基因敲除動(dòng)物模型的方法中，所述動(dòng)物可為哺乳動(dòng)物。所述哺乳動(dòng)物可為豬。所述動(dòng)物細(xì)胞可為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞具體可為豬細(xì)胞。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了下述任一應(yīng)用：

X1、所述產(chǎn)品在敲除MC3R基因中的應(yīng)用；

X2、所述產(chǎn)品在制備MC3R基因敲除動(dòng)物模型中的應(yīng)用；

X3、所述產(chǎn)品在動(dòng)物育種中的應(yīng)用；

X4、所述敲除動(dòng)物細(xì)胞中MC3R基因的方法在制備MC3R基因敲除動(dòng)物模型中的應(yīng)用；

X5、所述敲除動(dòng)物細(xì)胞中MC3R基因的方法在動(dòng)物育種中的應(yīng)用。

上述應(yīng)用中，所述動(dòng)物可為哺乳動(dòng)物。所述哺乳動(dòng)物可為豬。

本發(fā)明中，所述豬細(xì)胞具體可為豬成纖維細(xì)胞，如豬胎兒成纖維細(xì)胞。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述豬胎兒成纖維細(xì)胞為中國(guó)實(shí)驗(yàn)用小型豬胎兒成纖維細(xì)胞。

本文采用新型基因組編輯技術(shù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)，在中國(guó)實(shí)驗(yàn)用小型豬(Chinese Experimental Mini pig,CEMP)MC3R基因上及其附近設(shè)計(jì)敲除靶位點(diǎn)，利用構(gòu)建好的MC3R基因敲除載體，通過(guò)電擊法轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細(xì)胞，篩選獲得MC3R基因敲除的豬成纖維細(xì)胞共72個(gè)克隆，其中MC3R敲除純合子克隆10個(gè)，雜合子克隆11個(gè)，敲除效率達(dá)到29.16％。用篩選得到的MC3R缺失細(xì)胞系，通過(guò)體細(xì)胞核移植獲得MC3R基因敲除豬1頭。并且本發(fā)明利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠快速高效的將目的基因大片段敲除，并且不留下外源基因片段。本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)快速高效的構(gòu)建了MC3R基因敲除豬模型，為研究MC3R基因的生理作用和分子機(jī)制提供了材料，通過(guò)觀察MC3R基因敲除豬的生理生化指標(biāo)，以及轉(zhuǎn)錄組分析等都可以更深入的研究MC3R基因的作用機(jī)制和機(jī)理。同時(shí)MC3R調(diào)控采食和能量分配，還可以評(píng)估其在豬分子育種中的價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1為中國(guó)實(shí)驗(yàn)用小型豬MC3R基因序列和GenBank中豬的MC3R基因序列比對(duì)結(jié)果。其中，Sus為GenBank中豬的MC3R基因序列，CEMP為中國(guó)實(shí)驗(yàn)用小型豬MC3R基因序列，Pr為氨基酸序列；箭頭表示基因起止方向。

圖2為豬胎兒成纖維細(xì)胞系。

圖3為綠色熒光觀察電擊轉(zhuǎn)染效率。

圖4為T(mén)7EN1酶切檢測(cè)靶點(diǎn)切割效率。①表示pX330-target1，②表示pX330-target2，③表示pX330-target3，④表示pX330-target4，━表示pX330。

圖5為MC3R基因敲除胎兒成纖維細(xì)胞系鑒定結(jié)果。其中，A與B為12CEPEF2♂PCR鑒定結(jié)果，C與D為H4♀PCR鑒定結(jié)果，A-D中，a為純合子，b為雜合子，1、2、3分別為陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和水；E為陽(yáng)性片段測(cè)序結(jié)果，E中下滑線為起始密碼子和終止密碼子。

圖6為MC3R基因敲除豬鑒定結(jié)果。其中，A為基因敲除豬PCR鑒定結(jié)果，1-4為陰性豬；B為19501的仔豬的PCR產(chǎn)物中的小片段與MC3R基因及其附近序列比對(duì)結(jié)果；C為19501的仔豬的PCR產(chǎn)物中的較大片段編碼的氨基酸序列與MC3R蛋白質(zhì)序列的比對(duì)結(jié)果，紅框標(biāo)注為翻譯終止位點(diǎn)。

圖7為出生50天的19501的仔豬。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。

下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中的peGFP載體為Addgene公司產(chǎn)品。

下述實(shí)施例中的pL425(Neo抗性)為Addgene公司產(chǎn)品。

實(shí)施例1、采用CRISPR/Cas9技術(shù)制備MC3R基因敲除細(xì)胞系和MC3R基因敲除豬

豬種不同可能導(dǎo)致MC3R基因序列的存在差異，為了為避免核苷酸序列差異引起切割效率下降，本發(fā)明首先對(duì)中國(guó)實(shí)驗(yàn)用小型豬MC3R基因組序列進(jìn)行了測(cè)定并與NCBI中的MC3R基因序列進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果表明，中國(guó)實(shí)驗(yàn)用小型豬(Chinese Experimental Mini pig,CEMP)MC3R基因序列和NCBI中GenBank的MC3R基因序列有7個(gè)單核苷酸差異，氨基酸序列無(wú)差異(圖1)。本申請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)了四個(gè)Cas9切割靶序列(靶序列1、靶序列2、靶序列3和靶序列4)對(duì)MC3R基因進(jìn)行敲除，具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：

一、表達(dá)載體構(gòu)建

所用骨架載體為pX330載體(Addgene產(chǎn)品)，gRNA表達(dá)載體具體構(gòu)建過(guò)程如下：

將表1中每個(gè)靶序列的兩條寡核苷酸片段稀釋到200mM后混合，退火形成雙鏈，連接到經(jīng)BbsI酶(NEB(USA)公司)酶切后得到的pX330骨架載體上，并測(cè)序驗(yàn)證得到序列正確的四個(gè)重組載體，將得到的含有靶序列1、靶序列2、靶序列3和靶序列4的重組載體分別命名為pX330-target1、pX330-target2、pX330-target3和pX330-target4，將pX330-target1表達(dá)的gRNA命名為gRNA1，將pX330-target2表達(dá)的gRNA命名為gRNA2。

表1、引物序列

二、原代細(xì)胞分離

將CEMP 30天胎豬從子宮中取出，超凈臺(tái)內(nèi)用鑷子剝?nèi)ヌヒ?，將胎豬在體積百分比濃度為75％的乙醇水溶液中洗去血塊，再用含有雙抗(青霉素和鏈霉素)的PBS清洗兩遍。取背部皮膚組織，剪成小碎塊后滴加少量FBS，均勻的鋪到T75培養(yǎng)瓶中，加入10％DMEM(含雙抗)培養(yǎng)基，37℃，5％CO₂倒置培養(yǎng)2小時(shí)。待組織塊貼壁后再反轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，正置培養(yǎng)3-4天(Svetlana,G.and A.L.Osterman,Cell Biology Protocols.John Wiley Professio,2007(2).)，即得到豬胎兒成纖維細(xì)胞系(圖2)，細(xì)胞呈放射狀生長(zhǎng)，形態(tài)細(xì)長(zhǎng)飽滿，表明細(xì)胞狀態(tài)較好，生長(zhǎng)旺盛。收集細(xì)胞并凍存。共得到兩種類型CEMP豬胎兒成纖維細(xì)胞系，即雌性和雄性，將雄性豬胎兒成纖維細(xì)胞系記為12CEPEF2，將雌性豬胎兒成纖維細(xì)胞系記為H4。

三、載體效率驗(yàn)證

通過(guò)電擊法將構(gòu)建好四個(gè)重組載體pX330-target1-4載體分別和peGFP載體共轉(zhuǎn)入步驟二得到的豬胎兒成纖維細(xì)胞(12CEPEF2)中，檢驗(yàn)各載體的靶點(diǎn)相對(duì)切割效率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

30小時(shí)后觀察，根據(jù)帶熒光信號(hào)細(xì)胞比例估算電擊轉(zhuǎn)染效率，用熒光倒置顯微鏡觀察帶熒光信號(hào)細(xì)胞的比例(圖3)，四種轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染效率均約有40％左右。

48小時(shí)后收集細(xì)胞，提取基因組，用引物(表2)XL1-F和XL1-R擴(kuò)增靶序列1和靶序列2，用引物XL2-F和XL2-R擴(kuò)增靶序列3和靶序列4。利用Surveyor法(錯(cuò)配酶法)——T7ENI酶(NEB(USA)公司)酶切驗(yàn)證，根據(jù)電泳圖中切割條帶(小片段)與未切割條帶(大片段)的亮度比例，推測(cè)各載體的靶點(diǎn)相對(duì)切割效率(圖4)(Peter Qiu,H.S.J.M.and A.G.F.Gerard,Mutation detection using Surveyor nuclease.BioTechniques,2004(36):p.702-707.)。

根據(jù)未切割的大片段條帶和切割后的小片段條帶亮度可知，四個(gè)重組載體均成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)靶點(diǎn)位置的切割，其中pX330-target2和pX330-target4切割效率最高，pX330-target1次之，pX330-target3最低?；谝陨蠑?shù)據(jù)，pX330-target1雖然切割效率略低于pX330-target2，但推測(cè)其與pX330-target4組合，能夠敲除MC3R基因的整個(gè)片段，令該基因功能完全喪失。所以，選用pX330-target1和與pX330-target4組合，構(gòu)建MC3R缺失細(xì)胞株。

表2、效率驗(yàn)證引物

四、MC3R基因敲除細(xì)胞系的獲得和分析

對(duì)步驟二得到的12CEPEF2和H4分別進(jìn)行MC3R基因敲除實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，具體步驟如下：

將豬胎兒成纖維細(xì)胞接種于到6孔板培養(yǎng)，待單孔細(xì)胞匯合度達(dá)到90％，進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)染(電轉(zhuǎn)儀型號(hào)Lonza AAD-1001S，電轉(zhuǎn)液longza VPI-1002，電轉(zhuǎn)參數(shù)A-024)，轉(zhuǎn)染的載體為pX330-target1(1μg)、pX330-target4(1μg)和以及帶有pL425(Neo抗性)(輔助篩選)(1μg)。電轉(zhuǎn)后分到15個(gè)10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，放入37℃，5％CO₂培養(yǎng)。在細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后(第二天)，開(kāi)始加G418進(jìn)行篩選，直到細(xì)胞大量死亡(約第5天)進(jìn)行換液。待克隆點(diǎn)長(zhǎng)大，挑取單克隆，傳代培養(yǎng)至48孔板，待48孔板細(xì)胞長(zhǎng)滿，提取細(xì)胞基因組用CX-F1和CX-R3組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果如圖5中A-D所示，所用引物序列如下：

CX-F1：atctctcaaggggtgtctcccg

CX-R3：tgttctcaggtgaccgcatgac

結(jié)果表明，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，在72個(gè)單克隆中，快速高效的獲得了MC3R基因敲除豬成纖維細(xì)胞陽(yáng)性克隆共21個(gè)，其中雄性12CEPEF2♂的純合子5個(gè)、雜合子4個(gè)；雌性H4♀的純合子6個(gè)、雜合子6個(gè)，陽(yáng)性克隆率(即MC3R基因的敲除效率)為29.16％。

將陽(yáng)性克隆的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有的陽(yáng)性克隆中的MC3R基因均有整個(gè)基因片段的缺失或部分片段的缺失(純合子的兩條染色體均缺失，雜合子的一條染色體缺失)，其中一個(gè)陽(yáng)性克隆的PCR產(chǎn)物序列與CEMP的MC3R基因極其附近的序列比對(duì)結(jié)果如圖5中E所示，該克隆為MC3R基因整個(gè)基因片段的缺失。

將陽(yáng)性克隆對(duì)應(yīng)的細(xì)胞進(jìn)行凍存，在體細(xì)胞核移植中將作為核供體細(xì)胞，用于構(gòu)建MC3R基因敲除豬模型。

五、體細(xì)胞核移植和胚胎移植以及克隆豬鑒定

采用徒手克隆策略(Polejaeva,I.A.,et al.,Cloned pigs produced by nuclear transfer from adult somatic cells.Nature,2000.407(6800):p.86-90.)，，通過(guò)體細(xì)胞核移植方法來(lái)構(gòu)建基因敲除豬。步驟如下：

以步驟四得到的MC3R基因敲除純合子細(xì)胞克隆與雜合子細(xì)胞克隆混合為核供體細(xì)胞，將核供體細(xì)胞生長(zhǎng)接觸抑制1-2d；采集CEMP卵母細(xì)胞并體外成熟培養(yǎng)，然后，在裝有顯微操作儀的倒置顯微鏡下去細(xì)胞核，然后與一個(gè)生長(zhǎng)接觸抑制1-2d的核供體細(xì)胞進(jìn)行重構(gòu)，制備重構(gòu)胚胎。再經(jīng)過(guò)融合和輔助激活后，將重構(gòu)胚胎放入PZM3培養(yǎng)基(Gibco(Grand Island，USA))中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為39℃、5％O₂、5％CO₂、90％N₂和飽和濕度。重構(gòu)胚胎培養(yǎng)12-48h后，進(jìn)行手術(shù)法胚胎移植CEMP，每頭受體豬移植重構(gòu)胚胎300—400枚，共移植8頭母豬。胚胎移植后第30天，對(duì)未返情的受體母豬進(jìn)行首次超聲波妊娠檢測(cè)。之后定期跟蹤胎兒發(fā)育情況，調(diào)整飼養(yǎng)管理，直至受體母豬分娩(Luo,Y.,et al.,High efficiency of BRCA1knockout using rAAV-mediated gene targeting:developing a pig model for breast cancer.Transgenic Research,2011.20(5):p.975-988.；衛(wèi)恒習(xí)等,胚胎移植方法和受體母豬因素對(duì)克隆豬生產(chǎn)效率的影響.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2012(15):第3147-3153頁(yè).)。母豬產(chǎn)仔后，取耳組織進(jìn)行利用CX-F1和CX-R3組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR和測(cè)序鑒定。

受體母豬懷孕114天，產(chǎn)仔六頭，其中一頭為畸形，畸形豬三天后死亡。仔豬鑒定結(jié)果如圖6中A，編號(hào)為19501的仔豬和畸形豬是陽(yáng)性豬，其余四頭為陰性豬。經(jīng)過(guò)PCR和測(cè)序分析可知，編號(hào)為19501的仔豬的PCR產(chǎn)物中，小片段中不含有MC3R基因的任何片段，較大片段經(jīng)過(guò)測(cè)序并將其翻譯為氨基酸序列可知，較大片段編碼的氨基酸序列與MC3R蛋白質(zhì)序列的相似性只有58.93％，并且提前終止翻譯(共編碼240個(gè)氨基酸)，使其沒(méi)有第6和第7跨膜結(jié)構(gòu)域，也能導(dǎo)致MC3R基因功能的喪失。由此得出編號(hào)為19501的仔豬為一頭MC3R基因功能缺失豬，出生50天的19501的仔豬如圖7所示?；呜i的PCR產(chǎn)物共有兩條帶，并且這兩條帶均小于野生型的CEMP的PCR產(chǎn)物，小片段中不含有MC3R基因的任何片段，較大片段缺失MC3R基因的部分片段，并且也導(dǎo)致了MC3R基因功能的喪失。而移植的這8頭母豬中的其他7頭豬，不是沒(méi)懷孕，就是流產(chǎn)了。