本發(fā)明涉及基因敲除技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種基因敲除選育wnt16基因缺失型斑馬魚的方法。

背景技術(shù)：

Wnt基因位于人類12q13，是編碼356個(gè)氨基酸的轉(zhuǎn)錄因子。一般認(rèn)為Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑分為經(jīng)典Wnt信號(hào)途徑和非經(jīng)典的Wnt信號(hào)途徑。經(jīng)典W nt信號(hào)途徑也稱為Wnt/p-catenin信號(hào)途徑。在不同物種中Wnt/p-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制具有極高的保守性。Wnt16是非經(jīng)典的wnt配體，一般認(rèn)為該基因介導(dǎo)β-catenin信號(hào)通路，可負(fù)調(diào)節(jié)RANK信號(hào)抑制破骨細(xì)胞的形成，參與骨形成和骨吸收等過(guò)程。通過(guò)基因差異表達(dá)譜分析和基因組關(guān)聯(lián)分析等，發(fā)現(xiàn)Wnt16基因是骨骼的一個(gè)重要的調(diào)節(jié)因子，與骨質(zhì)疏松密切相關(guān)。

斑馬魚與人類在骨骼發(fā)育過(guò)程中的基因、信號(hào)通路有高度同源性，且wnt16基因進(jìn)化上較為保守,在人類中，存在可變剪切體，wnt16基因有兩個(gè)亞型wnt16a和wnt16b。而且，與其他動(dòng)物模型相比，斑馬魚個(gè)體小、幼魚通體透明，利于骨骼發(fā)育的觀察。通過(guò)CRISPR/Cas9基因打靶技術(shù)，在斑馬魚wnt16基因上設(shè)計(jì)合適的打靶位點(diǎn)，將體外合成的特異性sgRNA(終濃度30ng/μL)和Cas9-mRNA(終濃度500ng/μL)顯微共注射進(jìn)斑馬魚一細(xì)胞內(nèi)，并通過(guò)活性檢測(cè)證實(shí)了所選位點(diǎn)的有效性?；虼虬屑夹g(shù)起源于20世紀(jì)80年代末，是一種通過(guò)對(duì)基因組進(jìn)行定點(diǎn)修飾來(lái)研究基因功能的重要的方法手段，也可用于治療人類的各種遺傳性疾病。該技術(shù)主要是利用缺失突變、基因滅活、染色體大片段刪除以及外源基因?qū)氲确绞絹?lái)改變生物的遺傳信息，并且在生殖系中穩(wěn)定遺傳后表達(dá)突變性狀，從而研究生物體內(nèi)特定基因在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的作用，所以這類技術(shù)手段已成為現(xiàn)代分子生物學(xué)研究熱點(diǎn)。傳統(tǒng)的基因打靶技術(shù)是建立在胚胎干細(xì)胞(ESC)和同源重組技術(shù)的基礎(chǔ)之上，故打靶技術(shù)效率極低。2013年初，一種全新的人工核酸內(nèi)切酶clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9，能更高效且更精確地在生物體基因組中沉默特定基因，且制作簡(jiǎn)單、成本低，且可同時(shí)對(duì)靶基因上多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行剪切，沉默任意數(shù)目的單個(gè)基因，但同時(shí)該技術(shù)存在一定的缺陷，其脫靶率相對(duì)較高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就在于為了解決上述問(wèn)題而提供一種基因敲除選育wnt16基因缺失型斑馬魚的方法。

本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)上述目的：

本發(fā)明包括以下步驟：

步驟一：CRISPR/Cas9基因敲除靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)

在GenBankTM、Ensembl或UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)上查詢斑馬魚wnt16基因的基因組DNA序列及其功能結(jié)構(gòu)域，根據(jù)CRISPR/Cas敲除原理，設(shè)計(jì)一對(duì)wnt16基因的靶位點(diǎn)，靶點(diǎn)的選擇必須遵循5’-20bp-NGG-3’標(biāo)準(zhǔn)：其中5’端的GG二核苷酸是T7啟動(dòng)子的一部分，設(shè)計(jì)靶位點(diǎn)時(shí)不受此限制，但是必須保證靶位點(diǎn)的3’端是NGG，靶點(diǎn)的選擇必須確保靶點(diǎn)位置堿基的插入或者缺失可以影響wnt16基因的整個(gè)結(jié)構(gòu)域，從而改變基因的表達(dá)，

兩對(duì)特異性PCR引物如下：

F1(靶位點(diǎn)a正向引物)：

tgTAATACGACTCACTATAgacacaagcctgttgggcagGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

F2(靶位點(diǎn)b正向引物)：

tgTAATACGACTCACTATAggcctcctcaccacgggtcgGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

R(共用的反向引物)：AAGCACCGACTCGGTGCCACT

步驟二：構(gòu)建gRNA表達(dá)載體以及gRNA體外合成：

首先將gRNA骨架克隆到p42250載體上，取1-2μL質(zhì)粒進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；

特異性gRNA體外合成：用BsaI限制性內(nèi)切酶線性化此質(zhì)粒，一般來(lái)說(shuō)，酶切反應(yīng)總體積為20μL，體系如下：

離心混勻后于37℃水浴，酶切4h以上，

以線性化的p42250載體為模板，通過(guò)下面特異性引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出用于特異性gRNA合成的雙鏈DNA，

>PCR引物

PCR引物上下游引物分別位于3號(hào)外顯子兩端的內(nèi)含子上：

F(5’-AGAAATCTCTCAGCCAAACACG-3’)

R(5’-ATACTGCGAACAATTCCTTGCT-3’)

正向引物F：T7啟動(dòng)子+20bp靶序列+gRNA上游序列

反向引物R：gRNA下游序列

PCR反應(yīng)體系(25μL)如下：

震蕩混勻之后，4℃離心，于PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃8min，(變性95℃30s，退火64℃30s，延伸72℃20s)30個(gè)循環(huán)，再72℃10min，待PCR擴(kuò)增完成后，取1μL樣品點(diǎn)樣于2.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，凝膠成像系統(tǒng)拍攝結(jié)果；

檢測(cè)確定條帶正確之后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠DNA回收，純化回收PCR產(chǎn)物，

測(cè)定純化之后的DNA濃度(盡量達(dá)到1μg)，再以此DNA為模板，用20μL體系進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，合成特異性gRNA，轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)中所用Tip頭，EP管均為DEPC處理過(guò)的RNase-Free產(chǎn)品，具體操作如下：

體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系(20μL)：

將反應(yīng)物都加入1.5mL RNase-Free的EP管中，混勻之后，于37℃水浴1.5h；

水浴結(jié)束后，取1μL樣品，用配制好的2.0％的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，以檢測(cè)轉(zhuǎn)錄結(jié)果，若轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物大小與預(yù)期的相符，則說(shuō)明轉(zhuǎn)錄成功；

向轉(zhuǎn)錄體系中加入1μL DNA酶，放置于37℃水浴鍋中反應(yīng)20min，用以消化DNA模板，再取1μL轉(zhuǎn)錄終產(chǎn)物，即gRNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以檢測(cè)轉(zhuǎn)錄效率，

特異性gRNA的純化：

用RNeasy Mini kit試劑盒純化轉(zhuǎn)錄成功的gRNA，保存于-20℃，吸取1μL溶液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以檢驗(yàn)純化產(chǎn)物，并測(cè)定純化之后的gRNA濃度，

步驟三：斑馬魚胚胎的顯微注射：

盡量在受精后30min之內(nèi)，用吸管吸取胚胎轉(zhuǎn)移至用瓊脂糖制作的顯微注射專用培養(yǎng)皿中，

在進(jìn)行顯微注射之前，將Cas9mRNA和gRNA配成混合液，充分混勻，使Cas9mRNA的終濃度為500ng/μL，gRNA的終濃度為30ng/μL，注射約1.8nL Cas9mRNA和gRNA混合液于0-1個(gè)細(xì)胞水平的受精卵內(nèi)，注射過(guò)的受精卵放置于E3水(5mmol/L NaCl，0.33mmol/L CaCl2，0.33mmol/L MgSO4，0.17mmol/L KCl，)中，28℃孵化，在體式顯微鏡下觀察胚胎表型，篩選正常發(fā)育的胚胎用于靶位點(diǎn)突變分析，

顯微注射體系如下：

步驟四：T7E1法和Sanger測(cè)序檢測(cè)靶位點(diǎn)的有效性：

對(duì)斑馬魚胚胎進(jìn)行顯微注射之后，挑選部分發(fā)育正常的早期胚胎，檢測(cè)其wnt16基因是否存在突變，可以提前確認(rèn)此次選擇的靶位點(diǎn)是否有效果，顯微注射操作是否規(guī)范；

步驟五：注射兩個(gè)月之后，進(jìn)行剪尾鑒定，同上鑒定步驟，

步驟六：目的序列的TA克隆

T7E1酶切初步鑒定有突變可能的目的序列再進(jìn)行Sanger測(cè)序，若測(cè)序峰圖有雙峰，并且測(cè)序結(jié)果顯示有插入或缺失現(xiàn)象的目的序列，接下來(lái)進(jìn)行TA克隆之后挑取單克隆作進(jìn)一步檢測(cè)；

步驟七：質(zhì)粒的Sanger測(cè)序：

將雙酶切檢測(cè)結(jié)果顯示條帶大小符合預(yù)期結(jié)果的質(zhì)粒送往測(cè)序，根據(jù)測(cè)序之后給出的峰圖和序列，在NCBI上與標(biāo)準(zhǔn)目的序列進(jìn)行對(duì)比，根據(jù)比對(duì)結(jié)果，分析出每個(gè)單克隆的突變類型，

步驟八：獲得可遺傳的斑馬魚突變體的F1代：

通過(guò)前面一系列篩選確定了斑馬魚突變體F0代，緊接著將F0代突變體分別與野生型斑馬魚雜交得到F1代胚胎，置于28℃培養(yǎng)，在初期觀察F1代的存活率，受精三天后，每個(gè)突變體F1代分別取10個(gè)胚胎進(jìn)行突變遺傳性鑒定，將每個(gè)胚胎單獨(dú)提取基因組，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增出700bp的靶位點(diǎn)附近區(qū)域，再進(jìn)行T7E1酶切分析并送部分去測(cè)序，確定此突變是否可以遺傳到F1代，

如果從F1代胚胎中檢測(cè)到存在突變，則將斑馬魚突變體的F1代養(yǎng)大至2-3個(gè)月，再分別對(duì)每條F1代斑馬魚成魚進(jìn)行剪尾，篩選F1代突變體(具體方法如前面所述)，

步驟九：獲得斑馬魚突變體的F2代純合子

從F1代突變體中挑選相同突變的雌魚和雄魚，雜交得到F2代，放置于28℃培養(yǎng)，受精三天后取部分胚胎進(jìn)行鑒定，將每個(gè)胚胎單獨(dú)提取基因組，PCR擴(kuò)增純化后通過(guò)BglⅠ限制性酶切分析并測(cè)序，初步檢驗(yàn)是否可以得到wnt16突變體純合子，如檢驗(yàn)結(jié)果證明存在純合子，則養(yǎng)大后再單條剪尾鑒定。

所述步驟四中，檢測(cè)其wnt16基因是否存在突變的方法如下：

(1)提取斑馬魚基因組

斑馬魚胚胎受精50小時(shí)后(50hpf)，分別收集總數(shù)1/3野生型(做對(duì)照)和注射后胚胎于1.5mL Ep管中(每管5只胚胎)，按照下述方法提取基因組DNA，具體步驟如下：

用移液槍將EP管中多余的水吸盡，向裝有胚胎的Ep管中加入400μL細(xì)胞裂解液，2μL蛋白酶K，放置于55℃水浴鍋中裂解4小時(shí)(期間每隔半小時(shí)，輕輕顛倒混勻，以保證胚胎被充分裂解完全)；

裂解完成后，放在振蕩器上充分震蕩，加入等體積(400μL)異丙醇(預(yù)先冷卻)于Ep管中，充分顛倒混勻，于4℃條件下，13000rpm離心10min，倒掉上清液；

加入75％乙醇500μL，于4℃條件下，13000rpm離心5min，棄上清液；

然后進(jìn)行空甩，13000rpm離心1min，用移液槍小心吸取多余液體，室溫干燥10-15min或烘箱干燥5min；

加入35μL去離子水，充分吹打混勻，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取效率，放4℃冰箱保存，

(2)PCR擴(kuò)增目的序列

提取基因組DNA之后，根據(jù)CRISPR靶位點(diǎn)上下游約150-200bp的基因組區(qū)域，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物序列以擴(kuò)增出目的DNA片段，

PCR反應(yīng)體系(50μL)如下：

震蕩混勻之后，4℃離心，于PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為：預(yù)變性94℃2min，(變性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃23s)30個(gè)循環(huán)，再72℃2min，待反應(yīng)結(jié)束后，離心PCR產(chǎn)物，取1μL樣品點(diǎn)樣于2.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，檢測(cè)PCR產(chǎn)物大小是否正確，

(3)若PCR產(chǎn)物正確，則用2.0％瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，在紫外下切下目的條帶，進(jìn)行純化回收，

(4)T7核酸內(nèi)切酶I(T7E1)法

用T7E1分析檢測(cè)是否存在突變，首先，取純化回收之后的DNA 15μL裝于200μL的Ep管中，置于95℃熱水中進(jìn)行變性，然后自然冷卻至室溫(至少30min)，再取變性之后的DNA進(jìn)行T7E1酶切，體系如下：

混勻體系后，于37℃水浴鍋中酶切反應(yīng)30min，再用2％的凝膠進(jìn)行電泳，以檢測(cè)目的DNA片段是否被切開(kāi)，如若目的DNA片段下面有被切開(kāi)的條帶，則使用ImageJ軟件，通過(guò)酶切后條帶的亮度來(lái)估計(jì)非同源末端連接的頻率，

另外，送部分純化之后的目的DNA片段進(jìn)行Sanger測(cè)序，由測(cè)序的峰圖來(lái)初步獲得插入或缺失的信息。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明是一種基因敲除選育wnt16基因缺失型斑馬魚的方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明能更高效且更精確地在生物體基因組中沉默特定基因，且制作簡(jiǎn)單、成本低，且可同時(shí)對(duì)靶基因上多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行剪切，沉默任意數(shù)目的單個(gè)基因。用于進(jìn)行基因與骨骼發(fā)育的相關(guān)研究，也可進(jìn)項(xiàng)其他方面探索研究，檢測(cè)wnt16基因的缺失與其他器官的發(fā)育是否具有相關(guān)性，例如心臟具有很好的醫(yī)學(xué)研究?jī)r(jià)值，同時(shí)敲除wnt16基因的斑馬魚其成長(zhǎng)周期明顯縮短，也具有很好的商業(yè)價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1是CRISPR/Cas9打靶系統(tǒng)的原理圖；

圖2是wnt16基因上靶位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)圖；

圖3是缺失型和WT基因型系列反向?qū)Ρ葓D；

圖4是靶位點(diǎn)附近缺失對(duì)比圖；

圖5是21號(hào)魚F1代突變體二級(jí)結(jié)構(gòu)改變的預(yù)測(cè)圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明：

包括以下步驟：

步驟一：CRISPR/Cas9基因敲除靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)

在GenBankTM、Ensembl或UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)上查詢斑馬魚wnt16基因的基因組DNA序列及其功能結(jié)構(gòu)域，根據(jù)CRISPR/Cas敲除原理，設(shè)計(jì)一對(duì)wnt16基因的靶位點(diǎn)，靶點(diǎn)的選擇必須遵循5’-20bp-NGG-3’標(biāo)準(zhǔn)：其中5’端的GG二核苷酸是T7啟動(dòng)子的一部分，設(shè)計(jì)靶位點(diǎn)時(shí)不受此限制，但是必須保證靶位點(diǎn)的3’端是NGG，靶點(diǎn)的選擇必須確保靶點(diǎn)位置堿基的插入或者缺失可以影響wnt16基因的整個(gè)結(jié)構(gòu)域，從而改變基因的表達(dá)，

兩對(duì)特異性PCR引物如下：

F1(靶位點(diǎn)a正向引物)：

tgTAATACGACTCACTATAgacacaagcctgttgggcagGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

F2(靶位點(diǎn)b正向引物)：

tgTAATACGACTCACTATAggcctcctcaccacgggtcgGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

R(共用的反向引物)：AAGCACCGACTCGGTGCCACT

步驟二：構(gòu)建gRNA表達(dá)載體以及gRNA體外合成：

首先將gRNA骨架克隆到p42250載體上，取1-2μL質(zhì)粒進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；

特異性gRNA體外合成：用BsaI限制性內(nèi)切酶線性化此質(zhì)粒，一般來(lái)說(shuō)，酶切反應(yīng)總體積為20μL，體系如下：

離心混勻后于37℃水浴，酶切4h以上，

以線性化的p42250載體為模板，通過(guò)下面特異性引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出用于特異性gRNA合成的雙鏈DNA，

>PCR引物

PCR引物上下游引物分別位于3號(hào)外顯子兩端的內(nèi)含子上：

F(5’-AGAAATCTCTCAGCCAAACACG-3’)

R(5’-ATACTGCGAACAATTCCTTGCT-3’)

正向引物F：T7啟動(dòng)子+20bp靶序列+gRNA上游序列

反向引物R：gRNA下游序列

PCR反應(yīng)體系(25μL)如下：

震蕩混勻之后，4℃離心，于PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃8min，(變性95℃30s，退火64℃30s，延伸72℃20s)30個(gè)循環(huán)，再72℃10min，待PCR擴(kuò)增完成后，取1μL樣品點(diǎn)樣于2.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，凝膠成像系統(tǒng)拍攝結(jié)果；

檢測(cè)確定條帶正確之后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠DNA回收，純化回收PCR產(chǎn)物，

測(cè)定純化之后的DNA濃度(盡量達(dá)到1μg)，再以此DNA為模板，用20μL體系進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，合成特異性gRNA，轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)中所用Tip頭，EP管均為DEPC處理過(guò)的RNase-Free產(chǎn)品，具體操作如下：

體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系(20μL)：

將反應(yīng)物都加入1.5mL RNase-Free的EP管中，混勻之后，于37℃水浴1.5h；

水浴結(jié)束后，取1μL樣品，用配制好的2.0％的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，以檢測(cè)轉(zhuǎn)錄結(jié)果，若轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物大小與預(yù)期的相符，則說(shuō)明轉(zhuǎn)錄成功；

向轉(zhuǎn)錄體系中加入1μL DNA酶，放置于37℃水浴鍋中反應(yīng)20min，用以消化DNA模板，再取1μL轉(zhuǎn)錄終產(chǎn)物，即gRNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以檢測(cè)轉(zhuǎn)錄效率，

特異性gRNA的純化：

用RNeasy Mini kit試劑盒純化轉(zhuǎn)錄成功的gRNA，保存于-20℃，吸取1μL溶液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以檢驗(yàn)純化產(chǎn)物，并測(cè)定純化之后的gRNA濃度，

步驟三：斑馬魚胚胎的顯微注射：

盡量在受精后30min之內(nèi)，用吸管吸取胚胎轉(zhuǎn)移至用瓊脂糖制作的顯微注射專用培養(yǎng)皿中，

在進(jìn)行顯微注射之前，將Cas9mRNA和gRNA配成混合液，充分混勻，使Cas9mRNA的終濃度為500ng/μL，gRNA的終濃度為30ng/μL，注射約1.8nL Cas9mRNA和gRNA混合液于0-1個(gè)細(xì)胞水平的受精卵內(nèi)，注射過(guò)的受精卵放置于E3水(5mmol/L NaCl，0.33mmol/L CaCl2，0.33mmol/L MgSO4，0.17mmol/L KCl，)中，28℃孵化，在體式顯微鏡下觀察胚胎表型，篩選正常發(fā)育的胚胎用于靶位點(diǎn)突變分析，

顯微注射體系如下：

步驟四：T7E1法和Sanger測(cè)序檢測(cè)靶位點(diǎn)的有效性：

對(duì)斑馬魚胚胎進(jìn)行顯微注射之后，挑選部分發(fā)育正常的早期胚胎，檢測(cè)其wnt16基因是否存在突變，可以提前確認(rèn)此次選擇的靶位點(diǎn)是否有效果，顯微注射操作是否規(guī)范；

步驟五：注射兩個(gè)月之后，進(jìn)行剪尾鑒定，同上鑒定步驟，

步驟六：目的序列的TA克隆

T7E1酶切初步鑒定有突變可能的目的序列再進(jìn)行Sanger測(cè)序，若測(cè)序峰圖有雙峰，并且測(cè)序結(jié)果顯示有插入或缺失現(xiàn)象的目的序列，接下來(lái)進(jìn)行TA克隆之后挑取單克隆作進(jìn)一步檢測(cè)；

步驟七：質(zhì)粒的Sanger測(cè)序：

將雙酶切檢測(cè)結(jié)果顯示條帶大小符合預(yù)期結(jié)果的質(zhì)粒送往測(cè)序，根據(jù)測(cè)序之后給出的峰圖和序列，在NCBI上與標(biāo)準(zhǔn)目的序列進(jìn)行對(duì)比，根據(jù)比對(duì)結(jié)果，分析出每個(gè)單克隆的突變類型，

步驟八：獲得可遺傳的斑馬魚突變體的F1代：

通過(guò)前面一系列篩選確定了斑馬魚突變體F0代，緊接著將F0代突變體分別與野生型斑馬魚雜交得到F1代胚胎，置于28℃培養(yǎng)，在初期觀察F1代的存活率，受精三天后，每個(gè)突變體F1代分別取10個(gè)胚胎進(jìn)行突變遺傳性鑒定，將每個(gè)胚胎單獨(dú)提取基因組，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增出700bp的靶位點(diǎn)附近區(qū)域，再進(jìn)行T7E1酶切分析并送部分去測(cè)序，確定此突變是否可以遺傳到F1代，

如果從F1代胚胎中檢測(cè)到存在突變，則將斑馬魚突變體的F1代養(yǎng)大至2-3個(gè)月，再分別對(duì)每條F1代斑馬魚成魚進(jìn)行剪尾，篩選F1代突變體(具體方法如前面所述)，

步驟九：獲得斑馬魚突變體的F2代純合子

從F1代突變體中挑選相同突變的雌魚和雄魚，雜交得到F2代，放置于28℃培養(yǎng)，受精三天后取部分胚胎進(jìn)行鑒定，將每個(gè)胚胎單獨(dú)提取基因組，PCR擴(kuò)增純化后通過(guò)BglⅠ限制性酶切分析并測(cè)序，初步檢驗(yàn)是否可以得到wnt16突變體純合子，如檢驗(yàn)結(jié)果證明存在純合子，則養(yǎng)大后再單條剪尾鑒定。

2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因敲除選育wnt16基因缺失型斑馬魚的方法，其特征在于：所述步驟四中，檢測(cè)其wnt16基因是否存在突變的方法如下：

提取斑馬魚基因組：

斑馬魚胚胎受精50小時(shí)后(50hpf)，分別收集總數(shù)1/3野生型(做對(duì)照)和注射后胚胎于1.5mL Ep管中(每管5只胚胎)，按照下述方法提取基因組DNA，具體步驟如下：

用移液槍將EP管中多余的水吸盡，向裝有胚胎的Ep管中加入400μL細(xì)胞裂解液，2μL蛋白酶K，放置于55℃水浴鍋中裂解4小時(shí)(期間每隔半小時(shí)，輕輕顛倒混勻，以保證胚胎被充分裂解完全)；

裂解完成后，放在振蕩器上充分震蕩，加入等體積(400μL)異丙醇(預(yù)先冷卻)于Ep管中，充分顛倒混勻，于4℃條件下，13000rpm離心10min，倒掉上清液；

加入75％乙醇500μL，于4℃條件下，13000rpm離心5min，棄上清液；

然后進(jìn)行空甩，13000rpm離心1min，用移液槍小心吸取多余液體，室溫干燥10-15min或烘箱干燥5min；

加入35μL去離子水，充分吹打混勻，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取效率，放4℃冰箱保存，

PCR擴(kuò)增目的序列：

提取基因組DNA之后，根據(jù)CRISPR靶位點(diǎn)上下游約150-200bp的基因組區(qū)域，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物序列以擴(kuò)增出目的DNA片段，

PCR反應(yīng)體系(50μL)如下：

震蕩混勻之后，4℃離心，于PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為：預(yù)變性94℃2min，(變性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃23s)30個(gè)循環(huán)，再72℃2min，待反應(yīng)結(jié)束后，離心PCR產(chǎn)物，取1μL樣品點(diǎn)樣于2.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，檢測(cè)PCR產(chǎn)物大小是否正確，

若PCR產(chǎn)物正確，則用2.0％瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，在紫外下切下目的條帶，進(jìn)行純化回收，

T7核酸內(nèi)切酶I(T7E1)法：

用T7E1分析檢測(cè)是否存在突變，首先，取純化回收之后的DNA 15μL裝于200μL的Ep管中，置于95℃熱水中進(jìn)行變性，然后自然冷卻至室溫(至少30min)，再取變性之后的DNA進(jìn)行T7E1酶切，體系如下：

混勻體系后，于37℃水浴鍋中酶切反應(yīng)30min，再用2％的凝膠進(jìn)行電泳，以檢測(cè)目的DNA片段是否被切開(kāi)，如若目的DNA片段下面有被切開(kāi)的條帶，則使用ImageJ軟件，通過(guò)酶切后條帶的亮度來(lái)估計(jì)非同源末端連接的頻率，

另外，送部分純化之后的目的DNA片段進(jìn)行Sanger測(cè)序，由測(cè)序的峰圖來(lái)初步獲得插入或缺失的信息。

由于篩選到的21號(hào)突變體的F1代的wnt16基因部分堿基缺失沒(méi)有造成整個(gè)基因的移碼突變，不能完全改變斑馬魚wnt16基因的表達(dá)。接下來(lái)，利用蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件Phyre對(duì)篩選到的F1代突變體Wnt16的結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖1、圖2和圖3所示，是野生型斑馬魚和21號(hào)斑馬魚F1代突變體的wnt16蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)的對(duì)比結(jié)果，顯示wnt16的某些保守結(jié)構(gòu)域處有改變(圖中用圓圈標(biāo)識(shí))。將堿基系列翻譯成氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)僅改變部分氨基酸沒(méi)有造成移碼，在整個(gè)WNT16蛋白上突變區(qū)域位于第146-182氨基酸，wnt16基因所編碼的蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。結(jié)果說(shuō)明所篩選到的21號(hào)斑馬魚的F1代整個(gè)wnt16結(jié)構(gòu)域有可能改變，可能會(huì)影響斑馬魚的骨骼生長(zhǎng)機(jī)制

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征及本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書中描述的只是說(shuō)明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。