技術(shù)特征：

1.一種基因敲除選育wnt16基因缺失型斑馬魚的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一：CRISPR/Cas9基因敲除靶位點設(shè)計

在GenBankTM、Ensembl或UCSC數(shù)據(jù)庫上查詢斑馬魚wnt16基因的基因組DNA序列及其功能結(jié)構(gòu)域，根據(jù)CRISPR/Cas敲除原理，設(shè)計一對wnt16基因的靶位點，靶點的選擇必須遵循5’-20bp-NGG-3’標(biāo)準(zhǔn)：其中5’端的GG二核苷酸是T7啟動子的一部分，設(shè)計靶位點時不受此限制，但是必須保證靶位點的3’端是NGG，靶點的選擇必須確保靶點位置堿基的插入或者缺失可以影響wnt16基因的整個結(jié)構(gòu)域，從而改變基因的表達(dá)，

兩對特異性PCR引物如下：

F1(靶位點a正向引物)：

tgTAATACGACTCACTATAgacacaagcctgttgggcagGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

F2(靶位點b正向引物)：

tgTAATACGACTCACTATAggcctcctcaccacgggtcgGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

R(共用的反向引物)：AAGCACCGACTCGGTGCCACT

步驟二：構(gòu)建gRNA表達(dá)載體以及gRNA體外合成：

首先將gRNA骨架克隆到p42250載體上，取1-2μL質(zhì)粒進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測；

特異性gRNA體外合成：用BsaI限制性內(nèi)切酶線性化此質(zhì)粒，一般來說，酶切反應(yīng)總體積為20μL，體系如下：

離心混勻后于37℃水浴，酶切4h以上，

以線性化的p42250載體為模板，通過下面特異性引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出用于特異性gRNA合成的雙鏈DNA，

>PCR引物

PCR引物上下游引物分別位于3號外顯子兩端的內(nèi)含子上：

F(5’-AGAAATCTCTCAGCCAAACACG-3’)

R(5’-ATACTGCGAACAATTCCTTGCT-3’)

正向引物F：T7啟動子+20bp靶序列+gRNA上游序列

反向引物R：gRNA下游序列

PCR反應(yīng)體系(25μL)如下：

震蕩混勻之后，4℃離心，于PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃8min，(變性95℃30s，退火64℃30s，延伸72℃20s)30個循環(huán)，再72℃10min，待PCR擴(kuò)增完成后，取1μL樣品點樣于2.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，凝膠成像系統(tǒng)拍攝結(jié)果；

檢測確定條帶正確之后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠DNA回收，純化回收PCR產(chǎn)物，

測定純化之后的DNA濃度(盡量達(dá)到1μg)，再以此DNA為模板，用20μL體系進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，合成特異性gRNA，轉(zhuǎn)錄實驗中所用Tip頭，EP管均為DEPC處理過的RNase-Free產(chǎn)品，具體操作如下：

體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系(20μL)：

將反應(yīng)物都加入1.5mL RNase-Free的EP管中，混勻之后，于37℃水浴1.5h；

水浴結(jié)束后，取1μL樣品，用配制好的2.0％的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，以檢測轉(zhuǎn)錄結(jié)果，若轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物大小與預(yù)期的相符，則說明轉(zhuǎn)錄成功；

向轉(zhuǎn)錄體系中加入1μL DNA酶，放置于37℃水浴鍋中反應(yīng)20min，用以消化DNA模板，再取1μL轉(zhuǎn)錄終產(chǎn)物，即gRNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以檢測轉(zhuǎn)錄效率，

特異性gRNA的純化：

用RNeasy Mini kit試劑盒純化轉(zhuǎn)錄成功的gRNA，保存于-20℃，吸取1μL溶液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以檢驗純化產(chǎn)物，并測定純化之后的gRNA濃度，

步驟三：斑馬魚胚胎的顯微注射：

盡量在受精后30min之內(nèi)，用吸管吸取胚胎轉(zhuǎn)移至用瓊脂糖制作的顯微注射專用培養(yǎng)皿中，

在進(jìn)行顯微注射之前，將Cas9mRNA和gRNA配成混合液，充分混勻，使Cas9mRNA的終濃度為500ng/μL，gRNA的終濃度為30ng/μL，注射約1.8nL Cas9mRNA和gRNA混合液于0-1個細(xì)胞水平的受精卵內(nèi)，注射過的受精卵放置于E3水(5mmol/L NaCl，0.33mmol/L CaCl2，0.33mmol/L MgSO4，0.17mmol/L KCl，)中，28℃孵化，在體式顯微鏡下觀察胚胎表型，篩選正常發(fā)育的胚胎用于靶位點突變分析，

顯微注射體系如下：

步驟四：T7E1法和Sanger測序檢測靶位點的有效性：

對斑馬魚胚胎進(jìn)行顯微注射之后，挑選部分發(fā)育正常的早期胚胎，檢測其wnt16基因是否存在突變，可以提前確認(rèn)此次選擇的靶位點是否有效果，顯微注射操作是否規(guī)范；

步驟五：注射兩個月之后，進(jìn)行剪尾鑒定，同上鑒定步驟，

步驟六：目的序列的TA克隆

T7E1酶切初步鑒定有突變可能的目的序列再進(jìn)行Sanger測序，若測序峰圖有雙峰，并且測序結(jié)果顯示有插入或缺失現(xiàn)象的目的序列，接下來進(jìn)行TA克隆之后挑取單克隆作進(jìn)一步檢測；

步驟七：質(zhì)粒的Sanger測序：

將雙酶切檢測結(jié)果顯示條帶大小符合預(yù)期結(jié)果的質(zhì)粒送往測序，根據(jù)測序之后給出的峰圖和序列，在NCBI上與標(biāo)準(zhǔn)目的序列進(jìn)行對比，根據(jù)比對結(jié)果，分析出每個單克隆的突變類型，

步驟八：獲得可遺傳的斑馬魚突變體的F1代：

通過前面一系列篩選確定了斑馬魚突變體F0代，緊接著將F0代突變體分別與野生型斑馬魚雜交得到F1代胚胎，置于28℃培養(yǎng)，在初期觀察F1代的存活率，受精三天后，每個突變體F1代分別取10個胚胎進(jìn)行突變遺傳性鑒定，將每個胚胎單獨提取基因組，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增出700bp的靶位點附近區(qū)域，再進(jìn)行T7E1酶切分析并送部分去測序，確定此突變是否可以遺傳到F1代，

如果從F1代胚胎中檢測到存在突變，則將斑馬魚突變體的F1代養(yǎng)大至2-3個月，再分別對每條F1代斑馬魚成魚進(jìn)行剪尾，篩選F1代突變體(具體方法如前面所述)，

步驟九：獲得斑馬魚突變體的F2代純合子

從F1代突變體中挑選相同突變的雌魚和雄魚，雜交得到F2代，放置于28℃培養(yǎng)，受精三天后取部分胚胎進(jìn)行鑒定，將每個胚胎單獨提取基因組，PCR擴(kuò)增純化后通過Bgl Ⅰ限制性酶切分析并測序，初步檢驗是否可以得到wnt16突變體純合子，如檢驗結(jié)果證明存在純合子，則養(yǎng)大后再單條剪尾鑒定。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因敲除選育wnt16基因缺失型斑馬魚的方法，其特征在于：所述步驟四中，檢測其wnt16基因是否存在突變的方法如下：

(1)提取斑馬魚基因組

斑馬魚胚胎受精50小時后(50hpf)，分別收集總數(shù)1/3野生型(做對照)和注射后胚胎于1.5mL Ep管中(每管5只胚胎)，按照下述方法提取基因組DNA，具體步驟如下：

用移液槍將EP管中多余的水吸盡，向裝有胚胎的Ep管中加入400μL細(xì)胞裂解液，2μL蛋白酶K，放置于55℃水浴鍋中裂解4小時(期間每隔半小時，輕輕顛倒混勻，以保證胚胎被充分裂解完全)；

裂解完成后，放在振蕩器上充分震蕩，加入等體積(400μL)異丙醇(預(yù)先冷卻)于Ep管中，充分顛倒混勻，于4℃條件下，13000rpm離心10min，倒掉上清液；

加入75％乙醇500μL，于4℃條件下，13000rpm離心5min，棄上清液；

然后進(jìn)行空甩，13000rpm離心1min，用移液槍小心吸取多余液體，室溫干燥10-15min或烘箱干燥5min；

加入35μL去離子水，充分吹打混勻，瓊脂糖凝膠電泳檢測提取效率，放4℃冰箱保存，

(2)PCR擴(kuò)增目的序列

提取基因組DNA之后，根據(jù)CRISPR靶位點上下游約150-200bp的基因組區(qū)域，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物序列以擴(kuò)增出目的DNA片段，

PCR反應(yīng)體系(50μL)如下：

震蕩混勻之后，4℃離心，于PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為：預(yù)變性94℃2min，(變性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃23s)30個循環(huán)，再72℃2min，待反應(yīng)結(jié)束后，離心PCR產(chǎn)物，取1μL樣品點樣于2.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，檢測PCR產(chǎn)物大小是否正確，

(3)若PCR產(chǎn)物正確，則用2.0％瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，在紫外下切下目的條帶，進(jìn)行純化回收，

(4)T7核酸內(nèi)切酶I(T7E1)法

用T7E1分析檢測是否存在突變，首先，取純化回收之后的DNA 15μL裝于200μL的Ep管中，置于95℃熱水中進(jìn)行變性，然后自然冷卻至室溫(至少30min)，再取變性之后的DNA進(jìn)行T7E1酶切，體系如下：

混勻體系后，于37℃水浴鍋中酶切反應(yīng)30min，再用2％的凝膠進(jìn)行電泳，以檢測目的DNA片段是否被切開，如若目的DNA片段下面有被切開的條帶，則使用ImageJ軟件，通過酶切后條帶的亮度來估計非同源末端連接的頻率，

另外，送部分純化之后的目的DNA片段進(jìn)行Sanger測序，由測序的峰圖來初步獲得插入或缺失的信息。