本發(fā)明涉及魚類的分子育種領(lǐng)域，特別是涉及一種利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除魚類MC4R基因的育種方法。

背景技術(shù)：

黑素皮質(zhì)素受體4(Melanocortin 4receptor，MC4R)屬于G-蛋白偶聯(lián)受體的家族，是下丘腦腹內(nèi)側(cè)核分泌的一類肽類物質(zhì)，在調(diào)節(jié)能量動態(tài)平衡和肥胖癥發(fā)生上具有重要作用。早在1997年，Huszar等通過對敲除MC4R基因的小鼠進行研究，發(fā)現(xiàn)敲除MC4R基因的小鼠出現(xiàn)遺傳性肥胖，表現(xiàn)出多食、胰島素分泌過多、肥胖等癥狀(Huszar D,Lynch C A,Fairchild-Huntress V,et al.Cell,1997,88(1):131-141.)。近年來一系列的研究結(jié)果表明，MC4R基因突變或多態(tài)性對動物生長性能有顯著的影響。2009年，過表達抑制MC4R活性的AGRP，美國黑鱸表現(xiàn)出了攝食增加和體型變長的表征(Sanchez E,Rubio V C,Thompson D,et al.AJP:Regulatory,Integrative and Comparative Physiology,2009,296(5):R1293-R1306.)。2010年，Lampert發(fā)現(xiàn)MC4R的突變會引起硬骨魚類生長速度增快，體型增大(Lampert K P,Schmidt C,Fischer P,et al.Curr Biol,2010,20(19):1729-1734.)。但是，目前還沒有研究報道在魚類中敲除MC4R基因是否能夠用于提高水產(chǎn)動物的生長育種速度。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點，本發(fā)明的目的在于提供一種利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除魚類MC4R基因的育種方法，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中魚類水產(chǎn)動物的生長速度較慢等問題。

為實現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明第一方面提供一種利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除魚類MC4R基因的育種方法，包括如下步驟：

1)MC4R基因打靶位點的確定：選擇MC4R基因打靶位點序列；

2)gRNA的制備：設(shè)計含有MC4R基因打靶位點序列的上游引物以及與其匹配的下游引物，通過體外轉(zhuǎn)錄得到gRNA；

3)體外顯微注射：魚產(chǎn)卵后，收集受精卵，將gRNA和Cas9RNA注射進入魚的受精卵，對注射的受精卵進行孵化培育；

4)MC4R基因敲除魚的篩選：通過剪尾檢測選出步驟3)中MC4R基因敲除陽性的魚，這類魚具有比野生魚更快的生長速度。

進一步地，步驟1)中，所述MC4R基因打靶位點序列如SEQ ID NO.1所示。

進一步地，步驟2)中，上游引物序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物序列如SEQ ID NO.3所示。

進一步地，步驟2)中，以含有g(shù)RNA骨架的質(zhì)粒為模板進行體外轉(zhuǎn)錄，質(zhì)粒序列如SEQ ID NO.4所示，通過RNA體外轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄為gRNA。

進一步地，步驟2)中，通過PCR擴增gRNA的DNA序列，PCR反應(yīng)程序為：98℃5min；98℃10s，58℃30s，72℃20s共35個循環(huán)，72℃5min。

更進一步地，步驟2)中，以純化后的產(chǎn)物為模板進行體外轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄體系為20μl，其中純化后的產(chǎn)物600ng、T7轉(zhuǎn)錄酶1μl、反應(yīng)緩沖液2μl、NTP混合物1μl、余量為無菌水，37℃孵育3h，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，通過RNA純化試劑盒純化回收，-80℃保存。

進一步地，步驟3)中，注射體系的總體積10μl，包括cas9RNA 300ng/μl、gRNA 30ng/μl、酚紅0.5μl、余量為無菌水。

進一步地，步驟4)中，通過剪尾檢測選出步驟3)中MC4R基因敲除陽性的魚，命名為P0代，P0代與野生型魚雜交，得到F1代雜合體，篩選出MC4R基因敲除陽性的魚。

更進一步地，步驟4)中，得到F1代雜合體后，通過測序與野生型魚比較，選出兩種品系，品系1缺失8個堿基，品系2缺失4個堿基，均引起基因的移碼突變，選擇F1代相同品系的魚進行自交，得到F2代，通過剪尾檢測，挑選得到MC4R基因敲除陽性的純系魚，純系魚具有比野生型魚更快的生長速度。

更進一步地，步驟4)中，從F2代中通過剪尾檢測挑選出MC4R基因敲除陽性的魚后，使其與野生型魚雜交，得到快速生長的雜合魚。

進一步地，步驟3)中，還包括敲除驗證，具體為：選取經(jīng)過培育的受精卵并分別提取DNA，在MC4R基因打靶位點兩側(cè)設(shè)計引物，擴增片段大小為500bp左右。引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，對DNA進行擴增，利用T7核酸內(nèi)切酶I確定打靶效率，隨后亞克隆到測序載體中送樣測序并同野生型魚的基因序列進行比較驗證，確認靶基因的有效敲除。

進一步地，步驟3)中，采用T7E1驗證堿基突變的反應(yīng)體系為：PCR產(chǎn)物8.5μl、緩沖液1μl，混合均勻后，在PCR儀中退火。其中，緩沖液的具體組成為：50mM NaCl、10mM Tris-HCl、10mM MgCl₂、1mM DTT，pH 7.9(25℃)。

進一步地，步驟3)中，退火程序為：95℃5min，94℃2sec，-0.1℃/cycle,200times，75℃1sec，-0.1℃/cycle,600times，16℃2min，退火完成后，加入T7E1酶，37℃孵育30min。

進一步地，步驟3)中，采用T7核酸內(nèi)切酶I驗證堿基突變的反應(yīng)體系中緩沖液的具體組成為：50mM NaCl、10mM Tris-HCl、10mM MgCl₂、1mM DTT，pH 7.9。

如上所述，本發(fā)明的利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除魚類MC4R基因的育種方法，具有以下有益效果：利用生物技術(shù)上最新基因敲除技術(shù)CRISPR-Cas9系統(tǒng)，對MC4R進行基因敲除，實現(xiàn)水產(chǎn)動物的快速生長育種。本發(fā)明為首次在魚類動物中敲除MC4R基因，該育種方法適用于所有的經(jīng)濟魚類，通過敲除魚類的MC4R基因，從而實現(xiàn)魚類的快速生長育種。與傳統(tǒng)的育種方法相比，本專利方法具有準(zhǔn)確性高、成本低、得到純系時間短的特點。與轉(zhuǎn)基因育種相比，由于基因敲除是使魚本身的基因功能缺失，不會引入外來基因，因此，不存在轉(zhuǎn)基因安全問題。

附圖說明

圖1顯示為本實施例中斑馬魚受精卵注射后，T7E1驗證打靶結(jié)果。

圖2顯示為本實施例中注射后MC4R基因測序比對圖。

圖3顯示為本實施例中基因敲除魚的篩選流程圖。

圖4顯示為本實施例中F1代與野生型斑馬魚生長對比圖(左為雄魚，右為雌魚；上排為F1代斑馬魚，下排為野生型斑馬魚)。

具體實施方式

以下通過特定的具體實例說明本發(fā)明的實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書所闡明的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實施方式加以實施或應(yīng)用，本說明書中的各項細節(jié)也可以基于不同觀點與應(yīng)用，在沒有背離本發(fā)明的精神下進行各種修飾或改變。

本實施例以斑馬魚為例，當(dāng)然，本發(fā)明也適用于其他經(jīng)濟魚類，具體包括鯉魚、鯽魚、羅非魚、草魚、鰱魚、鳙魚、斑鱧、烏鱧等其他經(jīng)濟魚類。

1、斑馬魚MC4R基因打靶位點的確定

首先，在基因數(shù)據(jù)庫查找斑馬魚MC4R基因的基因序列，對比其氨基酸序列，找到其功能區(qū)域，將功能區(qū)域附近的基因序列輸入到CRISPR-Cas9打靶位點設(shè)計網(wǎng)站上(http://zifit.partners.org/ZiFiT/)，根據(jù)網(wǎng)站給出的結(jié)果選擇合適的打靶序列，盡量選擇位于編碼區(qū)前面的打靶序列。本發(fā)明選擇的打靶位點序列如SEQ ID NO.1所示。當(dāng)然，MC4R基因打靶位點的序列不限于SEQ ID NO.1所示的序列，其他能夠敲除該MC4R基因的打靶序列也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

2、gRNA的制備

本發(fā)明采用PCR的方法擴增出gRNA的轉(zhuǎn)錄模板。首先根據(jù)選定的打靶序列設(shè)計引物，上下游引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。以含有g(shù)RNA骨架的質(zhì)粒pTarget為模板，質(zhì)粒序列如SEQ ID NO.4所示。PCR反應(yīng)程序為：98℃5min；98℃10s，58℃30s，72℃20s共35個循環(huán)，72℃5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％(質(zhì)量體積分數(shù)，即所稱取的瓊脂糖粉的質(zhì)量(g)比所加的緩沖液的體積(mL)即膠的濃度)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，通過PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收產(chǎn)物，除去多余的鹽離子、酶及引物等雜物。以純化后的產(chǎn)物為模板進行體外轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄體系為20μl，其中純化后的產(chǎn)物600ng，T7轉(zhuǎn)錄酶1μl，反應(yīng)緩沖液2μl，NTP混合物1μl，加無菌水補足20μl。37℃孵育3h。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測后，通過RNA純化試劑盒純化回收，保存在-80℃冰箱中。反應(yīng)緩沖液的具體組成為：50mM NaCl，10mM Tris-HCl，10mM MgCl₂，1mM DTT(pH 7.9，溫度25℃)。

3、體外顯微注射與敲除驗證

體外顯微注射：挑選性成熟的斑馬魚，2條雌魚1條雄魚，放入產(chǎn)卵盒，在產(chǎn)卵盒中間插入透明隔板，將雌雄魚分開。將產(chǎn)卵盒置于26-29℃恒溫室中黑暗過夜飼養(yǎng)，光周期為白晝14h，黑暗10h。次日上午，拔開透明隔板，保持安靜的環(huán)境，讓魚自行追逐產(chǎn)卵。產(chǎn)卵后，收取受精卵，通過顯微注射儀進行單細胞期胚胎注射。注射體系為：cas9 RNA終濃度300ng/μl，gRNA終濃度30ng/μl，酚紅0.5μl，無菌水補足10μl。注射部位為受精卵的動物極。此時即可對注射的受精卵進行孵化培育，當(dāng)然，也可以先對注射的受精卵進行敲除驗證之后，再對敲除成功的受精卵進行孵化培育，提高篩選的效率。

敲除驗證：注射后的第二天，在對照組與注射組的斑馬魚胚胎中各隨機選取5個受精卵，分別提取DNA，在MC4R基因打靶位點兩側(cè)選擇500bp左右的序列設(shè)計引物，引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。以此引物對斑馬魚DNA進行擴增。T7核酸內(nèi)切酶I(T7E1)具有識別并切割不完全配對DNA、異源雙鏈DNA特性，因此用該酶進行堿基突變驗證，反應(yīng)體系為：PCR產(chǎn)物8.5μl，緩沖液(50mM NaCl，10mM Tris-HCl，10mM MgCl₂，1mM DTT(pH 7.9，25℃))1μl，混合均勻后，在PCR儀中退火。退火程序為：95℃5min，94℃2sec，-0.1℃/cycle,200times，75℃1sec，-0.1℃/cycle,600times，16℃2min。退火完成后，加入0.5μl T7E1酶，37℃孵育30min。孵育完成后通過2％瓊脂糖凝膠電泳檢測是否打靶成功，結(jié)果如圖1所示。隨后亞克隆到測序載體中送樣測序并同野生型基因序列進行比較驗證，確認靶基因的有效敲除，如圖2所示。對敲除成功的受精卵進行孵化培育。

受精卵孵化培育的具體過程為：受精卵在培養(yǎng)皿中孵育至第5天，每天早晚喂食蛋黃，10天后開始喂食豐年蝦幼蟲，期間注意經(jīng)常換水。幼魚培育至一個月后，移到斑馬魚循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)，光暗周期為14h光照，10h黑暗，水溫為28℃。每天早晚喂食豐年蟲幼蟲兩次，分別為7:00和17:00。

4、MC4R基因敲除斑馬魚的篩選

兩個月后，對每條魚進行剪尾檢測，按照上步所述方法檢測每條魚是否有突變。選出檢測基因敲除陽性的斑馬魚，命名為P0代。P0代魚性成熟后與野生型斑馬魚雜交，得到F1代雜合體，此時，每條F1代魚只有一種堿基突變情況，挑選出其中堿基缺失或增加非3的倍數(shù)的F1代，相同突變情況的F1代自交，其后代F2代中即可篩選出基因完全突變的純系魚。本實施例中，通過測序與野生型比較，選出兩種品系，品系1缺失8個堿基，品系2缺失4個堿基，均引起基因的移碼突變。F1代相同品系的魚進行自交，得到F2代，通過剪尾檢測，挑選出其中MC4R敲除陽性的純系魚，如圖3所示。

選擇上述兩種品系的原因主要在于：同一個打靶位點打靶成功后，無論是堿基缺失還是增加，起作用的是錯義突變，即堿基的增加或缺失導(dǎo)致mRNA密碼子發(fā)生改變，從而導(dǎo)致氨基酸發(fā)生改變，使基因失活，因為在翻譯過程中，一個密碼子包含3個堿基，因此錯義突變有兩種情況，分別是3n+1和3n+2，這兩種情況分別導(dǎo)致不同的移碼突變，最終翻譯出的氨基酸也不同，但是相對于野生型來說，這兩個品系的基因都發(fā)生了突變，基因功能已都失活或喪失。

步驟3中注射的初代魚，因為基因編輯是在其發(fā)育過程中進行的，所以這些魚本身有可能只有身體上某個部位的基因堿基發(fā)生了缺失或增加，而且會有很多種缺失情況，第一步與野生型雜交，是為了選擇出性腺中的基因被敲除了的個體，只有這類個體，才能將其基因突變傳遞給下一代，而且使得后代的突變情況單一化，這樣再通過F1代之間的雜交，就能獲得整個基因組都被敲除了的純系魚。

將純系的MC4R基因敲除的魚與野生型斑馬魚雜交，即可得到100％的具有較大生長優(yōu)勢的雜合魚。分別培育該雜合斑馬魚、野生型斑馬魚：在同一個養(yǎng)殖系統(tǒng)，相同養(yǎng)殖密度下(1g/L，每升水養(yǎng)殖1g重量的斑馬魚)，每日喂食相同數(shù)量的食物，6個月成年斑馬魚雜合雄魚體長為3.3±0.2cm，體重為0.52±0.05g，野生型雄魚體長為3.0±0.1cm，體重為0.45±0.04g，雜合雄魚比野生型雄魚的體長增加10％，體重增加了15.6％。雜合雌魚體長為3.7±0.3cm，體重為0.74±0.05g，野生型雌魚體長為3.2±0.1cm，體重為0.51±0.05g，雜合雌魚比野生型雌魚的體長增加15.6％，體重增加了45.1％。本實施例獲得純系魚所需時間為：3*達到性成熟所需的時間，例如，斑馬魚3個月可性成熟，所以得到純系斑馬魚的時間為3*3＝9個月，時間較短。

綜上所述，本發(fā)明的利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除魚類MC4R基因的育種方法，利用生物技術(shù)上最新基因敲除技術(shù)CRISPR-Cas9系統(tǒng)，對MC4R進行基因敲除，實現(xiàn)水產(chǎn)動物的快速生長育種。本發(fā)明為首次在魚類動物中敲除MC4R基因，該育種方法適用于所有的經(jīng)濟魚類，通過敲除魚類的MC4R基因，從而實現(xiàn)魚類的快速生長育種。與傳統(tǒng)的育種方法相比，本專利方法具有準(zhǔn)確性高、成本低、得到純系時間短的特點。與轉(zhuǎn)基因育種相比，由于基因敲除是使魚本身的基因功能缺失，不會引入外來基因，因此，不存在轉(zhuǎn)基因安全問題。

上述實施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾或改變。因此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。