1.一種利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除魚類MC4R基因的育種方法,其特征在于,包括如下步驟:
1)MC4R基因打靶位點的確定:選擇MC4R基因打靶位點序列;
2)gRNA的制備:設計含有MC4R基因打靶位點序列的上游引物以及與其匹配的下游引物,通過體外轉(zhuǎn)錄得到gRNA;
3)體外顯微注射:魚產(chǎn)卵后,收集受精卵,將gRNA和Cas9RNA注射進入魚的受精卵,對注射的受精卵進行孵化培育;
4)MC4R基因敲除魚的篩選:通過剪尾檢測選出步驟3)中MC4R基因敲除陽性的魚。
2.根據(jù)權利要求1所述的利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除魚類MC4R基因的育種方法,其特征在于:步驟1)中,所述MC4R基因打靶位點序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根據(jù)權利要求1所述的利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除魚類MC4R基因促進魚類快速生長的育種方法,其特征在于:步驟2)中,上游引物序列如SEQ ID NO.2所示,下游引物序列如SEQ ID NO.3所示。
4.根據(jù)權利要求1所述的利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除魚類MC4R基因的育種方法,其特征在于:步驟2)中,以含有gRNA骨架的質(zhì)粒為模板進行體外轉(zhuǎn)錄,質(zhì)粒序列如SEQ ID NO.4所示。
5.根據(jù)權利要求1所述的利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除魚類MC4R基因的育種方法,其特征在于:步驟2)中,通過PCR擴增gRNA的DNA序列,PCR反應程序為:98℃ 5min;98℃ 10s,58℃ 30s,72℃ 20s共35個循環(huán),72℃ 5min。
6.根據(jù)權利要求1所述的利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除魚類MC4R基因的育種方法,其特征在于:步驟3)中,注射體系的總體積10μl,包括cas9RNA 300ng/μl、gRNA 30ng/μl、酚紅0.5μl、余量為無菌水。
7.根據(jù)權利要求1所述的利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除魚類MC4R基因的育種方法,其特征在于:步驟4)中,通過剪尾檢測選出步驟3)中MC4R基因基因敲除陽性的魚后,命名為P0代,P0代與野生型魚雜交,得到F1代雜合體,篩選出MC4R基因敲除陽性的魚。
8.根據(jù)權利要求7所述的利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除魚類MC4R基因的育種方法,其特征在于:步驟4)中,得到F1代雜合體后,通過測序與野生型魚比較,選出兩種品系,品系1缺失8個堿基,品系2缺失4個堿基,均引起基因的移碼突變,選擇F1代相同品系的魚進行自交,得到F2代,通過剪尾檢測,挑選得到MC4R基因敲除陽性的純系魚。
9.根據(jù)權利要求8所述的利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除魚類MC4R基因的育種方法,其特征在于:步驟4)中,從F2代中通過剪尾檢測挑選出MC4R基因敲除陽性的魚后,使其與野生型魚雜交,得到快速生長的雜合魚。
10.根據(jù)權利要求1所述的利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除魚類MC4R基因的育種方法,其特征在于:步驟3)中,還包括敲除驗證,具體為:選取經(jīng)過培育的受精卵并分別提取DNA,在MC4R基因打靶位點兩側(cè)設計引物,引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示,對DNA進行擴增,利用T7核酸內(nèi)切酶I(T7E1)確定打靶效率,隨后亞克隆到測序載體中送樣測序并同野生型魚的基因序列進行比較驗證,確認靶基因的有效敲除。