本發(fā)明屬于生物
技術領域：
，尤其涉及一種融合蛋白、制備方法及其應用。
背景技術：
：卵巢癌、子宮頸癌和子宮內膜癌是三種惡性腫瘤嚴重威脅女性生命健康，五年存活率不足50％，子宮頸癌發(fā)病率居女性生殖系統(tǒng)腫瘤之首，我國新發(fā)病例每年高達15萬之多，而且有明顯的年輕化趨勢，國家已經廣泛開展“兩癌篩查”，但是仍然未能改善腫瘤患者的預后，女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤是我國中長期科技發(fā)展綱要計劃攻關的惡性腫瘤之一。女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的傳統(tǒng)治療為手術、放療、化療，但是僅僅有一定療效，對于晚期或復發(fā)患者均不能奏效，目前急需尋找新的治療方法。技術實現(xiàn)要素：鑒于現(xiàn)有技術所存在的問題，本發(fā)明提供一種融合蛋白、制備方法及其應用。本發(fā)明解決上述技術問題的技術方案如下：一種融合蛋白，所述蛋白包括CLIC1蛋白、連接肽和Hsp27蛋白，CLIC1蛋白通過連接肽與Hsp27蛋白連接。采用上述方案的有益效果是:發(fā)明人通過蛋白質組學，免疫組化，RT-PCR，westernblot等研究方法，發(fā)現(xiàn)CLIC1(細胞內氯離子通道蛋白1，氯離子通道蛋白是一組調節(jié)基本細胞功能的蛋白，包括細胞膜電位穩(wěn)定、跨膜轉運、維持胞內pH，調節(jié)細胞容積)在卵巢癌組織中呈現(xiàn)高表達，CLIC1被發(fā)現(xiàn)和細胞周期相關，在細胞G2/M期表達于細胞膜上,應用CLIC1特異性拮抗劑阻斷該離子通道后，細胞的有絲分裂受到影響，細胞周期停滯于G2/M期，推測CLIC1在卵巢細胞周期中參與了調節(jié)這一過程，發(fā)明人進一步通過建立CLIC1基因敲降和過表達的細胞系，在體外試驗中證實CLIC1在SKOV3和A2780卵巢癌細胞系中呈現(xiàn)高表達，抑制CLIC1的表達可以減少卵巢癌細胞系的增殖及浸潤，提示CLIC1可能是參與卵巢癌發(fā)生及淋巴道轉移的重要基因之一，在此前國內外均尚未見相關報道。進一步，發(fā)明人將CLIC1基因和人HSP27基因(熱休克蛋白27，屬于低分子量熱休克蛋白家族的成員，HSP27是一個涉及到藥物抗性、細胞生長、細胞凋亡、腫瘤的發(fā)生和轉移等功能的重要蛋白，HSP27介導的這些功能可能與其對其它蛋白質的影響有關)通過一段柔性連接肽進行人工融合，合成一種CLIC1-HSP27的融合基因，采用基因聯(lián)合優(yōu)化技術在原核表達系統(tǒng)中成功實現(xiàn)了該融合基因的高表達，通過質譜鑒定和親和層析純化獲得了純度大于90％的CLIC1-HSP27融合蛋白，該融合蛋白標準品成功解決現(xiàn)有腫瘤細胞裂解物成分復雜，無法保證所誘發(fā)抗腫瘤免疫的強度和特異性的缺點，并且成分單一，結構明確，降低成本，方便于工業(yè)化生產，為以后的生物學研究打下基礎，非常具有應用前景。進一步，所述融合蛋白包括SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。采用上述方案的有益效果是：有現(xiàn)有技術進行改進，摸索出基因聯(lián)合優(yōu)化技術，從密碼子優(yōu)化，mRNA結構優(yōu)化，基因表達優(yōu)化三方面聯(lián)合入手，通過對稀有密碼子、mRNA結構、表達菌株的篩選、純化的溫度、誘導度、培養(yǎng)基OD值探索，提高外源基因的表達效率、可溶性和穩(wěn)定性，提升表達產量和準確性，后期質譜測序與原始預測序列在存在誤差的情況下符合率接近100％，傳統(tǒng)技術一般為60％-80％左右。進一步，所述連接肽為柔性連接肽。采用上述方案的有益效果是：采用柔性的連接肽有利于：增加產物的穩(wěn)定性，選甘氨酸作為融合蛋白linker是因為甘氨酸是所有氨基酸中最小且沒有手性碳，所以柔性最好，放在融合蛋白之間不會影響兩邊蛋白的構象和功能發(fā)揮，采用的linker不能太大，否則一是對結構有影響，二是增加了融合蛋白的抗原性。進一步，所述融合蛋白還包括基因聯(lián)合優(yōu)化技術。采用上述方案的有益效果是：一方面確保目標產物序列的準確性；另一方面提高融合基因表達產物的可溶性和穩(wěn)定性，提高目標蛋白產量?；蚵?lián)合優(yōu)化技術，本例從密碼子優(yōu)化，mRNA結構優(yōu)化，基因表達優(yōu)化三方面聯(lián)合入手，提升外源基因的表達效率和穩(wěn)定性。以下是該優(yōu)化過程所涉及的關鍵步驟：1.密碼子優(yōu)化是基因表達優(yōu)化技術的關鍵步驟之一，主要涉及mRNA二級結構、稀有密碼子、核糖體結合位點等關鍵因素，基因能否順利表達與稀有密碼子含量、mRNA結構是否阻礙翻譯有很大關系。許多motif在基因表達過程中承擔著重要的角色，通過仔細研究轉錄翻譯過程，不斷閱讀基礎資料和研究進展，將如下功能性motif納入到基因聯(lián)合優(yōu)化技術中：TATA框：是構成真核生物的啟動子元件之一，位于轉錄起始點上游-30bp處，它可以保證轉錄的正確定位。SD序列:作為原核表達的核糖體綁定位點，是翻譯必不可少的信號。Kozak序列：真核生物中符合Kozak規(guī)則的基因，其轉錄及翻譯效率較好。Chi序列：在原核生物中能夠增加自然重組的幾率，可能會影響人工重組蛋白的表達。隱蔽剪切位點：真核生物中存在大量的隱蔽剪切位點，一旦被激活，會造成mRNA的剪接偏離原始預期。重復序列和GC含量：重復序列過多，會增加基因合成的難度。反向互補序列也對mRNA二級結構有重要影響。相對于AT配對需要2個氫鍵，GC配對是3個氫鍵，GC含量直接影響著PCR退火溫度。在啟動子等保守區(qū)域GC含量相對較高。GC含量也影響著mRNA熱力學穩(wěn)定性及mRNA二級結構.本例對融合基因進行了改造,選用大腸桿菌偏愛的密碼子,增加了GC含量,去除原序列下影響mRNA穩(wěn)定的元件。2.mRNA二級結構優(yōu)化：mRNA二級結構是影響翻譯過程的重要因素，復雜穩(wěn)定的二級結構會阻礙翻譯過程的順利進行，特別是核糖體綁定位點(RBS)附近的二級結構。mRNA的二級結構預測是一個復雜的過程，需要考慮堿基配對、自由能等多種因素，本例通過識別發(fā)卡結構區(qū)并進行有效規(guī)避。密碼子偏好性：不同物種的種屬之間，對同義密碼子的使用頻率是不同的。在外源基因的同義密碼子使用頻率與表達宿主相匹配的情況下，外源基因的表達水平會顯著提高。限制性酶切位點:限制性酶切位點需要根據(jù)實際情況進行排除，以免與需要用到的酶切位點產生沖突，影響重組基因的操作。3.表達條件優(yōu)化:基因表達優(yōu)化的目的在于通過重組基因技術表達出盡可能接近天然構象的重組蛋白質。重組蛋白表達的關鍵要素包括基因、載體、表達宿主、表達培養(yǎng)條件。這些要素之間是相互影響的，所以為了更好地達到優(yōu)化的目的，需要將目標放到其所在上下文中進行優(yōu)化。表達條件的優(yōu)化對目標蛋白的表達量及表達質量同樣也起到至關重要的作用，包括以下幾點：親和標簽的選擇:親和標簽已經成為重組蛋白表達及純化的一個重要且有效的工具。它們不僅有利于融合蛋白的檢測與純化，而且可能對目標蛋白的理化性質產生有利的影響，可以提高重組蛋白的表達水平，增強重組蛋白的可溶性，促進重組蛋白的正確折疊。像GST、MBP、Ub、Sumo可以明顯提高重組蛋白的表達水平。在融合親和標簽進行原核表達的過程中，某些高度可溶的蛋白標簽具有提高融合蛋白可溶性的能力，如GST、MBP、Sumo、NusA等，本例研究和使用最清楚的增強融合蛋白可溶性的標簽有Mbp和NusA，促進蛋白正確折疊的標簽有MBP、NusA和Trx。親和標簽還可能抑制融合蛋白的水解、保護融合蛋白的抗原性。大腸桿菌中表達條件的優(yōu)化：為了提高大腸桿菌的重組蛋白表達水平，抑制包涵體的生成可以選用特定表達菌株、與分子伴侶共表達、降低目標蛋白表達溫度、調整誘導溫度等手段優(yōu)化蛋白表達。本發(fā)明采用0.5mMIPTG(異丙基硫代半乳糖苷)，15℃誘導16h達到最佳誘導條件。本發(fā)明提供一種編碼上述融合蛋白的核苷酸序列。本發(fā)明提供一種包括上述核苷酸序列的載體、重組細胞或重組菌。本發(fā)明提供一種融合蛋白的制備方法，包括以下步驟：構建包括SEQIDNO.2核苷酸序列的表達系統(tǒng)，利用該表達系統(tǒng)表達融合蛋白。所述的表達系統(tǒng)既可以是原核表達系統(tǒng)，也可以是真核表達系統(tǒng)。例如：大腸桿菌體系、昆蟲或哺乳動物細胞表達體系等等。進一步，還包括將表達系統(tǒng)表達的融合蛋白進行親和層析純化，獲得純化后的融合蛋白。采用上述方案的有益效果是：進一步提高融合蛋白的純度。一種上述的融合蛋白在腫瘤防治藥物制備中的應用。尤其可以用于人卵巢癌防治藥物的制備。一種疫苗，包括上述的融合蛋白和藥學上可接受的載體。所述的藥學上可接受的載體，例如：可以為聚乳酸-羥基乙酸微球等等。采用上述方案的有益效果是：使所生產的腫瘤疫苗具有低成本，結構單一準確，特異性好、抗原高效等優(yōu)點。附圖說明圖1為融合蛋白在BL21(DE3)中的表達結果，箭頭指目標蛋白，LaneM為SDS-PAGE蛋白marker；Lane0為對照，對照為未加誘導劑；Lane1為15℃誘導過夜的結果；Lane2為28℃誘導過夜的結果；Lane3為37℃誘導過夜的結果。圖2為通過SDA-PAGE分析融合蛋白上清純化的結果；LaneM為SDS-PAGE蛋白marker；Lane1為全菌破菌離心后上清；Lane2為上清同Ni-IDA孵育后流出液；Lane3-4為50nm濃度的咪唑的洗脫組分，Lane5-7為100nm濃度咪唑的洗脫組分，Lane8-13為300nm濃度咪唑的洗脫組分。圖3為分別利用SDS-PAGE和WesternBlot對融合蛋白質檢結果，Lane1為BSA(1.0ug)；Lane2為融合蛋白(1.0ug)；LaneM1為SDS-PAGE蛋白marker；LaneM2為WesternBlotmarker。圖4為融合蛋白質譜鑒定的結果。圖5為pET30aCLIC1-HSP27的質粒圖譜。圖6為實施例3的檢測結果。圖7為CLIC1-HSP27激活的T細胞對SKOV3(24、48h)細胞系遷移能力的影響的結果。具體實施方式以下結合附圖對本發(fā)明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。下面通過一些具體的實施例來進行進行介紹。各實施中采用的實驗材料及儀器介紹如下：質粒抽提試劑盒、DNA回收試劑盒(天根生化公司)，T4DNA連接酶、TaqDNA聚合酶(寶生物公司)，酵母提取物、蛋白胨(OXOID)，電泳相關試劑(Tris，Acr，Bis，AP,TEMED等)(Sigma)，0.22um濾器及透析袋(Millipore)，IPTG及抗生素(Amersco)，Ni-IDA樹脂，Bradford蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天公司)，DNA合成儀(MerMade-192),PCR儀(ABI)，電泳儀(Bio-Rad),超聲細胞破碎儀(寧波新芝生物)，高速冷凍離心機(湖南湘儀),四維旋轉混合儀(海門其林貝爾)ABI4800MALDI-TOF/TOF質譜儀。實施例1構建并表達純化融合蛋白1、對CLIC1和HSP27進行密碼子優(yōu)化和基因合成。設計目標核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，該核苷酸序列可以編碼SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。2.委托南通大學醫(yī)學院采用全基因合成的方法獲得SEQIDNO.2所示的基因片段，命名為CLIC1-HSP27基因。3、利用限制性內切酶NdeI和HindIII分別酶切CLIC1-HSP27基因和表達載體pET30a，將CLIC1-HSP27基因插入到表達載體pET30a中，獲得重組質粒，命名為pET30aCLIC1-HSP27，pET30aCLIC1-HSP27的質粒圖譜如圖5所示。質粒構建中，基因和載體的比例及一些相關條件如下(20ul反應體系)：COMPONENT20μlREACTION10XT4DNALigaseBuffer2ulVectorDNA50ngInsertDNA50ngNuclease-freewaterTo20ulT4DNALigase1ul具體操作為：步驟a.用移液器輕輕吹打混勻或輕微Vortex混勻，室溫離心數(shù)秒，使液體積聚于管底。步驟b.16℃孵育連接過夜。4、將重組質粒pET30aCLIC1-HSP27轉化到BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，然后將轉化后的細胞均勻涂布到LB平板上(含有50ug/mL的硫酸卡那霉素)，之后倒置于37℃培養(yǎng)箱過夜。從轉化的平板中挑選單克隆，接種到4mL的LB培養(yǎng)基中(含50ug/mL的硫酸卡那霉素)，待培養(yǎng)至OD600為0.5-0.8，向試管培養(yǎng)液中加入終濃度0.5mM異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，之后分別置于15℃、28℃、37℃誘導表達。取誘導后的培養(yǎng)液12000rpm離心5min，去除上清液，加入PBS液重懸沉淀，最后加入SDS-PAGE上樣緩沖液于100℃下加熱樣品10min，然后離心取上清電泳。電泳前10min時，100V穩(wěn)壓電泳，待溴酚藍指示劑進入分離膠后200V穩(wěn)壓電泳至溴酚藍帶遷移至離凝膠底部1cm,取出凝膠用考馬斯亮蘭染色液染色,隨后轉入脫色液中,脫色至背景清晰。結果見圖1。5、CLIC1-HSP27蛋白放大培養(yǎng),培養(yǎng)3L的表達菌，生長至OD600＝0.8時，加終濃度0.5mMIPTG，15℃誘導16h后收集菌體。上清中親和層析純化CLIC1-HSP27蛋白(整個純化過程在低溫下操作)全菌采用50mMTris(pH8.0),150mMNaCl含1％TritonX-100,1ug/mLPepstatinA,1ug/mLLeupeptin超聲裂解，同時以50mMTris(pH8.0),150mMNaCl緩沖液平衡Ni-IDA親和層析柱，之后用不同濃度(Lane3-4為50nm濃度的咪唑的洗脫組分，Lane5-7為100nm濃度咪唑的洗脫組分，Lane8-13為300nm濃度咪唑的洗脫組分)咪唑的平衡緩沖液洗脫目標蛋白，并收集每個洗脫組分進行SDS-PAGE分析檢測。分析結果見圖2。6經Ni-IDA親和層析純化，目標蛋白CLIC1-HSP27主要存在于洗脫組分Lane8-1中，收集上述目標蛋白將其透析到1XPBS,10％Glycerol,pH7.4中,透析結束后用0.22um膜過濾，并分裝凍于-80℃。7、CLIC1-HSP27蛋白質檢見圖3。利用SDS-PAGE對融合蛋白質檢的方法為：SDS-PAGE純度評估來源于R250染色的SDS-PAGE膠。利用WesternBlot對融合蛋白質檢，方法為：用His單抗和His標簽結合，二抗偶聯(lián)HPR再和His單抗結合最后顯影檢測目標蛋白。根據(jù)圖3的結果可以說明融合基因成功表達，分子量在預測范圍之內。8、融合蛋白質譜鑒定的結果見圖4。質譜鑒定的條件為：使用儀器：ABI4800MALDI-TOF/TOF，采用碰撞誘導裂解(CID)二級質譜(MS/MS)，鑒定覆蓋的肽段、對蛋白含量和置信度的綜合打分。根據(jù)圖4的結果可以看出，目標蛋白原始序列覆蓋率95.17％，由于本身存在肽段電離的誤差，結果說明表達產物的序列準確可靠。實施例2通過白細胞分離標準程序獲得周邊血單核細胞，體外與該重組蛋白CLIC1-HSP27共培養(yǎng)，獲得被該重組蛋白CLIC1-HSP27活化的抗原提呈細胞(APCs)及殺傷淋巴細胞，抗原呈遞細胞則將PAP蛋白消化為多肽而呈現(xiàn)于其表面，可被免疫系統(tǒng)T細胞識別，識別該抗原后的T細胞能找到并殺滅體內表達CLIC1抗原的癌細胞。實施例3Elisa法檢測CLIC1-HSP27負載樹突細胞激活的T淋巴細胞上清中的TGF-β含量(TGF-β是T細胞活化時分泌的一種細胞因子)，檢測結果如圖6所示，血樣A、血樣B和血樣C分別來自不同人的外周血。從圖6中可以看出，CLIC1-HSP27和對照組(空白對照組)相比，，CLIC1-HSP27刺激組的TGF-β的含量顯著上升(pg/ml)。實施例4CLIC1-HSP27激活的T細胞對SKOV3細胞的遷移能力的影響劃痕試驗檢測試驗組(空白T細胞)和對照組(50μg/mlCLIC1-HSP27激活T細胞)24和48小時對SKOV3細胞的遷移能力的影響。如圖7所示，與對照組相比，試驗組24和48小時細胞遷移的數(shù)量和距離均下降。本例使用獨創(chuàng)的基因聯(lián)合優(yōu)化技術，從密碼子優(yōu)化，mRNA結構優(yōu)化，基因表達優(yōu)化三方面聯(lián)合入手，通過對稀有密碼子，mRNA結構，表達菌株的篩選，純化的溫度、誘導度、培養(yǎng)基OD值探索，提高外源基因的表達效率、可溶性和穩(wěn)定性，提升表達產量和準確性。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。<110>張震宇<120>一種融合蛋白、制備方法及其應用<160>2<210>1<211>414<212>PRT<213>人工合成<220><221>CLIC1-HSP27蛋白<400>1MHHHHHHTERRVPFSLLRGPSWDPFRDWYPHSRLFDQAFGLPRLPEEWSQ111213141WLGGSSWPGYVRPLPPAAIESPAVAAPAYSRALSRQLSSGVSEIRHTADR5161718191WRVSLDVNHFAPDELTVKTKDGVVEITGKHEERQDEHGYISRCFTRKYTL101111121131141PPGVDPTQVSSSLSPEGTLTVEAPMPKLATQSNEITIPVTFESRAQLGGP151161171181191EAAKSDETAAKGGGSGGGSDTKRRTETVQKLCPGGQLPFLLYGTEVHTDT201211221231241NKIEEFLEAVLCPPRYPKLAALNPESNTAGLDIFAKFSAYIKNSNPALND251261271281291NLEKGLLKALKVLDNYLTSPLPEEVDETSAEDEGVSQRKFLDGNELTLAD301311321331341CNLLPKLHIVQVVCKKYRGFTIPEAFRGVHRYLSNAYAREEFASTCPDDE351361371381391EIELAYEQVAKALK401411<210>2<211>1031<212>DNA<213>人工合成<220><223>CLIC1-HSP27基因<400>2atgcaccaccatcatcatcacaccgagcggagagtgcccttcagcctgctgaggggccct60tcttgggaccccttcagagattggtacccccacagcaggctgttcgatcaggcctttggc120ctgcctagactgccagaagagtggagtcagtggctgggaggaagcagttggccaggatac180gtcagacctctgcctccagcagccattgaatctccagccgtggcagctccagcctatagc240agagccctgagcagacagctgtctagcggcgtgtccgagatcagacacaccgcagatcgc300tggagagtgtctctggacgtgaaccacttcgccccagacgagctgacagtgaagaccaag360gacggcgtggtggagatcaccggaaagcacgaggagaggcaggacgaacacggatacatc420agccgctgcttcacccggaagtacaccctgcctccaggagtggatcctacccaggtgtcc480tctagcctgagcccagaaggaaccctgaccgtggaagcccctatgcctaagctggccacc540cagagcaacgagatcaccatcccagtgaccttcgagagcagagctcagctgggaggacca600gaagcagccaaaagcgacgagacagccgctaaaggaggaggaagcggaggaggcagcgat660accaagagaaggaccgagaccgtgcagaaactctgtccaggcggtcagctccctttcctg720ctgtacggaaccgaggtgcacaccgacaccaacaagatcgaggagttcctggaggccgtg780ctgtgtcctcctaggtatcctaagctggccgccctgaacccagagtctaacacagccggc840ctggacatcttcgccaagttcagcgcctacatcaagaacagcaaccccgccctgaacgac900aacctggagaagggcctgctgaaagccctgaaggtgctggacaactacctgaccagccct960ctgccagaggaagtggacgaaaccagcgccgaagacgaaggagtgtctcagcggaagttc1020ctggacggaaa1031當前第1頁1 2 3