本發(fā)明涉及抗體工程
技術(shù)領(lǐng)域:
,具體涉及本發(fā)明涉及全人源的抗PCSK9的單克隆抗體、及其獲得方法與應(yīng)用。
背景技術(shù):
:PCSK9(前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9,Proproteinconvertasesubtilisin/kexintype9)屬于前蛋白轉(zhuǎn)化酶家族蛋白酶K亞家族。人PCSK9基因定位于染色體1p32.3,長(zhǎng)約22kb,共有12個(gè)外顯子,編碼含692個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。PCSK9蛋白由信號(hào)肽、前結(jié)構(gòu)域、催化結(jié)構(gòu)域和羧基末端結(jié)構(gòu)域(V結(jié)構(gòu)域)組成,它作為可溶性的74kDa的前體合成,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中經(jīng)過(guò)自身催化裂解產(chǎn)生14kDa的前肽和60kDa的成熟的蛋白酶。PCSK9主要在肝臟、腸道和腎臟表達(dá),皮膚和神經(jīng)系統(tǒng)也有少量表達(dá),但是只有肝臟中的PCSK9可以分泌到血液循環(huán)系統(tǒng)中。研究表明,PCSK9能介導(dǎo)低密度脂蛋白受體(LDLR)降解從而調(diào)節(jié)血漿中LDL膽固醇(LDL-C)水平,而LDLR介導(dǎo)肝內(nèi)的LDL胞吞過(guò)程是從循環(huán)系統(tǒng)中清除LDL的主要途徑。LDLR是1個(gè)多結(jié)構(gòu)域的蛋白,胞外域與表皮生長(zhǎng)因子前體同源結(jié)構(gòu)域EGF-A、EGF-B、EGF-C緊連。PCSK9介導(dǎo)LDLR降解首先需要與LDLR結(jié)合,LDLR上結(jié)合位點(diǎn)主要是EGF-A,形成PCSK9與EGF-A復(fù)合物。有研究表明,PCSK9也可通過(guò)極低密度脂蛋白受體、載脂蛋白B受體、載脂蛋白E受體2調(diào)節(jié)膽固醇代謝,但其中的分子機(jī)制并不明確?;A(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)表明,通過(guò)外源性的干預(yù)措施抑制PCSK9活性,可以加速血漿中LDL的清除,從而達(dá)到降血脂的作用。目前PCSK9的抑制劑主要包括單克隆抗體、反義核苷酸、小分子干擾RNA、模擬肽和小分子抑制劑等。單克隆抗體藥物是今年生物醫(yī)藥領(lǐng)域的研發(fā)熱點(diǎn),具有靶向性強(qiáng)、特異性高和毒副作用低等特點(diǎn),代表了藥品治療領(lǐng)域的最新發(fā)展方向。以PCSK9為靶標(biāo)的單克隆抗體可以與PCSK9發(fā)生特異性結(jié)合,阻斷PCSK9與LDLR的相互作用,減慢LDLR的降解過(guò)程從而發(fā)揮降低LDL-C水平的作用。臨床實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示了抗PCSK9單抗藥物的安全性、有效性及獨(dú)特的臨床應(yīng)用價(jià)值。全人源抗體是治療性抗體發(fā)展的主要方向??贵w庫(kù)技術(shù)的出現(xiàn)為人源抗體的制備篩選提供了良好的技術(shù)平臺(tái)??贵w庫(kù)技術(shù)繞過(guò)了以往單抗研制過(guò)程中必須的雜交瘤過(guò)程,甚至不需要經(jīng)過(guò)免疫過(guò)程即可獲得各種抗體基因及抗體分子片段。噬菌體抗體庫(kù)是最早出現(xiàn)也是目前應(yīng)用最廣泛的抗體庫(kù)。噬菌體抗體庫(kù)根據(jù)抗體基因的來(lái)源分為免疫庫(kù)和非免疫庫(kù),非免疫庫(kù)又包括天然庫(kù)、半合成庫(kù)和全合成庫(kù)。噬菌體抗體庫(kù)的篩選模擬了抗體親和力成熟的過(guò)程,通常將抗原包被在固相介質(zhì)上,加入待篩選的噬菌體抗體庫(kù),通過(guò)數(shù)輪“吸附-洗滌-洗脫-擴(kuò)增”的過(guò)程(即淘選)直至篩選到高親和力特異的抗體。目前多家制藥公司都在積極開(kāi)發(fā)針對(duì)PCSK9的單抗藥物。安進(jìn)的Repatha(evolocumab)和賽諾菲/再生元的Praluent(alirocumab)均為全人源抗體,已于2015年先后被批準(zhǔn)上市,用于原發(fā)性高膽固醇血癥和家族性高膽固醇血癥(雜合子和純合子)的治療。在他汀基礎(chǔ)上加用Evolocumab可使原發(fā)性高膽固醇血癥患者的LDL-C降低77%,雜合子家族性高膽固醇血癥患者的LDL-C降低68%,純合子家族性高膽固醇血癥患者的LDL-C降低31%。evolocumab耐受性良好,目前無(wú)任何明顯的安全性問(wèn)題。輝瑞的人源化單抗bococizumab正在進(jìn)行三期臨床,諾華的人源化單抗lodelcizumab正在進(jìn)行二期臨床。羅氏及默沙東也在開(kāi)展臨床試驗(yàn)。目前國(guó)內(nèi)該領(lǐng)域依然缺乏自主研發(fā)的具有高親和力的抗PCSK9的全人源抗體。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:本發(fā)明提供了抗PCSK9的單克隆抗體;本發(fā)明從全合成抗體庫(kù)中篩選出抗PCSK9的單克隆抗體,然后通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)分析,構(gòu)建小容量合成噬菌體抗體輕鏈庫(kù)的方法,對(duì)篩選獲得的抗PCSK9單克隆抗體的輕鏈的CDR1、2、3區(qū)突變建庫(kù);篩選后,選取親和力較高的單克隆抗體,再對(duì)其重鏈CDR1、2、3區(qū)突變建庫(kù)進(jìn)行篩選,最終篩選到了高親和力的抗PCSK9的單克隆抗體。本發(fā)明抗PCSK9抗體具有全新的序列,該抗體在體外特別是細(xì)胞水平上功能良好,極具醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景。為實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明一種抗PCSK9的單克隆抗體,包括:輕鏈和重鏈;所述輕鏈的互補(bǔ)決定區(qū)CDR1、CDR2和CDR3分別用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示;并且所述重鏈的互補(bǔ)決定區(qū)CDR1、CDR2和CDR3分別用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示;LCDR1包含RASQSIDNRLT(SEQNO.22)、RASQSVRNWLD(SEQNO.23)、RASQGINSWLN(SEQNO.24)、RASQNVNNWLN(SEQNO.25)、RASQNINSWLN(SEQNO.26)、RASQNINNWLN(SEQNO.27)、RASQGIHNWLN(SEQNO.28)、RASQDVDSWLT(SEQNO.29)、RASQSVRNWLN(SEQNO.30)、RASQDVRNWLT(SEQNO.31)或RASQSIRSYLN(SEQNO.32)中的任一種;LCDR2包含DASSRQS(SEQNO.33)、GASTLES(SEQNO.34)、AASTRET(SEQNO.35)、GASSRQS(SEQNO.36)、GASTRPT(SEQNO.37)、DASNRQS(SEQNO.38)、GASNLAS(SEQNO.39)、DASNLQS(SEQNO.40)或DASSRPT(SEQNO.41)中的任一種;LCDR3包含QQPENDPTT(SEQNO.42)、QQDNDIPLT(SEQNO.43)、QQWNNTPNT(SEQNO.44)、QQDNDMPLT(SEQNO.45)、QQWFDVPTT(SEQNO.46)、QQWDDTPNT(SEQNO.47)、QQNSNIPLT(SEQNO.48)、QQDSKIPLT(SEQNO.49)、QQWTDTPLT(SEQNO.50)、QQDDSTPPT(SEQNO.51)或QQGDSMPMT(SEQNO.52)中的任一種;HCDR1包含GGTFTNNA(SEQNO.53)、GYTVTSYG(SEQNO.54)或GYSLTSYG(SEQNO.55)中的任一種;HCDR2包含RIIPMFGMA(SEQNO.56)、WLSFYNGNT(SEQNO.57)、WVTFYNGNT(SEQNO.58)、WVSFYQGNT(SEQNO.59)、WVSFYNGQT(SEQNO.60)或WVSFYNGNS(SEQNO.61)中的任一種;HCDR3包含AREGIPMI(SEQNO.62)、ARGYSLDV(SEQNO.63)、ARGYGMSI(SEQNO.64)、ARGFGMDR(SEQNO.65)、ARGYGMTV(SEQNO.66)或ARGFGLSV(SEQNO.67)。其中,所述輕鏈可變區(qū)氨基酸序列優(yōu)選SEQNO.11、SEQNO.12、SEQNO.13、SEQNO.14、SEQNO.15、SEQNO.16、SEQNO.17、SEQNO.18、SEQNO.19、SEQNO.20或SEQNO.21中的任一種。其中,所述重鏈可變區(qū)氨基酸序列優(yōu)選SEQNO.1、SEQNO.2、SEQNO.3、SEQNO.4、SEQNO.5、SEQNO.6、SEQNO.7、SEQNO.8、SEQNO.9或SEQNO.10中的任一種。其中,所述重鏈可變區(qū)HCDR1序列為選自GYTVTSYG(SEQNO.54)或GYSLTSYG(SEQNO.55)的氨基酸序列;所述輕鏈可變區(qū)LCDR1序列選自RASQSVRNWLD(SEQNO.23)、RASQNVNNWLN(SEQNO.25)、RASQNINSWLN(SEQNO.26)、RASQNINNWLN(SEQNO.27)或RASQDVDSWLT(SEQNO.29)中的任一種氨基酸序列;所述重鏈可變區(qū)HCDR2序列選自WVSFYQGNT(SEQNO.59)、WVSFYNGQT(SEQNO.60)或WVSFYNGNS(SEQNO.61)中的任一種氨基酸序列;所述輕鏈可變區(qū)LCDR2序列選自GASTLES(SEQNO.34)、AASTRET(SEQNO.35)、GASSRQS(SEQNO.36)、GASTRPT(SEQNO.37)或GASNLAS(SEQNO.39)中的任一種氨基酸序列;所述重鏈可變區(qū)HCDR3序列選自ARGYSLDV(SEQNO.63)、ARGYGMSI(SEQNO.64)、ARGFGMDR(SEQNO.65)或ARGYGMTV(SEQNO.66)中的任一種氨基酸序列;所述輕鏈可變區(qū)LCDR3序列選自QQDNDIPLT(SEQNO.43)、QQDNDMPLT(SEQNO.45)、QQWFDVPTT(SEQNO.46)、QQWDDTPNT(SEQNO.47)或QQDSKIPLT(SEQNO.49)中的任一種氨基酸序列。其中,本發(fā)明還提供了多種包含上述輕鏈或上述重鏈的抗體、多肽或蛋白。其中,本發(fā)明還提供了多種包含上述輕鏈或上述重鏈的抗體,所述抗體能夠特異性與PCSK9結(jié)合,阻斷PCSK9與LDLR的結(jié)合,提高細(xì)胞表面LDLR的數(shù)量或血液循環(huán)系統(tǒng)中LDLR的水平,降低血液循環(huán)系統(tǒng)中LDL或LDL-C的水平。其中,本發(fā)明還提供了多種包含上述輕鏈或上述重鏈的多核苷酸序列或組合。其中,所述抗PCSK9的單克隆抗體的重鏈恒定區(qū)包含IgG1、IgG2、IgG3和IgG4;所述輕鏈恒定區(qū)包含Cκ或Cλ。其中,所述重鏈恒定區(qū)優(yōu)選IgG4或IgG2;所述重鏈的真核表達(dá)載體或原核生物表達(dá)載體。其中,所述輕鏈恒定區(qū)優(yōu)選Cκ;所述輕鏈的真核表達(dá)載體或原核生物表達(dá)載體。其中,本發(fā)明還提供了一種包含上述多核苷酸序列或組合的重組DNA表達(dá)載體;所述重組DNA表達(dá)載體的DNA序列中包含編碼抗PCSK9抗體的上述重鏈可變區(qū)、重鏈恒定區(qū)、輕鏈可變區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列。其中,本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)染上述重組DNA表達(dá)載體的宿主細(xì)胞,所述宿主細(xì)胞包含原核細(xì)胞、酵母、昆蟲(chóng)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。其中,所述原核細(xì)胞優(yōu)選大腸桿菌。其中,所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞優(yōu)選HEK293E細(xì)胞、CHO細(xì)胞或NS0細(xì)胞。其中,本發(fā)明還提供了多種含有上述輕鏈或上述重鏈的全長(zhǎng)抗體、單鏈抗體、單域抗體、雙特異抗體、抗體藥物偶聯(lián)物。其中,本發(fā)明還提供了多種含有上述輕鏈或上述重鏈的單克隆抗體、人工載體、藥物或藥物組合物。其中,所述單克隆抗體包含全長(zhǎng)抗體和抗PCSK9單克隆抗體的片段,所述片段包含但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或ScFv。其中,本發(fā)明還提供了一種含有上述輕鏈或上述重鏈的檢測(cè)試劑或試劑盒。本發(fā)明所述抗體可用于通過(guò)消除、抑制或降低PCSK9活性而被改善、緩解、抑制或預(yù)防的疾??;所述疾病包含血脂異常、心腦血管疾病和血栓閉塞性疾病。其中,所述血脂異常包含膽固醇升高、甘油三脂升高、低密度脂蛋白升高和高密度脂蛋白降低。所述心血管疾病包含冠狀動(dòng)脈硬化性心臟病、急性心肌梗塞、動(dòng)脈粥狀硬化、中風(fēng)和外周動(dòng)脈閉塞性疾病。本發(fā)明一種抗PCSK9的單克隆抗體的獲得方法,包括如下步驟:(1)、抗PCSK9單鏈抗體的生物淘選,通過(guò)三輪抗體庫(kù)的富集篩選,從全合成的ScFv噬菌體庫(kù)中獲得了一種親和力較高的抗體序列DFSK9-1,其重鏈DFSK9-H1具有SEQNO.1的氨基酸序列,其輕鏈DFSK9-L1具有SEQNO.11的氨基酸序列;(2)、以DFSK9-1為基礎(chǔ),通過(guò)計(jì)算機(jī)三級(jí)結(jié)構(gòu)模擬,設(shè)計(jì)并構(gòu)建輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)CDR1、CDR2、CDR3突變抗體庫(kù),并對(duì)這個(gè)突變抗體庫(kù)進(jìn)行生物淘選和陽(yáng)性克隆的篩選及鑒定,獲得了10種含有不同輕鏈的單鏈抗體序列,分別命名為DFSK9-2、DFSK9-3、DFSK9-4、DFSK9-5、DFSK9-6、DFSK9-7、DFSK9-8、DFSK9-9、DFSK9-10、DFSK9-11,對(duì)應(yīng)的輕鏈可變區(qū)分別命名為DFSK9-L2、DFSK9-L3、DFSK9-L4、DFSK9-L5、DFSK9-L6、DFSK9-L7、DFSK9-L8、DFSK9-L9、DFSK9-L10和DFSK9-L11,其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列分別見(jiàn)SEQNO.12、SEQNO.13、SEQNO.14、SEQNO.15、SEQNO.16、SEQNO.17、SEQNO.18、SEQNO.19、SEQNO.20和SEQNO.21;將上述單鏈抗體在噬菌體水平上進(jìn)行親和力比較;(3)、選出5株親和力較高的克隆DFSK9-2、DFSK9-4、DFSK9-5、DFSK9-6和DFSK9-8,設(shè)計(jì)并構(gòu)建重鏈互補(bǔ)決定區(qū)CDR1、CDR2、CDR3突變抗體庫(kù),再對(duì)這個(gè)重鏈突變的抗體庫(kù)進(jìn)行生物淘選和陽(yáng)性克隆的篩選及鑒定,獲得了10種不同的單鏈抗體序列,分別命名為DFSK9-12、DFSK9-13、DFSK9-14、DFSK9-15、DFSK9-16、DFSK9-17、DFSK9-18、DFSK9-19、DFSK9-20和DFSK9-21;其中,DFSK9-12、DFSK9-13、DFSK9-14、DFSK9-15、DFSK9-16、DFSK9-17、DFSK9-18、DFSK9-19、DFSK9-20和DFSK9-21的輕鏈可變區(qū)序列分別是DFSK9-L2、DFSK9-L8、DFSK9-L5、DFSK9-L6、DFSK9-L5、DFSK9-L6、DFSK9-L5、DFSK9-L4、DFSK9-L6、DFSK9-L6;其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列分別見(jiàn)SEQNO.12、SEQNO.18、SEQNO.15、SEQNO.16、SEQNO.15、SEQNO.16、SEQNO.15、SEQNO.14、SEQNO.16、SEQNO.16;DFSK9-12、DFSK9-13、DFSK9-14、DFSK9-15、DFSK9-16、DFSK9-17、DFSK9-18、DFSK9-19、DFSK9-20和DFSK9-21的重鏈可變區(qū)序列分別是DFSK9-H2、DFSK9-H8、DFSK9-H7、DFSK9-H3、DFSK9-H6、DFSK9-H4、DFSK9-H4、DFSK9-H9、DFSK9-H5、DFSK9-H10;其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列分別見(jiàn)SEQNO.2、SEQNO.8、SEQNO.7、SEQNO.3、SEQNO.6、SEQNO.4、SEQNO.4、SEQNO.9、SEQNO.5、SEQNO.10;將上述單鏈抗體在噬菌體水平上進(jìn)行親和力比較;(4)、將(3)中所述單克隆重鏈可變區(qū)基因和輕鏈可變基因克隆到真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞,獲得抗PCSK9單克隆抗體的全抗。其中,所述CDR為互補(bǔ)決定區(qū)(complementarity-determiningregion);所述ScFv為單鏈抗體(single-chainfragmentvariable);所述ADCs為抗體藥物偶聯(lián)物(antibody-drugconjugates);所述LDLR為低密度脂蛋白受體(LowDensityLipoproteinReceptor);所述LDL-C為低密度脂蛋白膽固醇(LowDensityLipoprotein-Cholesterol);所述HEK293E細(xì)胞為人胚腎293E細(xì)胞(humanembryonickidney293Ecell);CHO細(xì)胞為中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(chinesehamsterovarycell);NS0細(xì)胞為小鼠NS0胸腺瘤細(xì)胞。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)而言,具備的有益效果是:本發(fā)明提供的是多種全新的抗PCSK9抗體,與底物結(jié)合的親和力高,能夠很好的阻斷PCSK9與LDLR的結(jié)合,并且影響細(xì)胞表面的LDLR的分布和表達(dá),從而提高細(xì)胞表面的LDL-R與LDL結(jié)合能力,增加細(xì)胞對(duì)LDL攝取和降解,達(dá)到降低保外的LDL和LDL-C的含量,達(dá)到降低LDL、LDL-C和總膽固醇目的。本發(fā)明提供的單克隆抗體可以用于通過(guò)消除、抑制或降低PCSK9活性而改善、緩解、抑制或預(yù)防的疾病;所述疾病包含血脂異常、心腦血管疾病和血栓閉塞性疾病;血脂異常包含膽固醇升高、甘油三脂升高、低密度脂蛋白升高和高密度脂蛋白降低等;心血管疾病包含冠狀動(dòng)脈硬化性心臟病、急性心肌梗塞、動(dòng)脈粥狀硬化、中風(fēng)和外周動(dòng)脈閉塞性疾病等。說(shuō)明書(shū)附圖圖1、pScFvDisb-S1質(zhì)粒圖譜;圖2、輕鏈突變抗體庫(kù)陽(yáng)性克隆噬菌體單克隆ELISA鑒定單鏈抗體的相對(duì)親和力;圖3、輕鏈突變抗體庫(kù)陽(yáng)性克隆噬菌體梯度ELISA比較單鏈抗體的相對(duì)親和力;圖4、重鏈突變抗體庫(kù)陽(yáng)性克隆噬菌體單克隆ELISA鑒定單鏈抗體的相對(duì)親和力;圖5、重鏈突變抗體庫(kù)陽(yáng)性克隆噬菌體梯度ELISA比較單鏈抗體的相對(duì)親和力;圖6、pTSEG4質(zhì)粒圖譜;圖7、pTSEK質(zhì)粒圖譜圖8、抗PCSK9全抗體與PCSK9在分子水平上結(jié)合試驗(yàn);圖9、抗PCSK9全抗體競(jìng)爭(zhēng)抑制LDLR與PCSK9結(jié)合實(shí)驗(yàn);圖10、抗PCSK9全抗體生物學(xué)活性實(shí)驗(yàn)。具體實(shí)施方式本發(fā)明詳細(xì)的實(shí)施方法參見(jiàn)實(shí)施例,實(shí)施例中所述的實(shí)驗(yàn)方法和試劑,若無(wú)特殊說(shuō)明均為常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法和試劑。以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明和解釋本發(fā)明,而不是以任何方式限制本發(fā)明。本發(fā)明提供了一種特異性結(jié)合PCSK9的單克隆抗體,所述重鏈可變區(qū)序列包含SEQNO.1、2、3、4、5、6、7、8、9和10中的任一種,所述輕鏈可變區(qū)序列包含SEQNO.11、12、13、14、15、16、17、18、19、20和21中的任一種。優(yōu)選地,所述特異性結(jié)合PCSK9的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)序列選自SEQNO.2、3、4、5、6、7、8、9和10中的任一種,所述輕鏈可變區(qū)序列選自SEQNO.12、14、15、16和18中的任一種。通過(guò)輕鏈?zhǔn)删w庫(kù)篩選,所述抗體輕鏈或其功能性片段的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列選自以下氨基酸序列中的任一組合(如表1所示):表1、輕鏈各個(gè)CDR區(qū)的氨基酸序列通過(guò)重鏈?zhǔn)删w庫(kù)篩選,所述抗體重鏈或其功能性片段重鏈的互補(bǔ)決定區(qū)CDR1、CDR2和CDR3分別用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示:HCDR1為GGTFTNNA(SEQNO.53)、GYTVTSYG(SEQNO.54)或GYSLTSYG(SEQNO.55)中的任一種;HCDR2為RIIPMFGMA(SEQNO.56)、WLSFYNGNT(SEQNO.57)、WVTFYNGNT(SEQNO.58)、WVSFYQGNT(SEQNO.59)、WVSFYNGQT(SEQNO.60)或WVSFYNGNS(SEQNO.61)中的任一種;HCDR3為AREGIPMI(SEQNO.62)、ARGYSLDV(SEQNO.63)、ARGYGMSI(SEQNO.64)、ARGFGMDR(SEQNO.65)、ARGYGMTV(SEQNO.66)或ARGFGLSV(SEQNO.67)中的任一種。優(yōu)選地,通過(guò)重鏈?zhǔn)删w庫(kù)篩選,所述特異性結(jié)合PCSK9的單克隆抗體包含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重鏈可變區(qū)及含LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的輕鏈可變區(qū);其中,所述重鏈可變區(qū)HCDR1序列為選自GYTVTSYG(SEQNO.54)或GYSLTSYG(SEQNO.55)的氨基酸序列;所述輕鏈可變區(qū)LCDR1序列選自RASQSVRNWLD(SEQNO.23)、RASQNVNNWLN(SEQNO.25)、RASQNINSWLN(SEQNO.26)、RASQNINNWLN(SEQNO.27)或RASQDVDSWLT(SEQNO.29)中的任一種氨基酸序列;所述重鏈可變區(qū)HCDR2序列選自WVSFYQGNT(SEQNO.59)、WVSFYNGQT(SEQNO.60)或WVSFYNGNS(SEQNO.61)中的任一種氨基酸序列;所述輕鏈可變區(qū)LCDR2序列選自GASTLES(SEQNO.34)、AASTRET(SEQNO.35)、GASSRQS(SEQNO.36)、GASTRPT(SEQNO.37)或GASNLAS(SEQNO.39)中的一種氨基酸序列;所述重鏈可變區(qū)HCDR3序列選自ARGYSLDV(SEQNO.63)、ARGYGMSI(SEQNO.64)、ARGFGMDR(SEQNO.65)或ARGYGMTV(SEQNO.66)中的任一種氨基酸序列;所述輕鏈可變區(qū)LCDR3序列選自QQDNDIPLT(SEQNO.43)、QQDNDMPLT(SEQNO.45)、QQWFDVPTT(SEQNO.46)、QQWDDTPNT(SEQNO.47)或QQDSKIPLT(SEQNO.49)中的任一種氨基酸序列。本發(fā)明用全合成ScFv單鏈?zhǔn)删贵w庫(kù)獲得特異性抗體的方法,所述全人源的特異性結(jié)合PCSK9的單克隆抗體是用噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)篩選而得,其步驟在于:(1)、抗PCSK9單鏈抗體的生物淘選,通過(guò)三輪抗體庫(kù)的富集篩選,獲得了一種親和力較高的抗體序列DFSK9-1;(2)、以DFSK9-1為基礎(chǔ),通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì),構(gòu)建輕鏈CDR123突變庫(kù)并對(duì)該抗體庫(kù)進(jìn)行生物淘選和陽(yáng)性克隆的篩選及鑒定,獲得了10種不同輕鏈的抗體序列的克隆DFSK9-2、DFSK9-3、DFSK9-4、DFSK9-5、DFSK9-6、DFSK9-7、DFSK9-8、DFSK9-9、DFSK9-10、DFSK9-11。將上述10種單鏈抗體在噬菌體水平進(jìn)行親和力比較;(3)、選出兩株親和力較高的克隆,構(gòu)建重鏈CDR123庫(kù)并對(duì)該庫(kù)進(jìn)行生物淘選和陽(yáng)性克隆的篩選,獲得了種10不同序列的單鏈抗體DFSK9-12、DFSK9-13、DFSK9-14、DFSK9-15、DFSK9-16、DFSK9-17、DFSK9-18、DFSK9-19、DFSK9-20、DFSK9-21;將上述單鏈抗體在噬菌體水平上進(jìn)行親和力比較;(4)、將(3)中所述單克隆重鏈可變區(qū)基因和輕鏈可變基因克隆到真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞,獲得抗PCSK9單克隆抗體的全抗。優(yōu)選地,對(duì)(4)的抗PCSK9單克隆抗體的全抗再進(jìn)行親和力和生物活性試驗(yàn)。具體實(shí)施例以下結(jié)合附圖和實(shí)施例詳述本發(fā)明。實(shí)施例1、抗PCSK9單鏈抗體的生物淘選采用基因克隆的方法改造pCom3載體,改造后的載體命名為pScFvDisb-S1(圖1)。以該載體為基礎(chǔ)構(gòu)建全合成噬菌體抗體庫(kù)。免疫管中包被抗原PCSK9-His10μg/1ml/管,4℃包被過(guò)夜。用PBST-4%milk分別封閉免疫管和噬菌體抗體庫(kù)(噬菌體投入量約為109-1012),37℃封閉1h。封閉后的噬菌體抗體庫(kù)加入免疫管中進(jìn)行抗原抗體結(jié)合,37℃反應(yīng)1h。PBST-PBS洗去未結(jié)合的噬菌體,0.1MpH2.2的Glycine-HCl洗脫,用1.5MpH8.8的Tris-HCl中和洗脫液至pH7.0左右。洗脫液感染10ml生長(zhǎng)至OD值約0.5-0.8的XL1-Blue菌液,37℃先靜置30min后150rpm搖床振蕩培養(yǎng)1h。取出1%菌液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)坎加?YTATG小平皿上,用于計(jì)算噬菌體產(chǎn)出量。剩余的菌液離心后涂布于2YTATG大平皿,37℃過(guò)夜培養(yǎng)。將過(guò)夜培養(yǎng)菌轉(zhuǎn)接至2YTATG液體培養(yǎng)基,搖至對(duì)數(shù)期后加入M13K07輔助噬菌體感染,28℃培養(yǎng)過(guò)夜擴(kuò)增噬菌體,PEG6000-NaCl沉降純化噬菌體用于下一輪篩選。共進(jìn)行3輪噬菌體庫(kù)富集篩選。實(shí)施例2、抗PCSK9單鏈抗體陽(yáng)性克隆的篩選經(jīng)過(guò)三輪篩選后,挑取分隔良好的單克隆菌落,接種于加有2YTATG液體培養(yǎng)基的96孔深孔板,37℃,220rpm培養(yǎng)約5h至其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,每孔加入約1010的輔助噬菌體M13KO7,37℃靜置30min后150rpm振蕩培養(yǎng)1h。4000rpm,離心15min,沉淀重懸于2YTATKA液體培養(yǎng)基中,28℃,220rpm培養(yǎng)過(guò)夜。4000rpm,4℃離心15min,吸取含噬菌體上清進(jìn)行單克隆ELISA鑒定。篩選得到親和力較高的單鏈抗體DFSK9-1,其重鏈可變區(qū)命名為DFSK9-H1,其氨基酸序列見(jiàn)SEQNO.1;其輕鏈可變區(qū)命名為DFSK9-L1,氨基酸序列見(jiàn)SEQNO.11;SEQNO.1(DFSK9-H1重鏈可變區(qū)序列):QVQLVQSGAEVKRPGASVKVSCKASGGTFTNNAISWVRQAPGQGLEWMGRIIPMFGMANYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAREGIPMIWGQGTTVTVSSSEQNO.11(DFSK9-L1輕鏈可變區(qū)序列):DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDNRLTWYQQKPGKAPKLLIYDASSRQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQPENDPTTFGQGTKVEIK實(shí)施例3、對(duì)單鏈抗體DFSK9-1進(jìn)行體外親和力成熟3.1.構(gòu)建DFSK9-1輕鏈CDR123突變庫(kù)用NheI和NotI對(duì)pScFvDisb-DFSK9-1質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切,酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后,切膠回收大小5.5kb的條帶;用NheI和NotI對(duì)合成的輕鏈突變庫(kù)基因VLCDR123M進(jìn)行雙酶切,通用產(chǎn)物回收試劑盒回收產(chǎn)物。突變庫(kù)基因與載體按摩爾比3:1比例經(jīng)T4DNA連接酶16℃連接4h。將連接產(chǎn)物電擊法轉(zhuǎn)化至XL1-Blue電轉(zhuǎn)感受態(tài)中。37℃,150rpm振動(dòng)培養(yǎng)1h復(fù)蘇。取1%菌液,稀釋后涂小平皿,計(jì)算庫(kù)容量。其余菌液4000rpm離心15min后,沉淀涂布于2YTATG大平皿上,37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。建成的抗體庫(kù)庫(kù)容大約為108,隨機(jī)挑取20個(gè)克隆進(jìn)行序列分析,序列正確率和多樣性都大于90%。3.2.噬菌體抗體庫(kù)的生物淘選和陽(yáng)性克隆的篩選在按照實(shí)施例1和實(shí)施例2的方法進(jìn)行生物淘選和陽(yáng)性克隆篩選,對(duì)親和力較高的克隆進(jìn)行測(cè)序,共得到10種不同的單鏈抗體序列,分別命名為DFSK9-2、DFSK9-3、DFSK9-4、DFSK9-5、DFSK9-6、DFSK9-7、DFSK9-8、DFSK9-9、DFSK9-10、DFSK9-11,對(duì)應(yīng)的輕鏈可變區(qū)命名為DFSK9-L2、DFSK9-L3、DFSK9-L4、DFSK9-L5、DFSK9-L6、DFSK9-L7、DFSK9-L8、DFSK9-L9、DFSK9-L10、DFSK9-L11,它們對(duì)應(yīng)的氨基酸序列分別見(jiàn)SEQNO.12、SEQNO.13、SEQNO.14、SEQNO.15、SEQNO.16、SEQNO.17、SEQNO.18、SEQNO.19、SEQNO.20和SEQNO.21;輕鏈可變區(qū)序列SEQNO.12-SEQNO.21如下:SEQNO.12(DFSK9-L2輕鏈可變區(qū)序列):DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVRNWLDWYQQKPGKAPKLLIYGASTLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDNDIPLTFGQGTKVEIKSEQNO.13(DFSK9-L3輕鏈可變區(qū)序列):DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGINSWLNWYQQKPGKAPKLLIYAASTRETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWNNTPNTFGQGTKVEIKSEQNO.14(DFSK9-L4輕鏈可變區(qū)序列):DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNVNNWLNWYQQKPGKAPKLLIYAASTRETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDNDMPLTFGQGTKVEIKSEQNO.15(DFSK9-L5輕鏈可變區(qū)序列):DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNINSWLNWYQQKPGKAPKLLIYGASSRQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWFDVPTTFGQGTKVEIKSEQNO.16(DFSK9-L6輕鏈可變區(qū)序列):DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNINNWLNWYQQKPGKAPKLLIYGASTRPTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWDDTPNTFGQGTKVEIKSEQNO.17(DFSK9-L7輕鏈可變區(qū)序列):DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIHNWLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNRQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQNSNIPLTFGQGTKVEIKSEQNO.18(DFSK9-L8輕鏈可變區(qū)序列):DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVDSWLTWYQQKPGKAPKLLIYGASNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDSKIPLTFGQGTKVEIKSEQNO.19(DFSK9-L9輕鏈可變區(qū)序列):DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVRNWLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWTDTPLTFGQGTKVEIKSEQNO.20(DFSK9-L10輕鏈可變區(qū)序列):DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVRNWLTWYQQKPGKAPKLLIYGASNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDDSTPPTFGQGTKVEIKSEQNO.21(DFSK9-L11輕鏈可變區(qū)序列):DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRSYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASSRPTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGDSMPMTFGQGTKVEIK單克隆噬菌體ELISA鑒定結(jié)果如圖2所示;3.3.噬菌體水平梯度稀釋ELISA鑒定抗PCSK9單鏈抗體的相對(duì)親和力將本實(shí)施例3.2中獲得的克隆進(jìn)行單克隆噬菌體的展示和純化,進(jìn)行噬菌體水平的梯度稀釋ELISA鑒定單鏈抗體的相對(duì)親和力。用pH7.2的0.01MPBS緩沖液包被PCSK9-His(300ng/孔/100μl),4℃包被過(guò)夜。PBST洗滌3次,PBST-4%milk37℃封閉1h。加入PBST-4%milk五倍梯度稀釋的純化噬菌體樣品(100μl/孔),37℃靜置1h。用PBST洗滌5次,加入PBST-4%milk1:5000稀釋的anti-M13-HRP單克隆抗體(100μl/孔),37℃放置1h。TMB顯色試劑盒顯色(100μl/孔),室溫顯色10min,用2MH2SO4(50μl/孔)終止顯色,。酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450nm和630nm讀數(shù)。使用軟件GraphPadPrism5Demo分析數(shù)據(jù)并作圖,結(jié)果如圖3所示:結(jié)果顯示篩選出的噬菌體單鏈抗體均能與PCSK9進(jìn)行結(jié)合,而且DFSK9-2、DFSK9-4、DFSK9-5、DFSK9-6和DFSK9-8的親和力明顯高于其它克隆,選取上述5個(gè)單鏈抗體進(jìn)行下一步試驗(yàn)。實(shí)施例4、對(duì)篩選出的抗PCSK9的單鏈抗體再次進(jìn)行體外親和力成熟4.1鏈置換法構(gòu)建重鏈CDR123突變庫(kù)用NcoI-HF和KpnI對(duì)實(shí)施例3.3中DFSK9-2、DFSK9-4、DFSK9-5、DFSK9-6和DFSK9-8等5種單鏈抗體的混合質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切,切膠回收大小5.5kb的條帶;用NcoI-HF和KpnI對(duì)合成的重鏈突變庫(kù)基因VHCDR123M進(jìn)行雙酶切,通用回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物。突變庫(kù)基因與載體按摩爾比3:1比例經(jīng)T4DNA連接酶16℃連接4h。將連接產(chǎn)物電擊法轉(zhuǎn)化至XL1電轉(zhuǎn)感受態(tài)中。37℃,150rpm培養(yǎng)1h復(fù)蘇。取1%菌液,稀釋后涂小平皿,計(jì)算庫(kù)容量。其余菌液4000rpm,離心15min后,沉淀涂布于2YTATG大平皿上,37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。構(gòu)建成的抗體庫(kù)庫(kù)容大約為5*108,隨機(jī)挑取20個(gè)克隆進(jìn)行序列分析,正確率和多樣性均大于90%。4.2噬菌體抗體庫(kù)的生物淘選和陽(yáng)性克隆的篩選將實(shí)施例4.1中的抗體庫(kù)進(jìn)行噬菌體展示和純化回收。從該庫(kù)中淘選抗PCSK9的單鏈抗體。噬菌體抗體庫(kù)的生物淘選方法和陽(yáng)性克隆的篩選同實(shí)施案例1和實(shí)施例2。測(cè)序后發(fā)現(xiàn)共篩選到10種不同的抗PCSK9抗體序列,分別命名為DFSK9-12、DFSK9-13、DFSK9-14、DFSK9-15、DFSK9-16、DFSK9-17、DFSK9-18、DFSK9-19、DFSK9-20、DFSK9-21。其中DFSK9-12的輕鏈可變區(qū)序列是DFSK9-L2,對(duì)應(yīng)的氨基酸序列見(jiàn)SEQNO.12;DFSK9-13的輕鏈可變區(qū)序列是DFSK9-L8,對(duì)應(yīng)的氨基酸序列見(jiàn)SEQNO.18;DFSK9-14、DFSK9-16和DFSK9-18的輕鏈可變區(qū)序列是DFSK9-L5,對(duì)應(yīng)的氨基酸序列見(jiàn)SEQNO.15;DFSK9-15、DFSK9-17、DFSK9-20和DFSK9-21的輕鏈可變區(qū)序列是DFSK9-L6,對(duì)應(yīng)的氨基酸序列見(jiàn)SEQNO.16;DFSK9-19的輕鏈可變區(qū)序列是DFSK9-L4,對(duì)應(yīng)的氨基酸序列見(jiàn)SEQNO.14。DFSK9-12的重鏈可變區(qū)序列是DFSK9-H2,對(duì)應(yīng)的氨基酸序列見(jiàn)SEQNO.2;DFSK9-13的重鏈可變區(qū)序列是DFSK9-H8,對(duì)應(yīng)的氨基酸序列見(jiàn)SEQNO.8;DFSK9-14的重鏈可變區(qū)序列是DFSK9-H7,對(duì)應(yīng)的氨基酸序列見(jiàn)SEQNO.7;DFSK9-15的重鏈可變區(qū)序列是DFSK9-H3,對(duì)應(yīng)的氨基酸序列見(jiàn)SEQNO.3;DFSK9-16的重鏈可變區(qū)序列是DFSK9-H6,對(duì)應(yīng)的氨基酸序列見(jiàn)SEQNO.6;DFSK9-17和DFSK9-18的重鏈可變區(qū)序列是DFSK9-H4,,對(duì)應(yīng)的氨基酸序列見(jiàn)SEQNO.4;DFSK9-19的重鏈可變區(qū)是DFSK9-H9,對(duì)應(yīng)的氨基酸序列見(jiàn)SEQNO.9;DFSK9-20的重鏈可變區(qū)是DFSK9-H5,對(duì)應(yīng)的氨基酸序列見(jiàn)SEQNO.5;DFSK9-21的重鏈可變區(qū)序列是DFSK9-H10,對(duì)應(yīng)的氨基酸序列見(jiàn)SEQNO.10。輕鏈可變區(qū)序列參照實(shí)施例3.2中氨基酸序列SEQNO.12、SEQNO.14、SEQNO.15、SEQNO.16和SEQNO.18,重鏈可變區(qū)氨基酸序列SEQNO.2-SEQNO.10如下:SEQNO.2(DFSK9-H2重鏈可變區(qū)序列):QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTVTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWLSFYNGNTNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGYSLDVWGQGTTVTVSSSEQNO.3(DFSK9-H3重鏈可變區(qū)序列):QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTVTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVSFYNGQTNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGYSLDVWGQGTTVTVSSSEQNO.4(DFSK9-H4重鏈可變區(qū)序列):QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTVTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVSFYNGNSNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGYSLDVWGQGTTVTVSSSEQNO.5(DFSK9-H5重鏈可變區(qū)序列):QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSLTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVSFYNGNSNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGFGMDRWGQGTTVTVSSSEQNO.6(DFSK9-H6重鏈可變區(qū)序列):QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTVTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVSFYQGNTNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGFGMDRWGQGTTVTVSSSEQNO.7(DFSK9-H7重鏈可變區(qū)序列):QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSLTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVSFYNGQTNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGYGMSIWGQGTTVTVSSSEQNO.8(DFSK9-H8重鏈可變區(qū)序列):QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSLTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVSFYQGNTNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGYGMTVWGQGTTVTVSSSEQNO.9(DFSK9-H9重鏈可變區(qū)序列):QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSLTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVTFYNGNTNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGFGLSVWGQGTTVTVSSSEQNO.10(DFSK9-H10重鏈可變區(qū)序列):QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSLTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVSFYNGQTNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGYGMDRWGQGTTVTVSS單克隆phageELISA鑒定phage-Abs的相對(duì)親和力如圖4所示。4.3.梯度稀釋噬菌體ELISA鑒定抗PCSK9單鏈抗體的親和力將本實(shí)施例4.2中獲得的克隆進(jìn)行單克隆噬菌體的展示和純化,進(jìn)行噬菌體梯度稀釋ELISA實(shí)驗(yàn)鑒定單鏈抗體的親和力,方法同實(shí)施例3中3.3。結(jié)果如圖5所示:篩選出的10種不同的單鏈抗體均能與PCSK9進(jìn)行很好的結(jié)合,且親和力均高于最初的單鏈DFSK9-1。實(shí)施例5、抗PCSK9全抗體的親和力鑒定5.1抗PCSK9全抗體的制備將實(shí)施例4中篩到抗體的重鏈VH克隆至含有重鏈恒定區(qū)基因(γ4)的載體pTSEG4(圖6)上,輕鏈VK基因克隆到含有輕鏈恒定區(qū)基因(κ鏈)的載體pTSEK(圖7)上,載體pTSEG4和pTSEK均以PTT載體為基礎(chǔ)改造獲得。PTT載體的制備過(guò)程在參考文獻(xiàn)(Yves.Durocher,Sylvie.PerretandAmine.KamenNucleicAcidsResearch,2002Vol.30,No.2e9)中有詳細(xì)描述。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293E細(xì)胞,進(jìn)行全抗體表達(dá)。使用AKTA儀器proteinA親和柱純化獲得全抗體蛋白。5.2全抗體與PCSK9的結(jié)合實(shí)驗(yàn)用pH7.2的0.01MPBS緩沖液包被PCSK9-His(300ng/孔/100μl),4℃包被過(guò)夜。用300μl/孔PBST(1‰Tween20)洗3次,再加入PBST-4%milk37℃封閉1h。加入不同稀釋度的全抗體DFSK9-1,DFSK9-12、DFSK9-13、DFSK9-14、DFSK9-15、DFSK9-16、DFSK9-17、DFSK9-18、DFSK9-19、DFSK9-20和DFSK9-21。11種全抗體最高濃度是50ug/ml,5倍梯度稀釋?zhuān)總€(gè)全抗體做8個(gè)梯度,37℃孵育1h。用300μl/孔PBST洗5次,再加入用PBST-4%milk1:5000稀釋的山羊抗人IgG-HRP二抗37℃孵育1h。用300μl/孔PBST洗5次,TMB顯色試劑盒顯色(100μl/孔),室溫顯色10min,然后用2MH2SO4(50μl/孔)終止顯色。酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450nm和630nm讀數(shù)。使用軟件GraphPadPrism5Demo分析數(shù)據(jù)作圖,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8和表2所示,所有抗體均能很好的與PCSK9分子結(jié)合,其中DFSK9-14、DFSK9-15、DFSK9-16、DFSK9-17、DFSK9-18、DFSK9-20和DFSK9-21具有相對(duì)較高的親和力。表2、全抗體親和力EC50值5.3全抗體競(jìng)爭(zhēng)抑制LDLR與PCSK9結(jié)合實(shí)驗(yàn)用pH7.2的0.01MPBS包被LDLR-Fc(100ng/孔/100μl),4℃包被過(guò)夜。PBST洗滌3次,再加入PBST-4%milk37℃封閉1h。加入PBST-4%milk稀釋的濃度為2μg/ml的PCSK9-His(100μl/孔),37℃孵育1h。加入PBST-4%milk稀釋不同稀釋度的全抗體DFSK9-1,DFSK9-12、DFSK9-13、DFSK9-14、DFSK9-15、DFSK9-16、DFSK9-17、DFSK9-18、DFSK9-19、DFSK9-20和DFSK9-21。11種全抗體最高濃度是100ug/ml,五倍梯度稀釋?zhuān)總€(gè)全抗體做8個(gè)梯度,37℃孵育2h。PBST洗5次,加入用PBST-4%milk稀釋的小鼠抗HisIgG-HRP二抗,37℃孵育1h。TMB顯色試劑盒顯色(100μl/孔),室溫顯色10min,用2MH2SO4(50μl/孔)終止顯色。酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450nm和630nm讀數(shù)。使用軟件GraphPadPrism5Demo作圖,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9和表3所示,所有抗體均能有效的抑制PCSK9與LDLR的結(jié)合,其中DFSK9-14、DFSK9-15、DFSK9-16、DFSK9-17、DFSK9-18、DFSK9-20和DFSK9-21抑制能力稍強(qiáng)一些。表3、全抗體競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)IC50值5.4BIAcoreX100測(cè)定全抗體的親和力采用捕獲法測(cè)定全抗體的親和力。將山羊抗人IgG偶聯(lián)到CM5芯片表面,分別稀釋DFSK9-1、DFSK9-12、DFSK9-13、DFSK9-14、DFSK9-15、DFSK9-16、DFSK9-17、DFSK9-18、DFSK9-19、DFSK9-20和DFSK9-21保證大約200RU左右的抗體被山羊抗人IgG捕獲。將PCSK9設(shè)置一系列的濃度梯度(200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nM、1.5625nM、0.78125nM)流經(jīng)固定相表面,測(cè)定抗體的親和力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)篩出的抗體都具有較高的親和力(見(jiàn)表4),選取親和力最高的8種全抗體進(jìn)行生物學(xué)活性實(shí)驗(yàn)。表4、抗PCSK9全抗體親和力常數(shù)測(cè)定數(shù)值實(shí)例6、抗PCSK9全抗體生物學(xué)活性實(shí)驗(yàn)將HepG2細(xì)胞以2.5X105cells/ml接種到96孔中。次日,將10%FBS的EMEM生長(zhǎng)培養(yǎng)基換成80μl含5%除脂蛋白FBS的分析培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)24h。次日,將分析培養(yǎng)基稀釋的不同稀釋度的全抗體(10μl/孔)加入到已接種HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)板中。8種全抗體樣品初始濃度為900nmol/L,3倍梯度稀釋?zhuān)總€(gè)全抗體做8個(gè)梯度。然后再加入30nmol/L的PCSK9溶液(10μl/孔),混勻后37℃,5%CO2條件下培養(yǎng)4h。每孔加入10ul0.1mg/mLBODIPY標(biāo)記的LDL溶液,混勻后37℃,5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)15-20h。洗滌每孔加入200μlPBS洗滌2次。每孔加入100μlPBS,酶標(biāo)儀波長(zhǎng)490nm和520nm讀取相對(duì)熒光單位RFU數(shù)值。GraphPadPrism5Demo軟件分析數(shù)據(jù)作圖,結(jié)果如圖10所示,以同型IgG為陰性對(duì)照,由圖上可以看出8個(gè)抗體均能以劑量依賴(lài)性方式阻斷PCSK9與低密度脂蛋白受體LDLR結(jié)合,增加低密度脂蛋白LDL在HepG2細(xì)胞內(nèi)攝取率,各抗體之間的生物學(xué)活性相差不多。表5、生物學(xué)活性實(shí)驗(yàn)EC50值No.SampleEC50(nmol/L)No.SampleEC50(nmol/L)1DFSK9-1329.617DFSK9-1718.512DFSK9-1416.598DFSK9-1823.913DFSK9-1515.319DFSK9-2017.954DFSK9-1623.8010DFSK9-2120.33對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言,具體實(shí)施例只是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了示例性描述,顯然本發(fā)明具體實(shí)現(xiàn)并不受上述方式的限制,只要采用了本發(fā)明的方法構(gòu)思和技術(shù)方案進(jìn)行的各種非實(shí)質(zhì)性的改進(jìn),或未經(jīng)改進(jìn)將本發(fā)明的構(gòu)思和技術(shù)方案直接應(yīng)用于其它場(chǎng)合的,均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。<110>北京東方百泰生物科技有限公司.<120>一種全人源的抗PCSK9的單克隆抗體及其獲得方法.<210>1:DFSK9-H1重鏈可變區(qū)氨基酸序列QVQLVQSGAEVKRPGASVKVSCKASGGTFTNNAISWVRQAPGQGLEWMGRIIPMFGMANYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAREGIPMIWGQGTTVTVSS2:DFSK9-H2重鏈可變區(qū)氨基酸序列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTVTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWLSFYNGNTNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGYSLDVWGQGTTVTVSS3:DFSK9-H3重鏈可變區(qū)氨基酸序列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTVTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVSFYNGQTNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGYSLDVWGQGTTVTVSS4:DFSK9-H4重鏈可變區(qū)氨基酸序列:QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTVTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVSFYNGNSNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGYSLDVWGQGTTVTVSS5:DFSK9-H5重鏈可變區(qū)氨基酸序列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSLTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVSFYNGNSNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGFGMDRWGQGTTVTVSS6:DFSK9-H6重鏈可變區(qū)氨基酸序列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTVTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVSFYQGNTNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGFGMDRWGQGTTVTVSS7:DFSK9-H7重鏈可變區(qū)氨基酸序列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSLTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVSFYNGQTNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGYGMSIWGQGTTVTVSS8:DFSK9-H8重鏈可變區(qū)氨基酸序列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSLTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVSFYQGNTNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGYGMTVWGQGTTVTVSS9:DFSK9-H9重鏈可變區(qū)氨基酸序列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSLTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVTFYNGNTNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGFGLSVWGQGTTVTVSS10:DFSK9-H10重鏈可變區(qū)氨基酸序列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSLTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWVSFYNGQTNYAQKLQGRGTMTTDPSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGYGMDRWGQGTTVTVSS11:DFSK9-L1輕鏈可變區(qū)氨基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDNRLTWYQQKPGKAPKLLIYDASSRQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQPENDPTTFGQGTKVEIK12:DFSK9-L2輕鏈可變區(qū)氨基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVRNWLDWYQQKPGKAPKLLIYGASTLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDNDIPLTFGQGTKVEIK13:DFSK9-L3輕鏈可變區(qū)氨基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGINSWLNWYQQKPGKAPKLLIYAASTRETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWNNTPNTFGQGTKVEIK14:DFSK9-L4輕鏈可變區(qū)氨基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNVNNWLNWYQQKPGKAPKLLIYAASTRETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDNDMPLTFGQGTKVEIK15:DFSK9-L5輕鏈可變區(qū)氨基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNINSWLNWYQQKPGKAPKLLIYGASSRQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWFDVPTTFGQGTKVEIK16:DFSK9-L6輕鏈可變區(qū)氨基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNINNWLNWYQQKPGKAPKLLIYGASTRPTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWDDTPNTFGQGTKVEIK17:DFSK9-L7輕鏈可變區(qū)氨基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIHNWLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNRQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQNSNIPLTFGQGTKVEIK18:DFSK9-L8輕鏈可變區(qū)氨基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVDSWLTWYQQKPGKAPKLLIYGASNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDSKIPLTFGQGTKVEIK19:DFSK9-L9輕鏈可變區(qū)氨基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVRNWLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWTDTPLTFGQGTKVEIK20:DFSK9-L10輕鏈可變區(qū)氨基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVRNWLTWYQQKPGKAPKLLIYGASNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDDSTPPTFGQGTKVEIK21:DFSK9-L11輕鏈可變區(qū)氨基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRSYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASSRPTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGDSMPMTFGQGTKVEIK22:DFSK9-L1輕鏈CDR1區(qū)氨基酸序列RASQSIDNRLT23:DFSK9-L2輕鏈CDR1區(qū)氨基酸序列RASQSVRNWLD24:DFSK9-L3輕鏈CDR1區(qū)氨基酸序列RASQGINSWLN25:DFSK9-L4輕鏈CDR1區(qū)氨基酸序列RASQNVNNWLN26:DFSK9-L5輕鏈CDR1區(qū)氨基酸序列RASQNINSWLN27:DFSK9-L6輕鏈CDR1區(qū)氨基酸序列RASQNINNWLN28:DFSK9-L7輕鏈CDR1區(qū)氨基酸序列RASQGIHNWLN29:DFSK9-L8輕鏈CDR1區(qū)氨基酸序列RASQDVDSWLT30:DFSK9-L9輕鏈CDR1區(qū)氨基酸序列RASQSVRNWLN31:DFSK9-L10輕鏈CDR1區(qū)氨基酸序列RASQDVRNWLT32:DFSK9-L11輕鏈CDR1區(qū)氨基酸序列RASQSIRSYLN33:DFSK9-L1輕鏈CDR2區(qū)氨基酸序列DASSRQS34:DFSK9-L2輕鏈CDR2區(qū)氨基酸序列GASTLES35:DFSK9-L3和DFSK9-L4輕鏈CDR2區(qū)氨基酸序列AASTRET36:DFSK9-L5輕鏈CDR2區(qū)氨基酸序列GASSRQS37:DFSK9-L6輕鏈CDR2區(qū)氨基酸序列GASTRPT38:DFSK9-L7輕鏈CDR2區(qū)氨基酸序列DASNRQS39:DFSK9-L8和DFSK9-L10輕鏈CDR2區(qū)氨基酸序列GASNLAS40:DFSK9-L9輕鏈CDR2區(qū)氨基酸序列DASNLQS41:DFSK9-L11輕鏈CDR2區(qū)氨基酸序列DASSRPT42:DFSK9-L1輕鏈CDR3區(qū)氨基酸序列QQPENDPTT43:DFSK9-L2輕鏈CDR3區(qū)氨基酸序列QQDNDIPLT44:DFSK9-L3輕鏈CDR3區(qū)氨基酸序列QQWNNTPNT45:DFSK9-L4輕鏈CDR3區(qū)氨基酸序列QQDNDMPLT46:DFSK9-L5輕鏈CDR3區(qū)氨基酸序列QQWFDVPTT47:DFSK9-L6輕鏈CDR3區(qū)氨基酸序列QQWDDTPNT48:DFSK9-L7輕鏈CDR3區(qū)氨基酸序列QQNSNIPLT49:DFSK9-L8輕鏈CDR3區(qū)氨基酸序列QQDSKIPLT50:DFSK9-L9輕鏈CDR3區(qū)氨基酸序列QQWTDTPLT51:DFSK9-L10輕鏈CDR3區(qū)氨基酸序列QQDDSTPPT52:DFSK9-L11輕鏈CDR3區(qū)氨基酸序列QQGDSMPMT53:DFSK9-H1重鏈CDR1區(qū)氨基酸序列GGTFTNNA54:DFSK9-H2、DFSK9-H3、DFSK9-H4和DFSK9-H6重鏈CDR1區(qū)氨基酸序列GYTVTSYG55:DFSK9-H5、DFSK9-H7、DFSK9-H8、DFSK9-H9和DFSK9-H10重鏈CDR1區(qū)氨基酸序列GYSLTSYG56:DFSK9-H1重鏈CDR2區(qū)氨基酸序列RIIPMFGMA57:DFSK9-H2重鏈CDR2區(qū)氨基酸序列WLSFYNGNT58:DFSK9-H9重鏈CDR2區(qū)氨基酸序列WVTFYNGNT59:DFSK9-H6和DFSK9-H8重鏈CDR2區(qū)氨基酸序列WVSFYQGNT60:DFSK9-H3、DFSK9-H7和DFSK9-H10重鏈CDR2區(qū)氨基酸序列WVSFYNGQT61:DFSK9-H4和DFSK9-H5重鏈CDR2區(qū)氨基酸序列WVSFYNGNS62:DFSK9-H1重鏈CDR3區(qū)氨基酸序列AREGIPMI63:DFSK9-H2、DFSK9-H3和DFSK9-H4重鏈CDR3區(qū)氨基酸序列ARGYSLDV64:DFSK9-H7重鏈CDR3區(qū)氨基酸序列ARGYGMSI65:DFSK9-H5、DFSK9-H6和DFSK9-H10重鏈CDR3區(qū)氨基酸序列ARGFGMDR66:DFSK9-H8重鏈CDR3區(qū)氨基酸序列ARGYGMTV67:DFSK9-H9重鏈CDR3區(qū)氨基酸序列ARGFGLSV當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3