本發(fā)明涉及T淋巴細胞
技術領域：
，尤其涉及一種CAR表達載體及其構建方法。
背景技術：
：CAR-T細胞(ChimericantigenreceptorTcell，嵌合抗原受體T細胞)即是表達嵌合抗原受體修飾的T細胞，而CAR-T細胞的嵌合抗原受體(Chimericantigenreceptor，CAR)包括胞膜外抗原結合區(qū)、鉸鏈區(qū)和胞內信號傳導區(qū)三部分構成。其中，胞膜外抗原結合區(qū)是一段單鏈可變區(qū)結構域(singlechainFvdomain，scFv)，具有特異性識別并結合TAA(tumor-associatedantigen，腫瘤相關性抗原)的功能。scFv的構成是將單克隆抗體的重鏈可變區(qū)(thevariableregionofheavychain，VH)和輕鏈可變區(qū)(thevariableregionoflightchain，VL)用一可彎曲的多肽接頭(Linker)將VH和VL連接起來，構成VH-Linker-VL或VL-Linker-VH。鉸鏈區(qū)通常是由免疫球蛋白超家族組成，比如CD8、CD28和IgG。胞內信號傳導區(qū)包括共刺激分子(costimulatorymolecule，CM)和免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptortyrosine-basedactivationmotifs，ITAM)，其中，CM通常為CD28，ITAM通常為CD3ζ或FcεRIγ。表達CAR的T細胞可通過scFv直接識別并結合腫瘤細胞表面的TAA，CAR將信號傳入T細胞內，激活T細胞分泌細胞因子包括穿孔素、顆粒酶、INF-γ、TNF-a等，從而發(fā)揮殺傷腫瘤細胞作用。因此，CAR-T細胞是MHC非限制性的。CAR-T細胞將抗體-抗原特異性結合能力以及T細胞介導的殺傷功能結合于一體，是免疫抗腫瘤治療的重要方法。嵌合性抗原受體方法應用的關鍵是確定一種腫瘤相關性抗原，在腫瘤細胞表面高表達，而在正常組織中無表達或者低表達。原癌基因人上皮生長因子受體2(humanepidermalgrowthfactorreceptor2，Her-2/neu)又稱HER2或c-erbB-2基因，在多種腫瘤的發(fā)病及臨床進程中發(fā)揮重要作用，體外與動物實驗己明確顯示Her-2/neu基因擴增、蛋白過度表達在致瘤轉化和腫瘤發(fā)展中起著關鍵作用。研究證實：30％以上的人類腫瘤組織中，如乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌、輸卵管癌、宮頸癌、前列腺癌、胃癌、唾液腺癌、舌癌、頭頸部鱗癌、非小細胞性肺癌等，均伴有Her-2/neu基因的擴增及p185蛋白的過度表達，而正常組織中p185蛋白為陰性或微量表達。而在乳腺癌中，大約有1/3的病人過表達HER2蛋白。過表達HER2蛋白使腫瘤的侵襲性更強，是乳腺癌病人預后不良的獨立的危險因素。盡管抗HER2單克隆抗體(如曲妥株單抗)在臨床的應用使部分病人獲益，但是其價格昂貴，很大程度上限制了其大規(guī)模臨床應用。HER2蛋白位于細胞表面，容易被抗體識別，因此，HER2蛋白可作為CAR-T細胞抗腫瘤治療的一個理想靶點。CAR-T細胞是由CAR表達載體與T細胞進行基因重組而成的，然而，現(xiàn)有技術中并未提供表達抗HER2單克隆抗體的CAR表達載體，導致現(xiàn)有的CAR-T細胞并不能以HER2蛋白為靶向而直接識別并結合HER2蛋白，導致CAR無法將信號傳入T細胞內，而無法分泌殺傷高表達HER2蛋白的腫瘤細胞的細胞因子。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的主要目的在于提供一種CAR表達載體，旨在表達抗HER2單克隆抗體，而使CAR-T細胞的CAR以HER2蛋白為靶向直接識別并結合腫瘤細胞表面高表達的HER2蛋白。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種CAR表達載體，包括載體和接入所述載體的CAR，所述CAR包括胞膜外抗原結合區(qū)、鉸鏈區(qū)和胞內信號傳導區(qū)，所述胞膜外抗原結合區(qū)為用于結合HER2蛋白的chA21scFv；所述胞內信號傳導區(qū)為CD28-X-ITAM，其中，所述X為ICOS、CD137、CD134、CD80或者CD86共刺激分子。優(yōu)選地，所述X為ICOS共刺激分子。優(yōu)選地，所述載體為病毒質粒。此外，為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供一種如上所述的CAR表達載體的構建方法，包括步驟如下：獲取所述chA21scFv的基因片段、所述鉸鏈區(qū)的基因片段、所述CD28的基因片段、所述X的基因片段以及所述ITAM的基因片段；提供引導鏈，基因融合所述引導鏈與所述chA21scFv的基因片段，而形成引導鏈-chA21scFv；基因融合所述鉸鏈區(qū)的基因片段、所述CD28的基因片段、所述X的基因片段和所述ITAM的基因片段，而形成鉸鏈區(qū)-CD28-X-ITAM；基因融合所述引導鏈-chA21scFv和所述鉸鏈區(qū)-CD28-X-ITAM，而形成引導鏈-chA21scFv-鉸鏈區(qū)-CD28-X-ITAM；將所述引導鏈-chA21scFv-鉸鏈區(qū)-CD28-X-ITAM接入載體，而獲得CAR表達載體。優(yōu)選地，所述獲取所述chA21scFv的基因片段、所述鉸鏈區(qū)的基因片段、所述CD28的基因片段、所述X的基因片段以及所述ITAM的基因片段的過程中，包括步驟如下：獲取并激活PMBCs；提取所述PMBCs的mRNA并反轉錄為cDNA；分別提供所述鉸鏈區(qū)的引物、所述CD28的引物、所述X的引物和所述ITAM的引物，且均以所述PMBCs的cDNA為模板，分別進行PCR擴增，而獲得所述鉸鏈區(qū)的基因片段、所述CD28的基因片段、所述X的基因片段以及所述ITAM的基因片段；提供所述chA21scFv的模板DNA和所述chA21scFv的引物，并進行PCR擴增，而獲得所述chA21scFv的基因片段。優(yōu)選地，所述載體為病毒質粒。本發(fā)明技術方案，通過表達chA21scFv而識別和結合腫瘤細胞表面高表達的HER2蛋白，并通過胞內信號傳導區(qū)將信號傳入T細胞，從而活化T細胞，促進T細胞分泌細胞因子，該細胞因子進而可以殺傷高表達HER2蛋白的腫瘤細胞。而且，胞內信號傳導區(qū)整合了CD28共刺激分子以及X共刺激分子，可使T細胞持續(xù)活化增殖，細胞因子持續(xù)分泌，增強殺傷腫瘤細胞作用。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術中的技術方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖示出的內容獲得其他的附圖。圖1為本發(fā)明實施例1制備的CAR表達載體的基因結構圖；圖2為ELISA法檢測本發(fā)明實施例1制備的CAR-T細胞及現(xiàn)有的NT-T細胞分別與HER2+/-腫瘤細胞的共培養(yǎng)后的IFN-γ分泌量的柱狀圖；圖3為ELISA法檢測本發(fā)明實施例1制備的CAR-T細胞及現(xiàn)有的NT-T細胞分別與HER2+/-腫瘤細胞的共培養(yǎng)后的IL-2分泌量的柱狀圖；圖4為ELISA法檢測本發(fā)明實施例1制備的CAR-T細胞的HER2特異性的統(tǒng)計圖；圖5為51Cr釋放試驗檢測本發(fā)明實施例1制備的CAR-T細胞對乳腺癌細胞的特異性殺傷作用的統(tǒng)計圖。具體實施方式下面將結合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明的一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。本發(fā)明提供一種CAR表達載體，該CAR表達載體包括載體和接入該載體的CAR，該CAR包括胞膜外抗原結合區(qū)、鉸鏈區(qū)和胞內信號傳導區(qū)，胞膜外抗原結合區(qū)為用于結合HER2蛋白的chA21scFv；胞內信號傳導區(qū)為CD28-X-ITAM，其中，X為ICOS、CD137、CD134、CD80或者CD86共刺激分子。本發(fā)明CAR表達載體通過表達chA21scFv而識別和結合腫瘤細胞表面高表達的HER2蛋白，并通過胞內信號傳導區(qū)將信號傳入T細胞，從而活化T細胞，促進T細胞分泌細胞因子，該細胞因子進而可以殺傷高表達HER2蛋白的腫瘤細胞。而且，胞內信號傳導區(qū)整合了CD28共刺激分子以及X共刺激分子，可使T細胞持續(xù)活化增殖，細胞因子持續(xù)分泌，增強殺傷腫瘤細胞作用。需要說明的是，在該CAR的結構中，chA21為采用表面包埋法(surfaceepitopemaskingmethod，SEM)生產(chǎn)的人源化單克隆抗體A21，是一種抗ErbB2抗體，其具有很強的結合特異性和抑瘤活性；chA21可特異性識別HER2胞外區(qū)C-端的第I結構域，遠離HER2受體二聚化功能位，因此，本發(fā)明以抗HER2的chA21為基礎構建CAR-T細胞；chA21scFv由chA21單克隆抗體的重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域通過多肽接頭連接形成，由于不少供應商或科研機構已經(jīng)成功合成chA21scFv，且合成方法也為現(xiàn)有技術，故該chA21scFv可以直接由供應商或科研機構提供。鉸鏈區(qū)可以是CD3、CD4、CD8、或者CD28，具體視實際情況而定。胞內信號傳導區(qū)的共刺激分子X可為ICOS、CD137、CD134、CD80或者CD86共刺激分子，均可起到傳導信號的作用，實現(xiàn)T細胞持續(xù)活化增殖，細胞因子持續(xù)分泌，增強殺傷腫瘤細胞的目的；胞內信號傳導區(qū)的ITAM通常為CD3ζ或者FcεRIγ。進一步地，該載體為病毒質粒，可以為逆轉錄病毒質粒，也可以為慢病毒質粒，其實質是以質粒的形式存在的病毒。本發(fā)明還提供一種上述的CAR表達載體的構建方法，包括步驟如下：S1、獲取chA21scFv的基因片段、鉸鏈區(qū)的基因片段、CD28的基因片段、X的基因片段以及ITAM的基因片段；S2、提供引導鏈，基因融合引導鏈與chA21scFv的基因片段，而形成引導鏈-chA21scFv；S3、基因融合鉸鏈區(qū)的基因片段、CD28的基因片段、X的基因片段和ITAM的基因片段，而形成鉸鏈區(qū)-CD28-X-ITAM；S4、基因融合引導鏈-chA21scFv和鉸鏈區(qū)-CD28-X-ITAM，而形成引導鏈-chA21scFv-鉸鏈區(qū)-CD28-X-ITAM；S5、將引導鏈-chA21scFv-鉸鏈區(qū)-CD28-X-ITAM接入載體，而獲得CAR表達載體。通過PCR擴增技術和重疊PCR技術，將chA21scFv的基因片段、鉸鏈區(qū)的基因片段、CD28的基因片段、X的基因片段以及ITAM的基因片段進行基因融合，而構建CAR表達載體，其構建方式高效、簡單。需要說明的是，該引導鏈優(yōu)選為人CD8α引導鏈，人CD8α引導鏈可以從人CD8α細胞中提取，也可以從相應的供應商中獲取，而人CD8α引導鏈的引物可由相應的供應商提供。進一步地，步驟S1具備包括如下步驟：S10、獲取并激活PMBCs(peripheralbloodmononuclearcells，外周血單核細胞)；S11、提取PMBCs的mRNA并反轉錄為cDNA；S12、分別提供鉸鏈區(qū)的基因的引物、CD28的引物、X的引物和ITAM的引物，且均以PMBCs的cDNA為模板，分別進行PCR擴增，而獲得鉸鏈區(qū)的基因片段、CD28的基因片段、X的基因片段以及ITAM的基因片段；S13、提供chA21scFv的模板DNA和chA21scFv的引物，并進行PCR擴增，而獲得chA21scFv的基因片段。通過PMBCs獲得T細胞的mRNA，然后將mRNA反轉錄為cDNA，從而為不同種類的T細胞的基因片段的擴增提供了模板，同時通過現(xiàn)有的chA21scFv的模板DNA和chA21scFv的引物對chA21scFv進行PCR擴增，顯然，上述PCR擴增高效、簡便，有利于提供CAR表達載體的構建。進一步地，該載體為病毒質粒，可以為逆轉錄病毒質粒，也可以為慢病毒質粒，其實質是以質粒的形式存在的病毒?，F(xiàn)通過實施例1對本發(fā)明CAR表達載體及其構建方法、CAR-T細胞的制備方法以及CAR-T細胞抗HER2的效果做進一步解釋和說明，在該CAR-T細胞中，CAR的胞內信號傳導區(qū)的X共刺激分子優(yōu)選為ICOS共刺激分子，CAR-T細胞具體構建方式參見如下詳述的內容。同理，根據(jù)下述的構建方式，可以構建X共刺激分子為其他共刺激分子時的CAR-T細胞，至于X共刺激分子的引物序列可以從NCBI的GenBank中查找獲得，X共刺激分子的引物可以相應的商家中購買獲得，也可以自行設計。實施例1一、本發(fā)明實施例所用到的材料及試劑1、人外周血單核細胞三位健康志愿者的外周血單核細胞來源于北京大學深圳醫(yī)院腫瘤介入科。2、細胞系人乳腺癌細胞株SKBR3，T47D，MCF-7，MDA-MB-231和卵巢癌細胞株SKOV3，0VCAR3，A1847和A2780，以及HER2陰性的腫瘤細胞株MDA-MB-468(購買于ATCC)。TC-1是HPV-16轉染的小鼠肺癌細胞，用來作為人HER2陰性表達的對照，也購買于ATCC。293T細胞購買于ATCC。3、試劑(1)RPMI-1640培養(yǎng)基(Invitrogen公司)(2)滅活胎牛血清(Invitrogen公司)(3)青一鏈霉素10000U/ml10000IU/ml(Invitrogen公司)(4)抗CD3/抗CD28磁珠(Invitrogen公司)(5)重組人白介素-2(IL-2)(PeproTech公司)(6)DMSO(二甲基亞砜)(Invitrogen公司)(7)0.25％胰酶(Invitrogen公司)(8)LTS1077淋巴細胞分層液(上海研謹生物科技有限公司)(9)mRNA提取試劑盒(Invitrogen公司)(10)反轉錄試劑盒(Invitrogen公司)(11)PCR試劑盒(Invitrogen公司)(12)PCR產(chǎn)物純化試劑盒(Qiagen公司)(13)含有人源化抗HER2的chA21scFv的質粒PEE14-chA21(中國科技大學提供)(14)人CD8α引導鏈(CD8αleader鏈)(Takara公司)(15)人CD8α引導鏈的正向引物AF(Takara公司)(16)CD8α鉸鏈區(qū)(CD8αhinge)的正向引物CF和反向引物CR(Takara公司)(17)CD28的正向引物DF和反向引物DR(Takara公司)(18)ICOS的正向引物GF和反向引物GR(Takara公司)(19)CD3ζ的正向引物EF和反向引物ER(Takara公司)(20)chA21scFv的正向引物BF和反向引物BR(Takara公司)(21)pMD.G質粒、pMDLg/p質粒、Rev表達質粒(Qiagen公司)(22)FITC標記的山羊抗鼠F(ab’)2抗體(JacksonImmunoResearch公司)(23)APCCY7標記的抗人-CD3，PE標記的抗人-CD45，F(xiàn)ITC抗人-CD4，PE抗人-CD4，APC抗人-CD8，PE抗人CD45RO，APC抗人CD62L抗體(Biolegend公司)(24)IFN-γELISA試劑盒(Biolegend公司)(25)IL-2ELISA試劑盒(Biolegend公司)(26)HER2-Fc嵌合蛋白(R&DSystems公司)(27)CD19-Fc嵌合蛋白(SPEEDBioSystems公司)(28)鉻酸鈉(Na251CrO4)(DuPontNEN公司)(29)FITC兔抗人HER2抗體(Clone24D2，Biolegend公司)(30)脂質體2000(Invitrogen公司)(31)凝聚胺(Sigma公司)4、引物序列表表一二、本實施例的技術方案(一)、外周血單核細胞的分離與激活1、人外周血單核細胞(peripheralbloodmononuclearcell，PBMC)的分離(1)抗凝血管抽取健康志愿者的外周血15ml；(2)向該抗凝血管中加入等體積的PBS，輕輕吹打成細胞懸液30ml；(3)另取兩支50ml離心管，向一離心管加入15ml的LTS1077淋巴細胞分層液；然后，用吸管吸取15ml的細胞懸液，在距離LTS1077淋巴細胞分層液上方1cm處將細胞懸液小心而緩慢的加入，使細胞懸液重疊于LTS1077淋巴細胞分層液上，2000rpm離心20min；(4)取出離心后的離心管，移液管吸去最上層的血漿，移液槍吸取血漿層下的單個核細胞置入另一離心管中；然后，加入l5ml的PBS洗滌，輕輕吹打均勻后再次離心，1500rpm，l0min，去掉上清；共洗滌3次；(5)向去掉上清后的離心管內加入含10％滅活胎牛血清、100U/ml青一鏈霉素、100U/mlIL-2的RPMI-1640培養(yǎng)基，放置于37℃，5％CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，而分離獲得PBMC細胞制劑。2、人外周血單核細胞的激活(1)取步驟1獲得的PBMC細胞制劑，于24孔板中種植1x106個PBMC細胞(1×106/ml)；(2)按照免疫磁珠分選試劑盒的說明書的方法，用PBS將包被抗CD3/CD28的磁珠洗3遍；(3)將磁珠按3:1(磁珠:細胞)比例加入PBMC細胞中，放置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；(4)細胞激活12～24小時后，離心，收取被激活的人外周血單核細胞，用作提mRNA并反轉錄為cDNA。(二)、提取激活的外周血單核細胞的mRNA并反轉錄為cDNA1、外周血單核細胞的mRNA的提取(1)取出被激活后的人外周血單核細胞1.5×106個，用PBS沖洗2遍；(2)去掉上清后，向細胞沉淀中加入1.5ml的Trizol，吹打成均勻細胞懸浮液；(3)采用1ml注射器來回抽吸細胞懸浮液，以剪切基因組DNA，然后用注射器直接將樣品轉移到一新的1.5ml的EP管中；(4)向EP管中加入250μl的氯仿，劇烈震蕩30sec，12000rpm離心5min；(5)將離心后產(chǎn)生的上清移至另一新的1.5ml的Ep管中，并加入等體積的異丙醇，室溫放置5min；(6)12000rpm離心5min，吸走上清液；(7)向吸走上清液后的Ep管中加入70％的乙醇750μl，不需吹打，12000rpm離心2min；(8)盡可能徹底吸走離心后產(chǎn)生的上清，室溫干燥使乙醇揮發(fā)，而形成沉淀；(9)向該沉淀加入60μl的DEPC(diethylpyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)水，而溶解該沉淀，即溶解外周血單核細胞的mRNA；(10)取溶解的mRNA3μl，加至1ml的DEPC水中，采用紫外分光光度計測量260nm和280nm的吸光度值：OD260/280＝1.9～2.0；按1OD＝40μg的mRNA計算mRNA的產(chǎn)率，OD260/280在1.9～2.0視為提取的mRNA純度很高；(11)用提取的RNA產(chǎn)物來進行下一步的RT反應。2、RT(ReverseTranscription，反轉錄)反應(1)將步驟1提取的mRNA與其他試劑構成如下的反應體系：試劑體積mRNA1.5μlOligodT-AdaptorPrimer(引物)1μldNTPMixture(各10nM)2μlAMVReverseTranscriptase1μl10×RTBuffer1.5μlRNaseFreedH2O3.75μlMgCl22μlRNaseInhibitor0.25μlTotal13μl(2)RT反應條件：室溫，10min；42℃，1h；99℃，5min滅活AMVReverseTranscriptase；進而反轉錄獲得PMBCs的cDNA；(3)將反轉錄得到的PMBCs的cDNA置于-80℃冰箱保存，備用。(三)、靶向HER2的嵌合性抗原受體(CAR)載體的構建1、PCR擴增chA21scFv、CD8αhinge、CD28、ICOS和CD3ζ1.1、PCR擴增chA21scFva、提供chA21scFv的DNA模板及chA21scFv的引物：chA21scFv的DNA模板由中國科技大學提供的質粒PEE14-chA21獲得；chA21scFv的正向引物BF和反向引物BR由Takara公司提供，其引物系列具體見上表一)；b、按照如下的PCR反應體系和PCR反應條件獲得PCR產(chǎn)物；PCR反應體系：試劑體積DNA模板(chA21scFv)1.5μl(75ng)10×PCRbuffer7.5μl10mMdNTP1.5μl10um正向引物BF3μl10um反向引物BR3μl50mMMgSO43μlTaqDNA聚合酶1μl(5單位)加三蒸水至80μlPCR反應條件：c、電泳配制瓊脂糖凝膠(20g/L)：稱取0.6g的瓊脂糖凝膠粉，加入30ml的TAE電泳緩沖液，混勻后放入微波爐中加熱45s，加入1ul的EB液，混勻后灌注，室溫冷卻；向電泳槽中加入適量TAE電泳緩沖液，用DL2000作為DNAMarker，向樣本孔中加入5u1的上述PCR產(chǎn)物，調節(jié)電泳儀電壓為90mV，電泳半小時；d、結果觀察利用數(shù)碼凝膠圖像采集與分析系統(tǒng)進行掃描分析可知：上述PCR產(chǎn)物為chA21scFv基因片段；e、PCR產(chǎn)物回收(1)將電泳后余下的PCR產(chǎn)物轉移至2ml的EP管中，加入300ul的PB緩沖液，充分混勻；(2)吸附：QIAquick柱子鏈接2ml的EP管，將含PCR產(chǎn)物的PB緩沖液緩慢加入QIAquick柱子，13000轉/分離心30秒；(3)洗滌：棄去EP管中的液體，向QIAquick柱子中加入800ul的PE緩沖液，13000轉/分離心30秒；(4)棄去EP管中的液體，13000轉/分離心1分鐘；(5)洗脫：將QIAquick柱子置于新的1.5ml的EP管中，向柱子中加入60ul的EB緩沖液，13000轉/分離心1分鐘，棄去EP管中的液體而回收PCR產(chǎn)物；(6)將回收后的PCR產(chǎn)物置于-20℃冰箱保存。1.2、PCR擴增CD8αhinge、CD28和CD3ζa、提供引物以及步驟(二)制得的PBMCs的cDNA：CD8αhinge的正向引物CF和反向引物CR由Takara公司提供，其引物系列見上表一；CD28的正向引物DF和反向引物DR由Takara公司提供，其引物系列見上表一；ICOS的正向引物DF和反向引物DR由Takara公司提供，其引物系列見上表一；CD3ζ的正向引物EF和反向引物ER由Takara公司提供，其引物系列見上表一；b、按照如下的PCR反應體系和PCR反應條件獲得PCR產(chǎn)物；PCR反應體系：PCR反應條件：與PCR擴增chA21scFv的PCR反應條件相同；c、PCR產(chǎn)物回收(與PCR擴增chA21scFv的PCR產(chǎn)物回收的步驟相同)，進而獲得CD8αhinge/CD28/ICOS/CD3ζ的PCR產(chǎn)物。2、重疊PCR而進行基因融合2.1、提供CD8αleader鏈(CD8α引導鏈)，將CD8αleader鏈與PCR擴增后的chA21scFv進行基因融合，而形成CD8αleader-chA21scFv：a、第一步PCR反應，其反應體系和反應時間如下；第一步PCR反應體系：試劑體積CD8αleader鏈～50ng擴增后的chA21scFv～50ng10×PCRbuffer5μl10mMdNTP1μl50mMMgSO42μlTaqDNA聚合酶0.2μl加水至50μl第一步PCR反應條件：b、第二步PCR反應，其反應體系和反應時間如下；第二步PCR反應體系：向第一步PCR反應完成后的體系中加入CD8αleader鏈的正向引物AF(其引物系列如表一所示)以及chA21scFv的反向引物BR(其引物序列如表一所示)各2ul；第二步PCR反應條件：e、將第二步PCR反應的PCR產(chǎn)物進行電泳，數(shù)碼凝膠圖像采集與分析系統(tǒng)進行掃描分析，而證明第二步PCR反應的PCR產(chǎn)物為CD8αleader-chA21scFv；f、第二步PCR反應的PCR產(chǎn)物回收(與PCR擴增chA21scFv的PCR產(chǎn)物回收的步驟相同)，而獲得CD8αleader-chA21scFv；2.2、將擴增后的CD8αhinge與擴增后的CD28進行基因融合，獲得CD8αhinge-CD28；將CD8αhinge-CD28與擴增后的ICOS進行基因融合，獲得CD8αhinge-CD28-ICOS；將CD8αhinge-CD28-ICOS與擴增后的CD3ζ進行基因融合，獲得CD8αhinge-CD28-ICOS-CD3ζ；將CD8αleader-chA21scFv與CD8αhinge-CD28-ICOS-CD3ζ進行基因融合，獲得CD8αleader-chA21scFv-CD8αhinge-CD28-ICOS-CD3ζ，其基因結構如圖1所示；具體方法同上，其中，CD8αhinge與CD28融合過程中所添加的引物為CF，DR；CD8αhinge-CD28與ICOS融合過程中所添加的引物為CF，GR；CD8αhinge-CD28-ICOS與CD3ζ融合過程中所添加的引物為CF，ER；CD8αleader-chA21scFv與CD8αhinge-CD28-ICOS-CD3ζ融合過程中所添加的引物為AF，ER(引物序列如表一所示)。將PCR產(chǎn)物進行電泳，數(shù)碼凝膠圖像采集與分析系統(tǒng)進行掃描分析，最終回收PCR產(chǎn)物CD8αleader-chA21scFv-CD8αhinge-CD28-ICOS-CD3ζ。3、將CD8αleader-chA21scFv-CD8αhinge-CD28-ICOS-CD3ζ交由美國劍橋加基因公司(Addgene，Cambridge，MA，USA)接入pSin(慢病毒)骨架形成pSin-chA21-28ζ質粒，即CAR表達載體。(四)包裝CAR表達載體(包裝pSin-chA21-28ζ慢病毒質粒)，而制得感染混合物1、293T細胞傳代培養(yǎng)及準備a、293T細胞復蘇及培養(yǎng)(1)細胞培養(yǎng)基：配置含10％滅活胎牛血清、100U/ml青一鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基；(2)從液氮罐取出凍存的293T細胞，迅速放入37℃水浴鍋，凍存的293T細胞融化后，在超凈臺內將細胞懸液移入離心管中，加入4ml的RPMI-1640培養(yǎng)基，放入離心機中，1000轉/分離心3～4分鐘；(3)棄去上清液，加入1ml配制的RPMI-1640培養(yǎng)基輕輕吹打成細胞懸液，移入75cm2細胞培養(yǎng)瓶中，加入RPMI-1640培養(yǎng)基至10ml，放入37℃，5％CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24小時后給予換液；b、293T細胞傳代培養(yǎng)皿中的細胞布滿約80～90％時進行傳代。將舊的培養(yǎng)基吸走，向培養(yǎng)皿中加入2～3ml的PBS沖洗1遍，吸走PBS，向培養(yǎng)皿中加入0.25％的胰蛋白酶2ml，消化3～5min，注意在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化，當見到細胞回縮，形態(tài)變圓，細胞間連接間隙增大時，向培養(yǎng)皿中加5ml的RPMI-1640培養(yǎng)基終止消化，吸管反復吹打使細胞脫落，制成細胞懸液后，按大約1:3比例傳代培養(yǎng)；c、293T細胞凍存(1)生長狀態(tài)良好的細胞，布滿培養(yǎng)瓶約80～90％時可以凍存。細胞消化后吹打成細胞懸液，移入15ml離心管中，放入離心機中，1000轉/分離心3～4分鐘；(2)棄去上清液，加入含10％二甲基亞砜的滅活胎牛血清1ml，輕輕吹打成細胞懸液，移入細胞凍存管中，做好標記，置入冰上，并迅速投入液氮罐中保存。2、慢病毒質粒的包裝(1)取出凍存的293T細胞，并置于75cm2的細胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)；選取融合度60～70％的293T細胞，換液后三小時后備用；(2)將3種包裝質粒pMD.G、pMDLg/p、Rev及pSin-chA21-28z質粒按下表比例于1ml無血清無雙抗的37℃預熱的RPMI-1640中混合均勻，室溫孵育5分鐘，而獲得質?；旌衔铮籶MDLg/p5.5μgRev3μgpMD.G4.5μgpSin-chA21-28z13μg總計26μg(3)將26μg的上述質?；旌衔锱c39μl脂質體2000(質粒與脂質體2000的比率為1μg:1.5μl)逐滴加入1ml無血清無抗生素的RPMI-1640中輕輕混合均勻，室溫孵育5分鐘，而獲得混合液；(4)將最終的脂質體2000及質粒共混物的混合液逐滴加到293T細胞培養(yǎng)皿中，輕輕混合均勻，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(5)收集轉染24小時和48小時的293T細胞上清液；(6)取收集的293T細胞上清液約35ml，收集于50ml離心管中，2000轉，10分鐘，去除293T細胞碎片，而獲得去碎片后的上清液；(7)將步驟(6)獲得的上清液置于冰上，用60ml注射器連接0.45μm針頭濾器將離心后的上清液過濾于35ml超速離心管中，25000轉，3小時；(8)將離心管輕輕取出，置于冰上；(9)在病毒專用超凈臺中，打開金屬離心管，吸去部分離心后的病毒上清，用鑷子取出超速離心管，吸去大部分上清，剩余約4ml；(10)用5ml移液管反復吹打剩余的4ml病毒上清約10次，0.75ml/管進行分裝，放入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆茫@得慢病毒顆粒，即感染混合物。(五)、轉染外周血單核細胞1、人外周血單核細胞的分離與激活與步驟(一)相同。2、人外周血單核細胞的轉染(1)人外周血單核細胞在24孔板中激活12～24小時后，離心24孔板，吸走800μl上清培養(yǎng)液，加入新的培養(yǎng)液，調整每孔細胞數(shù)目約0.5×106/200μl；(2)從人外周血單核細胞分選出T細胞并激活，取(7～9)×105激活的T細胞，用CD45RO，CD62L抗體染色，流式細胞儀檢測轉染前激活的人外周血單核細胞的分型(方法同上)；(3)在室溫下將凍存的慢病毒顆粒融化，輕輕混勻，將1ml的慢病毒顆粒加入T細胞中，向24孔板中加入凝聚胺，用RPMI1640培養(yǎng)基調整至終濃度為12μg/ml，將24孔板放入離心機離心，2500r/min，離心1.5小時；離心后將24孔板放于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；(4)離心過夜培養(yǎng)的24孔板，去掉大部分含慢病毒顆粒的上清培養(yǎng)液，加入新鮮的RPMI-1640培養(yǎng)液，擴增T細胞；(5)每2天計數(shù)T細胞，向RPMI-1640培養(yǎng)基中加入IL-250IU/ml，維持T細胞密度為(0.5～1)×106/ml；(6)2周后，使用抗人CD3，CD45，CD4，CD8，CD45RO，CD62L抗體以及FITC標記的羊抗鼠F(ab')2抗體，進行流式細胞儀分析(方法同上)；(7)轉染成功的chA21-28-ICOSζCAR-T細胞備用。(六)、表達抗HER2的CAR-T細胞體外功能的檢測在檢測前，先將實施例1制備的CAR-T細胞與表達HER2的腫瘤細胞株(實施例1所涉及的材料中的細胞系)按如下步驟進行共培養(yǎng)，而獲得共培養(yǎng)液：(1)用0.25％胰酶消化腫瘤細胞后，加入RPMI1640培養(yǎng)基中和胰酶，離心后調整細胞密度為1x106/ml，取100μl(1x105)腫瘤細胞接種于U型96孔板中，設置3個復孔；(2)表達抗HER2的chA21-28-ICOSζCAR-T細胞體外培養(yǎng)擴增14天后，離心去掉抗CD3/CD28磁珠，在無IL-2的RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)過夜，使T淋巴細胞靜息；(3)收取靜息的T淋巴細胞，離心去掉上清，將細胞重懸于RPMI1640培養(yǎng)液中，計數(shù)，調整細胞密度為1x106/ml，取100μl(1x105)T細胞接種于U型96孔板中已經(jīng)接種腫瘤細胞的相應的孔中，將96孔板放置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。只有T細胞的孔作為陰性對照孔。1、ELISA法檢測共培養(yǎng)液中IFN-γ的含量(1)包被：按說明書指導，將Capture抗體稀釋于1X包被緩沖液中，向試劑盒提供的微孔板中的各反應孔中各加0.1ml，塑料貼紙覆蓋微孔板，放置4℃過夜；(2)封閉：將過夜后的微孔板用自動ELISA洗板機洗漆4次后，拋干，用IX分析緩沖液100μl封閉1小時；(3)加樣：將微孔板再次洗漆4次后，拋干，向各反應孔加入待檢測的T細胞與腫瘤細胞共培養(yǎng)的上清液100μl，相應稀釋倍數(shù)的上清液及IFN-γ標準品(1000pg/ml，倍比稀釋至15.6pg/ml)，室溫孵育2小時；(4)加檢測抗體：微孔板洗滌4次后，拋干，按說明書指定將Detection抗體用1X分析緩沖液稀釋，取100μl加入各反應孔中，室溫孵育1小時；(5)加辣根過氧化物酶標記的二抗：微孔板洗漆4次后，拋干，將HRP標記的抗體用1X分析緩沖液稀釋，向各反應孔中各加100μl，室溫孵育0.5小時；(6)微孔板洗漆4次后，拋干，向各反應孔中加入新鮮配制的TMB底物溶液100μl，避光孵育15分鐘；(7)向各反應孔中加入1M硫酸100μl終止反應；(8)結果判定：在ELISA檢測儀上，以空白對照孔調零，檢測各孔450nm吸光值(OD值)，計算IFN-γ濃度值。檢測結果如圖2所示。根據(jù)圖2可知，chA21-28-ICOSζCAR-T細胞可以特異性的識別所有HER2+的腫瘤細胞并大量分泌IFN-γ，針對乳腺癌細胞(SKBR3)分泌的IFN-γ高達19000pg/ml以上，但將chA21-28-ICOSζCAR-T細胞與HER2陰性的MDA-MB-468和TC-1細胞共培養(yǎng)時，細胞培養(yǎng)液上清中只能檢測到非常低劑量的IFN-γ。而NT-T細胞與HER2陽性的腫瘤細胞共培養(yǎng)時，細胞培養(yǎng)液上清中檢測不到IFN-γ。因此，結果表明：HER2-特異性的T細胞可以特異性的識別并殺傷HER2陽性的腫瘤細胞。2、ELISA法檢測共培養(yǎng)液中IL-2的含量檢測步驟與IFN-γ的步驟相同，檢測結果如圖3所示。根據(jù)圖3可知，chA21-28-ICOSζCAR-T細胞可以特異性的識別所有HER2+的腫瘤細胞并大量分泌IL-2，針對乳腺癌細胞(SKBR3)分泌的IL-2高達2800pg/ml以上。但將chA21-28-ICOSζCAR-T細胞與HER2陰性的MDA-MB-468和TC-1細胞共培養(yǎng)時，細胞培養(yǎng)液上清中只能檢測到非常低劑量的IL-2。而NT-T細胞與HER2陽性的腫瘤細胞共培養(yǎng)時，細胞培養(yǎng)液上清中檢測不到IL-2。因此，結果表明：HER2-特異性的T細胞可以特異性的識別并殺傷HER2陽性的腫瘤細胞。3、CAR-T細胞的抗原特異性評價試驗(1)包被：用200μl5μg/mlHER2-Fc嵌合蛋白或者CD19-Fc嵌合蛋白的包被96孔板，用塑料貼紙覆蓋96孔板，4℃過夜；(2)加入活化的T細胞：次日，PBS洗滌3次后，拋干，向96孔板中加入1×105個chA21-28-ICOSζCAR-T細胞或NTT細胞，37℃培養(yǎng)過夜；(3)酶聯(lián)免疫法檢測IFN-γ的分泌，檢測結果如圖4所示。根據(jù)圖4可知，NT-T細胞對HER2-FC嵌合蛋白和CD19-FC嵌合蛋白均無特殊反應，chA21-28-ICOSζCAR-T細胞對CD19-Fc嵌合蛋白也無特殊反應，但是在HER2-FC嵌合蛋白封閉的96孔板中，chA21-28-ICOSζCAR-T細胞釋放了大量的INF-γ，且高達19000pg/ml以上。4、51Cr釋放試驗檢測chA21-28-ICOSζCAR-T細胞殺傷乳腺癌細胞能力(1)收獲處于對數(shù)生長期的乳腺癌細胞(SKBR3)，調整細胞濃度為2×106/ml；(2)取1×106細胞(0.5ml)，加Na251CrO4100uCi，37度孵育2～3h，每15min輕輕振搖一次；(3)用10％FCSRPMI1640洗滌3次，每次800rpm、5min。(4)重懸細胞濃度1×105/ml；(5)96孔U型培養(yǎng)板中，每孔加100μl(1x104細胞)，設3個復孔；(6)按照效應T細胞與靶細胞為1:1，3:1和10:1的比例，每孔加入100μl不同細胞濃度的實施例1制備的CAR-T細胞；設置最大釋放組，向乳腺癌細胞加100μl1％TritonX-100；設置自然釋放組，向乳腺癌細胞中加100μlRPMI1640培養(yǎng)基；(7)200g離心1min，放入37℃、5％CO2孵箱培養(yǎng)4h。(8)200g離心1min，每孔取出100μ上清，用Wizard2gamma計數(shù)(PerkinElmer)檢測；(9)計算：特異性殺傷率(％)＝(實驗組cpm-自然釋放cpm)/(最大釋放組-自然釋放cpm)，計算結果圖5所示。根據(jù)圖5可知，chA21-28-ICOSζCAR-T細胞特異性的裂解HER2-陽性的SKBR3腫瘤細胞，而NTT細胞對于HER2陽性或者陰性的SKBR3腫瘤細胞均未有裂解作用。同時，將NT-T細胞和chA21-28-ICOSζCAR-T細胞分別與表達HER2的SK0V3細胞共培養(yǎng)24小時后，可以看到NT-T細胞對SK0V3細胞的生長沒有影響，而加入chA21-28-ICOSζCAR-T細胞的培養(yǎng)皿中可以看到T細胞集落的形成，且SKBR3腫瘤細胞明顯減少。5、統(tǒng)計分析所有數(shù)據(jù)均為表示。利用GraphPadPrism5.0(GraphPadSoftware，Inc.，SanDiego，CaliforniaUSA)軟件，T檢驗法分析細胞因子分泌的差異及特異性細胞裂解的差異。P＜0.05認為有統(tǒng)計學意義。綜上所述，本發(fā)明以CAR表達載體為基礎構建的CAR-T細胞對表達HER2的腫瘤細胞具有良好的殺傷效果，且CAR-T細胞與乳腺癌細胞(SKBR3)共培養(yǎng)時分泌的INF-γ高達19000pg/ml以上，IL-2高達2800pg/ml以上，遠高于其他第三代CAR-T細胞分泌的INF-γ和IL-2。以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是在本發(fā)明的發(fā)明構思下，利用本發(fā)明說明書及附圖內容所作的等效變換，或直接/間接運用在其他相關的
技術領域：
均包括在本發(fā)明的專利保護范圍內。當前第1頁1 2 3