本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及由CRISPR/Cas9介導(dǎo)的外源基因敲入整合到內(nèi)源等位基因，具體涉及應(yīng)用基因工程技術(shù)向動物細胞內(nèi)特定基因位點整合外源功能基因，得到穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因細胞系。

背景技術(shù)：

基因定點編輯是研究基因功能的重要手段，這種方法目前廣泛的運用于動植物功能基因的研究，人類疾病的治療和研究以及轉(zhuǎn)基因動植物生產(chǎn)等領(lǐng)域?；虬邢蛐揎椫饕诨虼虬泻虳NA修復(fù)機制，DNA修復(fù)機制有非同源末端連接(NHEJ)和同源重組(HDR)兩種，在動物細胞中，NHEJ是占主要的修復(fù)方式，而精確的基因編輯主要是基于HDR的修復(fù)機制。由于基因打靶的的效率非常的低，只有10^-6，其運用自然受到了制約，直到人工核酸酶的出現(xiàn)，自此，進行精確的基因操作成為可能，以此實現(xiàn)特定細胞組織的遺傳操作。

目前，最新的一代核酸酶就是來源于產(chǎn)膿鏈球菌具有一類成簇規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(CRISPRs)，與一些功能相關(guān)蛋白(CRISPR-associated，Cas)組成的CRISPR-CAS系統(tǒng)。其結(jié)構(gòu)由三部分構(gòu)成，5'端為tracrRNA基因，中間為一系列Cas蛋白編碼基因，包括Cas9、Cas1、Cas2和Csn2，3'端為CRISPR基因座，由啟動子區(qū)域和眾多的間隔序列(spacers)和重復(fù)序列(direct repeats)順序排列組成。因為CRISPR/Cas9系統(tǒng)對DNA分子具有靶向切割特性，所以可以被用于定向的基因修飾。CRISPR/Cas9由于其可操作、成本低、效用高而迅速的被用于人、小鼠、斑馬魚、蒼蠅等細胞基因操作上，使得轉(zhuǎn)基因動物的生產(chǎn)變得更方便可行，并取得了一定的研究進展。

盡管CRISPR/Cas9的介導(dǎo)使基因組修飾變得可操作，但是對于精確的基因組編輯，還是需要利用HDR的修復(fù)機制才能做到，而在動物細胞中不占主導(dǎo)地位的HDR機制效率更低。因此，由CRISPR/Cas9介導(dǎo)的HDR修復(fù)機制的基因組編輯技術(shù)的效率仍然是該項技術(shù)的一個重要的制約因子。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種基于CRISPR/Cas9的外源基因敲入整合系統(tǒng)及其建立方法和應(yīng)用。

為達到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：

基于CRISPR/Cas9的外源基因敲入整合系統(tǒng)，該敲入整合系統(tǒng)包括第一報告/供體載體，所述報告/供體載體包括兩條目標(biāo)基因同源臂以及位于兩條目標(biāo)基因同源臂之間的外源序列片段；兩條目標(biāo)基因同源臂在目標(biāo)基因上的同源序列分別位于目標(biāo)基因靶序列的兩側(cè)并與目標(biāo)基因靶序列相接；外源序列片段包括依次排列的啟動子、抗性基因、剪切肽序列、報告基因以及polyA尾，抗性基因內(nèi)部具有兩段該抗性基因的SSA修復(fù)同源序列，并且在兩段SSA修復(fù)同源序列之間插入有目標(biāo)基因靶序列。

所述啟動子選自CMV、CAG或U6啟動子；所述抗性基因選自puromycin或zeocin抗性基因；所述剪切肽序列選自T2A；所述報告基因選自熒光蛋白類報告基因eGFP或RFP；所述polyA尾選自polyA、SV40polyA或BGH polyA。

所述SSA修復(fù)同源序列的大小為150～200bp，同源序列太短則不利于發(fā)生SSA修復(fù)，200bp重復(fù)序列足夠SSA修復(fù)的發(fā)生。

所述敲入整合系統(tǒng)還包括與所述第一報告/供體載體共轉(zhuǎn)染宿主細胞的第二報告/供體載體。第一、第二報告/供體載體具有不同的抗性基因和報告基因，所述不同至少包括：對于抗性基因，針對不同的抗性篩選條件，對于報告基因，對應(yīng)不同的檢測信號。

所述宿主細胞為真核細胞。例如哺乳動物細胞。

所述敲入整合系統(tǒng)還包括Cas9表達載體。

上述基于CRISPR/Cas9的外源基因敲入整合系統(tǒng)的建立方法，該敲入整合系統(tǒng)的建立方法包括以下步驟：

1.1)以包括外源序列區(qū)段Ⅰ的載體a為骨架載體，所述外源序列區(qū)段Ⅰ內(nèi)設(shè)置有順次排列的啟動子、抗性基因Ⅰ、剪切肽序列、報告基因Ⅰ以及polyA尾，其中抗性基因Ⅰ的內(nèi)部具有兩段該抗性基因的SSA修復(fù)同源序列，將目標(biāo)基因靶序列插入外源序列區(qū)段Ⅰ，插入位置位于載體a的抗性基因Ⅰ內(nèi)兩段SSA修復(fù)同源序列之間，從而使抗性基因Ⅰ的閱讀框保持打亂狀態(tài)；

1.2)經(jīng)過步驟1.1)后，以包括目標(biāo)基因同源臂Ⅰ、多克隆酶切位點和目標(biāo)基因同源臂Ⅱ三個順次排列的元件的載體b為骨架載體，目標(biāo)基因同源臂Ⅰ、Ⅱ在目標(biāo)基因上的同源序列分別位于目標(biāo)基因靶序列的兩側(cè)并與目標(biāo)基因靶序列相接，利用多克隆酶切位點將載體a上的外源序列區(qū)段Ⅰ插入載體b上目標(biāo)基因同源臂Ⅰ、Ⅱ之間，從而構(gòu)建得到第一報告/供體載體。

所述敲入整合系統(tǒng)的建立方法還包括以下步驟：

2.1)在載體a的基礎(chǔ)上構(gòu)建載體c，載體c包括外源序列區(qū)段Ⅱ，所述外源序列區(qū)段Ⅱ內(nèi)設(shè)置有順次排列的啟動子、抗性基因Ⅱ、剪切肽序列、報告基因Ⅰ以及polyA尾，其中抗性基因Ⅱ與所述抗性基因Ⅰ對應(yīng)不同的抗性篩選條件，且抗性基因Ⅱ的內(nèi)部具有兩段該抗性基因的SSA修復(fù)同源序列；

2.2)將目標(biāo)基因靶序列插入外源序列區(qū)段Ⅱ，插入位置位于載體c的抗性基因Ⅱ內(nèi)兩段SSA修復(fù)同源序列之間，從而使抗性基因Ⅱ的閱讀框保持打亂狀態(tài)；并將載體c的外源序列區(qū)段Ⅱ中的報告基因Ⅰ替換為報告基因Ⅱ，報告基因Ⅰ和報告基因Ⅱ?qū)?yīng)不同的檢測信號；然后將載體c上的外源序列區(qū)段Ⅱ插入載體b上目標(biāo)基因同源臂Ⅰ、Ⅱ之間，從而構(gòu)建得到第二報告/供體載體。

所述步驟2.1)具體包括以下步驟：

2.1.1)克隆抗性基因Ⅱ，克隆過程中在抗性基因Ⅱ內(nèi)部增加兩段該抗性基因的SSA修復(fù)同源序列；

2.1.2)經(jīng)過步驟2.1.1)后，用具有SSA修復(fù)同源序列的抗性基因Ⅱ替換所述載體a中的抗性基因Ⅰ，得到載體c。

上述基于CRISPR/Cas9的外源基因敲入整合系統(tǒng)在雙染色體等位基因的雙敲入中的應(yīng)用。

上述基于CRISPR/Cas9的外源基因敲入整合系統(tǒng)在制備純系轉(zhuǎn)基因細胞系或轉(zhuǎn)基因動物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：

本發(fā)明運用基因工程技術(shù)，構(gòu)建了一套能夠高效定點精確靶向整合外源基因到內(nèi)源基因序列的敲入系統(tǒng)，而且能夠進行較高效率的雙染色體等位基因的雙敲入，能使整合進基因組的外源基因穩(wěn)定遺傳表達，得到雙敲入的轉(zhuǎn)基因細胞系。本方法能夠用于研究基因功能和純系轉(zhuǎn)基因細胞系及轉(zhuǎn)基因動物的生產(chǎn)。

附圖說明

圖1為pB-CMV-DsRed-CAG-PuroR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-eGFP載體的質(zhì)粒圖譜。

圖2為pB-CMV-DsRed-CAG-PuroR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-eGFP雙酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖3為pXL-L/R.CCR5 arm-MCS載體的質(zhì)粒圖譜。

圖4為pXL-L/R.CCR5 arm-MCS載體雙酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖5為pXL-L/R.CCR5 arm-CAG-PuroR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-eGFP載體的質(zhì)粒圖譜。

圖6為pXL-L/R.CCR5 arm-CAG-PuroR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-eGFP載體雙酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖7為pB-CMV-DsRed-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-MCS)-T2A-eGFP雙酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖8為pB-CMV-DsRed-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-eGFP質(zhì)粒圖譜。

圖9為pB-CMV-DsRed-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-eGFP酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖10為pB-CMV-DsRed-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-RFP載體質(zhì)粒圖譜。

圖11為pB-CMV-DsRed-CAG-PuroR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-RFP雙酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖12為pXL-L/R.CCR5 arm-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-RFP載體的質(zhì)粒圖譜。

圖13為pXL-L/R.CCR5 arm-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-RFP酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖14為HEK293T細胞轉(zhuǎn)染后24小時細胞圖。

圖15為流式細胞檢測圖。

圖16為puromycin和zeocin篩選后得到的單克隆細胞圖。

圖17為5'端連接處PCR檢測瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖18為3'端連接處Rep/Don ZR系統(tǒng)整合PCR檢測電泳圖。

圖19為3'端連接處Rep/Don PG系統(tǒng)整合PCR檢測凝膠電泳圖。

圖20為pXL-BacII-MCS載體的質(zhì)粒圖譜。

具體實施方式

為使本發(fā)明的技術(shù)方案便于理解，下面結(jié)合靶向CCR5基因(Genbank登錄號NC_000003.12)的具體實施例對本發(fā)明通過基于CRISPR/Cas9的雙敲系統(tǒng)整合敲入外源基因的方法作進一步說明。

表I.構(gòu)建雙敲系統(tǒng)所需引物

表I中，引物名稱后括號內(nèi)標(biāo)注的限制性內(nèi)切酶對應(yīng)酶切位點在序列中以斜體表示。CCR5a annealing f以及CCR5a annealing r中包含的CCR5靶序列以下劃線標(biāo)出。

(一)報告及供體系統(tǒng)載體pXL-L/R.CCR5 arm-CAG-PuroR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-eGFP(Rep/Don PG)和pXL-L/R.CCR5 arm-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-RFP(Rep/Don ZR)的構(gòu)建。

(1)將引物CCR5a annealing f和CCR5a annealing r擬合，得到CCR5片段，擬合得到的CCR5片段為含有目標(biāo)基因CCR5靶序列(CCR5a)的片段(該片段還具有懸臂)。把載體pB-CMV-DsRed-CAG-PuroR(200bp repeat.SSA-MCS)-T2A-eGFP(簡稱RPG，構(gòu)建方法參考Ren C,Xu K,Liu Z,Shen J,Han F,Chen Z,et al.Dual-reporter surrogate systems for efficient enrichment of genetically modified cells.Cell Mol Life Sci.2015；72(14):2763-72.doi:10.1007/s00018-015-1874-6.PubMed PMID:25725802)用BamHI和NotI雙酶切后與上述CCR5片段連接，酶切體系如表1，連接體系如表2，16℃連接過夜，構(gòu)建載體pB-CMV-DsRed-CAG-PuroR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-eGFP(簡稱RPG-CCR5)，PuroR(200bp repeat.SSA-CCR5)是指目標(biāo)基因CCR5的靶序列插入到具有兩段200bp SSA修復(fù)同源序列的puromycin抗性基因中，具體插入位置為兩段200bp SSA修復(fù)同源序列之間，puromycin抗性基因的閱讀框被200bp SSA修復(fù)同源序列和CCR5的靶序列打亂。然后將RPG-CCR5轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，涂LB/Amp平板，挑取單克隆并在LB/Amp液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)12h。

表1.RPG雙酶切反應(yīng)體系

表2.RPG和CCR5片段連接體系

所構(gòu)建的pB-CMV-DsRed-CAG-PuroR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-eGFP載體的質(zhì)粒圖譜如圖1所示，提取質(zhì)粒pB-CMV-DsRed-CAG-PuroR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-eGFP，并經(jīng)EcoRV和EcoRI酶切鑒定，結(jié)果如圖2所示，其中泳道M為DNA Marker；泳道1為pB-CMV-DsRed-CAG-PuroR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-eGFP經(jīng)EcoRV和EcoRI酶切的產(chǎn)物(3637bp+5666bp)。送陽性質(zhì)粒到南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序分析，保存測序正確的質(zhì)粒備用。

(2)把引物MCS-F和MCS-R擬合，得到片段MCS。將片段MCS與經(jīng)NotI/SalI雙酶切的pXL-BacII(Addgene)載體連接，得到pXL-BacII-MCS(圖20)。酶切體系見表3，連接體系見表4，16℃連接過夜，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，涂LB/Amp平板，挑取單克隆并在LB/Amp液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)12h。

表3.pXL-BacII雙酶切反應(yīng)體系

表4.pXL-BacII和MCS連接體系

用引物CCR5a-l-arm-f和CCR5a-l-arm-r在人的基因組上擴增CCR5基因的左臂(CCR5 L arm)，即5′臂，再用引物CCR5a-r-arm-f和CCR5a-r-arm-r在人基因組上擴增CCR5基因的右臂(CCR5R arm)，即3′臂，左右兩臂在人基因組上的同源序列位于目標(biāo)基因CCR5靶序列的兩側(cè)并與靶序列相接，將左、右兩同源臂(CCR5L arm、CCR5R arm)分別利用SpeI/BamHI雙酶切以及PacI/HindIII雙酶切克隆到pXL-BacII-MCS，得到載體pXL-L/R.CCR5 arm-MCS(質(zhì)粒圖譜如圖3)。該載體包含了CCR5基因的左右同源臂及兩個同源臂之間的多克隆酶切位點。提取質(zhì)粒，并經(jīng)BamHI和PacI酶切鑒定，結(jié)果如圖4所示，其中泳道M為DNA Marker，泳道1～3為pXL-L/R.CCR5 arm-MCS經(jīng)BamHI和PacI酶切的產(chǎn)物(4712bp+774bp)。送陽性質(zhì)粒到南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序分析，保存測序正確的質(zhì)粒備用。

(3)將上述方法所得載體pXL-L/R.CCR5 arm-MCS和pB-CMV-DsRed-CAG-PuroR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-eGFP用SpeI/PacI雙酶切，把酶切得到的CAG-PuroR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-eGFP-polyA片段(3602bp)插入到酶切后的pXL-L/R.CCR5 arm-MCS中，得到目的載體pXL-L/R.CCR5 arm-CAG-PuroR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-eGFP(Rep/Don PG)。酶切體系和連接體系分別見表5和表6。再轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，涂LB/Amp平板，挑取單克隆并在LB/Amp液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)12h。所構(gòu)建的pXL-L/R.CCR5 arm-CAG-PuroR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-eGFP載體的質(zhì)粒圖譜如圖5所示，此載體包括位于左右兩側(cè)的CCR5基因同源臂(CCR5L arm、CCR5R arm)，以及位于同源臂之間從5′到3′方向依次排列的啟動子CAG、PuroR(200bp repeat.SSA-CCR5)、剪切肽T2A、增強的綠色熒光蛋白eGFP以及polyA。提取質(zhì)粒，并經(jīng)EcoRI和XhoI酶切鑒定，結(jié)果如圖6所示，其中泳道M為DNA Marker；泳道1～2為pXL-L/R.CCR5 arm-CAG-PuroR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-eGFP經(jīng)EcoRI和XhoI酶切的產(chǎn)物(136bp+850bp+1382bp+2351bp+4355bp)。

表5.pXL-L/R.CCR5 arm-MCS和RPG-CCR5雙酶切反應(yīng)體系

表6.pXL-L/R.CCR5 arm-MCS和RPG-CCR5片段連接體系

(4)以pSLIK-Zeo(Addgene，Plasmid#25736)為模板，分別用引物對Zeo-F1/Zeo-R1和引物對Zeo-F2/Zeo-R2PCR擴增得到片段Zeo-1和Zeo-2，擴增體系見表7。再用BamHⅠ酶切兩個片段，酶切體系見表8，將Zeo-1和Zeo-2酶切后的片段用T4連接酶連接2h，連接體系見表9。取1μL Zeo-1和Zeo-2連接后的產(chǎn)物做模板，用引物對Zeo-F1/Zeo-R2進行PCR擴增得到Zeo-SSA，Zeo-SSA是指序列中具有兩段相互間隔的200bp SSA修復(fù)同源序列的zeocin抗性基因，200bp SSA修復(fù)同源序列將zeocin抗性基因的閱讀框打亂。擴增體系見表10。用EcoRI/XhoⅠ雙酶切片段Zeo-SSA和RPG，酶切體系見表11。將酶切后的Zeo-SSA片段(617bp)連進酶切后的RPG骨架(替換PuroR(200bp repeat.SSA-MCS))得到pB-CMV-DsRed-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-MCS)-T2A-eGFP(RZG)，連接體系見表12。再轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，涂LB/Amp平板，挑取單克隆并在LB/Amp液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)12h。提取質(zhì)粒，并經(jīng)EcoRI/XhoⅠ酶切鑒定，結(jié)果如圖7所示，其中泳道M為DNA Marker；泳道1為pB-CMV-DsRed-CAG-PuroR(200bp repeat.SSA-MCS)-T2A-eGFP經(jīng)EcoRI/XhoⅠ酶切的產(chǎn)物，泳道2～5為pB-CMV-DsRed-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-MCS)-T2A-eGFP經(jīng)EcoRI/XhoⅠ酶切的產(chǎn)物(605bp+8438bp)。送陽性質(zhì)粒到南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序分析，保存測序正確的質(zhì)粒備用。

表7.Zeo片段PCR擴增體系

表8.Zeo-1和Zeo-2酶切體系

表9.Zeo-1和Zeo-2連接體系

表10.Zeo-SSA PCR擴增體系

表11.Zeo-SSA和RPG雙酶切體系

表12.RPG和Zeo-SSA片段連接體系

(5)將引物CCR5a annealing f和CCR5a annealing r擬合，得到CCR5片段。把載體pB-CMV-DsRed-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-MCS)-T2A-eGFP(RZG)用BamHI和NotI雙酶切后與上述CCR5片段連接，酶切體系如表13，連接體系如表14，16℃連接過夜，構(gòu)建質(zhì)粒pB-CMV-DsRed-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-eGFP(RZG-CCR5)。ZeoR(200bp repeat.SSA-CCR5)是指被包含CCR5基因靶序列的200bp SSA修復(fù)同源序列打亂閱讀框的zeocin抗性基因，即將目標(biāo)基因CCR5的靶序列插入到具有兩段200bp SSA修復(fù)同源序列的zeocin抗性基因中，具體插入位置為兩段200bp SSA修復(fù)同源序列之間。然后將RZG-CCR5轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，涂LB/Amp平板，挑取單克隆并在LB/Amp液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)12h。

表13.RZG雙酶切反應(yīng)體系

表14.RZG和CCR5片段連接體系

pB-CMV-DsRed-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-eGFP(RZG-CCR5)圖譜見圖8。提取質(zhì)粒pB-CMV-DsRed-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-eGFP，并經(jīng)EcoRV和EcoRI酶切鑒定，結(jié)果如圖9所示，其中泳道M為DNA Marker；泳道1、2為pB-CMV-DsRed-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-eGFP經(jīng)EcoRV和EcoRI酶切的產(chǎn)物(3637bp+5423bp)。

(6)以pcDNA3-mRFP(Addgene，Plasmid#13032)為模板，用mRFP-F1和mRFP-R擴增得到mRFP1的片段，擴增體系見表15。再以得到的mRFP1為模板，用引物mRFP-F2和mRFP-R擴增得到T2A-mRFP-BGH-PA-terminator polyA片段，擴增體系見表16。用XhoI/PacI分別酶切載體pB-CMV-DsRed-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-eGFP(RZG-CCR5)和上述得到的T2A-mRFP-BGH-PA-terminator polyA片段(酶切體系見表17)，將酶切后的T2A-mRFP-BGH-PA-terminator polyA(1041bp)連接到酶切后的pB-CMV-DsRed-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-eGFP骨架片段(8017bp)，16℃過夜連接，連接體系見表18，得到pB-CMV-DsRed-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-RFP(RZR-CCR5)。

表15.mRFP1 PCR擴增體系

表16.T2A-mRFP-BGH-PA-terminator polyA PCR擴增體系

表17.T2A-mRFP-BGH-PA-terminator polyA和RZG-CCR5雙酶切體系

表18.RZG-CCR5和T2A-mRFP-BGH-PA-terminator polyA連接體系

所構(gòu)建的pB-CMV-DsRed-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-RFP(RZR-CCR5)載體的質(zhì)粒圖譜如圖10所示，提取質(zhì)粒pB-CMV-DsRed-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-RFP，并經(jīng)AgeI和PacI酶切鑒定，結(jié)果如圖11所示，其中泳道M為DNA Marker；泳道1、3、4為pB-CMV-DsRed-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-RFP經(jīng)AgeI和PacI酶切的產(chǎn)物(9048bp，載體構(gòu)建好之后AgeI就被消掉了，所以酶切鑒定的時候，只能切出來一條帶)。泳道2、5為pB-CMV-DsRed-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-eGFP經(jīng)AgeI和PacI酶切的產(chǎn)物。

(7)用SpeI/PacI分別雙酶切載體pB-CMV-DsRed-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-RFP(RZR-CCR5)和pXL-L/R.CCR5 arm-MCS，將前者酶切的大約3.3Kb的片段(CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-RFP-BGH polyA)膠回收后連接到酶切后的pXL-L/R.CCR5 arm-MCS中得到pXL-L/R.CCR5 arm-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-RFP(Rep/Don ZR)。此步驟酶切體系和連接體系見表19和表20。

所構(gòu)建的pXL-L/R.CCR5 arm-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-RFP(Rep/Don ZR)載體的質(zhì)粒圖譜如圖12所示，此載體包含了CCR5基因的左右同源臂、以及位于左右同源臂之間的按照從5′到3′方向依次排列的啟動子CAG、ZeoR(200bp repeat.SSA-CCR5)、T2A、紅色熒光蛋白RFP以及BGH polyA。提取質(zhì)粒pXL-L/R.CCR5arm-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-RFP，并經(jīng)SpeI和PacI酶切鑒定，結(jié)果如圖13所示，其中泳道M為DNA Marker；泳道1～2為pXL-L/R.CCR5 arm-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-RFP經(jīng)SpeI和PacI酶切的產(chǎn)物(3362bp+5472bp)。

表19.RZR-CCR5和pXL-L/R.CCR5 arm-MCS酶切體系

表20.RZR-CCR5片段和pXL-L/R.CCR5 arm-MCS連接體系

上述構(gòu)建過程中，所有限制性內(nèi)切酶及連接酶均采用New England Biolabs(NEB)公司產(chǎn)品。所用Taq酶、pfu酶、DNA Marker及dNTPs均采用北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。CCR5片段以及MCS片段擬合(annealing)反應(yīng)條件為：94℃5min；72℃5min；降1℃/秒；4℃保存。Zeo片段PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存。Zeo-SSA PCR擴增條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存。mRFP1PCR擴增條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，51℃退火30s，72℃延伸50s，35個循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存。T2A-mRFP-BGH-PA-terminator polyA PCR擴增條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，35個循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存。

(二)在HEK293T中驗證CRISPR/Cas9活性及報告和供體系統(tǒng)工作性能

HEK293T細胞置于含DMEM，10％胎牛血清，100μg/mL青鏈霉素的培養(yǎng)基中，37℃，5％的CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)。以24孔板為例，將HEK293T細胞接種至24孔板中，當(dāng)細胞密度達到60％時，用sofast轉(zhuǎn)染試劑(廈門太陽馬生物有限公司)將CRISPR/Cas9表達載體pX330-U6-CCR5a-CBh-hSpCas9(構(gòu)建方法參考Ren C,Xu K,Liu Z,Shen J,Han F,Chen Z,et al.Dual-reporter surrogate systems for efficient enrichment of genetically modified cells.Cell Mol Life Sci.2015；72(14):2763-72.doi:10.1007/s00018-015-1874-6.PubMed PMID:25725802)、報告和供體系統(tǒng)pXL-L/R.CCR5 arm-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-RFP(Rep/Don ZR)和pXL-L/R.CCR5 arm-CAG-PuroR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-eGFP(Rep/Don PG)共轉(zhuǎn)染到HEK293T細胞中。按照Cas9表達載體:Rep/Don ZR:Rep/Don PG三者之間摩爾比為(1～1.5):(1～1.5):(1～1.5)(例如，1.2:1:1)的比例進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染體系見表21。按說明書進行轉(zhuǎn)染，將0.6μg DNA質(zhì)粒稀釋于30μL Opti MEM(Invitrogen)中，輕輕混勻，得DNA稀釋液。1.5μL Sofast稀釋于30μL Opti MEM中，輕輕混勻，得Sofast稀釋液。然后將30μL Sofast稀釋液滴加到30μL DNA稀釋液中，一邊滴加一邊混勻。充分混勻后，將混合物置于室溫孵育20min，然后將60μL Sofast/DNA復(fù)合物加到一個24孔中并輕輕搖動使均勻混合。放置37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱，8小時后換新鮮DMEM培養(yǎng)基。24小時后在倒置熒光顯微鏡下觀察熒光，驗證CRISPR/Cas9活性，見圖14。一共分為四組進行驗證試驗，組一是空白對照組(Control)，組二是單敲系統(tǒng)的Rep/Don PG組，組三是單敲系統(tǒng)的Rep/Don ZR組，組四是雙敲系統(tǒng)的Rep/Don ZR和Rep/Don PG共轉(zhuǎn)染組(HRPI)。組二的綠色熒光代表Rep/Don PG系統(tǒng)工作效率，組三紅色熒光代表Rep/Don ZR系統(tǒng)工作效率，組四既有綠色熒光又有紅色熒光，各組試驗結(jié)果說明Rep/Don PG和Rep/Don ZR系統(tǒng)工作正常，且效率較高。48小時后收集細胞，用移液器把一個孔中的DMEM吸出，棄掉，再用PBS洗兩遍，再加入0.25％的胰蛋白酶-EDTA消化細胞，當(dāng)細胞形狀變成圓形并不貼壁時，加入DMEM終止消化。將消化下來的細胞一半接種到100mm培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)用于挑選單克隆，另一半用于流式細胞檢測。把用于流式檢測的細胞1000r/min離心三分鐘，將上清液移除，用1mL PBS重懸備測。流式細胞檢測測定雙敲系統(tǒng)的工作情況見圖15。流式檢測結(jié)果顯示，Cas9活性非常好，雙敲系統(tǒng)中的每個載體工作正常，效率較好。圖15中Control代表的是對照組；Rep/Don PG系統(tǒng)經(jīng)流式檢測，有50.1％出現(xiàn)在代表綠光的象限，說明在本系統(tǒng)工作下，有50.1％的細胞是陽性細胞；流式數(shù)據(jù)分析顯示Rep/Don ZR系統(tǒng)組，有37.6％帶有紅光的陽性細胞出現(xiàn)在了紅光象限里面。

表21.CRISPR/Cas9表達載體、Rep/Don ZR和Rep/Don PG共轉(zhuǎn)染體系

(三)生產(chǎn)CCR5基因位點的雙等位基因敲入細胞系及雙敲系統(tǒng)工作效率驗證

(1)HEK293細胞轉(zhuǎn)染、藥物篩選

將上述部分(二)中分出來在100mm培養(yǎng)皿中的細胞繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)細胞貼壁后，加入3μg/mL的puromycin和/或600mg/mL的zeocin進行藥物篩選(與具有的抗性基因?qū)?yīng))。每兩天更換一次新鮮的DMEM培養(yǎng)基(培養(yǎng)基中含puromycin和/或zeocin)。每次換液前在顯微鏡下觀察，當(dāng)單克隆形成，及時的挑取單克隆到24孔板的一個孔中，加入含puromycin和/或zeocin的DMEM培養(yǎng)基500μL繼續(xù)培養(yǎng)，單克隆細胞見圖16，從圖中可以看出，Rep/Don PG組的單克隆細胞是發(fā)綠光的，Rep/Don ZR系統(tǒng)敲入得到的細胞克隆是發(fā)紅光的，而Rep/Don PG和Rep/Don ZR雙系統(tǒng)經(jīng)篩選后得到的克隆細胞既發(fā)紅光又發(fā)綠光。當(dāng)24孔板里每一孔細胞長到約90％密度時，消化細胞，將一半的細胞轉(zhuǎn)移接種到12孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)密度達到70％時凍存；另一半細胞用于提取基因組DNA備用。(2)引物設(shè)計與合成

根據(jù)預(yù)計整合的CCR5基因序列，按照一條引物在CCR5基因同源臂外側(cè)，另一條引物在外源序列上的原則用Primerprimer6設(shè)計引物。一對引物在5’端，兩對引物在3’端，其中一對用于檢測Rep/Don PG整合，另一對用于檢測Rep/Don ZR插入。

(3)PCR擴增檢測雙敲系統(tǒng)的工作效率

將上述單克隆細胞提取的基因組DNA進行PCR擴增檢測雙敲系統(tǒng)的工作效率。設(shè)計了三對引物(F1和R1；F2和R2；F3和R3)用于確認外源基因是否為定點整合。確定為定點插入后，結(jié)合三對引物擴增的條帶再確定是否是雙敲的細胞。以上述單克隆細胞提取的基因組為模板，分別用設(shè)計的引物對進行擴增，PCR反應(yīng)體系為如表22所述。5'連接端反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存。3'連接端Rep/Don PG整合PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min 10s，35個循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存。3'連接端Rep/Don ZR插入PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，35個循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小正確結(jié)果，如圖17、18、19所示。圖17中，泳道M為Trans2K Plus DNA Marker，泳道1、2、4中箭頭所指的為目的片段的PCR擴增產(chǎn)物，泳道3為對照組。圖18中，泳道M為Trans2K Plus DNA Marker，泳道1、2為對照組，泳道3～7為目的片段的PCR擴增產(chǎn)物。圖19中，泳道M為Trans2K Plus DNA Marker，泳道3、7為對照組，泳道1、2、4～6為目的片段的PCR擴增產(chǎn)物。

綜合3對檢測引物擴增的情況來看，在44個單克隆細胞中，雙敲的單克隆細胞有15個，本系統(tǒng)的工作效率為34.09％。亦即，通過本發(fā)明的雙敲系統(tǒng)，能夠獲得34.09％的可穩(wěn)定遺傳的雙等位基因敲入整合轉(zhuǎn)基因細胞。

表22.5'3'連接端PCR擴增檢測反應(yīng)體系

以上實施例中，以人CCR5基因為例，對CCR5基因進行靶向整合。給出了敲入整合系統(tǒng)的構(gòu)建和轉(zhuǎn)基因細胞系生產(chǎn)兩部分。

雙敲系統(tǒng)(HRPI)包括兩個獨立的載體(Rep/Don PG和Rep/Don ZR)。其中每個載體既可以作為報告載體又可以作為供體載體為下述(Ⅰ)Rep/Don PG或(Ⅱ)Rep/Don ZR：

(Ⅰ)外源puromucin和GFP基因

pXL-L/R.CCR5 arm-CAG-PuroR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-eGFP(Rep/Don PG)，包含了真核細胞啟動子CAG、功能基因PuroR、GFP和polyA信號片段。

(Ⅱ)外源zeocin和RFP基因

pXL-L/R.CCR5 arm-CAG-ZeoR(200bp repeat.SSA-CCR5)-T2A-RFP(Rep/Don ZR)包含了啟動子CAG、功能基因ZeoR、RFP和BGH polyA信號片段。

將這兩個載體與CRISPR/Cas9表達載體共轉(zhuǎn)染到人293T細胞中，在轉(zhuǎn)染48小時后，更換含有puromycin和的zeocin的DMEM培養(yǎng)基進行抗生素藥物篩選。鑒于載體系統(tǒng)和細胞基因組上均有能被CAS9識別的靶序列，當(dāng)CAS9蛋白表達后，會先靶向載體上的靶序列，導(dǎo)致插入并打斷puromycin或zeocin抗性基因中間的靶序列雙鏈斷裂，由于靶序列兩邊有200bp的SSA重復(fù)序列，當(dāng)SSA修復(fù)進行后，puromycin或zeocin抗性基因密碼子恢復(fù)正常編碼，抗性基因發(fā)揮作用。又因為載體系統(tǒng)含有同源臂序列，5’3’同源臂之間的外源基因在細胞基因組出現(xiàn)斷裂后，通過同源重組的方式將外源基因整合到細胞基因組中，被整合的細胞就能抵抗puromycin和zeocin抗生素而存活下來，經(jīng)過15天篩選后能得到雙等位基因敲入的293T細胞系。

如果更換敲入的目標(biāo)基因，則只需對目標(biāo)基因的同源臂及目標(biāo)基因靶序列進行更換，其它部分保持不變。

本發(fā)明證實了基于CRISPR/Cas9的雙敲系統(tǒng)能夠快速有效的得到雙敲的細胞系，在此過程中此套系統(tǒng)不僅有報告載體的作用也同時具備作為供體載體發(fā)揮將外源基因整合進細胞內(nèi)源基因的功能。本發(fā)明具有應(yīng)用基因工程載體系統(tǒng)作為外源DNA供體載體，靶向整合進入細胞內(nèi)源基因組并且形成穩(wěn)定可遺傳的細胞系的功能，可以將本實驗所用的CCR5基因靶序列及其同源臂序列更換成其它功能基因或非編碼RNA及其同源臂，能夠用于有效的建立各種特定研究需求的細胞系。