子宮內(nèi)注射外源基因法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的技術(shù)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種制備轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)是由基因工程和胚胎工程相結(jié)合的一門新型生物技術(shù)。它是將人工重組的外源DNA通過人為的方法導(dǎo)入受體動(dòng)物的基因組，或者切除受體基因組中的一段DNA，從而使受體動(dòng)物的遺傳信息(基因型和表現(xiàn)型)發(fā)生人為性的改變，并且這種改變能遺傳給后代的一門生物技術(shù)[1]。
[0003]自1974年的嵌合體小鼠[2]誕生以來，哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)給發(fā)育生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和畜牧業(yè)等學(xué)科領(lǐng)域帶來了一場新的技術(shù)革命。隨著分子生物學(xué)和生物技術(shù)的發(fā)展，哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)取得了長足的發(fā)展。借助轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型R4'5]，將分子、細(xì)胞、組織、器官、及個(gè)體的發(fā)生發(fā)育和衰老統(tǒng)一起來，從時(shí)間和空間綜合角度研究基因的表達(dá)調(diào)控規(guī)律；通過轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，可研究遺傳病的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律，隨著基因定點(diǎn)整合[6'7]技術(shù)的成熟，轉(zhuǎn)基因技術(shù)可能成為治愈人類遺傳疾病的一種重要手段；通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育抗病力強(qiáng)、生長速度快、畜產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量高的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，以及通過轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)藥用或營養(yǎng)蛋白[8’9]、為人類提供異源器官等，最終提高畜牧業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。
[0004]自20世紀(jì)80年代的嵌合體鼠誕生以來，各國學(xué)者不斷尋求以操作簡單、成本低、高效轉(zhuǎn)基因的為目的轉(zhuǎn)基因技術(shù)。但是，到目前對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)常用的轉(zhuǎn)基因手段為:顯微注射法、精原干細(xì)胞轉(zhuǎn)染、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法、胚胎干細(xì)胞法、原始生殖細(xì)胞(PGC)和精子等技術(shù)方法。
[0005]1.顯微注射(microinject1n)法
顯微注射(microinject1n),利用顯微操作技術(shù),直接將精子注射到成熟卵母細(xì)胞胞質(zhì)的方法，稱為胞漿內(nèi)精子注射技術(shù)。在顯微操作環(huán)境中，采用該技術(shù)方法，將體外構(gòu)建好的目的基因片段注射到原核時(shí)期的受精卵的原核當(dāng)中，隨著受體受精卵DNA合成或修復(fù)，外源基因整合到其基因組中。顯微注射法是目前公認(rèn)的轉(zhuǎn)基因效果最好，制作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物應(yīng)用最廣的操作方法[1M1]。
[0006]顯微注射法的優(yōu)點(diǎn)是可以把10kb以下的不同長度且不含原核載體的DNA片段注入原核當(dāng)中，并能得到外源基因有效表達(dá)的陽性轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。但是，該技術(shù)也存在著許多制約因素，基因組DNA只能增加不能敲除或在指定的位點(diǎn)修飾，而且外源DNA的整合位點(diǎn)和拷貝數(shù)也無法控制；顯微注射法成本之昂貴，胚胎成活率之低，尤其是大家畜上，制備一個(gè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)需要大量的胚胎為基礎(chǔ)，再加上設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜，以及對(duì)技術(shù)人員操作技術(shù)要求高等因素限制該技術(shù)應(yīng)用。
[0007]2逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法
1976年，雖然Jaenich等是首次利用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法獲得了陽性小鼠，但是外源基因卻表現(xiàn)為沉默。直到1998年，Chan LI等[12]利用慢病毒成功轉(zhuǎn)染牛的卵母細(xì)胞和Cabot (2001)等[13]成功轉(zhuǎn)染體外成熟的豬卵母細(xì)胞，并獲得轉(zhuǎn)基因豬，逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法才重新被人們廣泛重視。
[0008]逆轉(zhuǎn)錄病毒是雙鏈RNA病毒，侵染細(xì)胞后在自身的反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以RNA為模板在寄主細(xì)胞染色體中反轉(zhuǎn)錄成DNA。其具體方法是將載體病毒放入動(dòng)物早期胚胎的培養(yǎng)液中[14]、將載體病毒注入囊胚腔[15’16]、體外培養(yǎng)轉(zhuǎn)染精子或卵母細(xì)胞[17’18]。用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物具有操作簡單、不受胚胎發(fā)育階段的影響，并且基因表達(dá)效率高；單位點(diǎn)、單拷貝整合，易鑒別分析插入位點(diǎn)等優(yōu)點(diǎn)。但是，用此法感染胚胎細(xì)胞時(shí)，如果在第一次卵裂之前外源DNA整合到胚胎基因組中，可獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物；但是，如果發(fā)生在第一次卵裂之后整合，會(huì)產(chǎn)生嵌合體，嵌合體的下一代可能有純系轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，這樣的話實(shí)驗(yàn)周期就很長。并且所攜帶的外援基因片段長度受到很大的限制，一般不能超過10kb[19]。
[0009]隨著對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)基因沉默現(xiàn)象，其主要作用機(jī)制為:反式作用因子可通過與病毒啟動(dòng)子內(nèi)特異序列結(jié)合而影響DNA前病毒的表達(dá)；整合的前病毒及兩側(cè)宿主DNA序列的甲基化，抑制其表達(dá)[2°]。
[0010]再加上載體病毒基因有潛在致瘤和引起病毒血癥的危險(xiǎn)，這就限制了使用逆轉(zhuǎn)錄病毒真被轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的廣泛應(yīng)用。
[0011]3 體細(xì)胞核移植(somatic cell nuclear transplantat1n )法
體細(xì)胞核移植(somatic cell nuclear transplantat1n )法是將體外培養(yǎng)的供體體細(xì)胞經(jīng)外源DNA轉(zhuǎn)染后，挑選出陽性轉(zhuǎn)基因細(xì)胞群，再通過體細(xì)胞核移植技術(shù)和胚胎移植可最終獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物[21]的方法。雖然用該方法制作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的優(yōu)點(diǎn)為理論上效率高達(dá)100%。但其缺點(diǎn)是成本之高、定點(diǎn)整合和核移植的效率仍然很低。目前已經(jīng)由成纖維細(xì)胞、胎兒成纖維細(xì)胞、卵丘細(xì)胞和乳腺細(xì)胞等轉(zhuǎn)基因而獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。Schnieke等(1998)
[22]將外源基因轉(zhuǎn)染了綿羊胎兒成纖維細(xì)胞，并成功獲得3頭轉(zhuǎn)基因綿羊，1999年揚(yáng)州大學(xué)成勇[23]教授課題組由胎兒成纖維細(xì)胞成功克隆出山羊，2000年楊向中等通過體細(xì)胞核移植成年牛耳尖成纖維細(xì)胞成功克隆轉(zhuǎn)基因牛，同年我國西北農(nóng)林科技大學(xué)張涌教授領(lǐng)導(dǎo)的課題組培育出由成年羊耳朵皮膚細(xì)胞體細(xì)胞核移植克隆的世界首例轉(zhuǎn)基因山羊，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)戴蘊(yùn)平(2003)等[24]和東北農(nóng)業(yè)大學(xué)劉忠華教授(2008)等[25]也分別獲得轉(zhuǎn)基因牛和豬。
[0012]4 胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cell, ES 細(xì)胞)法
自1981年Evans和Kaufman宣布分離得到ES細(xì)胞[26]以來,人們對(duì)胚胎干細(xì)胞的研究日漸深入。Bradly (1984)等[27]首次證實(shí)體外培養(yǎng)的ES細(xì)胞能發(fā)育成生殖系嵌合體，并獲得純合體后代。劉愛民(1994)等M研究了 hprt基因在小鼠胚胎干細(xì)胞中定位致變特性。陳勝偉(1999)等_報(bào)道了由小鼠ES細(xì)胞種系成功獲得嵌合體的研究，我國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院周江等[3°]于2001年獲得了國內(nèi)首例Smad2條件基因打靶小鼠。
[0013]ES細(xì)胞是從早期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)經(jīng)體外培養(yǎng)建立的多潛能細(xì)胞系，它具有與胚胎細(xì)胞相似的形態(tài)特征及分化性質(zhì)，在體外培養(yǎng)時(shí)保持未分化狀態(tài)，但在適當(dāng)條件下可被誘導(dǎo)分化。由于其具有穩(wěn)定的核型并易于誘捕外源基因，因此ES細(xì)胞進(jìn)行基因敲除或定向插入外源基因的理想細(xì)胞。
[0014]該方法是首先將外源基因轉(zhuǎn)染ES細(xì)胞，培養(yǎng)篩選出陽性細(xì)胞，將陽性細(xì)胞注入受體動(dòng)物的囊胚腔，生產(chǎn)嵌合體動(dòng)物，當(dāng)ES細(xì)胞分化為生殖細(xì)胞時(shí)外源基因可通過生殖細(xì)胞遺傳給后代，即從第二代中獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。這種方法可對(duì)陽性細(xì)胞進(jìn)行選擇，實(shí)現(xiàn)外源DNA的定點(diǎn)整合。缺點(diǎn)是第一代為嵌合體，許多嵌合體動(dòng)物生殖細(xì)胞內(nèi)不攜帶外源基因，即獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的效率低并且周期長。
[0015]盡管ES細(xì)胞法成功率較高，遺傳修飾能力精確，并且在細(xì)胞培養(yǎng)階段就可以初次篩選，大大提高轉(zhuǎn)基因的效率，但是目前只是在小鼠和人類建立了 ES細(xì)胞系，其他動(dòng)物上尚未建立完善的干細(xì)胞系，還有該方法需要熟練的胚胎操作技術(shù)人員。
[0016]5 精子介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因(sperm-mediated gene transfer, SMGT )
Brackett (1971)等[31]將兔子的精子與用H3標(biāo)記的SV40 DNA共孵育后，在精子頭部檢測到了放射性物質(zhì)，用這些與用H3標(biāo)記的SV40 DNA共孵育過的精子進(jìn)行人工授精，并且在受精卵和2-細(xì)胞時(shí)的胚胎中均檢測到SV40 DNA，證實(shí)外源基因既可以進(jìn)入精子細(xì)胞，還能在受精后表達(dá)。遺憾的是該技術(shù)在當(dāng)時(shí)并未引起人們的關(guān)注。直到1989年,等ArezzoF等[32]和Lavitrano M等[33]均報(bào)道了精子細(xì)胞能夠與外源性DNA結(jié)合并產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因后代后，這才吸引許多學(xué)者從事這方面的研究。但是又由于Brinster R L等(1989) [34]做了重復(fù)性實(shí)驗(yàn)而未獲得陽性結(jié)果，而使SMGT技術(shù)受到質(zhì)疑。而后的幾十年，研究人員通過哺乳動(dòng)物、鳥類、魚類和昆蟲類做了大量的研究，證實(shí)精子可以吸附并整合外源DNA，并且攜帶外源性DNA進(jìn)入卵細(xì)胞中。時(shí)至今日，對(duì)此技術(shù)仍然存在爭論，但是利用精子作為外源基因的載體制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物仍然極為令人注目，SMGT技術(shù)有兩大優(yōu)點(diǎn):a、能夠簡單、高效、快速、低廉、安全地進(jìn)行轉(zhuǎn)基因，其成本只有顯微注射法成本的1/10 ;b、不需要對(duì)動(dòng)物進(jìn)行手術(shù)處理。用這種方法最早由Lavitrano M等[33]在小鼠上獲得成功，至今已在家兔[35]、豬
[36]、牛[37]、羊[38]等哺乳動(dòng)物上以及雞[39?41]和魚[42]上都相繼獲得成功。其方法就是利用動(dòng)物精子有自發(fā)結(jié)合外源DNA的能力的特性，將成熟的精子與外源DNA進(jìn)行共孵育，然后直接進(jìn)行Al或IVF后體外培養(yǎng)后再胚胎移植，使精子攜帶外源DNA，與卵子受精時(shí)使外源DNA整合于受精卵的染色體中，最后輕松獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。用SMGT技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物便于實(shí)驗(yàn)室研究和在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。
[0017]目前應(yīng)用SMGT技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物主要通過體外精子轉(zhuǎn)染法(精子與外源DNA直接共孵育法、脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法和體外電穿孔導(dǎo)入法等)和體內(nèi)精子轉(zhuǎn)染法(曲細(xì)精管注射法、睪丸內(nèi)注射法等)兩大途徑來實(shí)現(xiàn)。
[0018]5.1體外精子轉(zhuǎn)染法
體外精子轉(zhuǎn)染法包括:精子與外源DNA直接共孵育法、脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法和體外電穿孔導(dǎo)入法等。
[0019]精子與外源DNA直接共孵育法，是在一定條件下直接將精子與裸露的外源DNA混合共孵育后，將仍然保持較好的活力且吸附有外源DNA的精子，通過體外受精或人工授精及胚胎移植等方法而獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。在分子生物學(xué)的研究初期和體外受精技術(shù)研究初期，Brackett等(1971) [31]直接用裸露的H3標(biāo)記的SV40 DNA與兔的精子孵育后，在精子頭部檢測到放射性物質(zhì)后，經(jīng)人工授精，又在受精卵和2-細(xì)胞時(shí)的胚胎均檢測到SV40 DNA,首次證實(shí)外源基因可以進(jìn)入精子細(xì)胞，并能在受精后的胚胎中表達(dá)。1989年，Arezzo F等
[32]和Lavitrano M等[33]等進(jìn)一步證實(shí)了精子具有結(jié)合外源DNA的能力。Lavitrano[43]于2003年發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率與孵育的時(shí)間、溫度等條件等有關(guān)。董煥聲等M (2007)利用DIG末端標(biāo)記技術(shù)和免疫組化技術(shù)分析了小鼠精子與外源DNA共孵育時(shí)間分別為20min、40min、60min、90min條件下,體外結(jié)合內(nèi)化外源DNA的效率時(shí),發(fā)現(xiàn)在60min內(nèi)外源DNA與精子的結(jié)合隨時(shí)間的延長而增加，90min精子的陽性率與60min差異不大。體外受精后熒光顯微鏡下檢測2-4細(xì)胞期的胚胎有GFP散在分布強(qiáng)弱不均的4.7%(2/43)陽性率。王曉梅等[45](2005)金黃地鼠附睪內(nèi)的精子與質(zhì)粒NFkB-1u