1.基于CRISPR/Cas9的外源基因敲入整合系統(tǒng),其特征在于:該敲入整合系統(tǒng)包括第一報告/供體載體,所述報告/供體載體包括兩條目標(biāo)基因同源臂以及位于兩條目標(biāo)基因同源臂之間的外源序列片段;兩條目標(biāo)基因同源臂在目標(biāo)基因上的同源序列分別位于目標(biāo)基因靶序列的兩側(cè)并與目標(biāo)基因靶序列相接;外源序列片段包括依次排列的啟動子、抗性基因、剪切肽序列、報告基因以及polyA尾,抗性基因內(nèi)部具有兩段該抗性基因的SSA修復(fù)同源序列,并且在兩段SSA修復(fù)同源序列之間插入有目標(biāo)基因靶序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于CRISPR/Cas9的外源基因敲入整合系統(tǒng),其特征在于:所述啟動子選自CMV、CAG或U6啟動子;所述抗性基因選自puromycin或zeocin抗性基因;所述剪切肽序列選自T2A;所述報告基因選自熒光蛋白類報告基因eGFP或RFP;所述polyA尾選自polyA、SV40polyA或BGH polyA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于CRISPR/Cas9的外源基因敲入整合系統(tǒng),其特征在于:所述SSA修復(fù)同源序列的大小為150~200bp。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于CRISPR/Cas9的外源基因敲入整合系統(tǒng),其特征在于:所述敲入整合系統(tǒng)還包括與所述第一報告/供體載體共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的第二報告/供體載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述基于CRISPR/Cas9的外源基因敲入整合系統(tǒng),其特征在于:所述宿主細(xì)胞為真核細(xì)胞。
6.基于CRISPR/Cas9的外源基因敲入整合系統(tǒng)的建立方法,其特征在于:該敲入整合系統(tǒng)的建立方法包括以下步驟:
1.1)以包括外源序列區(qū)段Ⅰ的載體a為骨架載體,所述外源序列區(qū)段Ⅰ內(nèi)設(shè)置有順次排列的啟動子、抗性基因Ⅰ、剪切肽序列、報告基因Ⅰ以及polyA尾,其中抗性基因Ⅰ的內(nèi)部具有兩段該抗性基因的SSA修復(fù)同源序列,將目標(biāo)基因靶序列插入外源序列區(qū)段Ⅰ,插入位置位于載體a的抗性基因Ⅰ內(nèi)兩段SSA修復(fù)同源序列之間,從而使抗性基因Ⅰ的閱讀框保持打亂狀態(tài);
1.2)經(jīng)過步驟1.1)后,以包括目標(biāo)基因同源臂Ⅰ、多克隆酶切位點和目標(biāo)基因同源臂Ⅱ三個順次排列的元件的載體b為骨架載體,目標(biāo)基因同源臂Ⅰ、Ⅱ在目標(biāo)基因上的同源序列分別位于目標(biāo)基因靶序列的兩側(cè)并與目標(biāo)基因靶序列相接,利用多克隆酶切位點將載體a上的外源序列區(qū)段Ⅰ插入載體b上目標(biāo)基因同源臂Ⅰ、Ⅱ之間,從而構(gòu)建得到第一報告/供體載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述基于CRISPR/Cas9的外源基因敲入整合系統(tǒng)的建立方法,其特征在于:所述敲入整合系統(tǒng)的建立方法還包括以下步驟:
2.1)在載體a的基礎(chǔ)上構(gòu)建載體c,載體c包括外源序列區(qū)段Ⅱ,所述外源序列區(qū)段Ⅱ內(nèi)設(shè)置有順次排列的啟動子、抗性基因Ⅱ、剪切肽序列、報告基因Ⅰ以及polyA尾,其中抗性基因Ⅱ與所述抗性基因Ⅰ對應(yīng)不同的抗性篩選條件,且抗性基因Ⅱ的內(nèi)部具有兩段該抗性基因的SSA修復(fù)同源序列;
2.2)將目標(biāo)基因靶序列插入外源序列區(qū)段Ⅱ,插入位置位于載體c的抗性基因Ⅱ內(nèi)兩段SSA修復(fù)同源序列之間,從而使抗性基因Ⅱ的閱讀框保持打亂狀態(tài);并將載體c的外源序列區(qū)段Ⅱ中的報告基因Ⅰ替換為報告基因Ⅱ,報告基因Ⅰ和報告基因Ⅱ?qū)?yīng)不同的檢測信號;然后將載體c上的外源序列區(qū)段Ⅱ插入載體b上目標(biāo)基因同源臂Ⅰ、Ⅱ之間,從而構(gòu)建得到第二報告/供體載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述基于CRISPR/Cas9的外源基因敲入整合系統(tǒng)的建立方法,其特征在于:所述步驟2.1)具體包括以下步驟:
2.1.1)克隆抗性基因Ⅱ,克隆過程中在抗性基因Ⅱ內(nèi)部增加兩段該抗性基因的SSA修復(fù)同源序列;
2.1.2)經(jīng)過步驟2.1.1)后,用具有SSA修復(fù)同源序列的抗性基因Ⅱ替換所述載體a中的抗性基因Ⅰ,得到載體c。
9.如權(quán)利要求4所述基于CRISPR/Cas9的外源基因敲入整合系統(tǒng)在雙染色體等位基因的雙敲入中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求1或4所述基于CRISPR/Cas9的外源基因敲入整合系統(tǒng)在制備純系轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或轉(zhuǎn)基因動物中的應(yīng)用。