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CAR表達(dá)載體及其構(gòu)建方法與流程

文檔序號:11936826閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種CAR表達(dá)載體,包括載體和接入所述載體的CAR,所述CAR包括胞膜外抗原結(jié)合區(qū)、鉸鏈區(qū)和胞內(nèi)信號傳導(dǎo)區(qū),其特征在于,

所述胞膜外抗原結(jié)合區(qū)為用于結(jié)合HER2蛋白的chA21 scFv;

所述胞內(nèi)信號傳導(dǎo)區(qū)為CD28-X-ITAM,其中,所述X為ICOS、CD137、CD134、CD80或者CD86共刺激分子。

2.如權(quán)利要求1所述的CAR表達(dá)載體,其特征在于,所述X為ICOS共刺激分子。

3.如權(quán)利要求1所述的CAR表達(dá)載體,其特征在于,所述載體為病毒質(zhì)粒。

4.一種如權(quán)利要求1所述的CAR表達(dá)載體的構(gòu)建方法,其特征在于,包括步驟如下:

獲取所述chA21 scFv的基因片段、所述鉸鏈區(qū)的基因片段、所述CD28的基因片段、所述X的基因片段以及所述ITAM的基因片段;

提供引導(dǎo)鏈,基因融合所述引導(dǎo)鏈與所述chA21 scFv的基因片段,而形成引導(dǎo)鏈-chA21 scFv;

基因融合所述鉸鏈區(qū)的基因片段、所述CD28的基因片段、所述X的基因片段和所述ITAM的基因片段,而形成鉸鏈區(qū)-CD28-X-ITAM;

基因融合所述引導(dǎo)鏈-chA21 scFv和所述鉸鏈區(qū)-CD28-X-ITAM,而形成引導(dǎo)鏈-chA21 scFv-鉸鏈區(qū)-CD28-X-ITAM;

將所述引導(dǎo)鏈-chA21 scFv-鉸鏈區(qū)-CD28-X-ITAM接入載體,而獲得CAR表達(dá)載體。

5.如權(quán)利要求4所述的CAR表達(dá)載體的構(gòu)建方法,其特征在于,所述獲取所述chA21 scFv的基因片段、所述鉸鏈區(qū)的基因片段、所述CD28的基因片段、所述X的基因片段以及所述ITAM的基因片段的過程中,包括步驟如下:

獲取并激活PMBCs;

提取所述PMBCs的mRNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA;

分別提供所述鉸鏈區(qū)的引物、所述CD28的引物、所述X的引物和所述ITAM的引物,且均以所述PMBCs的cDNA為模板,分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增,而獲得所述鉸鏈區(qū)的基因片段、所述CD28的基因片段、所述X的基因片段以及所述ITAM的基因片段;

提供所述chA21 scFv的模板DNA和所述chA21 scFv的引物,并進(jìn)行PCR擴(kuò)增,而獲得所述chA21 scFv的基因片段。

6.如權(quán)利要求4所述的CAR表達(dá)載體的構(gòu)建方法,其特征在于,所述載體為病毒質(zhì)粒。

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