本發(fā)明涉及生物技術領域，特別是涉及一種促進star基因表達的表達載體及其構建方法和應用。

背景技術：

類固醇激素合成急性調節(jié)蛋白(steroidogenicacuteregulatoryprotein，star)，也稱類固醇激素靈敏調節(jié)蛋白，是促進膽固醇由線粒體外膜轉入到線粒體內(nèi)膜的一種轉運蛋白，在膽固醇的代謝以及類固醇激素的合成中起關鍵的限速作用。研究表明，star在調節(jié)睪酮的合成過程中起重要的作用，是維持正常生理功能所必須的一種重要蛋白。傳統(tǒng)的star基因表達技術中，例如任欣等利用萊克多巴胺實現(xiàn)對大鼠睪丸中star基因表達的調控，馬金魁等則研究了鹽酸克倫特羅對大鼠睪丸中star表達的影響。上述研究均為應用間接手段調控star基因表達，目前缺乏能夠轉染到人源細胞，并在人源細胞中持續(xù)、穩(wěn)定且高效表達star基因的表達載體。

技術實現(xiàn)要素：

基于此，有必要提供一種能夠在人源細胞中持續(xù)、穩(wěn)定且高效表達star基因的表達載體及其構建方法和應用。

一種促進star基因表達的表達載體，包括慢病毒載體plvx-mcmv-zsgreen-pgk-puro的基本序列、抗性基因序列、多克隆位點序列、啟動子序列以及目的基因表達片段，所述多克隆位點包括ecori酶切位點和noti酶切位點，所述目的基因表達片段中含有用于表達star的star基因編碼序列，所述目的基因表達片段的5’端具有ecori酶切位點黏性末端，所述目的基因表達片段的3’端具有noti酶切位點黏性末端，所述目的基因表達片段正向插入在所述多克隆位點序列的所述ecori酶切位點和所述noti酶切位點之間。

在一個實施方式中，所述star基因編碼序列的核苷酸序列如seqidno.1所示。

在一個實施方式中，所述ecori酶切位點黏性末端的3’端直接與所述star基因編碼序列的5’端連接，所述noti酶切位點黏性末端的5’端直接與所述star基因編碼序列的3’端連接，所述ecori酶切位點黏性末端的堿基序列為5’-aattc-3’，所述noti酶切位點黏性末端的堿基序列為5’-ggccgc-3’。

一實施方式的促進star基因表達的表達載體的構建方法，包括以下步驟：

以star基因編碼序列作為擴增模板，并加入上游引物和下游引物后進行pcr擴增，得到pcr擴增產(chǎn)物，所述上游引物包括針對所述star基因編碼序列的5’端設計的序列和針對ecori酶切位點設計的序列，所述下游引物包括針對所述star基因編碼序列的3’端設計的序列和針對noti酶切位點設計的序列；

對所述pcr擴增產(chǎn)物進行加a尾反應，使得所述pcr擴增產(chǎn)物的兩端連接a堿基，并將加a尾反應后的所述pcr擴增產(chǎn)物連接到t載體中，得到重組t載體；

用限制性內(nèi)切酶ecori和限制性內(nèi)切酶noti對所述重組t載體進行雙酶切，得到目的基因表達片段；以及

將所述目的基因表達片段連接到經(jīng)過限制性內(nèi)切酶ecori和限制性內(nèi)切酶noti雙酶切處理后的慢病毒載體plvx-mcmv-zsgreen-pgk-puro中，得到所述促進star基因表達的表達載體。

在一個實施方式中，所述star基因編碼序列的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述上游引物的堿基序列如seqidno.2所示，所述下游引物的堿基序列如seqidno.3所示。

一種含有star基因的慢病毒，通過如下方法制備得到：

將上述的促進star基因表達的表達載體轉染進入293ft細胞中；以及

對轉染后的所述293ft細胞擴增表達，獲得所述含有star基因的慢病毒。

一種組合物在制備抗腫瘤的藥物中的應用，所述組合物包括上述的促進star基因表達的表達載體。

在一個實施方式的應用中，所述組合物還包括塑化劑。

在一個實施方式的應用中，所述塑化劑為鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯。

在一個實施方式的應用中，所述組合物用于制備抗乳腺癌的藥物。

上述促進star基因表達的表達載體包括慢病毒載體plvx-mcmv-zsgreen-pgk-puro的基本序列、抗性基因序列、多克隆位點序列、啟動子序列以及目的基因表達片段。多克隆位點序列包括ecori酶切位點和noti酶切位點，目的基因表達片段中含有用于表達star的star基因編碼序列，目的基因表達片段的5’端具有ecori酶切位點黏性末端，3’端連具有noti酶切位點黏性末端。目的基因表達片段正向插入在多克隆位點序列的ecori酶切位點和noti酶切位點之間。發(fā)明人在載體的選擇、目的基因插入位點、構建方法等方面進行了大量的探索研究，預料不到地發(fā)現(xiàn)，將含有star基因編碼序列的目的基因表達片段正向插入在慢病毒載體plvx-mcmv-zsgreen-pgk-puro的ecori酶切位點和noti酶切位點之間，成功地構建出能夠特異性促進star基因表達的表達載體。實驗結果表明該表達載體能夠轉染到人源細胞中，并在人源細胞中持續(xù)、穩(wěn)定且高效表達star基因。轉染了該促進star基因表達的表達載體的乳腺癌細胞系mcf-7細胞表達的star是對照組的591.9倍，表達量具有顯著的差異。該表達載體還能增加塑化劑對腫瘤細胞的毒性，實驗結果表明，轉染了該表達載體的人乳腺癌細胞mcf-7的凋亡基因、雌激素受體基因以及dna氧化損傷基因表達水平均高于未轉染的人乳腺癌細胞mcf-7，該表達載體能夠加速腫瘤細胞的凋亡，增加塑化劑對腫瘤細胞的損害作用，有望應用在抗腫瘤的藥物中，為腫瘤治療提供一種思路。

附圖說明

圖1為一實施方式的促進star基因表達的表達載體的構建方法的流程圖；

圖2為實施例1中star基因編碼序列pcr擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖3為實施例1中所用的plvx-mcmv-zsgreen-pgk-puro骨架載體的譜圖；

圖4為實施例4中熒光定量pcr檢測mcf-7細胞和轉染促進star基因表達的表達載體的mcf-7細胞的star的mrna表達水平結果圖；

圖5為實施例5中westernblot檢測兩組細胞star蛋白表達水平的結果圖；

圖6為對圖5中的圖像用imagej軟件進行條帶灰度定量分析star蛋白表達水平結果圖；

圖7為實施例6中熒光定量pcr檢測不同濃度的dehp條件下，兩組乳腺癌細胞mcf-7的凋亡基因bax的mrna表達水平結果圖；

圖8為實施例6中熒光定量pcr檢測不同濃度的dehp條件下，兩組乳腺癌細胞mcf-7的凋亡基因caspase-3的mrna表達水平結果圖；

圖9為實施例6中熒光定量pcr檢測不同濃度的dehp條件下，兩組乳腺癌細胞mcf-7的凋亡基因caspase-8的mrna表達水平結果圖；

圖10為實施例6中熒光定量pcr檢測不同濃度的dehp條件下，兩組乳腺癌細胞mcf-7的雌激素受體基因erα的mrna表達水平結果圖；

圖11為實施例6中熒光定量pcr檢測不同濃度的dehp條件下，兩組乳腺癌細胞mcf-7的雌激素受體基因erβ的mrna表達水平結果圖；

圖12為實施例6中熒光定量pcr檢測不同濃度的dehp條件下，兩組乳腺癌細胞mcf-7的dna損傷基因hogg1的mrna表達水平結果圖；

圖13為實施例6中熒光定量pcr檢測不同濃度的dehp條件下，兩組乳腺癌細胞mcf-7的dna損傷基因mth1的mrna表達水平結果圖。

具體實施方式

為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點能夠更加明顯易懂，下面結合具體實施例及附圖對本發(fā)明的具體實施方式做詳細的說明。在下面的描述中闡述了很多具體細節(jié)以便于充分理解本發(fā)明。但是本發(fā)明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來實施，本領域技術人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似改進，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實施的限制。

一實施方式的促進star基因表達的表達載體，包括慢病毒載體plvx-mcmv-zsgreen-pgk-puro的基本序列、抗性基因序列、多克隆位點序列、啟動子序列以及目的基因表達片段。多克隆位點包括ecori酶切位點和noti酶切位點。目的基因表達片段中含有用于表達star的star基因編碼序列，目的基因表達片段的5’端具有ecori酶切位點黏性末端，目的基因表達片段的3’端具有noti酶切位點黏性末端。目的基因表達片段正向插入在多克隆位點序列的ecori酶切位點和noti酶切位點之間。

具體地，抗性基因序列用于篩選轉化后的表達載體。

在一個實施方式中，抗性基因序列選自氨芐青霉素抗性基因序列和卡那霉素抗性基因序列中的至少一種。

具體地，多克隆位點序列中包括多個酶切位點，除ecori酶切位點和noti酶切位點之外，多克隆位點序列中還可以包括hpai酶切位點、sfii酶切位點和sbfi酶切位點等。

具體地，啟動子(promoters)序列用于控制表達載體中的基因表達的起始時間和表達的程度。

在一個實施方式中，ecori酶切位點黏性末端的3’端直接與star基因編碼序列的5’端連接，noti酶切位點黏性末端的5’端直接與star基因編碼序列的3’端連接。進一步地，ecori酶切位點黏性末端的堿基序列為5’-aattc-3’，noti酶切位點黏性末端的堿基序列為5’-ggccgc-3’。

具體地，目的基因表達片段中含有用于表達star的star基因編碼序列，star基因編碼序列從ncbi數(shù)據(jù)庫中篩選獲得。

在一個實施方式中，star基因編碼序列依據(jù)star的mrna序列設計。具體為篩選出ncbi數(shù)據(jù)庫的genbanknm_000349，設計得到star基因編碼序列的核苷酸序列如seqidno.1所示。

在慢病毒載體plvx-mcmv-zsgreen-pgk-puro中，star基因編碼序列以雙鏈的形式存在，star基因編碼序列的5’端連接有ecori酶切位點黏性末端，ecori酶切位點黏性末端包括經(jīng)ecori酶酶切后的一段堿基序列，例如aattc。star基因編碼序列的3’端連接有noti酶切位點黏性末端，noti酶切位點黏性末端包括經(jīng)noti酶酶切后的一段堿基序列，例如tcgag，設置ecori酶切位點黏性末端以及ecori酶切位點黏性末端使得star基因編碼序列能夠順利的插入到慢病毒載體plvx-mcmv-zsgreen-pgk-puro中。

進一步地，ecori酶切位點黏性末端以及noti酶切位點黏性末端中還含有保護序列，提高酶切效率。

發(fā)明人在載體的選擇、目的基因插入位點、構建方法等方面進行了大量的探索研究，預料不到地發(fā)現(xiàn)，將含有star基因編碼序列的目的基因表達片段正向插入在慢病毒載體plvx-mcmv-zsgreen-pgk-puro的ecori酶切位點和noti酶切位點之間，成功地構建出能夠特異性促進star基因表達的表達載體。實驗結果表明該表達載體能夠轉染到人源細胞中，上述表達載體具有轉染效率高，用量少，并在人源細胞中持續(xù)、穩(wěn)定且高效表達star基因的優(yōu)點，轉染了該促進star基因表達的表達載體的乳腺癌細胞系mcf-7細胞表達的star是對照組的591.9倍，表達量具有顯著的差異，可作為有力工具應用于制備治療star基因表達異常相關疾病藥物的研究和開發(fā)中。

進一步地，該表達載體還能增加塑化劑對腫瘤細胞的毒性。實驗結果表明，轉染了該表達載體的人乳腺癌細胞mcf-7的細胞凋亡基因、雌激素受體基因以及dna氧化損傷基因的表達水平均高于未轉染的人乳腺癌細胞mcf-7，該表達載體能夠加速腫瘤細胞的凋亡，增加塑化劑對腫瘤細胞的損害作用，該表達載體有望應用在抗腫瘤的藥物中，為腫瘤治療提供一種思路。

請參閱圖1，一實施方式的上述促進star基因表達的表達載體的構建方法，包括以下步驟s110～s140。

s110、以star基因編碼序列作為擴增模板，并加入上游引物和下游引物后進行pcr擴增，得到pcr擴增產(chǎn)物，上游引物包括針對star基因編碼序列的5’端設計的序列和針對ecori酶切位點設計的序列，下游引物包括針對star基因編碼序列的3’端設計的序列和針對noti酶切位點設計的序列。

具體地，目的基因表達片段中含有用于表達star的star基因編碼序列，star基因編碼序列從ncbi數(shù)據(jù)庫中篩選獲得。

在一個實施方式中，star基因編碼序列依據(jù)star的mrna序列設計。具體為篩選出ncbi數(shù)據(jù)庫的genbanknm_000349，設計得到star基因編碼序列的核苷酸序列如seqidno.1所示。設計的star基因編碼序列可通過基因合成的方式獲得。

上游引物包括針對star基因編碼序列的5’端設計的序列和針對ecori酶切位點設計的序列，下游引物包括針對star基因編碼序列的3’端設計的序列和針對noti酶切位點設計的序列，通過上游引物和下游引物的擴增，使得star基因編碼序列具有ecori酶切位點和noti酶切位點。

具體地，上游引物中包括擴增ecori酶切位點的序列以及保護序列，下游引物中包括擴增noti酶切位點的序列以及保護序列，使得pcr擴增得到的pcr擴增產(chǎn)物具有ecori酶切位點和noti酶切位點。上下游引物無引物二聚體且退火溫度差距較小。

在一個實施方式中，上游引物的堿基序列如seqidno.2所示，下游引物的堿基序列如seqidno.3所示。

具體地，按照premixprimestarhs的使用說明配置反應體系進行pcr，退火溫度為62℃。pcr擴增完成后進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，然后用dna膠回收試劑盒回收約1000bp的pcr產(chǎn)物，得到pcr擴增產(chǎn)物。

s120、對s110中得到的pcr擴增產(chǎn)物進行加a尾反應，使得pcr擴增產(chǎn)物的兩端連接a堿基，并將加a尾反應后的pcr擴增產(chǎn)物連接到t載體中，得到重組t載體。

具體地，用extaq酶對pcr擴增產(chǎn)物進行加a尾反應，參見extaq酶的使用說明書，在extaq酶的條件下，將pcr擴增產(chǎn)物的兩端分別加上a堿基，形成加a尾的pcr擴增產(chǎn)物，使得pcr擴增產(chǎn)物能夠順利連接到t載體中。

具體地，參見t4dna連接酶的使用說明書，將兩端加a堿基后的pcr擴增產(chǎn)物連接到t載體中，形成重組t載體。

具體地，獲得重組t載體后，還包括對重組t載體的擴增和鑒定。具體包括將重組t載體轉化進入大腸桿菌感受態(tài)細菌中，篩選獲得陽性單克隆，培養(yǎng)陽性單克隆并提取獲得大量的重組t載體。大腸桿菌感受態(tài)細菌例如為jm107感受態(tài)細菌或dh5α感受態(tài)細菌等。

本實施方式中，將重組t載體轉化進入jm107感受態(tài)細菌中，涂布在具有抗性的培養(yǎng)基上，挑取陽性單克隆小量培養(yǎng)并測序鑒定。然后將測序正確的菌液擴大培養(yǎng)，提取細菌中的重組t載體。

s130、用限制性內(nèi)切酶ecori和限制性內(nèi)切酶noti對s120中得到的重組t載體進行雙酶切，得到目的基因表達片段。

具體地，挑取測序正確的重組t載體，先進行noti酶切，用核酸共沉劑回收酶切產(chǎn)物后，再用ecori酶切，電泳鑒定后，用dna膠回收試劑盒回收的酶切產(chǎn)物，得到目的基因表達片段。該目的基因片段的5’端有ecori酶切位點黏性末端，該目的基因片段的3’端有noti酶切位點黏性末端。

s140、將s130中得到的目的基因表達片段連接到經(jīng)過限制性內(nèi)切酶ecori和限制性內(nèi)切酶noti雙酶切處理后的慢病毒載體plvx-mcmv-zsgreen-pgk-puro中，得到促進star基因表達的表達載體。

慢病毒載體plvx-mcmv-zsgreen-pgk-puro先經(jīng)過限制性內(nèi)切酶ecori和限制性內(nèi)切酶noti雙酶切處理，打開缺口，使得目的基因表達片段順利插入到慢病毒載體plvx-mcmv-zsgreen-pgk-puro的ecori酶切位點和noti酶切位點之間，獲得促進star基因表達的表達載體。

一實施方式的含有star基因的慢病毒，通過如下方法制備得到：該上述促進star基因表達的表達載體轉染進入293ft細胞中，通過對轉染后的293ft細胞擴增表達，從而獲得含有star基因的慢病毒。

具體地，將轉染后的293ft細胞培養(yǎng)36h～60h后，收集細胞上清培養(yǎng)基用濾膜過濾，得到含有star基因的慢病毒的上清液。獲得含有star基因的慢病毒后，還包括使用lenti-xgostix金標試劑盒測定病毒滴度，然后保存于-80℃條件下。

上述促進star基因表達的表達載體的構建方法操作簡單，在載體的選擇、目的基因插入位點、構建方法等方面進行了大量的探索研究，將含有star基因編碼序列的目的基因表達片段正向插入在慢病毒載體plvx-mcmv-zsgreen-pgk-puro的ecori酶切位點和noti酶切位點之間，成功地構建出能夠特異性促進star基因表達的表達載體。實驗結果表明該方法構建的表達載體能夠轉染到人源細胞中，具有轉染效率高，用量少，并在人源細胞中持續(xù)、穩(wěn)定且高效表達star基因的優(yōu)點。轉染了該促進star基因表達的表達載體的乳腺癌細胞系mcf-7細胞表達的star是對照組的591.9倍，表達量具有顯著的差異。

本文還提供一實施方式的組合物在制備抗腫瘤的藥物中的應用，該組合物包括上述的促進star基因表達的表達載體。

具體地，該組合物可以是應用于預防腫瘤的疫苗，也可以是應用于治療已經(jīng)確診為腫瘤甚至癌癥的藥物。

進一步地，該組合物為用于制備抗乳腺癌的藥物。

在一個實施方式中，該組合物還包括塑化劑。

具體地，塑化劑為鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯(dehp)。

進一步地，塑化劑在組合物中的濃度為0.05mmol/l以上，優(yōu)選0.80mmol/l以上。

可以理解，該組合物中還可以包括淀粉、硬質酸鈉等藥物輔助劑。

在一個實施方式的應用中，該組合物應用在促進凋亡基因bax、caspase-3或caspase-8表達的抗腫瘤藥物中。優(yōu)選地，該組合物應用在促進凋亡基因caspase-3或caspase-8表達的抗腫瘤藥物中。

在一個實施方式的應用中，該組合物應用在促進雌激素受體基因erα或erβ表達的抗腫瘤藥物中。優(yōu)選地，該組合物應用在促進雌激素受體基因erα表達的抗腫瘤藥物中。

在一個實施方式應用中，該組合物應用在促進dna氧化損傷基因hogg1或mth1表達的抗腫瘤藥物中。

進一步地，該組合物應用在同時促進凋亡基因、雌激素受體基因以及dna氧化損傷基因表達的抗腫瘤藥物中。

進一步地，塑化劑與促進star基因表達的表達載體形成的組合物應用在同時促進凋亡基因、雌激素受體基因以及dna氧化損傷基因表達的抗腫瘤藥物中。

實驗結果表明，將上述促進star基因表達的表達載體轉染到乳腺癌細胞系mcf-7細胞中后，mcf-7表達的star是對照組的591.9倍，表達量具有顯著的差異。轉染了該表達載體的人乳腺癌細胞mcf-7的凋亡基因、雌激素受體基因以及dna氧化損傷基因表達水平均高于未轉染的人乳腺癌細胞mcf-7，該表達載體能夠加速腫瘤細胞的凋亡，增加塑化劑對腫瘤細胞的損害作用。有望應用在抗腫瘤的藥物中，為腫瘤治療提供一種思路。

此外，即使在塑化劑的濃度為0mmol/l，即塑化劑不存在的條件下。轉染了該表達載體的人乳腺癌細胞mcf-7的雌激素受體基因erα、erβ和dna氧化損傷基因hogg1的表達量也高于未轉染的人乳腺癌細胞mcf-7，說明該促進star基因表達的表達載體本身對腫瘤細胞具有毒性，對腫瘤細胞的損害作用，有望應用在抗腫瘤的藥物中。

下面為具體實施例部分。

以下實施例中，如無特別說明，未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如參見薩姆布魯克、ef弗里奇、t曼尼阿蒂斯等(金冬雁，黎孟楓等譯)所著的的分子克隆實驗指南[m](北京：科學出版社，1992)中所述的條件或者試劑盒生產(chǎn)廠家推薦的方法實現(xiàn)。實施例中所使用的試劑均為市售。

實施例中所用的材料：限制性內(nèi)切酶ecori、noti(美國fermentas公司)，t4dna連接酶(美國fermentas公司)，dna膠回收試劑盒rneasyminikit試劑盒(德國qiagen公司)，primescriprtreagentkit和sybrprimescriptrt-pcrkit(中國takara公司)，質粒小量提取和無內(nèi)毒素質粒小量提取試劑盒(美國omegabio-tek公司)，j107大腸桿菌感受態(tài)(天根生物公司)，真核表達載體plvx-mcuv-zsgreen-pglc-puro(以下簡稱plvx載體，biovector公司)，包裝輔助質粒plvx-gfp和該質粒對應的慢病毒包裝試劑盒(美國clontech公司)，用于慢病毒包裝的293ft細胞(美國invitrogen公司)，rpmi-1640培養(yǎng)基和10％胎牛血清(美國gibco公司)，人乳腺癌mcf-7細胞(中國上海細胞庫)，dmso(美國sigma公司)，dehp(純度>99％，tci公司)，bax、caspase-3、caspase-8、erα、erβ、hogg1、mth1基因pcr引物由上海生工合成，β-actin一抗、兔抗star(ab133657)一抗、羊抗鼠igg-hrp和羊抗兔igg-hrp均為美國thermoscientific公司產(chǎn)品。

實施例1

構建促進star基因表達的表達載體

(1)star目的基因表達片段引物的設計。

根據(jù)ncbi數(shù)據(jù)庫genbanknm_000349設計star基因編碼序列，獲得核苷酸序列如seqidno.1所示的star基因編碼序列(star的cdna序列)。使用oligo7對其進行分析，搜索上下游引物(要求盡可能無引物二聚體且退火溫度差距較小)，然后在上游引物的5’端加入保護堿基與ecori酶切位點序列，下游引物的5’端分加入保護堿基與noti酶切位點序列，設計得到的引物序列如表1所示。設計的pcr引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

表1：star基因編碼序列的pcr擴增引物

(2)star基因編碼序列(cdna)的擴增及其重組t載體的構建

按照premixprimestarhs的使用說明配置反應體系進行pcr，退火溫度為62℃。pcr完成后進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結果如圖2所示。然后用dna膠回收試劑盒回收約1000bp的pcr產(chǎn)物，得到pcr擴增產(chǎn)物。并再用extaq酶進行加a尾反應。按照t4dna連接酶的說明書，將加a尾產(chǎn)物與t載體連接，轉化jm107感受態(tài)細菌。常規(guī)篩選鑒定，挑取小量培養(yǎng)的pcr鑒定陽性克隆的細菌菌液進行測序鑒定。將測序正確的菌液擴大培養(yǎng)，提取細菌中的重組t載體。

(3)促進star基因表達的表達載體與鑒定

挑取測序正確的重組t載體，先進行noti酶切，用核酸共沉劑回收酶切產(chǎn)物后，再用ecori酶切。電泳鑒定后，用dna膠回收試劑盒回收的酶切產(chǎn)物，，得到目的基因表達片段。然后將目的基因表達片段與經(jīng)過相同處理的plvx-mcmv-zsgreen-pgk-puro慢病毒載體連接。plvx-mcmv-zsgreen-pgk-puro骨架載體的譜圖請參閱圖3。進一步將連接后的載體轉化jm107感受態(tài)細菌，小量培養(yǎng)篩選出來的細菌取重組質粒進行pcr鑒定，并將菌液進行測序鑒定。將測序結果證實star基因cdna序列正確插入的菌液擴增培養(yǎng)，用去內(nèi)毒素質粒提取試劑盒對重組質粒進行抽提，得到特異性促進star基因表達的表達載體(plvx-star)。

實施例2

制備含有star基因的慢病毒

培養(yǎng)293ft細胞，取生長狀態(tài)良好的細胞接種到六孔中，每孔10⁶個細胞，用慢病毒包裝輔助試劑盒，取實施例1中抽提的plvx-star重組載體2μg轉染到293ft細胞，置于37℃培養(yǎng)48h后將上清培養(yǎng)基用0.45μm濾膜過濾，收集病毒上清，使用lenti-xgostix金標試劑盒測定病毒滴度，然后保存于-80℃。

實施例3

慢病毒轉導人乳腺癌mcf-7細胞

取實施例2獲得的病毒上清，用rpmi-1640完全培養(yǎng)基按1:1稀釋后，再加入polybrene至終濃度為6μg/ml～10μg/ml待用。將3×10⁵個mcf-7細胞接種于t25細胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)18h后細胞匯合度達到50％，去除培養(yǎng)瓶中原有的完全培養(yǎng)基，用pbs洗兩遍后加入上述含慢病毒的rpmi-1640完全培養(yǎng)基。轉染24h，去除含慢病毒的rpmi-1640完全培養(yǎng)基，加入正常的rpmi-1640完全培養(yǎng)基再培養(yǎng)24h，然后換用1μg/ml嘌呤霉素對細胞進行篩選，每隔2天換液1次，篩選時間為7天，篩選獲得star基因高表達的mcf-7細胞株(plvx-star細胞株)。

實施例4

熒光定量pcr檢測star基因表達量

根據(jù)gapdh(genbanknm_002046.5)和star(genbanknm_000349)基因mrna序列，利用引物設計軟件oligo7.0設計pcr引物，引物序列如表2所示。

表2：gapdh和star基因的pcr引物

分別接種mcf-7細胞、實施例3制備的star基因高表達的mcf-7細胞株(plvx-star細胞株)至6孔板。細胞密度達到80％-90％時，用rneasyminikit提取各組細胞的總rna，利用primescriprtreagentkit將mrna逆轉錄為cdna，逆轉錄條件：37℃，15min；85℃，5s；4℃，∞。反轉錄結束后，加入90μl的rnasefreedh2o稀釋cdna，-20℃保存，以便后面檢測使用。

取各組細胞的cdna1μl為模板，分別加入表2中的引物，以gapdh為內(nèi)參，實時熒光定量pcr檢測star相對表達量，設置反應條件：95℃30s，1循環(huán)；54℃30s，40循環(huán)；95℃5s；60℃1min，95℃15s，利用sybrprimescriptrt-pcrkit檢測各組細胞star基因相對表達量，結果如圖4所示?？梢钥吹?，plvx-star細胞株的star基因表達水平較正常的mcf-7細胞提高了591.9倍，具有非常顯著的差異(p<0.01)，說明本發(fā)明提供的star基因cdna序列成功插入至plvx-mcuv-zsgreen-pglc-puro慢病毒載體中，能特異、持續(xù)、高效、穩(wěn)定地促進star基因高表達。

實施例5

westernblot檢測star蛋白表達水平

將正常mcf-7細胞、實施例3制備的plvx-star細胞株分別接種到t25細胞培養(yǎng)瓶(1×10⁶個)。培養(yǎng)約24h后待細胞匯合度達90％后去除培養(yǎng)基，吸棄細胞培養(yǎng)液，用冷pbs洗3次，加入細胞裂解液提取細胞總蛋白，100℃變性8min；用二辛可寧酸法(bicinchoninicacidassay，bca法)進行蛋白定量?？偟白赃M行10％sds-pace電泳分離，接著將蛋白電轉至pvdf膜上，5％脫脂奶粉室溫封閉2h。根據(jù)marker和分子量將膜上含β-actin(43kd),star蛋白(32kd)的部分分別切下，加入相應的一抗，冰上孵育過夜；tbst緩沖液洗膜3次，每次10min。加入對應的二抗，室溫孵育1h；tbst緩沖液洗膜3次，每次10min。加入westernblot化學發(fā)光試劑光后用冷ccd成像系統(tǒng)對其進行曝光拍照，結果如圖5所示。所得圖像用imagej軟件進行條帶灰度定量分析結果如圖6所示。可以看到，plvx-star細胞株的star蛋白質表達水平比對照組升高2.81倍，差異具有非常顯著統(tǒng)計學意義(p<0.01)。這說明plvx-star細胞株構建成功，能持續(xù)、高效、穩(wěn)定地高表達star蛋白。

實施例6

促進star基因表達的表達載體對凋亡基因、雌激素受體基因、dna氧化損傷基因的mrna的表達量的影響

將mcf-7細胞、實施例3制備的plvx-star細胞株(star基因高表達的mcf-7細胞)分別分接種到6孔板中，待細胞融合度達80％時進行dehp染毒。dehp終濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.4、0.8mmol/l，以5‰dmso作為對照，對細胞染毒24h。染毒結束后，參見實施例4熒光定量pcr檢測star基因表達量的方法分別測定的各組細胞中bax、caspase-3、caspase-8、erα、erβ、hogg1、mth1基因表達水平的改變。具體為用rneasyminikit提取各組細胞的總rna，利用primescriprtreagentkit將mrna逆轉錄為cdna，逆轉錄條件：37℃，15min；85℃，5s；4℃下保存。反轉錄結束后，加入90μl的rnasefreedh2o稀釋cdna，-20℃保存，以便后面檢測使用。

取各組細胞的cdna1μl為模板，分別加入表3中的引物，以gapdh為內(nèi)參，實時熒光定量pcr檢測star相對表達量，設置反應條件：95℃30s，1循環(huán)；54℃30s，40循環(huán)；95℃5s；60℃1min，95℃15s，利用sybrprimescriptrt-pcrkit檢測各組細胞bax、caspase-3、caspase-8、erα、erβ、hogg1、mth1r基因相對表達量。bax、caspase-3、caspase-8、erα、erβ、hogg1、mth1的pcr引物的序列如表3所示。

表3：bax、caspase-3、caspase-8、erα、erβ、hogg1、mth1的pcr引物

實驗結果：

(1)促進star基因表達的表達載體對凋亡基因表達水平的影響

在不同濃度的dehp條件下，兩組人乳腺癌細胞mcf-7的凋亡基因bax、caspase-3、caspase-8的表達水平分別請參見圖7、圖8和圖9所示。圖中mcf-7-cells表示正常的mcf-7細胞對照組。staroverexpressionmcf-7-cells表示轉染了促進star基因表達的表達載體的實驗組。不同條件下各基因的表達水平以dehp終濃度為0mmol/l的正常的mcf-7細胞的表達量為作為基準1計算。

從圖7中可以看出，塑化劑dehp染毒24h后，轉染了促進star基因表達的表達載體的乳腺癌細胞mcf-7的凋亡基因bax表達水平明顯高于對照組，從低劑量組至高劑量組分別升高到相應的對照組的1.2～2倍，差異有統(tǒng)計學意義(p<0.01)。

從圖8中可以看出，塑化劑dehp染毒24h，轉染了促進star基因表達的表達載體的乳腺癌細胞mcf-7的凋亡基因caspase-3表達水平明顯高于對照組，從低劑量組至高劑量組分別升高到相應的對照組的1.3～8.0倍，差異有統(tǒng)計學意義(p<0.01)。特別是當dehp終濃度為0.8mmol/l時，caspase-3表達水平是正常的mcf-7細胞的14倍，表達量差異顯著。

從圖9中可以看出，塑化劑dehp染毒24h，轉染了促進star基因表達的表達載體的乳腺癌細胞mcf-7的凋亡基因caspase-8表達水平明顯高于對照組，從低劑量組至高劑量組分別升高到相應的對照組的1.1～8.6倍，差異有統(tǒng)計學意義(p<0.01)。特別是當dehp終濃度為0.8mmol/l時，caspase-8表達水平是正常的mcf-7細胞的12倍，表達量差異顯著。

(2)促進star基因表達的表達載體對雌激素受體基因表達水平的影響

在不同濃度的dehp條件下，兩組人乳腺癌細胞mcf-7的雌激素受體基因erα、erβ的表達水平分別請參見圖10和圖11所示。

從圖10中可以看出，塑化劑dehp染毒24h，轉染了促進star基因表達的表達載體的乳腺癌細胞mcf-7的雌激素erα基因表達水平明顯高于對照組，從低劑量組至高劑量組分別升高到相應的對照組的1.2～3.3倍，差異有統(tǒng)計學意義(p<0.01)。特別是當dehp終濃度為0.8mmol/l時，erα表達水平是正常的mcf-7細胞的8倍，表達量差異顯著。

從圖11中可以看出，塑化劑dehp染毒24h，轉染了促進star基因表達的表達載體的乳腺癌細胞mcf-7的雌激素erβ基因表達水平明顯高于對照組，從低劑量組至高劑量組分別升高到相應的對照組的1.1～1.5倍，差異有統(tǒng)計學意義(p<0.01)。

(3)促進star基因表達的表達載體對dna損傷基因表達水平的影響

在不同濃度的dehp條件下，兩組人乳腺癌細胞mcf-7的dna損傷基因hogg1、mth1的表達水平分別請參見圖12和圖13所示。

從圖12中可以看出，塑化劑dehp染毒24h，轉染了促進star基因表達的表達載體的乳腺癌細胞mcf-7的hogg1基因表達水平明顯高于對照組，從低劑量組至高劑量組分別升高到相應的對照組的1.1～1.4倍，差異有統(tǒng)計學意義(p<0.01)。

從圖13中可以看出，塑化劑dehp染毒24h，轉染了促進star基因表達的表達載體的乳腺癌細胞mcf-7的mth1基因表達水平明顯高于對照組，從低劑量組至高劑量組分別升高到相應的對照組的1～1.5倍，差異有統(tǒng)計學意義(p<0.01)。

以上結果表明，轉染了該表達載體的人乳腺癌細胞mcf-7的凋亡基因、雌激素受體基因以及dna氧化損傷基因表達水平均高于未轉染的人乳腺癌細胞mcf-7，該表達載體能夠加速腫瘤細胞的凋亡，增加塑化劑對腫瘤細胞的損害作用。此外，即使在塑化劑的濃度為0mmol/l，即塑化劑不存在的條件下。轉染了該表達載體的人乳腺癌細胞mcf-7的雌激素受體基因erα、erβ和dna氧化損傷基因hogg1的表達量也高于未轉染的人乳腺癌細胞mcf-7，說明該促進star基因表達的表達載體本身對腫瘤細胞具有毒性，對腫瘤細胞的損害作用，有望應用在抗腫瘤的藥物中。

以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的一種或幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。

sequencelisting

<110>深圳市疾病預防控制中心

<120>促進star基因表達的表達載體及其構建方法和應用

<130>sdf

<160>21

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>855

<212>dna

<213>star基因編碼序列

<400>1

atgctgctagcgacattcaagctgtgcgctgggagctcctacagacacatgcgcaacatg60

aaggggctgaggcaacaggctgtgatggccatcagccaggagctgaaccggagggccctg120

gggggccccacccctagcacgtggattaaccaggttcggcggcggagctctctactcggt180

tctcggctggaagagactctctacagtgaccaggagctggcctatctccagcagggggag240

gaggccatgcagaaggccttgggcatccttagcaaccaagagggctggaagaaggagagt300

cagcaggacaatggggacaaagtgatgagtaaagtggtcccagatgtgggcaaggtgttc360

cggctggaggtcgtggtggaccagcccatggagaggctctatgaagagctcgtggagcgc420

atggaagcaatgggggagtggaaccccaatgtcaaggagatcaaggtcctgcagaagatc480

ggaaaagatacattcattactcacgagctggctgccgaggcagcaggaaacctggtgggg540

ccccgtgactttgtgagcgtgcgctgtgccaagcgccgaggctccacctgtgtgctggct600

ggcatggccacagacttcgggaacatgcctgagcagaagggtgtcatcagggcggagcac660

ggtcccacttgcatggtgcttcacccgttggctggaagtccctctaagaccaaacttacg720

tggctactcagcatcgacctcaaggggtggctgcccaagagcatcatcaaccaggtcctg780

tcccagacccaggtggattttgccaaccacctgcgcaagcgcctggagtcccaccctgcc840

tctgaagccaggtgt855

<210>2

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

ggaattcatgctgctagcgacattc25

<210>3

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<212>dna

<213>人工序列

<400>3

ccgcggccgcacacctggcttcagaggc28

<210>4

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

tctgacttcaacagcgacacc21

<210>5

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<212>dna

<213>人工序列

<400>5

ctgttgctgtagccaaattcgt22

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<211>21

<212>dna

<213>人工序列

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attgctttcataggcaccagt21

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<212>dna

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ccttgtgatccgcctacctca21

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<212>dna

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gccagcaaactggtgctcaa20

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<212>dna

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<213>人工序列

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caaatgcaaactggatgatgac22

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agcaggctcttgttgatttgg21

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<212>dna

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gcctggctagagatcctgatg21

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ggagtggaaaccagtagctgtc22