本發(fā)明涉及生物技術(shù)及作物病害防治技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及zmpao基因在玉米抗矮花葉病中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

玉米是我國主要糧食作物，但由甘蔗花葉病毒(sugarcanemosaicvirus，scmv)侵染引起的玉米矮花葉病(maizedwarfmosaicdisease,mdmd)對我國玉米高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)造成嚴重威脅。scmv是造成我國北方玉米產(chǎn)區(qū)玉米矮花葉病的主要病原，常引起玉米30％以上的產(chǎn)量損失。由于scmv強致病力株系的出現(xiàn)，一些原有的抗病毒品種喪失抗性，在生產(chǎn)上導(dǎo)致更大的危害。亟需鑒定新的抗病基因或抗性材料，以便可持續(xù)、更有效地控制scmv及其危害，保證玉米生產(chǎn)安全。

植物病毒作為一種細胞內(nèi)專性寄生物，在侵染、增殖過程中必須依賴和借助寄主因子完成病毒脫殼、基因組復(fù)制、蛋白表達、病毒顆粒組裝和向鄰近細胞移動等生命過程。因此，鑒定參與植物病毒侵染、增殖過程中的寄主因子能夠幫助我們深入了解病毒的侵染和致病機制，從而為病毒病的防控提供新的材料和理論基礎(chǔ)。后基因組時代，各種組學(xué)技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于寄主與生物脅迫或非生物脅迫互作研究，并已成為探尋病毒致病機制及尋找抗病基因的主要手段之一。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供zmpao基因在玉米抗矮花葉病中的應(yīng)用。

本發(fā)明的另一目的是提供一種抑制甘蔗花葉病毒在玉米中復(fù)制和增殖的方法。

本發(fā)明利用同位素標(biāo)記相對和絕對定量(isobarictaggingforrelativeandabsolutequantification,itraq)蛋白組學(xué)技術(shù)，篩選scmv侵染玉米后上部第一片和第二片系統(tǒng)侵染葉片中顯著差異表達的蛋白，鑒定到一個在兩片葉片中均顯著差異表達的蛋白zmpao。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供zmpao基因在玉米抗矮花葉病中的應(yīng)用，其是利用基因工程的方法，在玉米中過表達zmpao基因，從而提高作物對玉米矮花葉病的抗病性。

本發(fā)明所述玉米矮花葉病是指由scmv侵染引起的玉米矮花葉病害。

本發(fā)明中，zmpao基因來自玉米，所述zmpao基因為：

i)seqidno:2所示的核苷酸序列；或

ii)seqidno:2第233-1732位所示的核苷酸序列；或

iii)seqidno:2第233-1735位所示的核苷酸序列；或

iv)在嚴格條件下與i)～iii)任一序列雜交且表達相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列，所述嚴格條件為在含0.1％sds的0.1×sspe或含0.1％sds的0.1×ssc溶液中，在65℃下雜交，并用該溶液洗膜；或

v)與i)～iii)任一序列具有90％以上同源性且表達相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列。

由所述zmpao基因編碼的蛋白為：

a)seqidno:1所示的氨基酸序列；或

b)seqidno:1所示氨基酸序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

前述的應(yīng)用，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將含有zmpao基因的表達載體轉(zhuǎn)化目標(biāo)植物，篩選轉(zhuǎn)基因玉米植株。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述表達載體的出發(fā)載體為pcambia1300。

攜帶有所述目的基因的表達載體還可通過使用植物病毒載體、直接dna轉(zhuǎn)化、微注射、電穿孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細胞中(weissbach，1998，methodforplantmolecularbiologyviii，academypress，newyork，第411-463頁；geiserson和corey，1998，plantmolecularbiology，2^ndedition)。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，通過抑制zmpao基因在玉米中的表達，進而驗證了該基因的功能，具體方法如下：

1、提取玉米自交系va35的總rna并反轉(zhuǎn)錄為cdna。

2、以步驟1得到的cdna為模板，用zmpao-silencing-f和zmpao-silencing-r組成的引物對進行pcr擴增，得到pcr擴增產(chǎn)物。

zmpao-silencing-f：5'-tacctaggctacggagtgtggcag-3'

zmpao-silencing-r：5'-taccatgggagttgtcctctgtcttg-3'

3、用限制性內(nèi)切酶ncoi和avrii酶切步驟2的pcr擴增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。

4、用限制性內(nèi)切酶ncoi和avrii酶切載體pc13/f3-13m，回收約5000bp的載體骨架。

5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組載體pc13/f3-13m-pao。

6、將重組載體pc13/f3-13m-pao和載體pc13/f1+2共轉(zhuǎn)染本生煙葉片，培養(yǎng)后得到含有重組雀麥花葉病毒(bromemosaicvirus,bmv)的病毒粒子的葉片。

7、從步驟6的煙草葉片中提純重組bmv病毒粒子。

8、在兩葉期，選取生長良好的且第2片葉(第一片真葉)基本完全展開的va35玉米苗，在第2片葉上撒上少許金剛砂，用提純的重組bmv病毒粒子進行摩擦接種，進而瞬時沉默zmpao基因。

在玉米葉片中瞬時沉默zmpao基因后接種scmv，雖然其發(fā)病時間與在未沉默zmpao基因的玉米葉片上接種scmv的發(fā)病時間和侵染癥狀無明顯差異，但沉默zmpao基因后顯著促進了scmv的積累(表現(xiàn)在scmv基因組rna水平和cp蛋白水平)。因此推測，zmpao基因可能參與玉米抗scmv侵染的防御反應(yīng)。zmpao基因可能在防治由scmv引起的玉米矮花葉病害中發(fā)揮重要作用。

本發(fā)明首次通過基因功能試驗和驗證，沉默zmpao基因?qū)е铝藄cmv復(fù)制和增殖水平顯著提高，表明玉米蛋白zmpao及其編碼基因在玉米抵抗scmv侵染、增殖中發(fā)揮重要作用，是玉米編碼的抗scmv的抗病毒基因，可以用于玉米抗scmv的分子育種等工作。本發(fā)明將為研究植物蛋白在病毒侵染中的作用，玉米抗病毒育種等領(lǐng)域提供依據(jù)，提高我國玉米抗病毒研究水平，促進和保證我國玉米生產(chǎn)安全。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例3中scmv在沉默zmpao玉米植株上的侵染表型；其中，bmv-pao為zmpao基因沉默植株，bmv-gfp為對照。

圖2為本發(fā)明實施例3中沉默zmpao基因促進了scmv在玉米植株中的復(fù)制和增殖；其中，(a)scmv接種后7天和14天，zmpao在對照組(bmv-gfp)和處理組(bmv-pao)系統(tǒng)侵染的葉片中相對積累量；(b)scmv基因組rna相對積累量；(c)scmvcp相對積累量；(d)利用imagej軟件對scmvcp相對積累量統(tǒng)計分析結(jié)果。

圖2(c)中cbb表示考馬斯亮藍染色；將對照組的積累量設(shè)定為1，1.577和1.968分別表示處理組中蛋白相對于對照組的積累量。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例均按照常規(guī)實驗條件，如sambrook等分子克隆實驗手冊(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。

以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。

本發(fā)明中使用的生物材料如下：

玉米自交系va35：參見dingxs,schneiderwl,chaluvadisr,etal.characterizationofabromemosaicvirusstrainanditsuseasavectorforgenesilencinginmonocotyledonoushosts.molplant-microbeinteract,2006,19:1229-1239.

本生煙：參見goodinmm,zaitlind,naiduraetal.nicotianabenthamiana:itshistoryandfutureasamodelforplant-pathogeninteractions.molplant-microbeinteract,2008,21(8):1015-1026。

載體pc13/f1+2：參見zhum,cheny,dingxs,etal.maizeelongincinteractswiththeviralgenome-linkedprotein,vpg,ofsugarcanemosaicvirusandfacilitatesvirusinfection.newphytologist,2014,203:1291-1304.

載體pc13/f3-13m-gfp：參見zhum,cheny,dingxs,etal.maizeelongincinteractswiththeviralgenome-linkedprotein,vpg,ofsugarcanemosaicvirusandfacilitatesvirusinfection.newphytologist,2014,203:1291-1304.

載體pc13/f3-13m：參見zhum,cheny,dingxs,etal.maizeelongincinteractswiththeviralgenome-linkedprotein,vpg,ofsugarcanemosaicvirusandfacilitatesvirusinfection.newphytologist,2014,203:1291-1304.

載體pc13/f1+2和載體pc13/f3-13m共轉(zhuǎn)染煙草后，表達雀麥花葉病毒(bmv)的病毒粒子。雀麥花葉病毒的病毒粒子由三條rna鏈組成,載體pc13/f1+2含有rna1和rna2，載體pc13/f3-13m含有rna3，二個載體共轉(zhuǎn)染煙草后擴繁bmv的重組病毒粒子。

甘蔗花葉病毒(scmv)：參見fanzf,chenhy,liangxm,etal.completesequenceofthegenomicrnaoftheprevalentstrainofapotyvirusinfectingmaizeinchina.archvirol,2003,148:773-782。

實施例1zmpao蛋白及其編碼基因的發(fā)現(xiàn)

利用同位素標(biāo)記相對和絕對定量(isobarictaggingforrelativeandabsolutequantification,itraq)蛋白組學(xué)技術(shù)和方法，篩選scmv侵染玉米后上部第一片和第二片系統(tǒng)侵染葉片中顯著差異表達的蛋白，鑒定到一個在兩片葉片中均顯著差異表達的蛋白zmpao，序列如seqidno:1所示。將編碼zmpao蛋白的基因命名為zmpao基因，序列如seqidno:2所示。

實施例2構(gòu)建重組質(zhì)粒pc13/f3-13m-pao

1、提取玉米自交系va35的總rna并反轉(zhuǎn)錄為cdna。

2、以步驟1得到的cdna為模板，用zmpao-silencing-f和zmpao-silencing-r組成的引物對進行pcr擴增，得到pcr擴增產(chǎn)物。

zmpao-silencing-f：5'-tacctaggctacggagtgtggcag-3'

zmpao-silencing-r：5'-taccatgggagttgtcctctgtcttg-3'

3、用限制性內(nèi)切酶ncoi和avrii酶切步驟2的pcr擴增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。

4、用限制性內(nèi)切酶ncoi和avrii酶切載體pc13/f3-13m，回收約5000bp的載體骨架。

5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組載體pc13/f3-13m-pao。根據(jù)測序結(jié)果，對重組載體pc13/f3-13m-pao進行結(jié)構(gòu)描述如下：在載體pc13/f3-13m的ncoi和avrii酶切位點插入了seqidno:2第1300-1533位所示的雙鏈dna分子。

zmpao基因的瞬時沉默載體由重組載體pc13/f3-13m-pao、載體pc13/f1+2組成。

實施例3zmpao基因的瞬時沉默實驗

一、在本生煙中擴繁bmv的病毒粒子

1、用攜帶bmv載體的農(nóng)桿菌浸潤本生煙

(1)將測序正確的pc13/f3-13m-pao載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌c58c1感受態(tài)細胞中；同時將-80℃保存的攜帶pc13/f1+2和pc13/f3-13m-gfp的農(nóng)桿菌菌種于lb平板(含50μg/mlkan，100μg/mlrif)上劃線，28℃培養(yǎng)48h左右。挑取lb平板上的單菌落接種于3～4ml的lb液體培養(yǎng)基(含50μg/mlkan，100μg/mlrif)中，28℃，180rpm培養(yǎng)14～18h；

(2)按1:100的比例取200～300μl的菌液轉(zhuǎn)接于20～30mllb液體培養(yǎng)基(含50μg/mlkan，100μg/mlrif)中，28℃，180rpm培養(yǎng)10～12h；

(3)室溫，4500rpm離心8min收集菌體，用20ml浸潤緩沖液(10mmmes，ph5.7，10mmmgcl2，200μm乙酰丁香酮)懸浮沉淀，用分光光度計測定菌懸液的濃度，用浸潤緩沖液調(diào)整菌懸液濃度至最終濃度為od600＝2.0。

(4)將攜帶pc13/f1+2的菌懸液分別和等體積的攜帶pc13/f3-13m-pao與pc13/f3-13m-gfp的菌懸液混勻后，室溫放置3h。用無針頭的1ml注射器浸潤本生煙葉片的下表皮。

(5)浸潤后的本生煙置于22～24℃的人工氣候室中培養(yǎng)3天后取樣，取樣時將樣品用錫箔紙包好迅速置于液氮中冷凍，置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2、zmpao插入片段的檢測

取0.1g左右的農(nóng)桿菌浸潤的本生煙葉片，用trizol法提取煙草葉片的總rna，用oligodt(5'-tttttttttttttttttt-3')引物進行反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cdna為模板用引物xsd198/199(xsd198：5'-cttgtgttgctgagaaac-3'；xsd199：5'-tcttgtaagaggtctgc-3')進行pcr擴增，并對pcr產(chǎn)物進行電泳分析，用pc13/f3-13m空載體質(zhì)粒為對照，檢測農(nóng)桿菌浸潤的本生煙葉片中重組bmv病毒攜帶的外源插入片段是否發(fā)生丟失。將攜帶完整外源插入片段的bmv重組病毒的煙草葉片，在液氮中研磨，磨成粉末后分裝到2ml離心管中(每管0.4g左右)，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3、bmv病毒粒子的粗提純

(1)取適量(根據(jù)需接種的玉米植株數(shù)量而定)的-80℃保存的煙草葉片樣品粉末，每管中加入800μlbmv提取緩沖液，混勻后置冰上孵育20～30min；

(2)4℃，8000g離心10min，取上清，按照每200μl上清液加入46μl40％peg/nacl溶液的比例加入相應(yīng)體積的40％peg/nacl溶液，充分混勻后置于冰上，在搖床上低轉(zhuǎn)速孵育1h；

(3)4℃，13000g離心15min，棄上清，每管用100μlbmv儲存緩沖液懸浮沉淀，即得到粗提純的bmv病毒粒子，用于后續(xù)的摩擦接種實驗。

4、病毒粒子接種va35玉米和挑戰(zhàn)接種scmv

用nanodrop^tm分光光度計檢測bmv病毒粒子的濃度，od260的值約等于病毒粒子的濃度(μg/μl)。在兩葉期，選取生長良好的且第2片葉(第一片真葉)基本完全展開的va35玉米苗，在第2片葉上撒上少許金剛砂，每棵用20μg粗提純的bmv病毒粒子進行摩擦接種。bmv-pao與bmv-gfp(作為對照)接種相同數(shù)量的植株。將接種后的玉米植株置于透光的塑料罩內(nèi)，在18～20℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6天后移去塑料罩，在第二片葉(第一片真葉)挑戰(zhàn)接種scmv，并將接種后的植物置于24℃/22℃光照培養(yǎng)箱或人工氣候室中繼續(xù)培養(yǎng)，分別于scmv接種后7天和14天檢測目標(biāo)基因的沉默效率和對應(yīng)的scmvrna和cp(外殼蛋白)的積累量。

二、瞬時沉默zmpao基因降低了scmv復(fù)制和積累水平

1、病毒粒子接種va35玉米和挑戰(zhàn)接種scmv

用nanodrop^tm分光光度計檢測bmv病毒粒子的濃度，od260的值約等于病毒粒子的濃度(μg/μl)。在兩葉期，選取生長良好的且第2片葉(第一片真葉)基本完全展開的va35玉米苗，在第2片葉上撒上少許金剛砂，每棵用20μg粗提純的bmv病毒粒子進行摩擦接種。bmv-pao與bmv-gfp(作為對照)接種相同數(shù)量的植株。將接種后的玉米植株置于透光的塑料罩內(nèi)，在18～20℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6天后移去塑料罩，在第二片葉(第一片真葉)挑戰(zhàn)接種scmv，并將接種后的植物置于24℃/22℃光照培養(yǎng)箱或人工氣候室中繼續(xù)培養(yǎng)，分別于scmv接種后7天和14天檢測目標(biāo)基因的沉默效率和對應(yīng)的scmvrna和cp的積累量。

2、scmv接種后第7天和第14天，取上部第二片系統(tǒng)侵染葉片，提取總rna并反轉(zhuǎn)錄為cdna，以cdna作為模板，采用康為世紀熒光定量pcr試劑和，采用ubiquitin基因作為內(nèi)參基因，rt-qpcr鑒定zmpao基因的相對表達量和scmv基因組rna的含量，采用ubiquitin基因作為內(nèi)參基因。

用于鑒定zmpao基因的引物對如下：

zmpao-qrt-f：5'-actccgctgaaattctcatcaa-3'

zmpao-qrt-r：5'-caaatcgtgctcatcgaacc-3'

用于鑒定ubiquitin基因的引物對如下：

ubi-qrt-f：5'-ggaaaaaccataaccctgga-3'

ubi-qrt-r：5'-atatggagagagggcaccag-3'

用于鑒定scmv的引物對如下：

scmv-cp-qrt-f：5'-ggcgagactcaggagaataca-3'

scmv-cp-qrt-r：5'-acacgctacaccagaagacact-3'

得到的數(shù)據(jù)用2^-△△ct法進行分析，步驟如下：

首先，對實驗組樣本(test)和對照組樣本(calibrator)，用參照基因(ref)的ct值歸一目標(biāo)基因(target)的ct值：

△ct(test)＝ct(target,test)-ct(ref,test)

△ct(calibrator)＝ct(target,calibrator)-ct(ref,calibrator)

其次，用對照組樣本的△ct值歸一實驗組樣本的△ct值：

△△ct＝△ct(test)－△ct(calibrator)

最后，計算表達水平比率：

2^-△△ct＝表達量的比值

scmv基因組rna的相對含量見圖2(b)，zmpao基因的相對表達量見圖2(a)。

結(jié)果表明，scmv接種后7天和14天，與對照組相比，實驗組zmpao積累量分別下調(diào)了為50％和60％左右，scmv基因組rna的積累量均為對照組的1.6倍左右。

5、scmv接種后第7天和第14天，取上部第二片系統(tǒng)侵染葉片，提取總蛋白，以scmvcp抗血清為一抗，ap標(biāo)記的羊抗兔為二抗，進行westernblot分析，見圖2(c)和圖2(d)。結(jié)果表明，在zmpao沉默效率分別約為50％和60％的植株上，scmvcp的積累量明顯增加，為對照組的1.6和2倍左右，說明沉默zmpao導(dǎo)致了scmv復(fù)制和增殖量顯著增加。

以上結(jié)果表明，在玉米葉片中瞬時沉默zmpao基因后接種scmv，雖然其發(fā)病時間與在未沉默zmpao基因的玉米葉片上接種scmv的發(fā)病時間和侵染癥狀無明顯差異(圖1)，但沉默zmpao基因?qū)е铝藄cmv復(fù)制和增殖水平顯著提高(圖2)，表明玉米蛋白zmpao及其編碼基因在抵抗scmv侵染、增殖中發(fā)揮重要作用，是玉米編碼的抗scmv的抗病毒基因，可以用于玉米抗scmv的分子育種等工作。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之做一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。

序列表

<110>中國農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>zmpao基因在玉米抗矮花葉病中的應(yīng)用

<130>khp171112951.8

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>500

<212>prt

<213>玉米

<400>1

metserserserproserpheglyleuleualaleualaalavalleu

151015

leualaleuasnleualaglnhisglyserleualaalathrvalgly

202530

proargvalilevalvalglyalaglymetserglyileseralaala

354045

lysargleuserglualaglyilethraspleuleuileleugluala

505560

thrasphisileglyglyargmethislysthrasnphealaglyile

65707580

asnvalgluleuglyalaasntrpvalgluglyvalasnglyglylys

859095

metasnproiletrpproilevalasnserthrleulysleuargasn

100105110

pheargserasppheasptyrleualaglnasnvaltyrlysgluasp

115120125

glyglyvaltyraspgluasptyrvalglnlysargilegluleuala

130135140

aspservalgluglumetglyglulysleuseralathrleuhisala

145150155160

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165170175

hisglnproasnglyproalathrprovalaspmetvalvalasptyr

180185190

tyrlyspheasptyrgluphealagluproproargvalthrserleu

195200205

glnasnthrvalproleualathrpheserasppheglyaspaspval

210215220

tyrphevalalaaspglnargglytyrglualavalvaltyrtyrleu

225230235240

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245250255

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260265270

glyglyvalthrvallysthrgluaspasnservaltyrseralaasp

275280285

tyrvalmetvalseralaserleuglyvalleuglnseraspleuile

290295300

glnphelysprolysleuprothrtrplysvalargalailetyrgln

305310315320

pheaspmetalavaltyrthrlysilepheleulyspheproarglys

325330335

phetrpprogluglylysglyarggluphepheleutyralaserser

340345350

argargglytyrtyrglyvaltrpglnglupheglulysglntyrpro

355360365

aspalaasnvalleuleuvalthrvalthraspglugluserargarg

370375380

ilegluglnglnseraspgluglnthrlysalagluilemetglnval

385390395400

leuarglysmetpheproglylysaspvalproaspalathraspile

405410415

leuvalproargtrptrpseraspargphetyrlysglythrpheser

420425430

asntrpprovalglyvalasnargtyrglutyraspglnleuargala

435440445

provalglyargvaltyrphethrglygluhisthrsergluhistyr

450455460

asnglytyrvalhisglyalatyrleuserglyileaspseralaglu

465470475480

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485490495

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500

<210>2

<211>2166

<212>dna

<213>玉米

<400>2

tttttttttttttgatgtgattagtccttggtgagctggtccggatggaccttttggtaa60

gtgagggaccatgcatcccatcacaatgggttatgatgattagcctttagatgtgtgtat120

atatatgaggggtgagaggggggaggggcctggggagcaacacaagcactccacactgct180

gtgcagaacgagagcgtaaccatcagtactcaatagttagagcgaccaatagatgagttc240

ctccccgtcctttggtctcctggccttagcagcagtactcctagcactgaacttagcaca300

acatggctccctcgccgcaaccgtcggccccagggtcatcgtcgtcggcgccggcatgtc360

tgggatctcggcggcgaagaggctgtcggaggccgggataaccgacctgctgattctgga420

agcgacggaccacatcggcgggcggatgcacaagacgaacttcgccggcatcaacgtcga480

gttaggcgccaactgggtggagggcgtgaacggcggcaagatgaaccccatctggcccat540

cgtcaactccaccctcaagctccgcaacttccgctccgacttcgactacctcgctcagaa600

cgtctacaaggaggacggtggcgtctacgatgaagattacgtccagaagagaattgaact660

ggcggacagcgtggaagagatgggggagaagctctctgccactttgcacgccagtggcag720

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