專利名稱：一種提高玉米對(duì)矮花葉病抗性的方法及其專用干擾rna的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高玉米對(duì)矮花葉病抗性的方法及其專用干擾RNA。
背景技術(shù)：
玉米矮花葉病(maize dwarf mosaic，MDM)是一種在世界范圍內(nèi)廣泛傳播的玉米病毒病，對(duì)玉米的生產(chǎn)造成嚴(yán)重影響。我國于1968年在河南省新鄉(xiāng)和安陽地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)該病，后來該病逐步擴(kuò)展蔓延，遍及黑龍江、遼寧、內(nèi)蒙古、北京、天津、河北、河南、山東、山西、陜西、四川、甘肅、新疆、上海、浙江、廣西和海南等省及臺(tái)灣地區(qū)，其中以華北和西北地區(qū)受災(zāi)較為嚴(yán)重。1998年，山西省矮花葉病的發(fā)病面積高達(dá)670余萬畝，大田發(fā)病率為20-30％，制種田高達(dá)70-100％，使制種田減產(chǎn)40-50％，總產(chǎn)損失5億公斤，絕收地塊屢見不鮮。玉米矮花葉病現(xiàn)已成為阻礙玉米生產(chǎn)的一大病害。
我國的玉米矮花葉病主要由甘蔗花葉病毒(SCMV)引起。甘蔗花葉病毒在田間主要由蚜蟲以非持久性方式傳播。通過化學(xué)藥劑治蚜防病的效果欠佳，種植抗病品種是控制該病毒病的最佳途徑，而抗病育種面臨的最達(dá)障礙是天然抗性基因資源嚴(yán)重不足并且難以分離，同時(shí)還存在育種周期長、抗性基因遺傳不穩(wěn)定等問題。
植物病毒主要依賴于寄主的復(fù)制轉(zhuǎn)錄體系完成自身的繁殖和侵染。干擾病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，就能達(dá)到延遲和減輕病毒病害的目的。自Beachy研究小組(Beachy R N.Coatprotein mediated resistance against virus infection.Ann.Rev.Phytopathol.1990，28451-474)首次證實(shí)表達(dá)煙草花葉病毒(TMV)外殼蛋白的轉(zhuǎn)基因植物對(duì)TMV產(chǎn)生抗性以來，利用病毒來源的基因獲得抗病轉(zhuǎn)基因植物成為植物抗病毒基因工程的重要途徑。
玉米抗矮花葉病基因工程主要利用甘蔗花葉病毒或玉米矮花葉病毒(MDMV)的外殼蛋白基因培育轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)為發(fā)病延遲、發(fā)病程度減輕。但因抗病程度不高，尚難用于生產(chǎn)。
植物體內(nèi)正?；虻霓D(zhuǎn)錄產(chǎn)物因無互補(bǔ)序列不會(huì)形成雙鏈RNA，因此植物體內(nèi)出現(xiàn)了雙鏈RNA就會(huì)激發(fā)RNAi(RNA interference，RNA干擾)機(jī)制。RNA干擾技術(shù)是在雙鏈RNA(ds RNA)分子的介導(dǎo)下特異性降解靶基因的生物技術(shù)，能使基因表達(dá)沉默，達(dá)到拮抗靶基因和實(shí)現(xiàn)生物(基因)治療目的。將雙鏈RNA降解成長度為21-25nt的小干擾RNA片段(siRNA，small interfering RNA)，這些小片段會(huì)進(jìn)一步介導(dǎo)與其同源的單鏈RNA降解。RNAi效率高，是植物保持自身基因穩(wěn)定的一種防御機(jī)制，已被用于反向遺傳學(xué)和功能基因組學(xué)的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種提高玉米對(duì)矮花葉病抗性的方法及其專用干擾RNA。
本發(fā)明所提供的提高玉米對(duì)矮花葉病抗性的干擾RNA，是正義鏈具有序列表中SEQ ID №1的核苷酸序列，反義鏈具有序列表中SEQ ID №2的雙鏈RNA序列。
將上述雙鏈RNA序列命名為SCMV iRNA，其反義鏈與SCMV mRNA的1-900位置序列互補(bǔ)。序列表中SEQ ID №1由1044個(gè)堿基組成，序列的方向從左至右為5′端→3′端；序列表中SEQ ID №2由900個(gè)堿基組成，序列的方向從左至右為5′端→3′端。
上述提高玉米對(duì)矮花葉病抗性的干擾RNA的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。它可具有下述雙鏈核苷酸序列正義鏈(不做模板的DNA鏈)具有序列表中SEQ ID №3的核苷酸序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；反義鏈(做模板的DNA鏈)具有序列表中SEQ ID №4的核苷酸序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №4限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件可為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下雜交并洗膜。
序列表中SEQ ID №3由1944個(gè)堿基組成，序列的方向從左至右為5′端→3′端；序列表中SEQ ID №4由1944個(gè)堿基組成，序列的方向從左至右為3′端→5′端。
含有提高玉米對(duì)矮花葉病抗性的干擾RNA編碼基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌以及擴(kuò)增提高玉米對(duì)矮花葉病抗性的干擾RNA編碼基因中任一片段的引物也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種提高玉米對(duì)矮花葉病抗性的方法。
本發(fā)明所提供的提高玉米對(duì)矮花葉病抗性的方法，是將上述提高玉米對(duì)矮花葉病抗性的干擾RNA的編碼基因?qū)胗衩淄庵搀w，得到矮花葉病抗性提高的玉米。
所述提高玉米對(duì)矮花葉病抗性的干擾RNA的編碼基因通過含有所述提高玉米對(duì)矮花葉病抗性的干擾RNA的編碼基因的RNAi植物表達(dá)載體導(dǎo)入玉米外植體；用于構(gòu)建所述RNAi植物表達(dá)載體的出發(fā)載體可為任意一種可在玉米中表達(dá)外源基因的植物表達(dá)載體，如pCAMBIA1300(購自CAMBIA公司)、pCAMBIA1301(購自CAMBIA公司)、pCAMBIA3301(購自CAMBIA公司)、pBI121(購自Clontech公司)、pBin19(購自Clontech公司)、pART27(Gleave，A.P.(1992)A versatile binary vector systemwith a T-DNA organisational structure conducive to efcient integration ofcloned DNA into the plant genome.Plant Mol.Biol.20，1203-1207)等，其中，pCAMBIA3301為優(yōu)選的出發(fā)載體。
以pCAMBIA3301為出發(fā)載體，構(gòu)建的RNAi植物表達(dá)載體為p3301SCMVirNIb。
攜帶有提高玉米對(duì)矮花葉病抗性的干擾RNA編碼基因的植物表達(dá)載體可通過使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、電擊法、花粉管導(dǎo)入法或脂質(zhì)體融合法等方法轉(zhuǎn)化玉米的外植體，優(yōu)選為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法；所述農(nóng)桿菌可為任意一種根癌農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌，優(yōu)選為根癌農(nóng)桿菌LBA4404。
所述外植體可為玉米的幼胚、愈傷組織、原生質(zhì)體、幼苗基部葉片、花藥、花粉?；蜃臃?，優(yōu)選為幼胚。
所述玉米的品種可以是多種多樣的，如綜3、綜31、齊31、黃早四、先早17、P138或鄭87-1等。
本發(fā)明應(yīng)用RNAi技術(shù)，將甘蔗花葉病毒(SCMV)復(fù)制酶基因的正義基因和反義基因相連，構(gòu)建了一個(gè)RNAi基因，利用植物表達(dá)載體將該RNAi基因?qū)胗衩?。在玉米體內(nèi)，該RNAi基因轉(zhuǎn)錄出的RNA能通過序列互補(bǔ)形成發(fā)夾狀的雙鏈RNA結(jié)構(gòu)，激發(fā)植株體內(nèi)的RNAi機(jī)制，降解入侵病毒與其同源的RNA。本發(fā)明的RNAi基因轉(zhuǎn)入玉米后，轉(zhuǎn)基因玉米對(duì)矮花葉病具有高抗性。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1)現(xiàn)有的玉米抗矮花葉病基因工程是利用植物表達(dá)載體將目標(biāo)病毒的某個(gè)基因的全部核苷酸序列的cDNA導(dǎo)入玉米，以此獲取抗病轉(zhuǎn)基因植株。此法所得到的轉(zhuǎn)基因玉米的抗病株率較低，且抗性只是延遲發(fā)病或者減輕發(fā)病程度，抗病水平不高，難以用于生產(chǎn)。利用本發(fā)明的方法獲得的轉(zhuǎn)基因玉米抗病株率高，可達(dá)90％，且抗性能達(dá)高抗甚至免疫水平，較易在生產(chǎn)上應(yīng)用。
2)本發(fā)明的RNAi基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物會(huì)形成一種序列自我互補(bǔ)的雙鏈結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)會(huì)激發(fā)植株體內(nèi)的RNAi機(jī)制，把該雙鏈結(jié)構(gòu)降解成小片段，因此轉(zhuǎn)基因的mRNA不存在或存在量很少，也不會(huì)翻譯成蛋白質(zhì)，避免了常規(guī)抗病毒轉(zhuǎn)基因方式可能引起病毒與轉(zhuǎn)基因發(fā)生遺傳重組或異源包裝產(chǎn)生新病毒的風(fēng)險(xiǎn)。
本發(fā)明對(duì)培育高抗矮花葉病轉(zhuǎn)基因玉米中具有重要的理論及實(shí)踐意義。
說明書附1為所構(gòu)建的甘蔗花葉病毒復(fù)制酶基因的RNAi植物表達(dá)載體的PstI和SacI單酶切鑒定結(jié)果圖2為所構(gòu)建的甘蔗花葉病毒復(fù)制酶基因的RNAi植物表達(dá)載體的SacI和MunI雙酶切鑒定結(jié)果具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所用引物由上海博亞公司合成。
實(shí)施例1、抗矮花葉病性提高的轉(zhuǎn)基因玉米的獲得一、甘蔗花葉病毒外殼蛋白的RNAi載體的構(gòu)建1、RT-PCR擴(kuò)增甘蔗花葉病毒復(fù)制酶的全長cDNA基因根據(jù)甘蔗花葉病毒復(fù)制酶基因的核苷酸序列(GenBanK號(hào)AJ001691)設(shè)計(jì)反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增其cDNA的引物，引物序列如下引物1(上游引物)5′-GAGCGTTGAAGAACAATGTG-3′；引物2(下游引物)5′-CGTTGTTCCAGATCCACTTC-3′采用RT-PCR法擴(kuò)增甘蔗花葉病毒復(fù)制酶的全長cDNA基因，具體方法包括以下步驟1)反轉(zhuǎn)錄合成其第一鏈cDNA提取感染矮花葉病玉米植株葉片的總RNA，10μL反應(yīng)體系為葉片總RNA 2μL，10mM dNTP 1μL，Oligo(dT) 1μL，ddH2O 6μL。65℃水浴5min，冰浴2min。再向管內(nèi)加入以下組分10×RT緩沖液(Promega)2μL，25mMMgCl24μL，0.1M DTT 2μL，RNasin 1μL，Superscript II RT酶1μL，混勻后，按如下條件進(jìn)行反應(yīng)先42℃ 50min，再70℃ 15min，冰浴5min后，加入RNase 1μL，37℃，20min。
2)PCR擴(kuò)增甘蔗花葉病毒復(fù)制酶的全長cDNA基因以步驟1)反轉(zhuǎn)錄合成的第一鏈cDNA為模板，在引物1和引物2的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增甘蔗花葉病毒復(fù)制酶的全長cDNA基因，50μL反應(yīng)體系為步驟1)的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2μL，ddH2O 39.6μL，10×PCR緩沖液(TaKaRa)5μL，10mM dNTP 1μL，10μM引物1 1μL，10μM引物21μL，Taq plus酶(TaKaRa)(5U/μL)0.4μL。PCR反應(yīng)條件為先94℃ 5min；再94℃ 1min，56℃ 1min，72℃延伸2min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃ 7min。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，用柱式回收試劑盒(上海生工)回收1.6kb的擴(kuò)增產(chǎn)物，將其溶于20μL去離子水中。將回收的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pGEM-T Easy載體連接，10μL連接反應(yīng)體系為PCR產(chǎn)物2μL，2×Rapid連接緩沖液(TaKaRa)5μL，pGEM-T Easy載體(Promega)(50ng/μL)1μL，T4DNA連接酶(3U/μL)1μL，ddH2O 1μL，4℃連接12-24小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，將連接產(chǎn)物加入到200μL大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化條件為先冰浴30min，再42℃熱擊90sec，然后冰浴5min，最后加入800μL LB液體培養(yǎng)基，37℃輕搖培養(yǎng)1h。培養(yǎng)結(jié)束后，3500rpm離心5min，棄去800μL上清液，將剩余物涂布于含100mg/L氨芐青霉素的LB平板上，37℃避光培養(yǎng)16小時(shí)。挑取長出的單菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，然后提質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，將陽性克隆送基康公司進(jìn)行核苷酸序列測定，測序結(jié)果表明獲得了序列正確的甘蔗花葉病毒復(fù)制酶的全長cDNA基因序列，將含有甘蔗花葉病毒復(fù)制酶的全長cDNA基因序列的重組載體命名為pGEM-T Easy/SCMV。
二、甘蔗花葉病毒外殼蛋白的RNAi載體的構(gòu)建1、用限制性內(nèi)切酶EcoRI將pGEM-T Easy/SCMV中的甘蔗花葉病毒復(fù)制酶基因的全長序列切下，插入到載體pUC19的EcoRI的酶切位點(diǎn)中構(gòu)建重組載體，將其命名為pUC19/SCMV。pUC19的多克隆位點(diǎn)處有XbaI酶切位點(diǎn)，甘蔗花葉病毒復(fù)制酶基因上有XhoI酶切位點(diǎn)，用限制性內(nèi)切酶XbaI和XhoI雙酶切重組載體pUC19/SCMV，對(duì)甘蔗花葉病毒復(fù)制酶基因在重組載體pUC19/SCMV中的插入方向進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果表明甘蔗花葉病毒復(fù)制酶基因以反向方式插入到pUC19中，插入方向正確。
2、用限制性內(nèi)切酶SacI和MunI雙酶切(MunI為部分酶切)重組載體pUC19/SCMV，回收甘蔗花葉病毒復(fù)制酶基因5’端長度分別為1044bp和896bp的兩個(gè)DNA片段，分別具有序列表中SEQ ID №5和SEQ ID №6限定的核苷酸序列。
3、將正義鏈分別為896bp和1044bp兩個(gè)長度的DNA片段同時(shí)與經(jīng)限制性內(nèi)切酶SacI酶切的植物表達(dá)載體pCAMBIA3301獲得的片段(命名為p3301Ubi)連接，構(gòu)建重組植物表達(dá)載體。連接體系及連接條件為回收的長度為1044bp片段2μL，896bp片段2μL，p3301Ubi片段1μL，10×緩沖液2μL，T4連接酶(TaKaRa)1μL，ddH2O 12μL，16℃連接12小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，將連接產(chǎn)物加入到200μL大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化條件為先冰浴30min，再42℃熱擊90sec，然后冰浴5min，最后加入800μL LB液體培養(yǎng)基，37℃輕搖培養(yǎng)1h。培養(yǎng)結(jié)束后，3500rpm離心5min，棄去500μL上清液，將剩余物涂布于含100mg/L卡那霉素的LB平板上，37℃避光培養(yǎng)16小時(shí)。挑取長出的單菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，然后提質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。分別用PstI和SacI進(jìn)行的單酶切鑒定結(jié)果如

圖1所示(泳道2、3為PstI單酶切產(chǎn)物，泳道5、6為SacI單酶切產(chǎn)物)，SacI和MunI的雙酶切鑒定結(jié)果如圖2所示(泳道1、2為SacI和MunI雙酶切產(chǎn)物)，酶切鑒定結(jié)果表明長度為1044bp的正義鏈和長度為896bp的反義鏈在MunI切口處連接，然后插入了植物表達(dá)載體p3301Ubi的SacI切口處，形成了含甘蔗花葉病毒復(fù)制酶基因干擾RNA的編碼基因的RNAi植物表達(dá)載體，命名為p3301SCMVirNIb。
三、將甘蔗花葉病毒復(fù)制酶基因的RNAi植物表達(dá)載體導(dǎo)入玉米T0表示由玉米愈傷組織得到的植株，T1表示T0代自交產(chǎn)生的種子及由它所生長的植株，T2表示T1代自交產(chǎn)生的種子及由它所生長的植株。
用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將步驟二構(gòu)建的RNAi植物表達(dá)載體p3301SCMVirNIb導(dǎo)入玉米，具體方法包括以下步驟1、用凍融直接轉(zhuǎn)化法將RNAi植物表達(dá)載體p3301SCMVirNIb導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404，具體步驟如下1)制備農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞取28℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.5的農(nóng)稈菌LBA4404的菌液于5000rpm離心5min后棄上清，然后加入10mL 0.15M的NaCl溶液懸浮細(xì)胞，再5000rpm離心5min后棄上清，用1mL預(yù)冷的20mM CaCl2懸浮細(xì)胞，冰浴后分裝，液氮中速凍1分鐘，置-70℃保存?zhèn)溆茫?)通過凍融直接轉(zhuǎn)化法將甘蔗花葉病毒復(fù)制酶基因的RNAi植物表達(dá)載體p3301SCMVirNIb導(dǎo)入農(nóng)稈菌LBA4404取200μL步驟1)制備的農(nóng)稈菌LBA4404的感受態(tài)細(xì)胞，加入1μg步驟二構(gòu)建的甘蔗花葉病毒復(fù)制酶基因的RNAi植物表達(dá)載體p3301SCMVirNIb，液氮中速凍1min，37℃水浴5min，然后加入1mL YEB培養(yǎng)基，28℃慢速振蕩培養(yǎng)4h后于1000rpm離心30sec，棄上清，加入0.1mL YEB培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，涂布于含有100μg/mL卡那霉素(Kan)和125μg/mL鏈霉素(Sm)的YEB平板上，28℃培養(yǎng)48h后，挑取平板上長出的單菌落，接種于YEB液體培養(yǎng)基(含有100μg/mL卡那霉素和125μg/mL Sm)中，28℃振蕩培養(yǎng)過夜。用特異性引物NIbU5′-GCTCACGGAGTGTATTCAGG-3′和NIbD5′-GGTGCTGCTGTAAAAGTCCG-3′對(duì)菌液進(jìn)行PCR鑒定，得到重組農(nóng)稈菌，命名為LBA4404/p3301SCMVirNIb。
3)通過農(nóng)稈菌介導(dǎo)法將RNAi植物表達(dá)載體p3301SCMVirNIb轉(zhuǎn)入玉米D-inf液配方(1L)N6大量(20×)50mL，B5微量(100×)10mL，Dicamba3.3mg，F(xiàn)e鹽(200×)5mL，RTV(100×)10mL，酪蛋白水解物0.5g，L-脯氨酸0.7g，蔗糖68.5g，葡萄糖36g，肌醇0.1g，pH5.2。
D-AS培養(yǎng)基配方(1L)N6大量(20×)50mL，B5微量(100×)10mL，Dicamba3.3mg，F(xiàn)e鹽(200×)5mL，RTV(100×)10mL，酪蛋白水解物0.5g，L-脯氨酸0.7g，AgNO310mg，乙酰丁香酮3.3mg，蔗糖20g，葡萄糖10g，肌醇0.1g，瓊脂粉8g，pH5.8。
D培養(yǎng)基配方(1L)N6大量(20×)50mL，B5微量(100×)10mL，Dicamba3.3mg，F(xiàn)e鹽(200×)5mL，RTV(100×)10mL，酪蛋白水解物0.5g，L-脯氨酸0.7g，蔗糖20g，葡萄糖10g，肌醇0.1g，瓊脂粉8g，pH5.8。
玉米綜3人工授粉10-13天后，取幼穗剝?nèi)グ~，在70％酒精中浸泡30秒后剝幼胚，將其浸入用D-inf液懸浮的重組農(nóng)稈菌LBA4404/p3301SCMVirNIb菌液，放置5min以上，取出用滅菌濾紙吸干，放到D-AS培養(yǎng)基上，25℃暗培養(yǎng)3天。然后將幼胚放到含有除草劑(10mgPPT/L)的D培養(yǎng)基上篩選培養(yǎng)，2周繼代一次，共繼代4次，篩選出抗性愈傷組織。把抗性愈傷放到誘導(dǎo)培養(yǎng)基(將D培養(yǎng)基中的麥草畏(Dicamba)減為1mg/L，再添加6-BA 5mg/L)上培養(yǎng)10d，誘導(dǎo)生成胚狀體。將胚狀體放到分化培養(yǎng)基(不加Dicamba的D培養(yǎng)基)上光照培養(yǎng)，胚狀體分化成苗。小苗轉(zhuǎn)到1/2MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，長出較粗的根后，取出幼苗，自來水沖凈培養(yǎng)基，移栽于混有營養(yǎng)土和蛭石(營養(yǎng)土和蛭石的混合比例為1∶3)的小花盆中練苗，待長出2-3片新葉時(shí)，將其移入溫室(或大田)，結(jié)果共得到26株生長正常的再生苗。
4)轉(zhuǎn)基因玉米植株的分子檢測用SDS法提取轉(zhuǎn)RNAi植物表達(dá)載體p3301SCMVirNIb的玉米基因組DNA約100ng，用引物NIbU和NIbD進(jìn)行PCR檢測，以構(gòu)建的RNAi載體為模板，利用引物NIbU和NIbD的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為陽性對(duì)照，以同品種非轉(zhuǎn)基因玉米植株的基因組DNA為模板；利用引物NIbU和NIbD的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為陰性對(duì)照。PCR反應(yīng)條件為先94℃ 5min；再94℃ 45sec，56℃ 45sec，72℃ 45sec，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃ 8min。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，結(jié)果26株中有14株可擴(kuò)增出560bp的特異性條帶，為陽性轉(zhuǎn)基因植株，陰性對(duì)照未擴(kuò)增出該特異性條帶。
將經(jīng)PCR檢測為陽性的植株定為轉(zhuǎn)基因植株。對(duì)這些轉(zhuǎn)基因植株的T1代和T2代植株分別在溫室和田間人工接種甘蔗花葉病毒，同時(shí)以同品種非轉(zhuǎn)基因玉米作對(duì)照，觀測發(fā)病癥狀，并作間接ELISA分析，測定病毒濃度。
其中，甘蔗花葉病毒的接種方法為將感染了甘蔗花葉病毒的玉米葉片于液氮中研磨至粉末狀，加10倍體積(W/V)的提取緩沖液(0.01M PB，pH7.0，配方為Na2HPO4.12H2O，43.7g，NaH2PO4.H2O 12.2g，蒸餾水定容至11)，搖動(dòng)混勻后3000rpm離心5min取上清。待玉米長出2葉一心時(shí)，在心葉下一葉正面撒上600目金剛砂，棉球蘸病毒汁液單向摩擦兩次，1周后再重復(fù)接種病毒一次，共接種3次。
用間接ELISA檢測病毒濃度的操作步驟如下(1)取0.2克葉片，液氮研磨，加10mL包被緩沖液(0.05M的碳酸鹽緩沖液，pH9.6)，低速離心(2500rpm/min)，取上清；(2)酶標(biāo)板中每孔加200μL步驟(1)提取的上清液，設(shè)2個(gè)重復(fù)。上樣后加蓋，4℃包被12-24小時(shí)；(3)甩干，用200μL洗滌液(0.02M的PBST，pH7.4，配方為取pH8.0的高壓滅菌的100mmol的Tris-HCl100mL，1.5mol的NaCl 100mL，0.5mL Tween-20，定容至1L)洗滌3次，每次3min；(4)每孔加200μL封閉液(0.1gBSA溶于10mlPBST溶液中，PBST配方為NaCl8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO42.9g，KH2PO40.2g，NaN30.2g，定容至1L后，加0.5mLTween-20)，37℃反應(yīng)1h；傾去孔內(nèi)封閉液，同樣方法沖洗3次；(5)每孔加150μL的兔抗血清(由中國科學(xué)院遺傳研究所制備)(PBST稀釋，或用健康葉汁液稀釋100倍)，37℃反應(yīng)2h；傾去孔內(nèi)封閉液，同樣方法沖洗3次；(6)每孔加150μL樣品稀釋液稀釋2500倍的辣根過氧化物標(biāo)記的羊抗兔IgG(SAR-IgG-HRP，購自Promega)，37℃反應(yīng)2h；(7)PBST沖洗3次，蒸餾水沖洗2次，除凈孔內(nèi)水分；(8)每孔加鄰苯二胺(OPD)底物溶液(含0.04g聯(lián)苯二氨，20mL底物緩沖液(5.1g檸檬酸，18.43g NaHPO4，加1L水溶解后加0.5mL Tween-20)和8μL H2O2)150μL，室溫或37℃顯色5-10min；(9)加入50μL 2M的H2SO4終止反應(yīng)；(10)在酶標(biāo)分光光度計(jì)上測490nm波長下的OD值(測定時(shí)每個(gè)樣品均設(shè)2次重復(fù))。
對(duì)冬季種于溫室的步驟3)獲得的轉(zhuǎn)基因玉米的T1代株行，重復(fù)3次(每次間隔3天)接種甘蔗花葉病毒。10天后進(jìn)行觀測，感病株上部葉片出現(xiàn)明顯的褪綠點(diǎn)線，有的褪綠面積比較大，條紋連片，甚至葉片變黃，并逐漸顯現(xiàn)一定程度的矮化，抗病株則表現(xiàn)正常，抗病與感病株差異明顯，易于區(qū)分。在14個(gè)株行中，轉(zhuǎn)基因玉米有11個(gè)株行的感病株率低于40％，而非轉(zhuǎn)基因?qū)φ招械母胁≈曷矢哂?5％。提取植株的基因組DNA，在引物NIbU和NIbD的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增甘蔗花葉病毒的復(fù)制酶基因，抗病株目的基因的PCR陽性株率為92％，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩昃赎幮?，表明抗病性與轉(zhuǎn)基因高度相關(guān)。
根據(jù)T1代植株抗病性鑒定，結(jié)合PCR檢測結(jié)果，在田間繼續(xù)種植T2代株系。在人工接種病毒的條件下，有3個(gè)株系的抗病株率高于85％，而非轉(zhuǎn)基因?qū)φ招?00％感病。用上述相同反應(yīng)條件和引物作PCR檢測抗病株，均擴(kuò)出了甘蔗花葉病毒的復(fù)制酶基因的目標(biāo)帶，而非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩昃赎幮?。ELISA檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因抗病株的OD值與未接病的健康植株無明顯差異，明顯低于接病的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩?，與癥狀觀測結(jié)果一致。
在成熟期測量了3個(gè)T2代株系的株高，并以相鄰的非轉(zhuǎn)基因行作對(duì)照。結(jié)果表明，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏钠骄旮卟蛔戕D(zhuǎn)基因植株平均株高的90％，減低了20cm左右。t檢驗(yàn)結(jié)果表明，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系與相鄰對(duì)照的株高差異均達(dá)極顯著水平。非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩耆~色明顯變黃，葉面積變小，后期葉片早衰，穗子變小，穗粒數(shù)減少。表明用本發(fā)明的方法得到的轉(zhuǎn)基因玉米對(duì)相關(guān)病毒的抗性程度高，較易得到穩(wěn)定的抗病株系。
序列表<160>6<210>1<211>1044<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>
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<223>
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<223>
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1.提高玉米對(duì)矮花葉病抗性的干擾RNA，是正義鏈具有序列表中SEQ ID №1的核苷酸序列，反義鏈具有序列表中SEQ ID №2的雙鏈RNA序列。
2.權(quán)利要求1所述的提高玉米對(duì)矮花葉病抗性的干擾RNA的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述提高玉米對(duì)矮花葉病抗性的干擾RNA的編碼基因是下述雙鏈核苷酸序列正義鏈具有序列表中SEQ ID №3的核苷酸序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；反義鏈具有序列表中SEQ ID №4的核苷酸序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №4限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
4.含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌。
5.一種提高玉米對(duì)矮花葉病抗性的方法，是將權(quán)利要求2或3所述的提高玉米對(duì)矮花葉病抗性的干擾RNA的編碼基因?qū)胗衩淄庵搀w，得到矮花葉病抗性提高的玉米。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述提高玉米對(duì)矮花葉病抗性的干擾RNA的編碼基因通過含有所述提高玉米對(duì)矮花葉病抗性的干擾RNA的編碼基因的RNAi植物表達(dá)載體導(dǎo)入玉米外植體；用于構(gòu)建所述RNAi植物表達(dá)載體的出發(fā)載體為pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1301、pCAMBIA3301、pART27或pBin19。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于用于構(gòu)建所述RNAi植物表達(dá)載體的出發(fā)載體為pCAMBIA3301。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述RNAi植物表達(dá)載體為p3301SCMVirNIb。
9.根據(jù)權(quán)利要求5或6或7或8所述的方法，其特征在于將所述提高玉米對(duì)矮花葉病抗性的干擾RNA編碼基因?qū)胗衩淄庵搀w的方法為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、電擊法、花粉管導(dǎo)入法或脂質(zhì)體融合法；所述農(nóng)桿菌為根癌農(nóng)桿菌LBA4404。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述玉米的品種為綜3、綜31、齊31、黃早四、先早17、P138或鄭87-1。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提高玉米對(duì)矮花葉病抗性的方法及其專用干擾RNA。該干擾RNA是正義鏈具有序列表中SEQ ID №1的核苷酸序列，反義鏈具有序列表中SEQ ID №2的雙鏈RNA序列。其編碼基因具有下述雙鏈核苷酸序列正義鏈具有序列表中SEQ ID№3的核苷酸序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；反義鏈具有序列表中SEQ ID №4的核苷酸序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №4限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。本發(fā)明對(duì)培育高抗矮花葉病轉(zhuǎn)基因玉米中具有重要的理論及實(shí)踐意義。
文檔編號(hào)C12N15/29GK1715407SQ200510084250
公開日2006年1月4日 申請(qǐng)日期2005年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月18日
發(fā)明者王國英, 白云鳳 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)