專利名稱：玉米體外應(yīng)用dsRNA抗矮花葉病毒干擾調(diào)控技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，尤其涉及一種玉米體外應(yīng)用dsRNA抗 矮花葉病毒干擾調(diào)控技術(shù)。
背景技術(shù)：
玉米是一種重要的糧食、飼料和工業(yè)原料等多用途作物，我國是世界玉米生產(chǎn)第 二大國。近年來，隨著農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化結(jié)構(gòu)的調(diào)整，我國玉米種植面積逐年增加，但是玉米病毒 病尤以玉米矮花葉病毒(Maize dwarfmosaic, MDM)病危害嚴(yán)重，不但造成玉米的大量減產(chǎn) 和品質(zhì)下降，并且可通過種子傳遞給后代，造成品種種性退化。玉米矮花葉病主要是通過蚜 蟲傳播，在我國其病原主要是甘蔗花葉病毒的B株系。在黃淮海夏播玉米區(qū)發(fā)生尤為頻繁 和嚴(yán)重。目前對這種玉米病毒病的防治，多采用農(nóng)藥來控制傳播病毒的蚜蟲，從而使植物免 受病毒侵染，但農(nóng)藥價格較高、易造成污染、費(fèi)工費(fèi)時且防治效果差。通過組織培養(yǎng)脫毒法 對防治某些病毒病曾取得一定的成果，但組織脫毒法成本高，工作量大，有效期短。因此，培 育推廣抗病品種和尋找新方法已成為病毒病防治的迫切需求。RNA沉默是一種真核生物共有的、轉(zhuǎn)錄后水平起作用的同源依賴的基因沉默現(xiàn)象。 目前RNAi作為一種高效的反向遺傳學(xué)手段，已廣泛應(yīng)用于多種動植物的功能基因組研究 和代謝途徑分析，并且在植物的抗病毒育種中也表現(xiàn)出了巨大的優(yōu)勢，具有抗病性強(qiáng)、抗性 持久、抗性植株頻率高和生物安全性高，遺傳穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，成為植物抗病毒基因工程的熱 點(diǎn)。目前利用病毒目的基因如外殼蛋白(CP)基因、復(fù)制酶基因和運(yùn)動蛋白基因等進(jìn)行抗病 基因工程研究已經(jīng)取得了一定的成果。應(yīng)用RNA介導(dǎo)的干擾技術(shù)進(jìn)行植物抗病毒方面的研 究目前主要是利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因法，而該方法面臨著轉(zhuǎn)化體系不成熟，轉(zhuǎn)化頻率低， 以及轉(zhuǎn)基因后代潛在的風(fēng)險等，從而限制了抗病基因工程的研究進(jìn)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為避免上述現(xiàn)有技術(shù)所存在的不足之處，提供大腸桿菌表達(dá)的dsRNA抗 玉米矮花葉病毒干擾調(diào)控技術(shù)，從而誘導(dǎo)植物對病原物產(chǎn)生抗性，可以形成一種防治作物 病害的新方法。本發(fā)明解決技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是玉米體外應(yīng)用dsRNA抗矮花葉病毒干擾調(diào)控技術(shù)，利用RT-PCR擴(kuò)增玉米矮花葉病 毒CP基因兩個特異性片段，構(gòu)建反向重復(fù)表達(dá)載體LMCPl及LMCP2，利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，在 大腸桿菌HT115或DE3中生產(chǎn)抗MDMV的dsRNA，將提取的dsRNA稀釋，稀釋濃度大于1/15 后噴灑三葉期的玉米葉片。其中，RT-PCR擴(kuò)增玉米矮花葉病毒CP基因特異性片段，分別正反向插入到 pUCCRNAi載體中構(gòu)建反向重復(fù)載體pUCCRNAi+2F，利用PstI-SalI雙酶切pUCCRNAi+2F及 L4440質(zhì)粒，并用T4連接酶連接，構(gòu)建原核表達(dá)載體LMCP。作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述的IPTG濃度為0. 6mmol. Γ1，誘導(dǎo)表達(dá)的時間為
34h。作為本發(fā)明的一種改進(jìn)，在噴灑的dsRNA稀釋液中加入滲透劑，濃度小于10_2。所 述的滲透劑為金爾阿硅。作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述的滲透劑的濃度為10_4。本發(fā)明以玉米矮花葉病毒MDMV的外殼蛋白基因的特異性片段為靶目標(biāo)，開展體 外抗病毒RNA干擾調(diào)控技術(shù)研究，對建立簡便高效玉米抗病毒RNAi調(diào)控技術(shù)體系，創(chuàng)建高 抗病毒玉米新種質(zhì)具有重要的理論和實(shí)踐意義。與已有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果體現(xiàn)在1、本發(fā)明利用RNA沉默的原理，從病毒RNA中擴(kuò)增特異性干擾片段，為植物病毒防 治提供新思路，避免了其他方法的種種弊端如環(huán)境污染、成本高、工作量大、有效期短等。2、本發(fā)明利用細(xì)菌表達(dá)的粗體液處理植株，該方法簡單，克服轉(zhuǎn)基因的風(fēng)險，更容 易進(jìn)行大田應(yīng)用。3、本發(fā)明在篩選最佳處理濃度及處理時間的基礎(chǔ)上，為延長dsRNA在葉片上的停 留時間以及增加dsRNA的滲透性，配置含不同濃度的滲透劑的dsRNA組合，此法探討思路新 穎。4、本發(fā)明建立玉米體外應(yīng)用dsRNA誘導(dǎo)抗病毒非轉(zhuǎn)基因RNA干擾調(diào)控技術(shù)體系和 篩選出高效dsRNA干擾制劑，可為玉米病毒病防治提供一種簡單、有效和廉價的新方法，也 可為其它植物病毒病防治提供借鑒。


圖1為本發(fā)明pUCCRNAi載體圖譜。
具體實(shí)施例方式1玉米矮花葉病毒CP基因特異性RNAi片段的獲得1. 1玉米矮花葉病毒RNA的提取采用Trizol法提取感染矮花葉病毒病植株的葉片RNA，方法如下(1)取0. Ig感染矮花葉病毒的玉米葉片在液氮中迅速研磨粉末后，立即將其轉(zhuǎn)入 到1.5mL dorf管中，加入ImL Trizol試劑，(注樣品總體積不能超過Trizol體積的10% ) 迅速渦旋震蕩15sec，室溫放置5min ；(2)加入200mL氯仿/異戊醇(24 1)劇烈震蕩15sec,混合，室溫放置3min ；(3) 40C 12000rpm離心15min，取上層水相，加入等體積的異丙醇。室溫靜置20min 以上(或者-20°C冰箱放置2h)；(4) 40C 12000rpm 離心 15min，棄上清；(5)加入lmL75%乙醇洗滌兩次，每次7500rpm離心5min，棄上清；(6)室溫下干燥5-lOmin (不能干燥過頭，否則難容)；(7)將RNA沉淀溶于30uL DEPC純水中，若需要可55_65°C水溶lOmin，溶解RNA沉 淀；1. 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。1. 2玉米矮花葉病毒CP基因特異性干涉片段的PCR擴(kuò)增按Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以引物對M1/M12擴(kuò)增CP基因上游正向片段(147bp)，M2/M12擴(kuò)增CP基因上游反向片段(247bp)，其中重疊序列為147bp;以引物 對M3/M34擴(kuò)增CP基因下游正向片段(140bp)，M4/M34擴(kuò)增CP基因下游反向片段(187bp)， 其中重疊序列為140bp。引物見表1。PCR反應(yīng)體系5yL 10XPCR Buffer (with MgCl2), !“!^^!^(^^!!!(^.^，上，下游引物各丄口!^^^!^^.!/1)…〕· 10μ L,4U Taq DNA聚合 酶，加滅菌ddH20至50 μ L ；反應(yīng)程序94°C預(yù)變性5min，94°C變性Imin，58°C退火45s，72 °C 延伸Imin，循環(huán)30次后72°C延伸lOmin。反應(yīng)完畢取5 μ L進(jìn)行電泳檢測。表1玉米矮花葉病毒CP基因特異性干涉片段的RT-PCR擴(kuò)增的引物序列及其參數(shù)
權(quán)利要求
玉米體外應(yīng)用dsRNA抗矮花葉病毒干擾調(diào)控技術(shù)，其特征在于利用RT PCR擴(kuò)增玉米矮花葉病毒外殼蛋白基因兩個特異性片段，構(gòu)建反向重復(fù)表達(dá)載體LMCP1及LMCP2，利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，在大腸桿菌中生產(chǎn)抗矮花葉病毒的dsRNA，將提取的dsRNA稀釋，稀釋濃度大于1/15后噴灑三葉期的玉米葉片。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的玉米體外應(yīng)用dsRNA抗矮花葉病毒干擾調(diào)控技術(shù)，其特征在 于=RT-PCR擴(kuò)增玉米矮花葉病毒外殼蛋白基因特異性片段，分別正反向插入到pUCCRNAi載 體中構(gòu)建反向重復(fù)載體pUCCRNAi+2F，利用PstI-SalI雙酶切pUCCRNAi+2F及L4440質(zhì)粒， 并用T4連接酶連接，構(gòu)建原核表達(dá)載體LMCP。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的玉米體外應(yīng)用dsRNA抗矮花葉病毒干擾調(diào)控技術(shù)，其特征在 于所述的IPTG濃度為0. 6mmol. Γ1，誘導(dǎo)表達(dá)的時間為4h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的玉米體外應(yīng)用dsRNA抗矮花葉病毒干擾調(diào)控技術(shù)，其特征在 于在噴灑的dsRNA稀釋液中加入滲透劑，濃度小于10_2。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的玉米體外應(yīng)用dsRNA抗矮花葉病毒干擾調(diào)控技術(shù)，其特征在 于所述的滲透劑為金爾阿硅。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的玉米體外應(yīng)用dsRNA抗矮花葉病毒干擾調(diào)控技術(shù)，其特 征在于所述的滲透劑的濃度為10_4。
全文摘要
本發(fā)明是一種生物技術(shù)領(lǐng)域的利用RNA干涉技術(shù)，玉米體外應(yīng)用dsRNA抗MDMV干擾調(diào)控技術(shù)。利用RT-PCR擴(kuò)增玉米矮花葉病毒CP基因兩個特異性片段，構(gòu)建反向重復(fù)表達(dá)載體LMCP1及LMCP2，利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，在大腸桿菌HT115(DE3)中生產(chǎn)抗MDMV的dsRNA，將提取的dsRNA稀釋，稀釋濃度大于1/15后噴灑三葉期的玉米葉片。本發(fā)明對開展抗病毒RNA干擾調(diào)控技術(shù)研究，建立玉米體外應(yīng)用dsRNA誘導(dǎo)抗病毒非轉(zhuǎn)基因RNA干擾調(diào)控技術(shù)體系和篩選出高效dsRNA干擾制劑具有重要理論和指導(dǎo)意義，可為玉米病毒病防治提供一種簡單、有效和廉價的新方法，也可為其它植物病毒病防治提供借鑒。
文檔編號A01H5/00GK101974526SQ20101027047
公開日2011年2月16日 申請日期2010年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月2日
發(fā)明者張姣, 朱蘇文, 甘德芳, 程備久, 程郢, 趙陽, 馬慶 申請人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)