專利名稱：控制基因表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及修飾基因表達(dá)的方法，并涉及修飾轉(zhuǎn)基因生物體，尤其是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或植物之細(xì)胞，組織或器官中的內(nèi)源性基因表達(dá)的合成基因。更特別的是，本發(fā)明利用重組DNA技術(shù)對(duì)細(xì)胞，組織，器官或整個(gè)生物體中的靶基因的表達(dá)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后修飾或調(diào)制，籍此產(chǎn)生新的表型。本發(fā)明還提供了新的合成基因和基因構(gòu)建體，當(dāng)導(dǎo)入生物體中時(shí)，它們能阻抑，延遲或要不然降低生物體中的內(nèi)源性基因或靶基因的表達(dá)。
概述說(shuō)明書(shū)的最后列出了本說(shuō)明書(shū)中所提到的參考文獻(xiàn)的詳細(xì)目錄。
本文所用術(shù)語(yǔ)“得自”指的是特定的整體可得自特定的來(lái)源或物種，但是不必直接得自特定的來(lái)源或物種。
除非本文另有解釋，說(shuō)明書(shū)中出現(xiàn)的“包含”，“包括”或“含有”指的是包含所提及的一個(gè)或多個(gè)步驟或元件或整體，但不排除其它任何一個(gè)或多個(gè)步驟或元件或整體。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解本文所述的發(fā)明不是那些具體描述的內(nèi)容，它允許變化和修飾。應(yīng)理解本發(fā)明包括所有這種變化和修飾。本發(fā)明也包括說(shuō)明書(shū)中單獨(dú)或共同提及或指出的所有步驟，特征，組合物和化合物，和任何兩個(gè)或多個(gè)所述步驟或特征的任何和所有組合。
本發(fā)明并不局限于本文所述的旨在闡明本發(fā)明的具體實(shí)施方案所限定的范圍，顯然，正如本文所述，功能等同的產(chǎn)物，組合物和方法也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
說(shuō)明書(shū)中包括的含有核苷酸和氨基酸序列資料的序列鑒定號(hào)(SEQID NO)匯總于說(shuō)明書(shū)之后，使用PatentIn 2.0版程序可以制備序列號(hào)。在序列表中，由數(shù)字標(biāo)識(shí)符<210>接著序列鑒別符(如<210>1，<210>2等)標(biāo)明各個(gè)核苷酸或氨基酸序列。各個(gè)核苷酸或氨基酸序列的長(zhǎng)度，序列類型(DNA，蛋白質(zhì)(PRT)等)和來(lái)源生物體分別由數(shù)字標(biāo)識(shí)域<211>，<212>和<213>提供的資料表示。說(shuō)明書(shū)中提及的核苷酸和氨基酸序列由數(shù)字標(biāo)識(shí)域<400>后接著序列鑒別符(如<400>1，<400>2等)所提供的資料限定。
本文提及的核苷酸殘基的名稱由IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會(huì)推薦，其中A表示腺嘌呤，C表示胞嘧啶，G表示鳥(niǎo)嘌呤，T表示胸腺嘧啶，Y表示嘧啶殘基，R表示嘌呤殘基，M表示腺嘌呤或胞嘧啶，K表示鳥(niǎo)嘌呤或胸腺嘧啶，S表示鳥(niǎo)嘌呤或胞嘧啶，W表示腺嘌呤或胸腺嘧啶，H表示除鳥(niǎo)嘌呤以外的核苷酸，B表示除腺嘌呤以外的核苷酸，V表示除胸腺嘧啶以外的核苷酸，D表示除胞嘧啶以外的核苷酸，N表示任何核苷酸殘基。
本文提及的氨基酸殘基的名稱由IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會(huì)推薦，并列于下表1。
表1
背景技術(shù)：
為了在真核生物體內(nèi)產(chǎn)生新的性狀或?qū)⑿碌男誀顚?dǎo)入所述生物體的特定細(xì)胞，組織或器官，必需控制所述生物體的代謝途徑。盡管重組DNA技術(shù)在闡明真核基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制方面取得了顯著進(jìn)步，但在目的為產(chǎn)生新性狀的基因表達(dá)實(shí)際操作方面卻收效甚微。另外，有關(guān)人為干預(yù)以調(diào)制真核基因表達(dá)水平，人們能利用的方法非常有限。
阻抑，延遲或要不然降低基因表達(dá)的一個(gè)方法利用了由核基因互補(bǔ)鏈轉(zhuǎn)錄的能被正常轉(zhuǎn)錄并能被翻譯成多肽的mRNA分子。盡管尚不清楚該方法所涉及的確切機(jī)制，但已假設(shè)雙鏈mRNA可通過(guò)互補(bǔ)核苷酸序列之間的堿基配對(duì)形成，從而產(chǎn)生以低效率被翻譯和/或在被翻譯之前即已被細(xì)胞內(nèi)的核糖核酸酶降解的復(fù)合物。
或者，當(dāng)在細(xì)胞中導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)拷貝的所述基因或一個(gè)或多個(gè)拷貝的基本上類似的基因時(shí)，可抑制細(xì)胞，組織或器官中的內(nèi)源性基因表達(dá)。盡管該現(xiàn)象所涉及的機(jī)制尚不清楚，但該機(jī)制似乎涉及機(jī)械性的異源加工。例如，已假設(shè)該方法涉及轉(zhuǎn)錄阻抑，此時(shí)會(huì)形成可由體細(xì)胞-遺傳的染色質(zhì)受阻抑狀態(tài)，或者涉及轉(zhuǎn)錄后沉默，其中轉(zhuǎn)錄起始正常發(fā)生但隨后消除了共-抑制基因的RNA產(chǎn)物。
靶向特定基因表達(dá)的這兩種方法的效率很低，通常得到高度可變的結(jié)果。使用基因的不同區(qū)域，例如5’-非翻譯區(qū)域，3’-非翻譯區(qū)域，編碼區(qū)域或內(nèi)含子序列靶向基因表達(dá)會(huì)得到不一致的結(jié)果。因此，至于可為使用現(xiàn)有技術(shù)阻抑，延遲或要不然降低基因表達(dá)提供最有效工具的基因序列的特性，目前還不存在共有區(qū)。另外，代與代之間存在的高水平變異使得人們不可能預(yù)測(cè)基因表達(dá)被顯著修飾的生物體的后代的特定基因的阻抑水平。
最近，Dorer和Henikoff(1994)闡明了果蠅基因組中的串聯(lián)重復(fù)基因拷貝的沉默和Polycomb基因(即Pc-G系統(tǒng)；Pal-Bhadra等，1997)對(duì)分散的果蠅Adh基因的轉(zhuǎn)錄阻抑。然而，這種串聯(lián)重復(fù)基因拷貝的沉默對(duì)通過(guò)重組方式操縱動(dòng)物細(xì)胞之基因表達(dá)的嘗試沒(méi)什么用處，其中能靶向特定基因表達(dá)的序列被導(dǎo)入基因組中的分散位置，該方法未能與基因-靶向技術(shù)聯(lián)合。盡管理論上是可行的，但根據(jù)分離中所用的基因靶向方法的低效性，預(yù)期這種聯(lián)合的工作效率較低，該聯(lián)合還需要復(fù)雜的載體系統(tǒng)。另外，轉(zhuǎn)錄阻抑的使用(如果蠅Pc-G系統(tǒng))似乎還需要懂得一些能調(diào)制任何特定靶基因表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制，因此，難以將其作為阻抑，延遲或降低動(dòng)物細(xì)胞基因表達(dá)的一般技術(shù)應(yīng)用于實(shí)際操作。
對(duì)這些現(xiàn)象所涉及的機(jī)制知之甚少意味著調(diào)制基因表達(dá)水平的技術(shù)，尤其是使用重組DNA技術(shù)阻抑，延遲或要不然降低特定基因表達(dá)的技術(shù)進(jìn)展甚微。另外，這些方法的不可預(yù)測(cè)性導(dǎo)致目前還沒(méi)有在商業(yè)上可行的用于調(diào)制真核或原核生物之特定基因表達(dá)水平的手段。
因此，需要調(diào)制基因表達(dá)的改良方法，尤其是阻抑，延遲或要不然降低動(dòng)物細(xì)胞基因表達(dá)的改良方法以在動(dòng)物細(xì)胞中導(dǎo)入新的表型性狀。具體地說(shuō)，這些方法應(yīng)提供表型修飾的一般手段而不必同時(shí)進(jìn)行基因靶向法。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明部分基于發(fā)明人令人驚奇的發(fā)現(xiàn)從含有與啟動(dòng)子可操作相連的核酸分子的轉(zhuǎn)化細(xì)胞中可產(chǎn)生和選擇表現(xiàn)出一個(gè)或多個(gè)所需性狀的細(xì)胞，其中核酸分子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物含有與內(nèi)源性或非內(nèi)源性靶基因轉(zhuǎn)錄物的核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列，所述靶基因的表達(dá)欲被調(diào)制。轉(zhuǎn)化細(xì)胞可再生為能表現(xiàn)出新性狀，尤其是病毒抗性和內(nèi)源性基因的修飾表達(dá)的完整的組織，器官或生物體。
因此，本發(fā)明一方面提供了調(diào)制動(dòng)物細(xì)胞，組織或器官中的靶基因表達(dá)的方法，所述方法至少包括在足以翻譯欲被修飾的所述靶基因的mRNA產(chǎn)物的條件下，將一個(gè)或多個(gè)分散的核酸分子或外源核酸分子導(dǎo)入所述細(xì)胞，組織或器官達(dá)一段時(shí)間的步驟，所述核酸分子含有多拷貝與所述靶基因的核苷酸序列或其區(qū)域基本上相同的或與其互補(bǔ)的核苷酸序列，該方法的前提條件是所述mRNA產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄不能全部受到阻抑或降低。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，分散的核酸分子或外源核酸分子含有的核苷酸序列編碼多拷貝與靶基因之mRNA產(chǎn)物的核苷酸序列基本上相同的mRNA分子。更優(yōu)選多拷貝的靶分子是串聯(lián)同向重復(fù)序列。
在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，分散的核酸分子或外源核酸分子為可表達(dá)的形式以使其至少能被轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生mRNA。
靶基因可以是對(duì)動(dòng)物細(xì)胞而言為內(nèi)源性的基因，或者是外源基因，如病毒或外源基因序列等。優(yōu)選靶基因?yàn)椴《净蛐蛄小?br> 本發(fā)明對(duì)調(diào)制真核基因表達(dá)，尤其是調(diào)制人或動(dòng)物的基因表達(dá)，甚至更特別地調(diào)制脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物，如昆蟲(chóng)，水生動(dòng)物(如魚(yú)，水生貝殼類動(dòng)物，軟體動(dòng)物，甲殼類動(dòng)物，如蟹，龍蝦和對(duì)蝦，鳥(niǎo)類動(dòng)物和哺乳動(dòng)物等)的基因表達(dá)特別有用。
用適當(dāng)方法和足夠數(shù)目的轉(zhuǎn)化細(xì)胞可選擇多種性狀。所述性狀包括但不限于可見(jiàn)的性狀，疾病抗性性狀和病原體抗性性狀。調(diào)制作用可應(yīng)用于在植物和動(dòng)物中表達(dá)的多種基因，包括例如負(fù)責(zé)細(xì)胞代謝或細(xì)胞轉(zhuǎn)化的內(nèi)源性基因，包括癌基因，轉(zhuǎn)錄因子和其它編碼參與細(xì)胞代謝之多肽的基因。
例如，通過(guò)靶向其中的酪氨酸酶基因的表達(dá)可導(dǎo)致小鼠色素的產(chǎn)生發(fā)生變化，從而為黑色小鼠提供了新的白化病表型。通過(guò)靶向植物細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞中的病毒復(fù)制所需的基因，可將含有多拷貝編碼病毒復(fù)制酶，聚合酶，外被蛋白或非包被基因或蛋白酶蛋白的核苷酸序列的基因構(gòu)建體導(dǎo)入表達(dá)上述蛋白質(zhì)的細(xì)胞中以賦予細(xì)胞抗病毒的免疫力。
在本發(fā)明的實(shí)施過(guò)程中，分散的核酸分子或外源核酸分子一般含有與靶基因序列有大于約85％的同一性的核苷酸序列，然而，較高的同源性能對(duì)靶基因序列的表達(dá)產(chǎn)生更有效的調(diào)制作用。優(yōu)選實(shí)質(zhì)上更高的同源性，或大于約90％的同源性，甚至更優(yōu)選約95％至絕對(duì)同一性。
相對(duì)于靶基因的初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或經(jīng)全面加工的mRNA而言，導(dǎo)入的分散的核酸分子或外源核酸分子序列無(wú)需為絕對(duì)同源，也無(wú)需為全長(zhǎng)。短于全長(zhǎng)的序列中較高的同源性可補(bǔ)償較長(zhǎng)但同源性較低的序列。另外，導(dǎo)入的序列無(wú)需具有相同的內(nèi)含子或外顯子模式，非編碼區(qū)段的同源性同樣有效。根據(jù)靶基因的大小，一般應(yīng)使用大于20-100個(gè)核苷酸的序列，但優(yōu)選使用大于約200-300個(gè)核苷酸的序列，特別優(yōu)選大于500-1000個(gè)核苷酸的序列。
本發(fā)明的第二方面提供了合成基因，該基因可修飾被其轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的原核或真核生物之細(xì)胞，組織或器官中的靶基因表達(dá)，其中所述合成基因至少含有分散的核酸分子或外源核酸分子，所述核酸分子含有多拷貝與所述靶基因或其衍生物的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列基本上相同的核苷酸序列，并被可操作地置于在所述細(xì)胞，組織或器官中可操作的啟動(dòng)子序列的控制之下。
本發(fā)明的第三方面提供了合成基因，該基因可修飾被其轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的原核或真核生物之細(xì)胞，組織或器官中的靶基因表達(dá)，其中所述合成基因至少含有多結(jié)構(gòu)基因序列，其中各個(gè)結(jié)構(gòu)基因序列含有與所述靶基因或其衍生物的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列基本上相同的核苷酸序列，其中所述多結(jié)構(gòu)基因序列被可操作地置于在所述細(xì)胞，組織或器官中可操作的單個(gè)啟動(dòng)子序列的控制之下。
本發(fā)明的第四方面提供了合成基因，該基因可修飾被其轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的原核或真核生物之細(xì)胞，組織或器官中的靶基因表達(dá)，其中所述合成基因至少含有多結(jié)構(gòu)基因序列，其中所述結(jié)構(gòu)基因序列被可操作地置于在所述細(xì)胞，組織或器官中可操作的單個(gè)啟動(dòng)子序列的控制之下，其中各個(gè)所述結(jié)構(gòu)基因序列含有與所述靶基因或其衍生物的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列基本上相同的核苷酸序列。
本發(fā)明的第五方面提供了基因構(gòu)建體，該構(gòu)建體可修飾被轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，組織或器官中的內(nèi)源性基因或靶基因的表達(dá)，其中所述基因構(gòu)建體至少含有本發(fā)明的合成基因和一個(gè)或多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)和/或可選擇的標(biāo)記基因序列。
為了觀察多細(xì)胞生物體，如植物和動(dòng)物中的很多新性狀，尤其是那些組織特異性或器官特異性或受發(fā)育-調(diào)節(jié)的性狀，需要將攜有本文所述的合成基因和基因構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生為完整的生物體。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解這意味著由一個(gè)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞，一組這樣的細(xì)胞，一個(gè)組織或器官長(zhǎng)成完整的生物體。由分離的細(xì)胞和組織再生某種植物和動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
因此，本發(fā)明的第六方面提供了含有本文所述的合成基因和基因構(gòu)建體的細(xì)胞，組織，器官或生物體。
附圖簡(jiǎn)述

圖1圖示了質(zhì)粒pEGFP-N1 MCS。
圖2圖示了質(zhì)粒pCMV.cass。
圖3圖示了質(zhì)粒pCMV.SV40L.cass。
圖4圖示了質(zhì)粒pCMV.SV40LR.cass。
圖5圖示了質(zhì)粒pCR.Bgl-GFP-Bam。
圖6圖示了質(zhì)粒pBSII(SK+).EGFP。
圖7圖示了質(zhì)粒pCMV.EGFP。
圖8圖示了質(zhì)粒pCR.SV40L。
圖9圖示了質(zhì)粒pCR.BEV.1。
圖10圖示了質(zhì)粒pCR.BEV.2。
圖11圖示了質(zhì)粒pCR.BEV.3。
圖12圖示了質(zhì)粒pCMV.EGFP.BEV2。
圖13圖示了質(zhì)粒pCMV.BEV.2。
圖14圖示了質(zhì)粒pCMV.BEV.3。
圖15圖示了質(zhì)粒pCMV.VEB。
圖16圖示了質(zhì)粒pCMV.BEV.GFP。
圖17圖示了質(zhì)粒pCMV.BEV.SV40L-O。
圖18圖示了質(zhì)粒pCMV.O.SV40L.BEV。
圖19圖示了質(zhì)粒pCMV.O.SV40L.VEB。
圖20圖示了質(zhì)粒pCMV.BEVx2。
圖21圖示了質(zhì)粒pCMV.BEVx3。
圖22圖示了質(zhì)粒pCMV.BEVx4。
圖23圖示了質(zhì)粒pCMV.BEV.SV40L.BEV。
圖24圖示了質(zhì)粒pCMV.BEV.SV40L.VEB。
圖25圖示了質(zhì)粒pCMV.BEV.GFP.VEB。
圖26圖示了質(zhì)粒pCMV.EGFP.BEV2.PFG。
圖27圖示了質(zhì)粒pCMV.BEV.SV40LR。
圖28圖示了質(zhì)粒pCDNA3.Galt。
圖29圖示了質(zhì)粒pCMV.Galt。
圖30圖示了質(zhì)粒pCMV.EGFP.Galt。
圖31圖示了質(zhì)粒pCMV.Galt.GFP。
圖32圖示了質(zhì)粒pCMV.Galt.SV40L.0。
圖33圖示了質(zhì)粒pCMV.Galt.SV40L.tlaG。
圖34圖示了質(zhì)粒pCMV.O.SV40L.Galt。
圖35圖示了質(zhì)粒pCMV.Galtx2。
圖36圖示了質(zhì)粒pCMV.Galtx4。
圖37圖示了質(zhì)粒pCMV.Galt.SV40L. Galt。
圖38圖示了質(zhì)粒pCMV.Galt.SV40L.tlaG。
圖39圖示了質(zhì)粒pCMV.Galt.GFP.tlaG。
圖40圖示了質(zhì)粒pCMV.EGFP.Galt.PFG。
圖41圖示了質(zhì)粒pCMV.Galt.SV40LR。
圖42圖示了質(zhì)粒pART7。
圖43圖示了質(zhì)粒pART7.35S.SCBV.cass。
圖44圖示了質(zhì)粒pBC.PVY。
圖45圖示了質(zhì)粒pSP72.PVY。
圖46圖示了質(zhì)粒pClapBC.PVY。
圖47圖示了質(zhì)粒pBC.PVYx2。
圖48圖示了質(zhì)粒pSP72.PVYx2。
圖49圖示了質(zhì)粒pBC.PVYx3。
圖50圖示了質(zhì)粒pBC.PVYx4。
圖51圖示了質(zhì)粒pBC.PVY.LNYV。
圖52圖示了質(zhì)粒pBC.PVY.LNYV.PVY。
圖53圖示了質(zhì)粒pBC.PVY.LNYV.YVPΔ。
圖54圖示了質(zhì)粒pBC.PVY.LNYV.YVP。
圖55圖示了質(zhì)粒pART27.PVY。
圖56圖示了質(zhì)粒pART27.35S.PVY.SCBV.O。
圖57圖示了質(zhì)粒pART27.35S.O.SCBV.PVY。
圖58圖示了質(zhì)粒pART27.35S.O.SCBV.YVP。
圖59圖示了質(zhì)粒pART7.PVYx2。
圖60圖示了質(zhì)粒pART7.PVYx3。
圖61圖示了質(zhì)粒pART7.PVYx4。
圖62圖示了質(zhì)粒pART7.PVY.LNYV.PVY。
圖63圖示了質(zhì)粒pART7.PVY.LNYV.YVPΔ。
圖64圖示了質(zhì)粒pART7.PVY.LNYV.YVP。
圖65圖示了質(zhì)粒pART7.35S.PVY.SCBV.YVP。
圖66圖示了質(zhì)粒pART7.35S.PVYx3.SCBV.YVPx3。
圖67圖示了質(zhì)粒pART7.PVYx3.LNYV.YVPx3。
圖68圖示了質(zhì)粒pART7.PVYMULT1。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了調(diào)制細(xì)胞，組織或器官中的靶基因表達(dá)的方法，所述方法至少包括在足以翻譯欲被修飾的所述靶基因的mRNA產(chǎn)物的條件下，將一個(gè)或多個(gè)分散的核酸分子或外源核酸分子導(dǎo)入所述細(xì)胞，組織或器官達(dá)一段時(shí)間的步驟，所述核酸分子含有多拷貝與所述靶基因的核苷酸序列或其區(qū)域基本上相同或與其互補(bǔ)的核苷酸序列，該方法的前提條件是所述mRNA產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄不能全部受抑或降低。
“多拷貝”指的是兩個(gè)或多個(gè)拷貝的靶基因以相同或不同的定向在物理位置上緊密相連或并列地存在于相同的核酸分子上，任選通過(guò)填充片段或基因間隔區(qū)將它們分開(kāi)以便于必要時(shí)在各個(gè)重復(fù)序列之間形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。填充片段可含有能與核酸分子共價(jià)連接的核苷酸或氨基酸殘基，碳水化合物分子或寡糖分子或碳原子或其同系物，類似物或衍生物的任何組合。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，填充片段含有核苷酸序列或其同系物，類似物或衍生物。
更優(yōu)選填充片段含有長(zhǎng)度至少約為10-50個(gè)核苷酸的核苷酸序列，甚至更優(yōu)選長(zhǎng)度至少約為50-100個(gè)核苷酸的序列，更優(yōu)選長(zhǎng)度至少約為100-500個(gè)核苷酸的序列。
當(dāng)分散的或外源的核酸分子含有內(nèi)含子/外顯子剪接連接序列時(shí)，填充片段可用作內(nèi)含子序列，其位于更靠近基因5’末端的結(jié)構(gòu)基因3’-剪接位點(diǎn)和結(jié)構(gòu)基因下一個(gè)下游單位的5’-剪接位點(diǎn)之間。或者，當(dāng)分散的外源核酸分子的兩個(gè)以上的鄰近核苷酸序列單位需要被翻譯時(shí)，位于它們之間的填充片段不應(yīng)包括框內(nèi)翻譯終止密碼子，在填充片段的兩個(gè)末端都缺乏內(nèi)含子/外顯子剪接連接序列或者在各個(gè)單位的5’末端添加翻譯起始密碼子，這一點(diǎn)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。
優(yōu)選填充片段編碼可測(cè)的標(biāo)記蛋白質(zhì)或其生物活性類似物和衍生物，例如熒光素酶，β-半乳糖醛酸酶，β-半乳糖苷酶，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶或綠色熒光蛋白等。也可以使用其它填充片段。
根據(jù)此實(shí)施方案，可測(cè)的標(biāo)記或其類似物或衍生物可利用其賦予特殊的可測(cè)表型，優(yōu)選為肉眼可測(cè)的表型的能力來(lái)顯示本發(fā)明的合成基因在細(xì)胞，組織或器官中的表達(dá)。
本文所用術(shù)語(yǔ)“調(diào)制”指的是與不使用本文所述的發(fā)明方法時(shí)所述基因的表達(dá)相比，靶基因的表達(dá)有一定幅度的降低和/或基因表達(dá)的時(shí)序被延遲和/或靶基因表達(dá)的發(fā)育或組織特異性或細(xì)胞特異性模式被改變。
盡管不限制本文所述發(fā)明的范圍，但本發(fā)明涉及調(diào)制基因表達(dá)，其包括以一定幅度阻抑，延遲或降低真核生物之特定細(xì)胞，組織或器官中的靶基因表達(dá)，所述真核生物具體包括植物，如單子葉植物或雙子葉植物，或人或其它動(dòng)物，甚至更特別地包括脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物，如昆蟲(chóng)，水生動(dòng)物(如魚(yú)，水生貝殼類動(dòng)物，軟體動(dòng)物，甲殼類動(dòng)物，如蟹，龍蝦和對(duì)蝦，鳥(niǎo)類動(dòng)物和哺乳動(dòng)物等)。
更優(yōu)選通過(guò)在細(xì)胞，組織或器官中導(dǎo)入分散的核酸分子或外源核酸分子使靶基因的表達(dá)完全失活。
盡管不受任何理論或行為模式的束縛，但是，由實(shí)施本發(fā)明所致的靶基因表達(dá)的降低或消除可歸因于靶基因之mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的翻譯被減少或延遲，或者是由于靶基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物被內(nèi)源性宿主細(xì)胞系統(tǒng)序列-特異性地降解，使得所述mRNA不能被翻譯。
為了取得最佳結(jié)果，特別優(yōu)選在靶基因之mRNA轉(zhuǎn)錄物被正常翻譯的時(shí)刻或階段之前，或者在靶基因之mRNA轉(zhuǎn)錄物被正常翻譯的同時(shí)發(fā)生靶基因之mRNA轉(zhuǎn)錄物的序列-特異性降解。因此，為了最好地實(shí)施本發(fā)明，應(yīng)注重考慮選擇適當(dāng)?shù)膯?dòng)子序列來(lái)調(diào)節(jié)導(dǎo)入的分散的核酸分子或外源核酸分子的表達(dá)。為此，特別優(yōu)選使用強(qiáng)的組成型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子系統(tǒng)來(lái)調(diào)節(jié)導(dǎo)入的分散的核酸分子或外源核酸分子的表達(dá)。
本發(fā)明清楚地包括降低的表達(dá)，其中靶基因表達(dá)的降低是由降低轉(zhuǎn)錄實(shí)現(xiàn)的，前提條件是轉(zhuǎn)錄的降低不是其發(fā)生的唯一機(jī)制，所述的轉(zhuǎn)錄降低至少伴隨著穩(wěn)態(tài)mRNA庫(kù)翻譯的降低。
靶基因可以是對(duì)動(dòng)物細(xì)胞而言為內(nèi)源性的基因序列，或者是非內(nèi)源性基因序列，如得自病毒或其它外源病原體生物并能進(jìn)入細(xì)胞并在感染后使用細(xì)胞機(jī)器的基因序列。
當(dāng)靶基因?qū)?dòng)物細(xì)胞而言為非內(nèi)源性基因序列時(shí)，需要靶基因編碼對(duì)病毒或其它病原體的復(fù)制或再生至關(guān)重要的功能。在此實(shí)施方案中，本發(fā)明對(duì)預(yù)防和治療動(dòng)物細(xì)胞的病毒感染或賦予或刺激針對(duì)所述病原體的抗性特別有用。
優(yōu)選靶基因含有植物或動(dòng)物細(xì)胞，組織或器官之病毒病原體的一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列。
例如，對(duì)動(dòng)物和人而言，病毒病原體可以是逆轉(zhuǎn)錄病毒，如慢病毒(如免疫缺損病毒)，單鏈(+)RNA病毒，如牛腸道病毒(BEV)或Sinbisα病毒。或者，靶基因可含有動(dòng)物細(xì)胞，組織或器官之病毒病原體的一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列，例如但不限于雙鏈DNA病毒，如牛皰疹病毒或單純皰疹病毒I(HSV I)等。
對(duì)植物而言，病毒病原體優(yōu)選為馬鈴薯Y病毒組，花椰菜花葉病毒組，badnavirus，雙粒病毒組，呼腸孤病毒，彈狀病毒，布尼亞病毒，tospovirus，細(xì)病毒組，番茄叢矮病毒組，黃矮病毒組，南方菜豆花葉病毒組，雀麥草花葉病毒組，南瓜花葉病毒組，等軸不穩(wěn)定環(huán)斑病毒組，苜蓿花葉病毒，煙草花葉病毒，煙草脆裂病毒組，馬鈴薯X病毒組和線形病毒組，例如但不限于CaMV，SCSV，PVX，PVY，PLRV和TMV等。
至于病毒病原體，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)懂得病毒編碼的功能可由宿主細(xì)胞編碼的多肽反式補(bǔ)償。例如，能補(bǔ)償失活的病毒DNA聚合酶基因的宿主細(xì)胞DNA聚合酶有利于牛皰疹病毒基因組在宿主細(xì)胞中復(fù)制。
因此，當(dāng)靶基因?qū)?dòng)物細(xì)胞而言為非內(nèi)源性基因序列時(shí)，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了編碼不能被宿主細(xì)胞功能補(bǔ)償?shù)牟《净蛲庠炊嚯牡陌谢?，例如病?特異性的基因序列。根據(jù)本發(fā)明此實(shí)施方案的靶基因例子包括但不限于編碼病毒外被蛋白，非包被蛋白和依賴于RNA的DNA聚合酶和依賴于RNA的RNA聚合酶等的基因。
在本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，靶基因是依賴于BEV RNA的RNA聚合酶基因或其同系物，類似物或衍生物或是編碼PVY Nia蛋白酶的序列。
其中的靶基因表達(dá)被修飾的細(xì)胞可以是得自多細(xì)胞植物或動(dòng)物的任何細(xì)胞，包括其細(xì)胞和組織培養(yǎng)物。優(yōu)選動(dòng)物細(xì)胞得自昆蟲(chóng)，爬行動(dòng)物，兩棲動(dòng)物，鳥(niǎo)類，人或其它哺乳動(dòng)物。動(dòng)物細(xì)胞的例子包括胚干細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞，神經(jīng)元細(xì)胞，體細(xì)胞，造血干細(xì)胞，T細(xì)胞和無(wú)限增殖化的細(xì)胞系，如COS，VERO，HeLa，小鼠C127，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系，WI-38，幼倉(cāng)鼠腎(BHK)或MDBK細(xì)胞系等。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易得到上述細(xì)胞和細(xì)胞系。因此，其中的靶基因表達(dá)被修飾的組織或器官可以是含有這種動(dòng)物細(xì)胞的任何組織或器官。
優(yōu)選植物細(xì)胞得自單子葉或雙子葉植物的種以及由其衍生的細(xì)胞系。
本文所用術(shù)語(yǔ)“分散的核酸分子”指的是含有一個(gè)或多個(gè)拷貝的，優(yōu)選為串聯(lián)同向重復(fù)的核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列與源自導(dǎo)入所述核酸分子的細(xì)胞，組織或器官的基因的核苷酸序列基本上相同，其中所述核酸分子是非內(nèi)源性的，也就是說(shuō)當(dāng)經(jīng)由重組方法將該核酸分子導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞，組織或器官時(shí)，它一般以染色體外的核酸或者以與所述基因不相連的整合的染色體核酸形式存在。更特別地，“分散的核酸分子”包括與靶基因不相連的染色體核酸或染色體外核酸，由于其未串聯(lián)連接或占據(jù)相同染色體上的不同染色體位置或位于不同染色體上或以附加體，質(zhì)粒，粘粒或病毒顆粒的形式存在于細(xì)胞中，在物理圖譜中是針對(duì)靶基因的。
“外源核酸分子”指的是分離的核酸分子，其具有一個(gè)或多個(gè)拷貝的，優(yōu)選為串聯(lián)同向重復(fù)的核苷酸序列，所述核苷酸序列源自與導(dǎo)入所述外源核酸分子的生物體不同的生物體的基因序列。這一定義包括源自與導(dǎo)入所述核酸分子的分類群相同之最低分類群(即相同種群)的不同個(gè)體的核酸分子，以及源自與導(dǎo)入所述核酸分子的分類群不同之分類群的不同個(gè)體的核酸分子，例如得自病毒病原體的基因。
因此，實(shí)施本發(fā)明時(shí)外源核酸分子所作用的靶基因可以是使用轉(zhuǎn)化或漸滲技術(shù)從一個(gè)生物體導(dǎo)入另一個(gè)生物體的核酸分子。根據(jù)本發(fā)明此實(shí)施方案的靶基因例子包括得自水母Aequoria victoria的編碼綠色熒光蛋白的基因(Prasher等，1992；國(guó)際專利
發(fā)明者M·W·格雷厄姆, R·N·里斯 申請(qǐng)人:聯(lián)邦科學(xué)和工業(yè)研究組織