專利名稱：一種編碼高溫酸性α－淀粉酶基因及其合成、克隆和表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種編碼高溫酸性α-淀粉酶基因及其合成、克隆和表達(dá)，屬于微生物基因工程領(lǐng)域。具體地說是通過基因工程的手段設(shè)計一套編碼新型高溫酸性α-淀粉酶的寡核苷酸，再運(yùn)用基因全合成方法獲得編碼新型高溫酸性α-淀粉酶基因amyF，可用于在芽孢桿菌中實現(xiàn)高效表達(dá)和制備重組蛋白質(zhì)。
背景技術(shù)：
淀粉是由葡萄糖聚合形成的一類高分子物質(zhì)。淀粉由直鏈淀粉和支鏈淀粉兩部分組成。淀粉粒一般為圓形或不規(guī)則形，大小為1-100μm，以內(nèi)部氫鍵維持其結(jié)構(gòu)。淀粉顆粒內(nèi)部為復(fù)雜的結(jié)晶組織，由于水分損失等原因位于顆粒表面的成分形成一種結(jié)構(gòu)緊密的外膜，對外力具有較強(qiáng)的抵抗力。因此，淀粉顆粒不溶于水和有機(jī)溶劑。淀粉是工業(yè)上制取葡萄糖和糊精的主要原料。傳統(tǒng)的方法用酸將淀粉水解成小分子的糊精和葡萄糖，這種方法目前已被酶法水解工藝所取代。
淀粉作為原料在工業(yè)中的應(yīng)用，其最主要的方式是將淀粉水解成葡萄糖、麥芽糖或者寡糖糖漿。這些糖漿隨后被用作原料用于如酒精、有機(jī)酸、氨基酸等工業(yè)生產(chǎn)或直接作為產(chǎn)品用于其他工業(yè)領(lǐng)域。淀粉水解工藝過程常常包括以下兩個步驟液化和糖化。在淀粉液化過程中，淀粉顆粒在冷水中形成乳濁液，在加熱到60～700℃后，淀粉顆粒吸水膨脹，體積迅速增加，晶體結(jié)構(gòu)被破壞，顆粒外膜裂開，形成一種糊狀的粘稠液體(這一過程稱為糊化)。濃度較高的淀粉液糊化時，必須迅速液化，否則淀粉液的粘度急劇上升會使設(shè)備無法運(yùn)行，另外已經(jīng)糊化的淀粉在溫度降低后會發(fā)生老化而無法液化。因此，用于淀粉液化的淀粉酶必須至少能耐受淀粉糊化所需溫度。淀粉糊化后，分子鏈直接暴露在酶分子的作用之下，分子鏈被迅速切斷，變短，最終形成低分子量的糊精，液體粘度急劇下降，這一過程被稱為液化?，F(xiàn)行大規(guī)模工業(yè)化淀粉水解工藝中的主流工藝為瞬間高溫噴射液化，液化時淀粉醪的內(nèi)部溫度達(dá)到1050℃以上。此外，目前絕大多數(shù)以淀粉為原料的制糖和發(fā)酵工藝中皆采用廢液回流策略，淀粉醪的pH值會因此降至4.5-5.0左右。因此，α-淀粉酶在高溫和酸性條件下的高活性對淀粉液化工藝的優(yōu)化和簡化具有極其重要的意義。
獲得新型高溫酸性α-淀粉酶的方式概括起來有兩種。一種是在既有耐高溫α-淀粉酶的基礎(chǔ)上，通過基因克隆、蛋白質(zhì)工程等有關(guān)手段對蛋白質(zhì)分子進(jìn)行改造，以此獲得耐高溫、耐酸性α-淀粉酶突變體。這方面的工作已有不少成功的報道。另一種是從自然界中尋找高溫酸性α-淀粉酶新型分子(Jorgenson等1997，ApplEnviron Microbiol)，如Pyrococcus sp.的α-淀粉酶，但產(chǎn)酶水平不到2U/mL。但是無論通過哪一種方式，所獲得的在高溫酸性條件下具有高活性的α-淀粉酶分子必須經(jīng)過高效和大量廉價制備才會具有工業(yè)應(yīng)用意義。
芽孢桿菌是革藍(lán)氏陽性細(xì)菌，如枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等已在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用多年，已被證實安全可靠和具有高效、大量分泌蛋白質(zhì)的能力。以芽孢桿菌為寄主細(xì)胞高效表達(dá)外源基因也有一些成功的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種編碼高溫酸性α-淀粉酶基因及其合成、克隆和表達(dá)，采用化學(xué)合成和分子體外組合技術(shù)尋找一種在芽孢桿菌中高效表達(dá)的高溫酸性α-淀粉酶基因。
本發(fā)明技術(shù)方案以自建α-淀粉酶蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫，分析獲得α-淀粉酶家族的結(jié)構(gòu)、功能區(qū)組成特征。以自建tRNA分析軟件分析枯草芽孢桿菌168和地衣芽孢桿菌ATCC14580基因組，獲得tRNA編碼基因特征和密碼子使用頻率參數(shù)。再以Pyrococcus sp.DSM3638α-淀粉酶編碼基因的核苷酸序列為基礎(chǔ)，使用DNAMAN軟件，設(shè)計了78條用于新基因合成的寡核苷酸，寡核苷酸在同一條鏈上是相鄰的，而與其互補(bǔ)的鏈有若干堿基是重疊的，重疊區(qū)域的解鏈溫度控制在45-50℃。用兩步體外拼接和擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行全基因的合成，獲得全長基因amyF。將基因amyF克隆入pBlueScript II SK(-)的EcoR V位點(diǎn)中，獲得重組質(zhì)粒pSK-amyF。重組質(zhì)粒pSK-amyF用于對amyF的序列測定和提供后續(xù)實驗用amyF。SmaI和EcoRI酶切pSK-amyF，割膠回收獲得全長amyF。將amyF克隆入分泌型表達(dá)載體pBL-WZX的SmaI和EcoRI位點(diǎn)，得到重組質(zhì)粒pBL-amyF。以重組質(zhì)粒pBL-amyF轉(zhuǎn)化地衣芽孢桿菌，構(gòu)建含基因amyF的重組菌和制備重組酶。
基因amyF的核苷酸序列如下gcaaaatact tggaacttga agaaggagga gttatcatgc aagcatttta ttgggatgtt60ccgggcggag gaatttggtg ggatcatatc agatcgaaaa ttccggaatg gtatgaagct120ggaatctcag caatctggct gccgccgccg agcaaaggca tgagcggagg atattcaatg180ggctacgatc cgtatgatta ctttgatctg ggcgaatact accagaaagg aacggtcgaa240
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1、本發(fā)明的高溫酸性α-淀粉酶基因amyF能夠在芽孢桿菌中實現(xiàn)高效分泌表達(dá)，表達(dá)水平是Pyrococcus sp.DSM3638產(chǎn)酶水平的225倍以上。
2、本發(fā)明的基因amyF的表達(dá)產(chǎn)物的最適作用溫度為95-98℃，最適作用pH范圍是4.8-6.5，并且具有很好的熱穩(wěn)定性。在高溫酸性條件下快速水解淀粉。
3、本發(fā)明的全基因合成技術(shù)可用于其它基因的全合成。


圖1基因amyF的合成過程。
圖2重組質(zhì)粒pBL-amyF的物理圖譜。
圖3重組酶的最適反應(yīng)溫度。
圖4重組酶在不同pH條件下的相對活力。
具體實施例方式
實施例1高溫酸性α-淀粉酶基因全合成用寡核苷酸序列的設(shè)計和寡核苷酸的化學(xué)合成。
根據(jù)α-淀粉酶蛋白質(zhì)家族生物信息分析和芽孢桿菌tRNA基因組成和密碼子使用特征，以Pyrococcus sp.DSM3638α-淀粉酶編碼基因的核苷酸序列為基礎(chǔ)，計算機(jī)設(shè)計出新的高溫酸性α-淀粉酶編碼基因的核苷酸序列，使用DNAMAN軟件設(shè)計了一組由78條序列組成的寡核苷酸。其中F0和R38中下劃線標(biāo)注的分別為EcoRI和SmaI酶切位點(diǎn)。運(yùn)用DNA合成儀經(jīng)化學(xué)合成獲得這組寡核苷酸，78條寡核苷酸的核苷酸序列為F0gagagaaaga attctacttg gaacttgaag aaggaggaR0aaaatgcttg catgataact cctccttctt caagttF1gttatcatgc aagcatttta ttgggatgtt ccggR1accaaattcc tccgcccgga acatcccaatF2gcggaggaat ttggtgggat catatcagat cgaR2cataccattc cggaattttc gatctgatat gatcccF3aaattccgga atggtatgaa gctggaatct cagcR3gcggcagcca gattgctgag attccagcttF4aatctggctg ccgccgccga gcaaaggcR4gaatatcctc cgctcatgcc tttgctcggc gF5atgagcggag gatattcaat gggctacgat ccR5cccagatcaa agtaatcata cggatcgtag cccattF6gtatgattac tttgatctgg gcgaatacta ccagaaaggaR6cgcgtttcga ccgttccttt ctggtagtat tcgF7acggtcgaaa cgcgctttgg atcaaaagaa gaacR7ttggatcaat ctcaccagtt cttcttttga tccaaagF8tggtgagatt gatccaaacg gcccatgcct aR8gcgatgactt tgattccata ggcatgggcc gtF9tggaatcaaa gtcatcgccg atgtcgttat caacc
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實施例3重組質(zhì)粒表達(dá)載體pBL-amyF的構(gòu)建用EcoRI和SmaI酶切克隆載體pSK-amyF，割膠回收全長基因amyF。將基因amyF克隆入芽孢桿菌整合型表達(dá)載體pBL-WZX的EcoRI和SmaI酶切位點(diǎn)中，獲得重組質(zhì)粒pBL-amyF(圖2)。在重組質(zhì)粒pBL-amyF中，基因amyF分別在PamyL控制下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，在amyL編碼的信號肽介導(dǎo)amyF基因產(chǎn)物的分泌。
實施例4amyF在芽孢桿菌中的表達(dá)重組質(zhì)粒pBL-amyF純化后，通過電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化地衣芽孢桿菌。轉(zhuǎn)化混合物在5μg/mL的硫酸卡那霉素的LB平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子。將所得到的重組子直接接種到LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48h后，離心取上清液測酶活。重組菌的最高產(chǎn)酶水平達(dá)到4.5mg/ml，表達(dá)水平是Pyrococcus sp.DSM3638產(chǎn)酶水平的225倍。選取其中一株重組菌用于重組酶的制備和酶學(xué)性質(zhì)的進(jìn)一步分析。結(jié)果表明重組酶的最適溫度95-98℃(圖3)，最適pH4.8-6.5(圖4)。
權(quán)利要求
1.一種人工合成的高溫酸性α-淀粉酶基因amyF，其核苷酸序列為gcaaaatact tggaacttga agaaggagga gttatcatgc aagcatttta ttgggatgtt60ccgggcggag gaatttggtg ggatcatatc agatcgaaaa ttccggaatg gtatgaagct120ggaatctcag caatctggct gccgccgccg agcaaaggca tgagcggagg atattcaatg180ggctacgatc cgtatgatta ctttgatctg ggcgaatact accagaaagg aacggtcgaa240acgcgctttg gatcaaaaga agaactggtg agattgatcc aaacggccca tgcctatgga300atcaaagtca tcgccgatgt cgttatcaac catagggctg gcggcgacct ggaatggaac360ccgttcgttg gagattacac atggacagac ttttctaaag ttgcctcagg caaatataca420gctaactatc tggacttcca tccgaacgaa cttcattgct gcgacgaagg aacgtttgga480ggatttccgg atatctgcca tcataaagaa tgggatcagt actggctgtg gaaaagcaat540gaaagctatg ctgcttatct gagaagcatc ggatttgatg gctggagatt tgactatgtt600aaaggctatg gagcttgggt tgtcagagac tggcttaatt ggtggggagg ctgggcagtt660ggagaatact gggacacaaa tgtcgatgca ctgctgagct gggcatatga aagcggcgca720aaagtctttg acttcccgct gtactataaa atggatgaag catttgacaa taacaacatt780ccggcactgg tctatgccct gcaaaacgga caaacggtcg tttcgagaga tccgtttaaa840gcagtcacgt tcgttgccaa tcatgacaca gatatcatct ggaacaaata tccggcatat900gcgttcatct tgacatatga aggacagccg gtcatcttct acagggactt tgaagaatgg960ctgaacaaag ataaactgat taacctgatt tggatccatg atcatttggc aggaggaagc 1020acaacaattg tctactacga caacgatgaa ctgatctttg tgagaaatgg agattctaga 1080aggccgggcc ttatcacgta cattaacttg agcccgaact gggttggcag gtgggtctac 1140gttccgaaat ttgcaggcgc ttgcattcat gaatacacgg gaaacctggg aggatgggtc 1200gataaaagag tcgatagcag cggatgggtc tacctggaag caccgccgca tgatccggct 1260aacggctact atggctactc cgtctggagc tattgcggcg ttggc 1305
2.如權(quán)利要求1所述高溫酸性α-淀粉酶基因amyF的合成、克隆和表達(dá)，其特征是(A)amyF的合成以Pyrococcus sp.DSM3638α-淀粉酶編碼基因的核苷酸序列為基礎(chǔ)，使用DNAMAN軟件，設(shè)計了一組78條寡核苷酸，運(yùn)用DNA合成儀經(jīng)化學(xué)合成獲得這組寡核苷酸，78條寡核苷酸的核苷酸序列為F0 gagagaaaga attctacttg gaacttgaag aaggaggaR0 aaaatgcttg catgataact cctccttctt caagttF1 gttatcatgc aagcatttta ttgggatgtt ccggR1 accaaattcc tccgcccgga acatcccaatF2 gcggaggaat ttggtgggat catatcagat cgaR2 cataccattc cggaattttc gatctgatat gatcccF3 aaattccgga atggtatgaa gctggaatct cagcR3 gcggcagcca gattgctgag attccagcttF4 aatctggctg ccgccgccga gcaaaggcR4 gaatatcctc cgctcatgcc tttgctcggc gF5 atgagcggag gatattcaat gggctacgat ccR5 cccagatcaa agtaatcata cggatcgtag cccattF6 gtatgattac tttgatctgg gcgaatacta ccagaaaggaR6 cgcgtttcga ccgttccttt ctggtagtat tcgF7 acggtcgaaa cgcgctttgg atcaaaagaa gaacR7 ttggatcaat ctcaccagtt cttcttttga tccaaagF8 tggtgagatt gatccaaacg gcccatgcct aR8 gcgatgactt tgattccata ggcatgggcc gtF9 tggaatcaaa gtcatcgccg atgtcgttat caaccR9 gccgccagcc ctatggttga taacgacatc gF10 atagggctgg cggcgacctg gaatggaaccR10 gtaatctcca acgaacgggt tccattccag gtcF11 cgttcgttgg agattacaca tggacagact tttctR11 gcctgaggca actttagaaa agtctgtcca tgtF12 aaagttgcct caggcaaata tacagctaac tatctggR12 cgttcggatg gaagtccaga tagttagctg tatatttF13 acttccatcc gaacgaactt cattgctgcg aR13 tccaaacgtt ccttcgtcgc agcaatgaag ttF14 cgaaggaacg tttggaggat ttccggatat ctgcR14 tgatcccatt ctttatgatg gcagatatcc ggaaatccF15 catcataaag aatgggatca gtactggctg tggaaR15 gcatagcttt cattgctttt ccacagccag tacF16 aagcaatgaa agctatgctg cttatctgag aagcaR16 cagccatcaa atccgatgct tctcagataa gcaF17 tcggatttga ggctggagat ttgactatgt taaaggR17 aacccaagct ccatagcctt taacatagtc aaatctcF18 ctatggagct tgggttgtca gagactggct taaR18 agcctcccca ccaattaagc cagtctctga cF19 ttggtgggga ggctgggcag ttggagaatR19 acatttgtgt cccagtattc tccaactgcc cF20 actgggacac aaatgtcgat gcactgctgaR20 ctttcatatg cccagctcag cagtgcatcgF21 gctgggcata tgaaagcggc gcaaaagtctR21 cagcgggaag tcaaagactt ttgcgccgF22 ttgacttccc gctgtactat aaaatggatg aagcaR22 ggaatgttgt tattgtcaaa tgcttcatcc attttatagt aF23 tttgacaata acaacattcc ggcactggtc tatgcR23 tgtccgtttt gcagggcata gaccagtgccF24 cctgcaaaac ggacaaacgg tcgtttcgagR24 actgctttaa acggatctct cgaaacgacc gttF25 agatccgttt aaagcagtca cgttcgttgc caR25 gatgatatct gtgtcatgat tggcaacgaa cgtgF26 atcatgacac agatatcatc tggaacaaat atccggcR26 gtcaagatga acgcatatgc cggatatttg ttccaF27 atatgcgttc atcttgacat atgaaggaca gccgR27 tccctgtaga agatgaccgg ctgtccttca tatF28 gtcatcttct acagggactt tgaagaatgg ctgaaR28 caggttaatc agtttatctt tgttcagcca ttcttcaaagF29 caaagataaa ctgattaacc tgatttggat ccatgatcat tR29 gcttcctcct gccaaatgat catggatcca aatF30 tggcaggagg aagcacaaca attgtctact acgR30 agatcagttc atcgttgtcg tagtagacaa ttgttgtF31 acaacgatga actgatcttt gtgagaaatg gagattcR31 ggcccggcct tctagaatct ccatttctca caaF32 tagaaggccg ggccttatca cgtacattaa cttgaR32 aacccagttc gggctcaagt taatgtacgt gataaF33 gcccgaactg ggttggcagg tgggtctaR33 tgcaaatttc ggaacgtaga cccacctgccF34 cgttccgaaa tttgcaggcg cttgcattcaR34 ggtttcccgt gtattcatga atgcaagcgc cF35 tgaatacacg ggaaacctgg gaggatgggt cR35 gctgctatcg actcttttat cgacccatcc tcccaF36 gataaaagag tcgatagcag cggatgggtc tacctggR36 atgcggcggt gcttccaggt agacccatccF37 aagcaccgcc gcatgatccg gctaacggR37 acggagtagc catagtagcc gttagccgga tcF38 ctactatggc tactccgtct ggagctattg cggcR38 aaacccgggc tagccaacgc cgcaatagct ccag采用寡核苷酸體外組合技術(shù)進(jìn)行amyF的合成，amyF的合成分兩步進(jìn)行第一步，在50μl反應(yīng)體系中，加入200mmol/L dNTPs，0.1mmol/L的全部78條寡核苷酸和0.5U的Pfu DNA多聚酶，PCR擴(kuò)增條件是95℃ 2min；94℃ 30s，52℃ 30s，70℃ 2min 30s 35次循環(huán)；70℃ 10min；第二步，在50μl反應(yīng)體系中，加入上述寡核苷酸拼接產(chǎn)物2μl，200mmol/L dNTPs，1mmol/L引物F0，1mmol/L引物R38和0.5U的Pfu DNA多聚酶，PCR擴(kuò)增條件是95℃ 2min；95℃ 30s，52℃ 30s，70℃ 2min 30s 35次循環(huán)；70℃ 10min；引物F0序列的下劃線部分為人工引入的EcoR I酶切位點(diǎn)，引物R38序列的下劃線部分為人工引入的Sma I酶切位點(diǎn)；(B)amyF的克隆在合成的amyF兩端的EcoR I和Sma I酶切位點(diǎn)，通過EcoR I和Sma I酶切，將amyF克隆入pBlueScript II SK(-)的EcoRV位點(diǎn)中獲得克隆載體pSK-amyF；(C)amyF的表達(dá)Sma I和EcoR I酶切pSK-amyF，割膠回收獲得全長amyF，將amyF克隆入表達(dá)載體pBL-WZX的Sma I和EcoR I位點(diǎn)，獲得高溫酸性α-淀粉酶基因amyF的芽孢桿菌分泌表達(dá)載體pBL-amyF。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述高溫酸性α-淀粉酶基因amyF的合成，其特征是設(shè)計寡核苷酸，密碼子為芽孢桿菌偏好性密碼子，寡核苷酸長度為28-41個堿基不等，相鄰寡核苷酸的兩端含有15-25個堿基的互補(bǔ)序列。
4.如權(quán)利要求2所述高溫酸性α-淀粉酶基因amyF的表達(dá)產(chǎn)物pBL-amyF的應(yīng)用，其特征是在高溫酸性條件下具有快速液化淀粉的能力，最適反應(yīng)溫度為95-98℃，最適反應(yīng)pH值為4.8-6.5。
全文摘要
一種編碼高溫酸性α－淀粉酶基因及其合成、克隆和表達(dá)，屬于微生物基因工程領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一種人工合成的高溫酸性α－淀粉酶基因amyF及其人工合成方法，提供了amyF的核苷酸序列，提供了含有amyF的克隆載體pSK－amyF和芽孢桿菌分泌表達(dá)載體pBL－amyF，以及運(yùn)用pBL－amyF進(jìn)行重組芽孢桿菌的構(gòu)建，重組酶的制備和酶學(xué)性質(zhì)的進(jìn)一步分析。本發(fā)明可用于在芽孢桿菌中高效表達(dá)和制備重組高溫酸性α－淀粉酶，實現(xiàn)在高溫酸性條件下快速水解淀粉。
文檔編號C12N15/56GK1702173SQ20051008164
公開日2005年11月30日 申請日期2005年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月27日
發(fā)明者王正祥, 牛丹丹 申請人:江南大學(xué)