本發(fā)明涉及一種重排的基因，尤其涉及重組犬干擾素-γ基因，本發(fā)明還涉及含有該基因的表達(dá)載體以及工程菌株，本發(fā)明進(jìn)一步涉及它們?cè)谥苽淙蓴_素-γ中的用途，屬于干擾素基因工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

犬類作為人的伴侶動(dòng)物，在人類的生活中占據(jù)日益重要的地位，與之相伴的各種犬類病毒性疾病也在人們的生活中重復(fù)發(fā)生，有些成為人畜共患病的病原。但在獸醫(yī)臨床方面，目前還沒有一種治療病毒性疾病的特效藥。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步及現(xiàn)代獸醫(yī)業(yè)的需要，免疫增強(qiáng)劑的防治作用越來越受到重視，特性確定、高效、穩(wěn)定、無毒的理想免疫增強(qiáng)劑將是未來防治動(dòng)物病毒性疾病的主要物質(zhì)。其中，最主要的免疫增強(qiáng)劑就是干擾素。干擾素（ifn）是一種廣譜抗病毒劑，并不直接殺傷或抑制病毒，而主要是通過細(xì)胞表面受體作用使細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白，從而抑制病毒的復(fù)制；同時(shí)還可增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞（nk細(xì)胞）、巨噬細(xì)胞和t淋巴細(xì)胞的活力，從而起到免疫調(diào)節(jié)作用，并增強(qiáng)抗病毒能力。干擾素是一組具有多種功能的活性蛋白質(zhì)（主要是糖蛋白），是一種由單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。它們?cè)谕N細(xì)胞上具有廣譜的抗病毒、影響細(xì)胞生長(zhǎng)，以及分化、調(diào)節(jié)免疫功能等多種生物活性。由于干擾素具有無毒、無副作用和抗病毒范圍廣泛的優(yōu)勢(shì)，在發(fā)現(xiàn)之初就受到關(guān)注，經(jīng)過多年的應(yīng)用發(fā)展，干擾素已經(jīng)成為一種廣泛的免疫增強(qiáng)劑用于病毒病和腫瘤等疾病的防治領(lǐng)域。

隨著國(guó)內(nèi)工作犬、肉用犬以及寵物犬等犬類的大幅度增加，病毒性傳染病成為威脅犬類生命的直接原因。人與犬的親密接觸大大增加了人被病毒感染的機(jī)會(huì)。如狂犬病毒病等。而干擾素已被證明是防止病毒性傳染病的重要制劑。以往干擾素-γ以野生型的形式生產(chǎn)，雖然與天然結(jié)構(gòu)相近，但半衰期較短，造成養(yǎng)殖戶使用成本較高。因此，運(yùn)用基因工程技術(shù)，對(duì)原始序列進(jìn)行改造，獲得效果更有益的重組犬干擾素-γ是當(dāng)前的研究思路。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是提供一種重組犬干擾素-γ基因，該基因可以在原核表達(dá)系統(tǒng)中穩(wěn)定、高效的表達(dá)重組犬干擾素；

本發(fā)明目的之二是提供含有上述重組犬干擾素-γ基因的表達(dá)載體；

本發(fā)明目的之三是提供由上述重組犬干擾素-γ基因所轉(zhuǎn)化的工程菌株；

本發(fā)明目的之四是提供一種制備重組犬干擾素-γ的方法；

本發(fā)明上述目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：

一種重組犬干擾素-γ基因，其核苷酸序列為seqidno.1所示，其編碼的氨基酸序列為seqidno.2所示。

本發(fā)明的重組犬干擾素-γ基因是以犬干擾素-γ、犬免疫球蛋白ch3區(qū)域和6個(gè)his連接而成，其中核酸序列通過優(yōu)化改造為最適合原核表達(dá)宿主生產(chǎn)的核酸序列。

本發(fā)明的重組犬干擾素-γ基因的結(jié)構(gòu)由犬干擾素-γ、6個(gè)his和犬免疫球蛋白ch3區(qū)串聯(lián)而成，該基因由807個(gè)核苷酸構(gòu)成編碼268個(gè)氨基酸。

本發(fā)明還構(gòu)建了含有seqidno.1所示核苷酸序列的重組表達(dá)質(zhì)粒及用該重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化得到的工程菌株。

本發(fā)明的重組表達(dá)質(zhì)?？赏ㄟ^本領(lǐng)域的常規(guī)方法構(gòu)建而成，即將seqidno.1所示的核苷酸序列插入到表達(dá)載體合適的限制性酶切位點(diǎn)之間，使seqidno.1所示的核苷酸序列可操作的與表達(dá)調(diào)控序列相連接。作為一個(gè)參考的實(shí)施方案，例如，可以將重組犬干擾素-γ基因與大腸桿菌原核表達(dá)載體pet27b利用酶切位點(diǎn)bamhi和hindiii相連，命名為pet-rcaifn-γ。

本發(fā)明所構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)?？赏ㄟ^各種常規(guī)的方法轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。作為參考，可以將含有重組犬干擾素-γ基因的重組質(zhì)粒pet-rcaifn-γ轉(zhuǎn)化大腸桿菌rosetta（購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)目錄cd801）得到的菌株，命名為escherichiacolirosetta/pet-rcaifn-γ，簡(jiǎn)稱rosetta/pet-rcaifn-γ。

利用大腸桿菌重組菌株rosetta/pet-rcaifn-γ生產(chǎn)重組蛋白的具體方法可以：

1、種子液的制備：將菌種劃線培養(yǎng)后獲得單菌落，挑取單菌落于10mllb液體培養(yǎng)基中，同時(shí)加入100mg/l氨芐青霉素，37℃培養(yǎng)12h。

2、發(fā)酵：將獲得的種子液按1：100接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，當(dāng)培養(yǎng)至od600為0.4左右時(shí)，加入iptg誘導(dǎo)，其終濃度為5mm，37℃培養(yǎng)3h左右收菌。

本發(fā)明還提供一種制備重組犬干擾素-γ的方法，包括以下步驟：

構(gòu)建含有seqidno.1所示的核苷酸序列的重組表達(dá)質(zhì)粒；培養(yǎng)用該重組表達(dá)質(zhì)粒所轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，得重組菌株；培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)，分離并純化所表達(dá)的重組蛋白。

上述制備重組蛋白的方法中，所述的重組表達(dá)質(zhì)粒優(yōu)選是pet-rcaifn-γ；所述的宿主細(xì)胞是大腸桿菌（escherichiacoli）rosetta(de3)，所述的重組菌株優(yōu)選為escherichiacolirosetta/pet-rcaifn-γ。

上述制備重組蛋白的方法中，優(yōu)選的，所述的重組蛋白的分離和純化包括以下步驟：

1、將收集的菌體懸于磷酸鹽緩沖液，破碎后低溫離心收集上清，利用ni親和柱和akta蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行蛋白粗提純；

2、將粗提純的蛋白再利用akta系統(tǒng)進(jìn)行分子篩的純化，最終得到純度達(dá)到90%以上的蛋白。

以天然犬干擾素基因-γ（犬干擾素基因-γ的原始序列見附錄一）代替重組犬干擾素-γ基因進(jìn)行以上步驟，得到可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的天然犬干擾素作為對(duì)照。

本發(fā)明將犬干擾素-γ與犬免疫球蛋白ch3區(qū)融合表達(dá)，增加了蛋白的穩(wěn)定性和活性，同時(shí)本發(fā)明的蛋白表達(dá)和純化方法具有生產(chǎn)時(shí)間短、表達(dá)效率高、表達(dá)量大、易于純化的優(yōu)點(diǎn)，并且經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所表達(dá)的重組犬干擾素-γ不僅在半衰期上顯著優(yōu)于天然犬干擾素-γ，而且提高了其抗病毒活性。

附圖說明

圖1重組犬干擾素-γ純化后的sds-page凝膠電泳結(jié)果。

其中，m為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)marker，1為目的帶。

圖2重組犬干擾素-γ對(duì)mdck細(xì)胞增殖的抑制作用。

圖3重組犬干擾素-γ促小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的試驗(yàn)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

mdck細(xì)胞：購自atcc，ccl-34，由本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的dmem。

實(shí)施例1重組犬干擾素-γ基因質(zhì)粒的構(gòu)建

1、通過化學(xué)合成的方法合成所需的重組犬干擾素-γ基因。

2、表達(dá)重組犬干擾素-γ基因的重組質(zhì)粒的構(gòu)建。

將上述步驟1合成的重組犬干擾素-γ基因用限制性內(nèi)切酶bamhi和hindiii進(jìn)行酶切，并與被相同酶切割之后的pet27b載體相連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α感受態(tài)，篩選具有氨芐抗性的轉(zhuǎn)化子，經(jīng)質(zhì)粒提取、酶切鑒定、測(cè)序后證明重組犬干擾素-γ基因已克隆至pet27b載體上，得到的重組質(zhì)粒命名為pet-rcaifn-γ。

實(shí)施例2高效表達(dá)重組犬干擾素-γ基因的大腸桿菌菌株e.colirosetta/pet-rcaifn-γ的構(gòu)建

用化學(xué)轉(zhuǎn)化方法將pet-rcaifn-γ轉(zhuǎn)化至e.colirosetta，在含有氨芐青霉素的lb平板上篩選轉(zhuǎn)化子，經(jīng)質(zhì)粒提取、酶切鑒定、測(cè)序分析證明獲得的重組子e.colirosetta/pet-rcaifn-γ和預(yù)期一致。

實(shí)施例3利用大腸桿菌工程菌e.colirosetta/pet-rcaifn-γ生產(chǎn)重組犬干擾素-γ

1、菌種的培養(yǎng)發(fā)酵

挑取大腸桿菌工程菌e.colirosetta/pet-rcaifn-γ，按1%接種量將工程菌接種于lb液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)12-14h，次日1：100擴(kuò)大培養(yǎng)至od值為0.4，加iptg至終濃度0.5mm，繼續(xù)培養(yǎng)3h，4000r/min，離心30min收集菌體。

2、重組犬干擾素-γ的純化

將上述收集的菌體超聲破碎離心后收集上清，將上清過濾后利用akta蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行純化，先后進(jìn)行親和層析和分子篩層析得到純化后的重組犬干擾素-γ。

取少量純化后的重組犬干擾素-γ蛋白加入1/5體積的5×sds上樣緩沖液，煮沸10分鐘后進(jìn)行sds-page凝膠電泳。電泳結(jié)果見圖1。

實(shí)施例4mtt法檢測(cè)重組犬干擾素-γ蛋白對(duì)mdck細(xì)胞增殖的抑制作用

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的犬的mdck細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后進(jìn)行收集，制備成110⁴個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，吹打均勻后接入96孔板，每孔200μl細(xì)胞懸液，在37℃、5%co2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)過夜，同時(shí)，取新鮮豬血10ml，加入等體積pbs，稀釋血樣。吸取等體積的淋巴細(xì)胞分離液置于50ml離心管中。將稀釋后的血樣按分離液2倍體積的量緩慢加入到淋巴細(xì)胞分離液的上層。使分離液：血樣：平衡鹽溶液的體積比為1：1：1，2200r離心22min?？焖傥“啄ぶ岭x心管中，添加至少3倍體積的pbs至離心管中，混勻，2200r離心8-10min，棄上清,用10ml無血清培養(yǎng)基懸起來（大瓶），進(jìn)行計(jì)數(shù)。臺(tái)盼藍(lán)染色統(tǒng)計(jì)活細(xì)胞>95%時(shí)，在96孔培養(yǎng)板中每孔加入200μl細(xì)胞懸液，置37℃，5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

去掉培養(yǎng)基，用pbs洗一次，分為6組，每組實(shí)驗(yàn)孔各加入2、10、50、250、1250、6250ng的caifn-γ蛋白100μl，對(duì)照孔加100μldmem。分別于48h、72h，每孔加入20μlmtt溶液（5mg/ml），4h后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入150μl的dmso，震蕩10min后，用酶聯(lián)免疫分析儀于測(cè)定波長(zhǎng)為570nm測(cè)定od值。生長(zhǎng)抑制率由下式計(jì)算：

抑制率%=（對(duì)照組od均值-治療組od值）/對(duì)照組od均值×100%

結(jié)果見圖2。從圖2中可以看出，與蛋白緩沖液對(duì)照組和天然犬干擾素-γ蛋白對(duì)照組相比，純化后的重組犬干擾素-γ對(duì)mdck細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，隨著濃度的增加，對(duì)mdck細(xì)胞抑制率逐漸增加(**p<0.01)。

實(shí)施例5脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)

1、取新鮮狗血10ml，加入等體積pbs，稀釋血樣。吸取等體積的淋巴細(xì)胞分離液置于50ml離心管中。

2、將稀釋后的血樣按分離液2倍體積的量緩慢加入到淋巴細(xì)胞分離液的上層。使分離液：血樣：平衡鹽溶液的體積比為1：1：1，2200r離心22min。

3、快速吸取白膜至離心管中，添加至少3倍體積的pbs至離心管中，混勻，2200r離心8-10min，棄上清,用10ml無血清培養(yǎng)基懸起來（大瓶），進(jìn)行計(jì)數(shù)。臺(tái)盼藍(lán)染色統(tǒng)計(jì)活細(xì)胞>95%時(shí)，在96孔培養(yǎng)板中每孔加入200μl細(xì)胞懸液，置37℃，5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4、培養(yǎng)1h后在細(xì)胞中分別加入重組犬rifn-γ蛋白和天然犬ifn-γ蛋白，并設(shè)細(xì)胞對(duì)照組。

5、培養(yǎng)72h后，再在每孔中加入mtt使其終濃度為5mg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)4h，取出培養(yǎng)板，輕輕翻轉(zhuǎn)控干孔內(nèi)液體，每孔加入150μldmso振蕩20min后，用酶標(biāo)儀測(cè)樣品孔o(hù)d570值。結(jié)果采用spss統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，應(yīng)用單因子方差分析方法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

結(jié)果見圖3。從圖3中可以看出，加入重組rcaifn-γ蛋白比加入天然caifn-γ蛋白對(duì)淋巴細(xì)胞有較高的增殖作用，而未加入caifn-γ蛋白的細(xì)胞沒有增殖作用。

附錄一

1atggatgtatcggacggtgggtctcttttcgtagatattttgaagaaatg

51gagagaggagagtgacaaaacaatcattcagagccaaattgtctctttct

101acttgaaactgtttgacaactttaaagataaccagatcattcaaaggagc

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751tacacagatctatccctctcccattctccgggtaaacatcatcatcatca

801tcattaa

序列表

<110>哈爾濱紫霞生物科技有限公司

<120>一種提高重組犬干擾素-γ融合蛋白抗病毒活性的方法

<210>seqidno:1

<211>807

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>seqidno:1

1atggacgtttctgacggtggttctctgttcgttgacatcctgaaaaaatggcgtgaagaa

61tctgacaaaaccatcatccagtctcagatcgtttctttctacctgaaactgttcgacaac

121ttcaaagacaaccagatcatccagcgttctatggacaccatcaaagaagacatgctgggt

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781ggtaaacaccaccaccaccaccactaa

<210>seqidno:2

<211>268

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>seqidno:2

1metaspvalseraspglyglyserleuphevalaspileleulyslystrparggluglu

21serasplysthrileileglnserglnilevalserphetyrleulysleupheaspasn

41phelysaspasnglnileileglnargsermetaspthrilelysgluaspmetleugly

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81valasnaspleuglnvalglnarglysalaileasngluleuilelysvalmetasnasp

101leuserproargserasnleuarglysarglysargserglnasnleupheargglyarg

121argalaserlysglyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyserleu

141proserproilegluargthrileserlysalaargglyglnalahisglnproserval

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181leuilelysaspphepheproprogluileaspvalglutrpglnserasnglyglnpro

201gluprogluserlystyrhisthrthralaproglnleuaspgluaspglysertyrphe

221leutyrserlysleuservalasplysserargtrpglnglnglyaspthrphethrcys

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261glylyshishishishishishis