本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種調(diào)控中山杉耐水淹特性的thadh4基因及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

中山杉是江蘇省中國科學(xué)院植物研究所從落羽杉×墨杉雜交組合中選育出來的優(yōu)良無性系，具有速生，耐水淹，耐鹽堿，抗病蟲害等優(yōu)點。由于其突出的耐水淹能力，近年來已在云南滇池、安徽巢湖和三峽庫區(qū)等地區(qū)的濕地生態(tài)系統(tǒng)構(gòu)建中發(fā)揮著重要作用。重慶萬州三峽庫區(qū)消落帶的試驗表明：經(jīng)過最長149d基部淹水，最長122d沒頂淹水，最大沒頂深度達(dá)12m，中山杉仍能獲得90%的造林保存率，樹木年平均胸徑和樹高生長量分別達(dá)1.3cm/a和0.60m/a，因而中山杉可以作為一種研究木本耐水淹特性的優(yōu)良材料。前期關(guān)于植物耐水淹機制研究主要集中在草本模式植物擬南芥以及糧食作物水稻中，中山杉的耐水淹特性研究也主要集中在形態(tài)學(xué)和生理學(xué)方面，無法深入揭示其耐淹機理。因而挖掘出中山杉響應(yīng)水淹脅迫的關(guān)鍵基因?qū)τ谔骄科淠退吞匦约敖沂灸颈局参锬脱蜋C制均具有重要意義。

植物在水淹脅迫下可誘導(dǎo)糖酵解發(fā)生進(jìn)而適應(yīng)缺氧環(huán)境，整個過程既可以為植物體提供能量又可以減少低氧對植物毒害。因而糖酵解途徑相關(guān)的基因被廣泛分離、鑒定，其中乙醇脫氫酶編碼基因adh備受關(guān)注。水稻中過量表達(dá)adh1雖沒有對植株水淹耐受力產(chǎn)生明顯影響，但是adh1一旦突變或缺失，植物的厭氧耐受力就大大降低。玉米和擬南芥adh無效突變體以及水稻rda（低活性的adh）突變體內(nèi)發(fā)酵能力顯著降低，根細(xì)胞胞質(zhì)ph值迅速下降，突變體明顯早于野生型死亡。將水稻的adh1基因轉(zhuǎn)入煙草中，煙草轉(zhuǎn)基因植株耐淹能力顯著增強，且adh1酶的活性也隨淹水時間增加而升高。中山杉水淹脅迫的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果也顯示，水淹程度越高，adh基因的rpkm值也會隨之升高。綜上可知：adh基因?qū)τ诓荼局参镯憫?yīng)低氧脅迫發(fā)揮著重要的作用，而木本植物中研究較少，在中山杉中尚未有相關(guān)報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：針對現(xiàn)在技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種調(diào)控中山杉耐水淹特性的thadh4基因。本發(fā)明的另一目的是提供上述調(diào)控中山杉耐水淹特性的thadh4基因的應(yīng)用。

技術(shù)方案：為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種調(diào)控中山杉耐水淹特性的thadh4基因，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

含有所述的調(diào)控中山杉耐水淹特性的thadh4基因的載體。

所述的調(diào)控中山杉耐水淹特性的thadh4基因的表達(dá)蛋白，其氨基酸序列如seqidno.2所示。

所述的調(diào)控中山杉耐水淹特性的thadh4基因在植物育種中的應(yīng)用。

所述的調(diào)控中山杉耐水淹特性的thadh4基因在植物抗?jié)持械膽?yīng)用。

本發(fā)明以中山杉406葉片為材料，通過race技術(shù)克隆了中山杉thadh4。同時，采用通路克隆技術(shù)構(gòu)建其過量表達(dá)載體ph35gs-thadh4，該基因位于啟動子p35s之后，在啟動子p35s的驅(qū)動下，thadh4在楊樹中高效表達(dá)，并伴隨著表型出現(xiàn)變異，轉(zhuǎn)基因植株生長速率加快，節(jié)間明顯變長。

有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明通過將thadh4基因轉(zhuǎn)入木本模式植物楊樹中，過量表達(dá)thadh4的轉(zhuǎn)基因楊樹，生長速率加快，節(jié)間明顯變長，且水淹脅迫下，基因的表達(dá)量呈幾百倍上升。說明thadh4基因是植物響應(yīng)水淹脅迫的重要基因，在林木基因工程領(lǐng)域有重要的應(yīng)用價值。

附圖說明

圖1是植物過表達(dá)載體ph35gs示意圖；

圖2是過量表達(dá)thadh4轉(zhuǎn)基因楊樹與未轉(zhuǎn)基因楊樹整體表型對比圖，圖中左為未轉(zhuǎn)基因楊樹，圖中右為轉(zhuǎn)基因楊樹；

圖3是過表達(dá)thadh4轉(zhuǎn)基因植株在水淹脅迫下的基因表達(dá)變化圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。

以下實施例中，未詳細(xì)敘述的操作均為常規(guī)生物學(xué)實驗操作，可參照分子生物學(xué)實驗手冊以及現(xiàn)有公開的期刊文獻(xiàn)等進(jìn)行。

實施例1通過race技術(shù)克隆thadh4基因

1）rna的提取及cdna的反轉(zhuǎn)

以中山杉406葉片為材料，使用rneasyplantminikit（qiagen公司），中山杉總rna的提取，由于葉片內(nèi)含有較多的酚類化合物，對操作步驟進(jìn)行了改良。在進(jìn)行提取rna操作前，所有的槍頭，離心管，研缽均應(yīng)用0.1%depc水浸泡過夜，高壓滅菌40min后烘干。所有溶液均應(yīng)采用0.1%depc水配制。用nanodrop1000進(jìn)行總rna濃度和純度的測定。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行總rna的分離，一個完整性較好的rna應(yīng)當(dāng)可以觀測到三條清晰的條帶，其中5.8srna稍暗，而28srna的條帶亮度約為18srna的兩倍左右，表明rna沒有被降解，后采用clontech公司的smarter?pcrcdnasynthesiskit，advantage?2pcrkit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

2）thadh4基因目的片段的獲得

根據(jù)中山杉轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進(jìn)行篩選thadh4的unigene序列，使用oligo6設(shè)計特異性的引物擴(kuò)增thadh4基因的目的片段，其中，thadh4目的片段的正向引物為：5’-gaagtgatgagaagagcaggtt-3’，5’-aggcctggtataatacgttggtat-3’。pcr反應(yīng)體系：takaralataq(5u/μl)0.5μl，10×lapcrbuffer(mg²⁺free)5.0μl，mgcl2（25mm）5.0μl，dntpmixture（2.5mmeach）8.0μl，forwardprimer(10μm)2.0μl，reverseprimer(10μm)2.0μl，cdnatemplate1.0μl，milli-qwater26.5μl。反應(yīng)程序為：94℃3min；94℃30sec，56℃30sec，72℃2min，35cycles；72℃10min；4℃forever。對產(chǎn)物進(jìn)行測序，獲得的thadh4基因目的片段序列如seqidno.3所示。

依據(jù)上述thadh4基因目的片段分別設(shè)計3’race和5’race擴(kuò)增，pcr篩選后進(jìn)行克隆測序，最后將獲得3’race片段及5’race片段進(jìn)行拼接。

3）3’race

3’race反轉(zhuǎn)錄：以總rna為模板，反應(yīng)體系如下：totalrna1μg（xμl），5×m-mlvbuffer2μl，dntpmixture（10mmeach）1μl，3'raceadaptor（5′-ctgatctagaggtaccggatcc-3′）（5μm）1μl，reversetranscriptasem-mlv(rnaseh)(200u/μl)0.25μl，rnaseinhibitor（40u/μl）0.25μl，rnasefreeh2o5.5-xμl，總體積10μl。反應(yīng)程序為：94℃3min；94℃30sec，56℃30sec，72℃2min，30cycles；72℃10min；4℃forever。獲得3’racecdna4℃儲存，進(jìn)入下一個步驟。

3’race巢氏pcr：3’race巢氏pcr分為3’raceouterpcr和3’raceinnerpcr兩輪，在獲得10μl3'race反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物后，可以進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂?，一般是稀釋?0μl用于后續(xù)反應(yīng)。

3'raceouterpcr是反應(yīng)體系如下：稀釋過的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液2μl，3'raceouterprimer（10μm）2μl，genespecificouterprimer（10μm）2μl，10×extaqbufferii（mg²⁺free）5μl，mgcl2（25mm）4μl，dntpmixture（10mmeach）4μl，extaqpolymerase0.3μl，ddh2o30.7μl，總體積50μl。反應(yīng)程序為：94℃3min；94℃30sec，56℃30sec，72℃2min，30cycles；72℃10min；4℃forever。反應(yīng)產(chǎn)物取5μl稀釋適當(dāng)倍數(shù)后用于innerpcr反應(yīng)，其余的用于瓊脂糖凝膠電泳檢測。

引物序列如下：thadh43'raceouterprimer：5'-taccgtcgttccactagtgattt-3'；genespecificouterprimer：5'-cctcaaagataataggaataga-3'。

3'raceinnerpcr是反應(yīng)體系如下：稀釋過的3'raceinnerpcr產(chǎn)物2μl，3'raceinnerprimer（10μm）2μl，genespecificouterprimer（10μm）2μl，10×extaqbufferii（mg²⁺free）5μl，mgcl2（25mm）4μl，dntpmixture（10mmeach）4μl，extaqpolymerase0.3μl，ddh2o30.7μl，總體積50μl。反應(yīng)程序為：94℃3min；94℃30sec，56℃30sec，72℃2min，32cycles；72℃10min；4℃forever。

引物序列如下：thadh43'raceinnerprimer：5'-cagcttcgaatgcattggaaatacca-3'，genespecificinnerprimer：5'-cgcggatcctccactagtgatttcactatagg-3'。

pcr產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，切取目的片段，利用切膠試劑盒回收后，連接于takara公司的pmd19-tsimplevector，轉(zhuǎn)化takara公司的top10大腸桿菌感受態(tài)，通過含有amp的lb篩選培養(yǎng)板進(jìn)行篩選，將篩選出的單克隆菌落pcr檢測后送至金斯瑞公司測序鑒定。

4）5’race

5’race反轉(zhuǎn)錄：去磷酸化反應(yīng)是5’race的第一步反應(yīng)，由alkalinephosphatase催化完成的。反應(yīng)體系如下：totalrna2-5μg（xμl），10×alkalinephosphatasebuffer（mgcl2free）5μl，alkalinephosphatase（calfintestine）（16u/μl）0.6μl，rnaseinhibitor（40u/μl）1μl，rnasefreedh2o43.4-xμl，總體積50μl。50℃反應(yīng)1h，向上述反應(yīng)液加入20μl的3mch3coona（ph5.2），130μl的rnasefreedh2o后充分混勻，加入200μl的酚：氯仿：異戊醇，充分混勻后13000g室溫離心5min，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的1.5ml的離心管中，加入200μl的氯仿，充分混勻后13000g室溫離心5min，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的1.5ml的離心管中，加入2μl的nacarrier后均勻混合，再加入200μl的異丙醇，充分混勻后，-40℃放置2h以上，4℃13000g離心20min，棄上清，加入500μl的75%的預(yù)冷乙醇漂洗，4℃，13000g離心5min，棄上清后干燥，加入7μl的depc水溶解沉淀，得到ciap-treatedrna。

5’race的第二步反應(yīng)是去帽子反應(yīng)，用tobaccoacidpyrophosphatase去掉mrna的5’帽子結(jié)構(gòu)，并保留一個磷酸基團(tuán)。反應(yīng)體系：ciap-treatedrna7μl，10×tapreactionbuffer1μl，tobaccoacidpyrophosphatase（0.5u/μl）1μl，rnaseinhibitor（40u/μl）1μl，totalvolume10μl。37℃反應(yīng)1h，取5μl用于5’raceadaptor連接反應(yīng)，剩余的5μl保存于-80℃。5’adaptor的連接反應(yīng)體系如下：ciap/tap-treatedrna5μl，5’raceadaptor（15μm）1μl，rnasefreedh2o4μl，65℃反應(yīng)5min后冰上放置2min，加入下列試劑：5×rnaligationbuffer8μl，40%peg600020μl，t4rnaligase1μl，rnaseinhibitor（40u/μl）1μl，總體積40μl，16℃反應(yīng)1h，4℃過夜。向上述反應(yīng)液中加入20μl的3mch3coona（ph5.2），140μl的rnasefreedh2o后，充分混勻，加入200μl的苯酚：氯仿：異戊醇，充分混勻后13000g室溫離心5min，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的1.5ml的離心管中，加入200μl的氯仿，充分混勻后13000g室溫離心5min，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的1.5ml的離心管中，加入2μl的nacarrier后充分混勻；再加入200μl的異丙醇，-40℃放置2h，加入500μl的75%的預(yù)冷乙醇漂洗，4℃，13000g離心5min，棄上清后再離心1min后徹底吸干溶液后干燥，加入7μl的rnasefreedh2o溶解沉淀，得到ligatedrna。

ligatedrna反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系：ligaterna6μl，5×m-mlvbuffer2μl，dntp（10μmeach）1μl，random9mers（50μm）0.5μl，reversetranscriptasem-mlv（rnaseh）（200u/μ）0.25μ，rnaseinhibitor（40u/μ）0.25μ，總體積10μl。反應(yīng)程序：30℃10min；42℃1h；70℃15min；4℃forever。獲得5’racecdna4℃儲存，進(jìn)入下一個步驟。

5’race巢氏pcr也分為5’raceouterpcr和5’raceinnerpcr兩輪，反應(yīng)體系，反應(yīng)條件與3’race巢氏pcr一致。

引物序列如下：thadh45’raceouterprimer：5'-acacaagcataatccacgactgtata-3'，genespecificouterprimer：5'-cgcggatccatggctacatgctgacagccta-3'。thadh45’raceinnerprimer：5'-tggtacaccggcttcccacccaaaga-3'，genespecificinnerprimer：5'-cgcggatccacagcctactgatgatcagtcgatg-3'。

pcr產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，切取目的片段，利用切膠試劑盒回收后，連接于takara公司的pmd19-tsimplevector，轉(zhuǎn)化takara公司的top10大腸桿菌感受態(tài)，通過含有amp的lb篩選培養(yǎng)板進(jìn)行篩選，將篩選出的單克隆菌落pcr檢測后送至金斯瑞公司測序鑒定。

將測序獲得的3'race及5’race產(chǎn)物利用bioedit軟件進(jìn)行拼接，獲得含有1506bp堿基的目的基因，blast確認(rèn)目的基因和水稻/擬南芥adh4基因高度同源，命名為thadh4基因，其核苷酸序列如seqidno.1所示，其包含一個1212bp的完整編碼閱讀框，其所編譯表達(dá)蛋白序列如seqidno.2所示。

實施例2thadh4基因植物表達(dá)載體構(gòu)建

利用gateway定向克隆技術(shù)，將目的基因片段轉(zhuǎn)移到目的表達(dá)載體上，包含bp反應(yīng)和lr反應(yīng)兩部分。本實施例所用的載體圖如圖1所示。

1）bp反應(yīng)的目的是將基因片段轉(zhuǎn)移到入門載體上，反應(yīng)體系：vectorthadh4orf片段10-20ng，saltsolution1μl，pcrtm8/gw/topotmvector（入門載體）1μl，加nuclease-freewater至總體積6μl，輕輕混勻，22℃反應(yīng)60min后轉(zhuǎn)移至冰上；將前步6μl反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到top10感受態(tài)細(xì)胞中，涂于lb篩選培養(yǎng)平板，挑取單克隆進(jìn)行菌液pcr檢測，所用引物為基因特異性上游引物和載體上的t7引物，檢測后的陽性克隆進(jìn)一步測序驗證。

2）lr反應(yīng)的目的在于將已經(jīng)重組入門載體的目標(biāo)基因再克隆到目的載體中，反應(yīng)體系：入門載體純化后的質(zhì)粒100ng，目的載體（100ng/μl）1.5μl，lrclonaseiienzymemix2μl，加1×te（ph8.0）至總體積8μl，渦旋后短暫離心，25℃溫浴1h，加入1μlproteinaseksolution，混勻，37℃溫浴10min以終止反應(yīng)；取2μllr反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化top10感受態(tài)細(xì)胞，涂于lb篩選培養(yǎng)平板，挑取單克隆進(jìn)行菌液pcr檢測，所用引物為thadh4基因特異性上游引物和載體上的35s引物，檢測后的陽性克隆進(jìn)一步測序驗證。驗證后，回收純化lr反應(yīng)后的重組載體，即得到目的基因的表達(dá)載體，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實施例3thadh4基因的遺傳轉(zhuǎn)化

通過液氮凍融法將thadh4基因轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，后用葉盤法轉(zhuǎn)化雜種山新楊。操作步驟：在eha105感受態(tài)細(xì)胞中加入至少100ng回收純化的表達(dá)載體，輕輕混勻，冰浴30min，液氮速凍1min，37℃熱擊3min，迅速置于冰上1-2min，加入800μllb培養(yǎng)基，28℃，100rmp復(fù)蘇3h，4000rmp離心3min，吸掉800μllb培養(yǎng)基，混勻剩余菌液，涂抹于含有抗生素的lb平板，28℃倒置培養(yǎng)30-48h，pcr檢測陽性克隆，將陽性克隆菌落擴(kuò)繁，接種于120ml含相應(yīng)抗生素的lb液體培養(yǎng)基中，28℃搖菌（220rmp）培養(yǎng)24h左右，至od600值約0.5，將菌液分裝于50ml的離心管中，1400rcf離心10min，收集菌體，用一定體積的ms（不加蔗糖）溶液重懸菌體至od600值0.5，乙酰丁香酮（as）至終濃度為20μm，25℃溫和振蕩（90rmp）菌液45min，將生長勢基本一致，4-6周的山新楊組培苗，取頂芽下的2-3片舒展的葉片，延葉的邊緣剪出傷口，片剪成大小合適的不等邊形，轉(zhuǎn)入制備好的浸染液中25℃溫和振蕩30min（250ml的三角瓶，90rmp），取出葉盤，用濾紙吸干殘余菌液，轉(zhuǎn)入不含抗生素的ms1分化培養(yǎng)平板上暗培養(yǎng)48h，洗菌后轉(zhuǎn)入不含抗生素的ms1分化培養(yǎng)平板上光培養(yǎng)1w，再將葉盤轉(zhuǎn)入入含抗生素的ms1分化培養(yǎng)平板上，進(jìn)行篩選培養(yǎng)，當(dāng)葉盤邊緣長出抗性不定芽時，將其轉(zhuǎn)入含抗生素的ms2莖伸長培養(yǎng)平板上培養(yǎng)，當(dāng)抗性不定芽在莖伸長培養(yǎng)基中生長至1cm左右時，將其剪下轉(zhuǎn)入含有抗生素的ms培養(yǎng)平板上進(jìn)行抗性植株生根篩選，從而獲得完整植株，扦插抗性植株的苗干于ms培養(yǎng)基上，進(jìn)行插條的表型觀測。生長4w后，從圖2可以看出，thadh4的過量表達(dá)對植株的表型產(chǎn)生了一定的影響，較對照植株，轉(zhuǎn)基因植株生長速度變快，節(jié)間發(fā)生變異，節(jié)間長度明顯長于對照植株。

實施例4轉(zhuǎn)基因植株水淹脅迫后的分子檢測

對篩選培養(yǎng)基上表型發(fā)生變異的轉(zhuǎn)thadh4基因楊樹及對照楊樹進(jìn)行沒頂淹水實驗，1w后對照楊樹葉片呈現(xiàn)萎蔫、發(fā)黃，而轉(zhuǎn)基因楊樹未有明顯變化，取樣進(jìn)行實時定量分子檢測。實時定量引物采用oligo6.6軟件設(shè)計，擴(kuò)增產(chǎn)物長度156bp，引物tm值在60℃，引物序列：qadh4f:5'-cataatagagagcgtgg-3'qadh4r:5'-tgactgttctcatgatt-3'。實時定量pcr的內(nèi)參基因采用已篩選出的18s基因。實時定量在abi7500realtimepcrsystems上完成，每反轉(zhuǎn)錄樣品三次重復(fù)，數(shù)據(jù)提取分析采用7500systemsdssoftware。反應(yīng)體系如下：sybrpremixextaqtm（2×）10μl，pcrforwardprimer（10μm）0.4μl，pcrreverseprimer（10μm）0.4μl，roxreferencedyeⅱ（50×）0.4μl，dna模板2μl，dh2o6.8μl，總體積20μl。反應(yīng)程序：94℃30s；94℃5s，60℃34s，95℃15s，40cycles；60℃1min，95℃15s。實時定量結(jié)果如圖3所示：水淹脅迫1w后，對照植株葉片呈現(xiàn)萎蔫狀態(tài)，而轉(zhuǎn)基因植株長勢良好。thadh4基因的表達(dá)量在轉(zhuǎn)基因植株中較對照高出220倍-506倍，說明中山杉thadh4基因和耐水淹特性密切相關(guān)，預(yù)測其在林木基因工程領(lǐng)域?qū)⒂兄匾膽?yīng)用價值。

sequencelisting

<110>江蘇省中國科學(xué)院植物研究所

<120>一種調(diào)控中山杉耐水淹特性的thadh4基因及其應(yīng)用

<130>100

<160>15

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1506

<212>dna

<213>中山杉406

<400>1

gaaaaatgggggaaggattttgaggtttagcaattagaagagaactgcaaatctcaggtc60

gagaattctttttgacagtgttttctatccttcgatttttgctctgttgtttggacaatg120

gagatacagaatggaatagaaattgactctttcagtaagagttttcagagtacaaatggc180

aaagtccctctgtctcttgcagaaactgctggtaaagtcatcacttgcaaagctgcagta240

gcatggggagtgaagcaacctctggtaatagaagatgttcaggtggatcctccaaaatca300

atggaagtccgcattaaaatcacccacacctctctctgccacaccgatattacattctgg360

atgggaggggaagaaagcacgtttcctcgcatattgggccatgagggtgctggcataata420

gagagcgtgggtgagggcataacagatcttgtgcctggagatcacgtgattccaacatac480

caaggagagtgtagagattgtgggtgttgcaaatctaagaaaaccaatcagtgtgacaag540

ttcaaaattgatatcatgagaacagtcatgagaagtgatgagaagagcaggttttctttg600

ggtgggaagccggtgtaccatttcatggccacatctacattcagcgagtatacagtcgtg660

gattatgcttgtgttgtcaaaattaatcctaaagctcctttagacaaagcctgcttgctt720

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tcaacagtggctgtctttggcctgggtactgttggccttgcagttgcagaagccgcaagt840

ctaagaggagcctcaaagataataggaatagataccaatccaaataagttcgccaaagcc900

aaagtattgggggtaaccgactgcatcaatccaaaagaccatgagaagcccattcaagaa960

gttatagcagagatgacaaatggaggcgtggattacagcttcgaatgcattggaaatacc1020

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gagatgtttatgcgtaaggagttgaaagttgaggaatatattactcacgagttctcattt1260

tcagaaatcaacaaagcatttgaattgttgttggaaggcaattgtttgagatgtgttctt1320

cacttctagacaaatttgaaggaatggaagatctatttctgaatggcagatagaaagaca1380

tttaggtagttggctaaaattacttctaaaacatgtgatggtcttaagaatgtccttgtg1440

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<210>2

<211>403

<212>prt

<213>中山杉406

<400>2

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