本發(fā)明涉及生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種調(diào)控種子大小的擬南芥mpk基因及增加種子大小的方法。

背景技術(shù)：

農(nóng)作物的產(chǎn)量受各種客觀因素的影響。其中種子的大小是影響產(chǎn)量的一個(gè)重要組成部分。種子的大小主要受母體組織(珠被)及合子組織(胚乳、胚胎)的遺傳調(diào)控及外界環(huán)境的影響。因此了解種子發(fā)育的機(jī)理、提高作物的產(chǎn)量，是現(xiàn)代育種的目標(biāo)之一。隨著對(duì)調(diào)控種子發(fā)育的分子生物學(xué)研究的深入，挖掘直接調(diào)控種子大小的基因，并應(yīng)用于遺傳改良培育高產(chǎn)新品種意義重大。

擬南芥中絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,mapk/mpk)家族通過三級(jí)級(jí)聯(lián)途徑，將細(xì)胞感知的外界信號(hào)進(jìn)一步擴(kuò)大并傳遞給下游靶標(biāo)，實(shí)現(xiàn)對(duì)外界逆境或生長發(fā)育信號(hào)的響應(yīng)。已知在擬南芥中含有20個(gè)mpk，10個(gè)mkk及80個(gè)mapkkk。mpk的20個(gè)成員又可以被分為a,b,c,d四組，其中報(bào)道最多的是a組的mpk3、mpk6與b組的mpk4等，主要參與調(diào)控冷害、鹽害、生物逆境耐受性以及氣孔發(fā)育、花粉管導(dǎo)向、生長素極性運(yùn)輸?shù)?。迄今為止，國?nèi)外已經(jīng)報(bào)道的參與控制種子大小的mapk級(jí)聯(lián)途徑的基因只有水稻的osmkk4-osmpk6。有關(guān)mapk家族的c組及d組的成員有何功能以及是否調(diào)控種子大小尚未見任何報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種調(diào)控種子大小的擬南芥mpk基因及增加種子大小的方法。本發(fā)明表明，如果提高mpk20基因在植物體內(nèi)的表達(dá)水平，可顯著地增加種子的長度與寬度，進(jìn)而增加千粒重，具有廣闊的應(yīng)用前景。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明主要提供了如下技術(shù)方案：

一方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種調(diào)控種子大小的擬南芥mpk基因，所述mpk基因?yàn)閙pk20基因，所述mpk20基因的核苷酸序列表為seq.id.no.1。

作為優(yōu)選，所述mpk20基因的擴(kuò)增引物為：

正向引物：5’-gaagatctgcagcaagataatcgcaaaaaggtg-3’，

反向引物：5’-cgggatccctagtacatctttgacataccgtaccg-3’。

另一方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了上述mpk20基因的編碼蛋白。

又一方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了上述mpk20基因的表達(dá)載體與轉(zhuǎn)基因植株。

再一方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種增加種子大小的方法，所述方法包括：將上述mpk20基因通過植物表達(dá)載體pcsgfpbt及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花蕾浸蘸法導(dǎo)入擬南芥，得到具有增大種子體積的擬南芥。

本發(fā)明人在進(jìn)行擬南芥mpk的t-dna插入突變體的表型分析篩選過程中發(fā)現(xiàn)了擬南芥mapk基因家族的d組的一個(gè)成員mpk20的敲除株系的種子顯著減小。atmpk20在種子發(fā)育過程中的合點(diǎn)端胚乳、珠被及成熟的胚中高度表達(dá)，而這些組織均是決定種子大小的關(guān)鍵組織。因此，本發(fā)明人推斷該基因在種子發(fā)育調(diào)控中起著重要的作用。基于此，本發(fā)明人進(jìn)行了本發(fā)明的研究。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明人基于上述研究，克隆了mpk20基因，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法將該基因的過表達(dá)載體遺傳轉(zhuǎn)入擬南芥，經(jīng)過對(duì)t3代純合株系進(jìn)行表型分析，發(fā)現(xiàn)了含有本發(fā)明的mpk20基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株產(chǎn)生的種子大小顯著增加，為將來的育種提供可靠的理論基礎(chǔ)與可供選擇的基因資源。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例1提供的mpk20在種子發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)分布圖(結(jié)果來自efpbrowser公共數(shù)據(jù)庫)；

圖2是本發(fā)明實(shí)施例1提供的擬南芥mpk20基因的結(jié)構(gòu)以及mpk20基因的pcr篩選純合株系的電泳結(jié)果圖，a圖為t-dna插入在最后一個(gè)外顯子上，白色與黑色長方形分別代表內(nèi)含子與外顯子；b圖為pcr電泳圖，wt為野生型擬南芥，m是1kbdna分子量標(biāo)準(zhǔn)，數(shù)字代表不同的株系)；

圖3是本發(fā)明實(shí)施例1提供的mpk20基因在擬南芥的不同組織與器官內(nèi)的表達(dá)水平圖；(數(shù)值來自三次生物學(xué)重復(fù)的qrt-pcr分析結(jié)果，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)誤(se))；

圖4是本發(fā)明實(shí)施例1提供的mpk20的過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系中的轉(zhuǎn)錄本水平的定量pcr檢測圖；(數(shù)值來自一次生物學(xué)重復(fù)、兩個(gè)技術(shù)重復(fù)的，不同的編號(hào)代表多個(gè)不同的獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因株系)；

圖5是本發(fā)明實(shí)施例1提供的mpk20的不同基因型的種子大小比較圖；(wt表示野生型，mpk20代表t-dna插入突變體；mpk-oe#13與mpk20-oe#20代表兩個(gè)獨(dú)立的高表達(dá)株系，標(biāo)尺表示150μm)；

圖6是本發(fā)明實(shí)施例1提供的比較mpk20的不同基因型的種子的長度和寬度比較的統(tǒng)計(jì)分析圖；(圖中a表示長度分析，b為寬度分析，不同字母代表anova分析后差異顯著(p<0.05))。

具體實(shí)施方式

為更進(jìn)一步闡述本發(fā)明為達(dá)成預(yù)定發(fā)明目的所采取的技術(shù)手段及功效,以下以較佳實(shí)施例，對(duì)依據(jù)本發(fā)明申請(qǐng)的具體實(shí)施方式、技術(shù)方案、特征及其功效，詳細(xì)說明如后。下述說明中的多個(gè)實(shí)施例中的特定特征、結(jié)構(gòu)、或特點(diǎn)可由任何合適形式組合。

實(shí)施例1

在前期工作中，我們發(fā)現(xiàn)擬南芥的atmpk20基因特異性地在發(fā)育的種子中表達(dá)(圖1)，暗示該基因可能調(diào)控種子的發(fā)育與大小。

為此，先對(duì)atmpk20基因進(jìn)行cdna克隆和測序：以擬南芥幼苗cdna文庫為模板擴(kuò)增mpk20的全長cdna，引物序列為：

atmpk20-bglii-f2:5’-gaagatctgcagcaagataatcgcaaaaaggtg-3’，

atmpk20-bamhi-r:5’-cgggatccctagtacatctttgacataccgtaccg-3’；

pcr反應(yīng)體系(50μl):

添加無菌的蒸餾水至50μl

pcr反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3分鐘，94℃x30秒,50℃x1分鐘,72℃x1分鐘50秒，35個(gè)循環(huán)；最后72℃x7分鐘。

pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為1821bp。

對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物采用bioer公司的瓊脂糖膠回收試劑盒，步驟按說明書進(jìn)行，pcr產(chǎn)物與pcsgfpbt載體均經(jīng)過bglii-bamhi雙酶切后，進(jìn)行連接，連接體系為：

于20℃水浴連接2小時(shí)，采用42℃熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)dh5α；挑取單菌落，進(jìn)行菌落pcr篩選陽性克隆。由于pcsgfpbt載體的序列在ncbi有公布(登錄號(hào)dq370426)，可以據(jù)此設(shè)計(jì)一條載體特異的正向引物5’-cgaatctcaagcaatcaagc-3’，反向引物(atmpk20-bamhi-r)同上。

pcr反應(yīng)體系(20μl):

添加無菌的蒸餾水至20μl

pcr反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3分鐘，94℃x30秒,50℃x1分鐘,72℃x1分鐘50秒，35個(gè)循環(huán)；最后72℃x5分鐘。

1％瓊脂糖電泳檢測，根據(jù)1kbdnamarker(fermentas)判斷在擴(kuò)增條帶特異且長度為2kb左右的應(yīng)該是陽性克隆，挑選陽性菌落進(jìn)行搖菌及質(zhì)粒提取，送至生物公司雙向測序驗(yàn)證。

atmpk20的核苷酸序列表為seq.id.no.1。

然后，進(jìn)行了該基因的突變體的鑒定：

從美國擬南芥生物資源中心(abrc)購得擬南芥atmpk20基因的t-dna插入突變體salk_146654種子，經(jīng)次氯酸鈉消毒2分鐘、無菌水漂洗5次后，播種在含有1％蔗糖的1/2xms培養(yǎng)基上，4℃層積處理3天后放置于溫室萌發(fā)一周，然后移栽在盛有營養(yǎng)土的盆缽里。生長三周后，取指甲蓋大的一片真葉，用常規(guī)的2％ctab法提取基因組dna，溶解于20ul的1xte緩沖液(ph8)中。利用taq聚合酶、兩對(duì)引物組合(lbb1.3+salk_146654_rp、salk_146654_lp+salk_146654_rp)，分別以野生型(col-0)與多個(gè)突變體的1μl的基因組dna作為模板，進(jìn)行20μl體系的常規(guī)pcr擴(kuò)增，然后，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳。根據(jù)1kbdnamarker(fermentas),篩選出純合的突變體株系(圖2b)。同時(shí)，對(duì)lbb1.3+salk_146654_rp產(chǎn)物克隆到pjet1.2載體(使用fermentas公司clonejetpcrcloningkit進(jìn)行克隆)，進(jìn)行了測序，與atmpk20基因的基因組dna序列進(jìn)行比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，salk_146654突變體插入在最后一個(gè)外顯子(圖2a)。

所用引物序列如下：

salk_146654_lp：5’-gaacagcaatctctcattgtgc-3’

salk_146654_rp:5’-agcaatgtgtccaaactgacc-3’

lbb1.3：5’-attttgccgatttcggaac-3’

atmpk20基因的組織器官特異性檢測：

播種擬南芥野生型col-0于營養(yǎng)土，在溫室中生長一周后取幼苗、生長5周后收集蓮座葉、莖生葉、開放的花朵、莢果、莖干以及根系，準(zhǔn)備三個(gè)生物學(xué)重復(fù)，分別用plantrnakit(omegabio-tek)提取總rna，然后，利用fermentas公司的revertaid1^stcdnasynthesiskit，對(duì)2.5μg總rna，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cdna，用無菌雙蒸餾水稀釋10倍后，采用sybrgreeni試劑(康為世紀(jì))進(jìn)行實(shí)時(shí)定量rt-pcr。

引物：

atubq10-f：5’-gttccaatctatgagggatacacgc-3’(內(nèi)參基因)

atubq10-r:5’-agaagttcgacttgtcattagaaagaaa-3’(內(nèi)參基因)

atmpk20-qpcr_f:5’-tctccccttttcacaacaatctgc-3’

atmpk20-qpcr_r:5’-gctgccgctgcgactcctat-3’

qpcr反應(yīng)體系如下：

2xsybrgreeni混合液:5μl

20μm正向引物:0.2μl

20μm反向引物:0.2μl

cdna模板：2μl

無菌水:加至總體積為10μl

pcr程序：95℃x15分鐘熱啟動(dòng)并變性模板，然后運(yùn)行35個(gè)循環(huán)的95℃x15秒，60℃x1分鐘，并運(yùn)行溶解曲線。

利用下述公式，以atubq10為內(nèi)參基因，計(jì)算atmpk20在各個(gè)組織器官內(nèi)的表達(dá)水平，相對(duì)表達(dá)水平(relativeexpressionlevel)＝(e靶標(biāo))^δcp靶標(biāo)(root–樣品)/(e內(nèi)參)^δcp內(nèi)參(root–樣品)

如圖3所示，表明atmpk20在除了蓮座葉、莖生葉以及根系之外的其他器官內(nèi)表達(dá)水平均較高。

atmpk20的過表達(dá)載體的凍融法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌gv3101：

加1μl的重組質(zhì)粒pcsgfpbt-atmpk20到50μl的gv3101感受態(tài)細(xì)胞中，冰上孵育30min。液氮冷凍1min后于37℃溫育5min。加入yeb培養(yǎng)基在28℃進(jìn)行活化培養(yǎng)2h。涂布于含有慶大霉素(25mg/l)、利福霉素(34mg/l)以及卡那霉素(50mg/l)的yeb培養(yǎng)基上,倒置于28℃培養(yǎng)2天。

擬南芥轉(zhuǎn)化：將野生型擬南芥col-0生態(tài)型在正常光周期(14h光照/8-10h黑暗)下培養(yǎng)5周左右；挑取一個(gè)上述農(nóng)桿菌的單菌落接種于5mlyeb培養(yǎng)基(含25mg/l慶大霉素、34mg/l利福霉素以及50mg/l卡那霉素),28℃,200rpm振蕩培養(yǎng)約20h。然后，將5ml菌液全部轉(zhuǎn)接入330mlyeb培養(yǎng)基中(含相應(yīng)抗生素),28℃培養(yǎng)8h至od600≈0.8-1.0。室溫5,000rpm離心10min，棄上清收集菌體。將農(nóng)桿菌菌體懸浮于等體積(330ml)的滲透介質(zhì)(1/2×ms基礎(chǔ)鹽,5.0％(w/v)蔗糖,ph5.7)懸浮。將上述農(nóng)桿菌懸浮液倒入500ml的微波爐盒中，加入終濃度為0.02％的silwetl-77，混勻。將擬南芥的花蕾倒置浸蘸在含有目的載體的滲透介質(zhì)中,浸蘸約20秒，其間輕微晃動(dòng)。然后，橫放在托盤里，用透明塑料蓋蓋住盆缽保持濕度，放在22℃溫室中。14h后揭開蓋，豎直盆缽，繼續(xù)培養(yǎng)，直至植物成熟收獲t1代種子，干燥。

轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選與傳代：將上述t1代種子進(jìn)行次氯酸鈉消毒處理后，播種于含30mg/l的潮霉素的1/2xms+1％蔗糖培養(yǎng)基上，4℃放置兩天后，在溫室萌發(fā)一周，挑選根系較長、子葉顏色呈現(xiàn)正常綠色的幼苗約40株,移栽于營養(yǎng)土中,繼續(xù)在溫室生長兩個(gè)月直至成熟收獲t2種子。類似地，將約40個(gè)獨(dú)立株系的t2代種子再播種于含潮霉素的1/2xms培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇萌發(fā)一周，統(tǒng)計(jì)孟德爾分離的抗性與不抗的幼苗的比例是否是3:1，據(jù)此判斷是單拷貝還是多拷貝插入，并觀察每一個(gè)株系的純合性。然后，將來自40個(gè)獨(dú)立t2株系的抗性幼苗移栽到營養(yǎng)土，繼續(xù)培養(yǎng)收獲t3代種子。

對(duì)多個(gè)獨(dú)立的純合株系的種子，萌發(fā)生長7天后，收集50mg幼苗，采用triol(上海生工)方法提取rna，按照說明書進(jìn)行。然后，利用fermentas公司的revertaid1^stcdnasynthesiskit，對(duì)2.5μg總rna，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cdna，用無菌雙蒸餾水稀釋10倍后，采用sybrgreeni試劑(康為世紀(jì))進(jìn)行實(shí)時(shí)定量rt-pcr，篩選出高表達(dá)的目的株系。

引物：

atubq10-f：5’-gttccaatctatgagggatacacgc-3’(內(nèi)參基因)

atubq10-r:5’-agaagttcgacttgtcattagaaagaaa-3’(內(nèi)參基因)

atmpk20-qpcr_f:5’-tctccccttttcacaacaatctgc-3’

atmpk20-qpcr_r:5’-gctgccgctgcgactcctat-3’

qpcr反應(yīng)體系如下：

2xsybrgreeni混合液:5μl

20μm正向引物:0.2μl

20μm反向引物:0.2μl

cdna模板：2μl

無菌水:加至總體積為10μl

pcr程序：95℃x15分鐘熱啟動(dòng)并變性模板，然后運(yùn)行35個(gè)循環(huán)的95℃x15秒，60℃x1分鐘。

利用下述公式，以atubq10為內(nèi)參基因，計(jì)算atmpk20在各個(gè)過表達(dá)株系(oe)中，與野生型col-0(wt)比較后的轉(zhuǎn)錄本水平。結(jié)果顯示，鑒定出多個(gè)高表達(dá)的多個(gè)獨(dú)立株系，選擇oe#13與oe#20進(jìn)行后續(xù)的表型分析與種子大小的比較(圖4)。

比值或倍數(shù)＝(e靶標(biāo))^δcp靶標(biāo)(wt–oe)/(e內(nèi)參)^δcp內(nèi)參(wt–oe)

種子大小的比較方法：將同時(shí)播種、同樣條件生長并收獲的成熟并干燥的野生型擬南芥、atmpk20的t-dna插入突變體以及過表達(dá)株系的種子，分別盛放在7.5cm直徑的玻璃培養(yǎng)皿中，均勻鋪開，在體視鏡下觀察并比較大小、拍照，每個(gè)基因型重復(fù)三次。然后，利用圖像處理軟件imagej，對(duì)各個(gè)基因型的種子的長度與寬度進(jìn)行測量，并利用spss軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

結(jié)果表明，atmk20的兩個(gè)獨(dú)立的過表達(dá)株系(oe#13與oe#20)的種子的大小明顯比突變體以及野生型col-0增大(圖5)。進(jìn)一步通過分析各個(gè)基因型種子的長度與寬度，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，atmk20的兩個(gè)獨(dú)立的過表達(dá)株系oe#13與oe#20的種子的長度顯著長于wt，而突變體與wt間差異不顯著(圖6a)。就種子寬度而言，atmk20的兩個(gè)獨(dú)立的過表達(dá)株系oe#13與oe#20的種子的寬度顯著長于wt，而突變體與wt比較顯著要短(圖6b)。綜上，atmpk20的表達(dá)水平高低明顯地與種子的大小正相關(guān)，說明通過操控atmpk20的表達(dá)，可望增大種子的大小，顯示出良好的應(yīng)用前景。

本發(fā)明實(shí)施例中未盡之處，本領(lǐng)域技術(shù)人員均可從現(xiàn)有技術(shù)中選用。

以上公開的僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)以上述權(quán)利要求的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。

sequencelisting

<110>西北農(nóng)林科技大學(xué)

<120>一種調(diào)控種子大小的擬南芥mpk基因及增加種子大小的方法

<160>1

<210>1

<211>1821

<212>dna

<213>擬南芥

<400>1

atgcagcaagataatcgcaaaaagaataatctggagatggagttcttttctgactatggc60

gatgccaatagatttaaagttcaagaagttattggaaaaggcagttatggagttgtttgc120

tcagctatagacactcttacgggtgagaaagtcgcgataaagaaaattcatgatattttt180

gagcatatttctgatgctgcgaggattctacgtgagattaaacttcttagactcctaagg240

catccagatatagttgaaattaagcacattatgcttcctccttcacgaagagaattcaaa300

gatatttatgttgtctttgagctcatggaatcggatcttcatcaagttattaaagccaat360

gatgatttgactagagagcattaccagtttttcctgtatcagttattgcgtgcactgaag420

tacattcacacagctaatgtctaccaccgagacctgaaaccaaagaacatattggcaaat480

gcaaactgtaaacttaagatttgtgattttggattggcaagggttgcattcaatgatacc540

cccacaacaatcttctggactgactatgttgctaccagatggtatagagctccagagctt600

tgtggatctttttactctaagtatacacccgcaattgacatctggagtataggctgcatt660

tttgcggaggtgttgatgggtaaaccacttttccctggaaagaatgtggttcaccagctg720

gatcttatgactgatctgctagggacaccttccctggacaccatctcacgggtgaggaat780

gagaaggcaaggaggtacttaacaagcatgaggaaaaagccacccattccgtttgcacag840

aaattcccaaatgcagatcctttgtctctgaagttgttggagaggcttcttgcttttgat900

ccaaaagaccggccaactgctgaagaggcacttgctgatccatattttaagggattggca960

aaagtggaaagggagccttcatgtcaacccatcacgaagatggaatttgagttcgagaga1020

agaaaggtcactaaagaggatataagagagctaatttctagggagatacttgagtaccac1080

cctcagctgcttaaagatcatatgaacggggctgataaagccagttttctctacccaagt1140

gctgttgatcaatttagaagacaatttgcgcatcttgaagaaaacagtggtaaaaccggc1200

cctgtggcacctctagaaaggaaacatgcctctcttcccagatcaacggtcatacactca1260

accgcagtagcacgaggaggacaaccaaaacttatgaataacacaaacacattgaaccct1320

gaaactactcaaaacattccttttaatcatgcaacaatacaagcacaacaaagaaacctc1380

tcagcagccaaaccaagcacattcatgggcccggttgcacctttcgacaatggcagaatc1440

agcagagatgcatatgacccgagatcattcatccggagcactaatctccccttttcacaa1500

caatctgctgcaacagtcgccatgggaaagcagcaagagagaagaacaactatggagcct1560

gagaagcaggcaagacaaatatctcagtataatagatatgcaccagatgtagccatcaac1620

atagacaacaacccgtttatcatggctagaacgggaatgaacaaagccgaaaacatcagt1680

gaccggatcataatcgacacaaatctgttacaggcaactgccggaataggagtcgcagcg1740

gcagctgcagcagctgctcctggtggttctgctcaccggaaagttggagctgttcggtac1800

ggtatgtcaaagatgtactag1821