本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用農(nóng)桿菌浸染法致使白花兜蘭基因轉(zhuǎn)變的方法。
背景技術(shù)：
白花兜蘭具有很高的觀賞價(jià)值，已經(jīng)成為國(guó)際花卉市場(chǎng)上十分流行的高檔花卉。白花兜蘭新品種的選育成為新一輪花卉育種的熱點(diǎn)，目前白花兜蘭的新品種培育方法主要是雜交育種，但是雜交育種存在遠(yuǎn)緣雜交不親和的缺點(diǎn)，難以打破物種之間的生殖隔離，以及在有性生殖過(guò)程中，由于重組時(shí)染色體的變換量小，難以打破某些基因連鎖出現(xiàn)等缺點(diǎn)；并且通過(guò)雜交育種方法培育新品種的周期很長(zhǎng)，某些優(yōu)良性狀難以保持，給改良某一單一性性狀帶來(lái)了極大的不便。近年來(lái)越來(lái)越多的花卉工作者利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改變花卉的花色、花期、花型、香氣等性狀。但是白花兜蘭的轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系到目前為止還沒(méi)有成功的報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了克服上述白花兜蘭轉(zhuǎn)基因技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明公開(kāi)了一種利用農(nóng)桿菌浸染法致使白花兜蘭基因轉(zhuǎn)變的方法。
本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的。
一種利用農(nóng)桿菌浸染法致使白花兜蘭基因轉(zhuǎn)變的方法，包括以下步驟：
a、白花兜蘭液體培養(yǎng)基的配制：向1l玻璃容器中加入去離子水900ml，松樹(shù)皮粉末90g，磷肥5g，鉀肥3g，氮肥2g，搖動(dòng)容器直至磷肥、鉀肥、氮肥完全溶解，松樹(shù)皮粉末均勻懸浮在水中，再加入離子水定容至1l，在15psi高壓下蒸汽滅菌20min，制得白花兜蘭液體培養(yǎng)基；
b、白花兜蘭固體培養(yǎng)基的配制：向1l玻璃容器中加入去離子水900ml，松樹(shù)皮粉末90g，磷肥5g，鉀肥3g，氮肥2g，搖動(dòng)容器直至磷肥、鉀肥、氮肥完全溶解，松樹(shù)皮粉末均勻懸浮在水中，加入離子水定容至1l，再加入150g瓊脂粉，攪拌均勻，于15psi高壓下蒸汽滅菌20min后，置于冷水浴中，待培養(yǎng)基溫度降到室溫時(shí)加入500mg頭孢氨芐毒素，充分搖勻，將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿后，打開(kāi)蓋子，在紫外光照下光照15分鐘后用封口膠封邊，倒置，于4℃下保存；
c、農(nóng)桿菌液體浸染液的配制；將帶有基因轉(zhuǎn)變質(zhì)粒的農(nóng)桿菌lba4404培養(yǎng)至od＝0.6～1.0，于5000r/min的離心機(jī)中離心5min，棄上清液，用100mg/l乙酰丁香酮的lb液體培養(yǎng)基懸浮沉淀，室溫下靜置3h，于5000r/min的離心機(jī)中離心5min，棄上清，用白花兜蘭液體培養(yǎng)基懸浮沉淀，制得農(nóng)桿菌液體浸染液；
d、白花兜蘭浸染：選擇生長(zhǎng)良好、無(wú)病變的白花兜蘭幼苗，滅菌，剪去莖尖和根部，置于農(nóng)桿菌液體浸染液中浸泡10～20min，每隔2min搖勻一次；
e、白花兜蘭暗培養(yǎng)：將上述浸泡后的白花兜蘭幼苗挑出浸染液，用滅菌后的濾紙擦干表層液體，置于白花兜蘭固體培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)3天；
f、白花兜蘭光照培養(yǎng)：將上述暗培養(yǎng)3天后的白花兜蘭幼苗用500mg/l的頭孢氨芐毒素清洗3遍，再用滅菌水沖洗5遍，最后用滅菌后的濾紙擦干后放到含有500mg/l的頭孢氨芐毒素的白花兜蘭固體培養(yǎng)基中進(jìn)行光照培養(yǎng)；
g、結(jié)果檢測(cè)：將浸染并培養(yǎng)兩周后的白花兜蘭用x-gluc染色液在37℃恒溫箱中浸泡3h，取出后用酒精脫色處理，能夠產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的深藍(lán)色化合物。
優(yōu)選的，所述農(nóng)桿菌lba4404本身帶有鏈霉素抗性和利福平抗性，培養(yǎng)溫度為28℃，搖菌轉(zhuǎn)速為180～220r/min，是一種弱毒的農(nóng)桿菌，采用yep培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
優(yōu)選的，所述乙酰丁香酮的lb液體培養(yǎng)基的配制方法為：在950ml去離子水中加入胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、nacl10g、搖動(dòng)容器直至溶質(zhì)溶解，用5mol/l的naoh溶液調(diào)節(jié)ph至7.0，然后加入去離子水定容至1l，最后在15psi高壓下蒸汽滅菌20min。
優(yōu)選的，所述白花兜蘭暗培養(yǎng)方法為在黑暗、室溫條件下，將白花兜蘭置于白花兜蘭固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天。
優(yōu)選的，所述頭孢氨芐毒素為頭孢氨芐緩釋片的液體溶液。
優(yōu)選的，所述白花兜蘭的光照培養(yǎng)方法為在光照強(qiáng)度5000lux、溫度24～26℃、濕度55～65％、二氧化碳濃度350～450ppm、光照時(shí)間12h/d的培養(yǎng)條件下溫室培養(yǎng)，每30天繼代一次。
優(yōu)選的，所述x-gluc染色液為β-葡糖醛酸酶基因檢測(cè)的顯色底物。
本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明通過(guò)將浸染并培養(yǎng)兩周后的白花兜蘭用x-gluc染色液在37℃恒溫箱中浸泡3h，取出后用酒精脫色處理，如果能夠產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的深藍(lán)色化合物，則說(shuō)明外源基因已經(jīng)在白花兜蘭上得以表達(dá)，從而可以說(shuō)明白花兜蘭已實(shí)現(xiàn)了基因轉(zhuǎn)變。本發(fā)明公開(kāi)的一種利用農(nóng)桿菌浸染法致使白花兜蘭基因轉(zhuǎn)變的方法造作簡(jiǎn)單、基因轉(zhuǎn)變效果顯著、成本低廉，為進(jìn)一步通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)改造白花兜蘭奠定了技術(shù)基礎(chǔ)與理論依據(jù)，將此發(fā)明用于白花兜蘭遺傳學(xué)上，可有效地改變白花兜蘭的花色、花期、花型、香氣等性狀，前景十分廣闊。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步作詳細(xì)的說(shuō)明。
實(shí)施例1
一種利用農(nóng)桿菌浸染法致使白花兜蘭基因轉(zhuǎn)變的方法，包括以下步驟：
a、白花兜蘭液體培養(yǎng)基的配制：向1l玻璃容器中加入去離子水900ml，松樹(shù)皮粉末90g，磷肥5g，鉀肥3g，氮肥2g，搖動(dòng)容器直至磷肥、鉀肥、氮肥完全溶解，松樹(shù)皮粉末均勻懸浮在水中，再加入離子水定容至1l，在15psi高壓下蒸汽滅菌20min，制得白花兜蘭液體培養(yǎng)基；
b、白花兜蘭固體培養(yǎng)基的配制：向1l玻璃容器中加入去離子水900ml，松樹(shù)皮粉末90g，磷肥5g，鉀肥3g，氮肥2g，搖動(dòng)容器直至磷肥、鉀肥、氮肥完全溶解，松樹(shù)皮粉末均勻懸浮在水中，加入離子水定容至1l，再加入150g瓊脂粉，攪拌均勻，于15psi高壓下蒸汽滅菌20min后，置于冷水浴中，待培養(yǎng)基溫度降到室溫時(shí)加入500mg頭孢氨芐毒素，充分搖勻，將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿后，打開(kāi)蓋子，在紫外光照下光照15分鐘后用封口膠封邊，倒置，于4℃下保存；
c、農(nóng)桿菌液體浸染液的配制；將帶有基因轉(zhuǎn)變質(zhì)粒的農(nóng)桿菌lba4404培養(yǎng)至od＝1.0，于5000r/min的離心機(jī)中離心5min，棄上清液，用100mg/l乙酰丁香酮的lb液體培養(yǎng)基懸浮沉淀，室溫下靜置3h，于5000r/min的離心機(jī)中離心5min，棄上清，用白花兜蘭液體培養(yǎng)基懸浮沉淀，制得農(nóng)桿菌液體浸染液；
d、白花兜蘭浸染：選擇生長(zhǎng)良好、無(wú)病變的白花兜蘭幼苗，滅菌，剪去莖尖和根部，置于農(nóng)桿菌液體浸染液中浸泡20min，每隔2min搖勻一次；
e、白花兜蘭暗培養(yǎng)：將上述浸泡后的白花兜蘭幼苗挑出浸染液，用滅菌后的濾紙擦干表層液體，在室溫、黑暗條件下置于白花兜蘭固體培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)3天；
f、白花兜蘭光照培養(yǎng)：將上述暗培養(yǎng)3天后的白花兜蘭幼苗用500mg/l的頭孢氨芐毒素清洗3遍，再用滅菌水沖洗5遍，最后用滅菌后的濾紙擦干后放到含有500mg/l的頭孢氨芐毒素的白花兜蘭固體培養(yǎng)基中進(jìn)行光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為5000lux、溫度為25℃、濕度為60％、二氧化碳濃度為400ppm、光照時(shí)間為12h/d每30天繼代一次；
g、結(jié)果檢測(cè)：將浸染并培養(yǎng)兩周后的白花兜蘭用x-gluc染色液在37℃恒溫箱中浸泡3h，取出后用酒精脫色處理，能夠產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的深藍(lán)色化合物；
h、實(shí)際種植效果：將培養(yǎng)后的白花兜蘭幼苗按常規(guī)白花兜蘭種植方法進(jìn)行移栽，結(jié)果表明，白花兜蘭香味更加濃郁，花期提前將近1個(gè)月。
以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制，任何未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。